Summary
Patient-derived Organoids (PDO) sind eine dreidimensionale (3D) Kultur, die die Tumorumgebung in vitro nachahmen kann. Bei hochgradigem serösem Ovarialkarzinom stellen PDOs ein Modell zur Untersuchung neuartiger Biomarker und Therapeutika dar.
Abstract
Organoide sind dynamische 3D-Tumormodelle, die erfolgreich aus patientischem Ovarialtumorgewebe, Aszites oder Pleuraflüssigkeit gezüchtet werden können und bei der Entdeckung neuartiger Therapeutika und prädiktiver Biomarker für Eierstockkrebs helfen. Diese Modelle rekapitulieren die klonale Heterogenität, die Tumormikroumgebung sowie Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass sie morphologisch, zytologisch, immunhistochemisch und genetisch mit dem Primärtumor übereinstimmen. So erleichtern Organoide die Erforschung von Tumorzellen und der Tumormikroumgebung und sind Zelllinien überlegen. Das vorliegende Protokoll beschreibt verschiedene Methoden zur Erzeugung von von Patientinnen stammenden Ovarialkarzinom-Organoiden aus Patiententumoren, Aszites und Pleuraflüssigkeitsproben mit einer Erfolgsrate von mehr als 97%. Die Patientenproben werden sowohl durch mechanischen als auch durch enzymatischen Aufschluss in zelluläre Suspensionen getrennt. Die Zellen werden dann mit einem Basalmembranextrakt (BME) plattiert und mit optimierten Wachstumsmedien unterstützt, die Nahrungsergänzungsmittel enthalten, die spezifisch für die Kultivierung von hochgradigem serösem Ovarialkarzinom (HGSOC) sind. Nach der Bildung der ersten Organoide können die PDOs eine Langzeitkultur aufrechterhalten, einschließlich der Passage zur Expansion für nachfolgende Experimente.
Introduction
Im Jahr 2021 wurde bei etwa 21.410 Frauen in den Vereinigten Staaten neu epithelialer Eierstockkrebs diagnostiziert, und 12.940 Frauen starben an dieser Krankheit1. Obwohl in der Chirurgie und Chemotherapie ausreichende Fortschritte erzielt wurden, entwickeln über 70% der Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung eine chemotherapeutische Resistenz und sterben innerhalb von 5 Jahren nach der Diagnose 2,3. Neue Strategien zur Behandlung dieser tödlichen Krankheit und repräsentative, verlässliche Modelle für die präklinische Forschung sind daher dringend erforderlich.
Krebszelllinien und patientenabgeleitete Xenotransplantate (PDX), die aus primären Ovarialtumoren hergestellt werden, sind die wichtigsten Instrumente, die in der Eierstockkrebsforschung verwendet werden. Ein großer Vorteil von Krebszelllinien ist ihre schnelle Expansion. Ihre kontinuierliche Kultur führt jedoch zu phänotypischen und genotypischen Veränderungen, die dazu führen, dass die Krebszelllinien von der ursprünglichen primären Krebstumorprobe abweichen. Aufgrund der bestehenden Unterschiede zwischen der Krebszelllinie und dem Primärtumor haben Arzneimittelassays, die positive Effekte in Zelllinien haben, inklinischen Studien nicht die gleichen Effekte 2. Um diese Einschränkungen zu überwinden, werden PDX-Modelle verwendet. Diese Modelle werden erstellt, indem frisches Eierstockkrebsgewebe in immundefiziente Mäuse implantiert wird. Da es sich um In-vivo-Modelle handelt, ähneln sie den biologischen Eigenschaften des Menschen genauer und sind wiederum prädiktiver für die Ergebnisse von Arzneimitteln. Diese Modelle weisen jedoch auch erhebliche Einschränkungen auf, einschließlich der Kosten, des Zeitaufwands und der Ressourcen, die für ihre Erstellung erforderlich sind4.
PDOs bieten ein alternatives Modell für die präklinische Forschung, das die Einschränkungen sowohl von Krebszelllinien als auch von PDX-Modellen überwindet. PDOs rekapitulieren den Tumor und die Tumormikroumgebung eines Patienten und bieten somit ein in vitro kontrollierbares Modell, das sich ideal für die präklinische Forschungeignet 2,3,5. Diese 3D-Modelle verfügen über Selbstorganisationsfähigkeiten, die den Primärtumor modellieren, was ein Merkmal ist, das ihre zweidimensionalen (2D) Zelllinien-Gegenstücke nicht besitzen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass diese Modelle genetisch und funktionell ihre Muttertumoren repräsentieren und somit zuverlässige Modelle für die Untersuchung neuartiger Therapeutika und biologischer Prozesse sind. Kurz gesagt, sie bieten langfristige Expansions- und Speicherfähigkeiten, die denen von Zelllinien ähneln, umfassen aber auch die Mikroumgebung und die Zell-Zell-Interaktionen, die Mausmodellen innewohnen 4,6.
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Erstellung von PDOs aus patienteneigenen Tumoren, Aszites und Pleuraflüssigkeitsproben mit einer Erfolgsrate von mehr als 97%. Die PDO-Kulturen können dann über mehrere Generationen erweitert und zum Testen der Sensitivität der medikamentösen Therapie und prädiktiver Biomarker verwendet werden. Diese Methode stellt eine Technik dar, die verwendet werden könnte, um Behandlungen basierend auf den therapeutischen Reaktionen von PDOs zu personalisieren.
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Protocol
Alle menschlichen Gewebeproben, die für Forschungszwecke gesammelt wurden, wurden gemäß dem vom Institutional Review Board (IRB) genehmigten Protokoll gewonnen. Die unten beschriebenen Protokolle wurden in einer sterilen menschlichen Gewebekulturumgebung durchgeführt. Die schriftliche Einverständniserklärung wurde von menschlichen Probanden eingeholt. Geeignete Patienten mussten eine Diagnose oder vermutete Diagnose von Eierstockkrebs haben, bereit und in der Lage sein, eine Einverständniserklärung zu unterschreiben, und mindestens 18 Jahre alt sein. Tumorgewebe (bösartiger Primärtumor oder metastasierende Stellen), Aszites und Pleuraflüssigkeit wurden von einwilligenden Patienten zum Zeitpunkt ihres Eingriffs gewonnen. Diese Proben wurden sofort ins Labor transportiert und mit den unten beschriebenen Methoden für die Organoiderzeugung aufbereitet.
1. Medienvorbereitung
- Komplette organoide Medienvorbereitung
- Bereiten Sie R-Spondin 1/Noggin-konditioniertes Medium nach einem zuvor veröffentlichten Bericht7 vor.
HINWEIS: R-Spondin-1/Noggin-konditioniertes Medium ist eine kostengünstigere Alternative zu kommerziell erhältlichen rekombinanten Proteinen. HEK293T-Zellen, die R-Spondin-1 und Noggin über Lentivirus-vermittelte Transduktion stabil sezernieren, waren ein großzügiges Geschenk von Ron Bose, Washington University School of Medicine in St. Louis, und Anil Rustgi, New York-Presbyterian/Columbia University Irving Medical Center 8,9,10. Als Ersatz könnte ein handelsübliches konditioniertes Medium verwendet werden (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie R-Spondin 1/Noggin-konditioniertes Medium nach einem zuvor veröffentlichten Bericht7 vor.
- Um das vollständige organoide Medium herzustellen, kombinieren Sie 10% R-Spondin 1/Noggin konditioniertes Medium, 50 ng/ml EGF, 10 ng/ml FGF-10, 10 ng/ml FGF2, 1x B27, 10 mmol/l Nicotinamid, 1,25 mmol/l N-Acetylcystein, 1 μmol/l Prostaglandin E2, 10 μmol/l SB202190, 500 nmol/l A83-01 und 10 μM ROCK-Inhibitor (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Das Medium kann bis zu 3 Monate bei 4 °C gelagert werden. Dieses Medium wurde von Hill et al.11 adaptiert. Die Konzentrationen und Inhaltsstoffe des Mediums sind die gleichen, mit dem Zusatz eines ROCK-Inhibitors. - Bereiten Sie das Organoid-Basismedium vor, indem Sie 500 ml einer fortschrittlichen Formulierung von DMEM/F12 mit 1 % Penicillin-Streptomycin, 1x Dipeptid, L-Alanyl-L-Glutamin und 1x HEPES (10 mM) kombinieren (siehe Materialtabelle).
2. Ernte von Organoiden aus Aszites und Pleuraflüssigkeit
HINWEIS: Aszites und Pleuraflüssigkeit müssen so schnell wie möglich verarbeitet werden, um die beste Ausbeute an Organoiden zu erzielen. Tauen Sie zuvor aliquotierten BME-, DNase I- und DNase I-Reaktionspuffer (siehe Materialtabelle) auf, indem Sie ihn auf Eis legen, bis der Inhalt verflüssigt ist.
- Erhalten Sie Aszites und Pleuraflüssigkeit von einwilligenden Patienten zum Zeitpunkt von Operationen oder Eingriffen in der Standardversorgung und transportieren Sie sie bei Raumtemperatur in einem Reisebehälter ins Labor.
HINWEIS: Alle Aszites oder die Verarbeitung von Pleuraflüssigkeit sollten in einer sterilen Umgebung durchgeführt werden. - Übertragen Sie 50 ml Aszites oder Pleuraflüssigkeit in 50 ml konische Röhrchen (die Anzahl der Röhrchen hängt vom Volumen des erhaltenen Aszites ab). Zentrifugieren bei 1.650 x g für 5 min bei 4 °C. Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig mit einer Pasteurpipette aus Glas absaugen.
- Fahren Sie fort, indem Sie 50 ml Aszites oder Pleuraflüssigkeit zu dem zuvor zentrifugierten Pellet geben und erneut bei 1.650 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pasteurpipette aus Glas ab. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis der gesamte Aszites oder die Pleuraflüssigkeit verarbeitet wurden.
- Bereiten Sie eine 100 μg/ml DNase-I-Lösung vor, indem Sie 1.000 μl nukleasefreies Wasser, 100 μl DNase-I-Reaktionspuffer und 10 μl DNase I kombinieren.
ANMERKUNG: Die angewandte DNase I-Behandlung reicht aus, um eine Einzelzellsuspension herzustellen, unabhängig davon, ob in einigen Patientenproben Zellaggregate vorhanden sind12. - Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 1 ml 100 μg/ml DNase I-Lösung. Geben Sie die DNase I-Lösung vorsichtig zutropfend hinzu und lassen Sie das Röhrchen 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
HINWEIS: Fügen Sie mindestens 1 ml DNase I-Lösung hinzu. Wenn 1 ml nicht ausreicht, um das Pellet zu stören, fügen Sie weitere 1 ml hinzu. - Nach der Inkubation 25 ml organoides Basismedium (Schritt 1.3) zu den Zellen geben und vorsichtig umdrehen, um es zu mischen. Anschließend bei 1.650 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig mit einer Glaspasteurpipette absaugen.
- Resuspendieren Sie die neu gebildeten Zellpellets in vorgewärmten 5 ml 1x Lysepuffer für rote Blutkörperchen (RBC) (siehe Materialtabelle). Stellen Sie den Wirbel auf 458 x g ein und wirbeln Sie die Lösungen in jedem konischen Röhrchen. Sobald die Lösungen homogen sind, verwenden Sie eine serologische Pipette, um den Inhalt aller konischen Röhrchen in einem einzigen konischen 50-ml-Röhrchen zu kombinieren.
- Inkubieren Sie das konische Röhrchen mit der gewirbelten Lösung 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach Beendigung der Inkubation bei 1.650 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
HINWEIS: Untersuchen Sie das Pellet. Ein rosa/rotes Pellet zeigt das Vorhandensein von Erythrozyten an, was erfordern würde, dass der Schritt des Erythrozytenlysepuffers wiederholt wird, bis das Pellet nicht mehr rot ist. - Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig mit einer Glaspasteurpipette absaugen. Anschließend wird das Pellet mit 10 ml PBS gewaschen, die Lösung bei 458 x g gewirbelt und bei 1.650 x g 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Wenn sich ein großzelliges Pellet bildet, saugen Sie das PBS mit einer Glaspasteurpipette ab und geben Sie 1 ml organoides Basismedium (Schritt 1.3) auf das Pellet. Wirbeln Sie die Lösung bei 458 x g und überführen Sie 300-400 μl in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie das Mikrozentrifugenröhrchen bei 1.650 x g für 5 min bei 4 °C.
HINWEIS: Der Teil des Zellpellets, der sich nicht in das Mikrozentrifugenröhrchen befindet, kann für die zukünftige Verwendung eingefroren werden (500 μl Zellen auf 1 ml 10% DMSO in FBS). Das gefrorene Zellpellet kann wochenlang bei −80 °C und jahrelang gelagert werden, wenn es in flüssigen Stickstoff13 eingelegt wird. - Das organoide Basismedium (Schritt 1.3) wird vorsichtig mit einer Glaspasteurpipette abgesaugt und mit kalten Spitzen in BME ( siehe Materialtabelle) resuspendiert.
HINWEIS: Die BME-Menge richtet sich nach der Größe des Pellets. Es wird empfohlen, 25% organoides Basismedium (Schritt 1.3) mit resuspendierten Zellen bis 75% BME zu verwenden. - Platte 40 μl Aliquote der resuspendierten Zelllösung auf eine 6-Well-Platte. Platten mit bis zu fünf Aliquoten pro Vertiefung (Abbildung 1).
- Legen Sie die Platte sofort für 20 Minuten in einen 37 °C heißen Inkubator, damit sich der BME verfestigen kann. Nach der Inkubation vorsichtig 2 ml vollständiges organoides Medium (Schritt 1.2) in jede Vertiefung geben.
Abbildung 1: Beschichtung von Organoiden von Eierstockkrebs von Patientinnen. Repräsentatives Bild der Organoid-Beschichtung. Aliquote der Organoidmischung werden sorgfältig plattiert, um sicherzustellen, dass sich keine Blasen bilden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
3. Ernte von Organoiden aus Gewebe
HINWEIS: Das Gewebe muss so schnell wie möglich verarbeitet werden, um die beste Ausbeute an Organoiden zu erzielen.
- Sammeln und transportieren Sie den Tumor auf Eis in einem Reisebehälter, der PBS enthält.
- Legen Sie die Probe auf eine 10 cm lange Gewebekulturschale (Abbildung 2). Zerkleinern Sie das Gewebe mit einem Einwegskalpell. Als nächstes zerkleinern Sie das Gewebe mit dem stumpfen Ende einer Einwegspritze, bis eine homogene Mischung entstanden ist.
- Legen Sie die homogene Gewebemischung mit einer Pinzette in ein Dissoziationsröhrchen. Für jeweils 1-2 ml homogenisiertes Gewebe werden 7-8 ml 1 mg/ml Kollagenaselösung Typ II (siehe Materialtabelle) in organoides Basismedium (Schritt 1.3) und 1 ml DNase I-Lösung gegeben. Wirbeln Sie die Lösung bei 458 x g.
HINWEIS: Die Menge an Gewebe bestimmt die Menge an Kollagenaselösung und die Anzahl der benötigten Röhrchen. - Verwenden Sie die Dissoziationsmaschine (siehe Materialtabelle), um das Gewebe zu verflüssigen, während es sich in der Kollagenaselösung befindet. Führen Sie das Programm 37C_h_TDK3 (1 h) aus, bis es sich um eine einzellige Suspension handelt.
HINWEIS: Das Programm muss wiederholt werden, wenn die resultierende Mischung nicht homogen ist (d. h. wenn noch Gewebestücke in der Mischung vorhanden sind). Wenn das Gewebe verdaut ist, die Lösung jedoch viskos ist, wird es mit Organoid-Basismedium verdünnt (Schritt 1.3). - Die homogenisierte Mischung wird in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen überführt und 20-40 ml organoides Basismedium (Schritt 1.3) zugegeben. Anschließend filtrieren Sie die Lösung durch ein 100-μm-Zellsieb in ein neu beschriftetes konisches 50-ml-Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie das filtrierte Gemisch bei 1.650 x g für 5 min bei 4 °C. Anschließend den Überstand vorsichtig mit einer Glaspasteurpipette absaugen.
- Bereiten Sie eine 100 μg/ml DNase-I-Lösung vor, indem Sie 1.000 μl nukleasefreies Wasser, 100 μl DNase-I-Reaktionspuffer und 10 μl DNase I kombinieren.
ANMERKUNG: Die angewandte DNase I-Behandlung reicht aus, um eine Einzelzellsuspension herzustellen, unabhängig davon, ob in einigen Patientenproben Zellaggregate vorhanden sind12. - Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml 100 μg/ml DNase I-Lösung. Geben Sie die DNase I-Lösung vorsichtig zutropfend hinzu und lassen Sie das Röhrchen 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- Nach der Inkubation 25 ml organoides Basismedium (Schritt 1.3) zu den Zellen geben und vorsichtig umdrehen, um es zu mischen. Anschließend bei 1.650 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig mit einer Glaspasteurpipette absaugen.
- Resuspendieren Sie das neu gebildete Zellpellet in 5 mL vorgewärmtem 1x Erythrozyten-Lysepuffer. Wirbeln Sie die Lösungen in jedem konischen Röhrchen bei 458 x g.
- Inkubieren Sie das konische Röhrchen mit dem Zellpellet, das im Erythrozyten-Lysepuffer resuspendiert ist, 5 Minuten lang. Nach Beendigung der Inkubation bei 1.650 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
HINWEIS: Untersuchen Sie das Pellet. Ein rosa/rotes Pellet zeigt das Vorhandensein von Erythrozyten an, was erfordern würde, dass der Schritt des Erythrozytenlysepuffers wiederholt wird, bis das Pellet weiß erscheint. - Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig mit einer Glaspasteurpipette absaugen. Anschließend wird das Pellet mit 10 ml PBS gewaschen, die Lösung bei 458 x g gewirbelt und bei 1.650 x g 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Wenn sich ein großzelliges Pellet bildet, saugen Sie das PBS mit einer Glaspasteurpipette ab und geben Sie 1 ml organoides Basismedium (Schritt 1.3) auf das Pellet. Wirbeln Sie die Lösung bei 458 x g und überführen Sie 300-400 μl in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren bei 1.650 x g für 5 min bei 4 °C.
HINWEIS: Der Teil des Zellpellets, der sich nicht in das Mikrozentrifugenröhrchen befindet, kann für die zukünftige Verwendung eingefroren werden (500 μl Zellen auf 1 ml 10% DMSO in FBS) (Schritt 5.1). Das gefrorene Zellpellet kann wochenlang bei −80 °C und jahrelang gelagert werden, wenn es in flüssigen Stickstoff13 eingelegt wird. - Das organoide Basismedium wird vorsichtig mit einer Glaspasteurpipette abgesaugt und mit kalten Spitzen in BME resuspendiert.
HINWEIS: Die BME-Menge richtet sich nach der Größe des Pellets. Es wird empfohlen, 25 % organoides Basismedium (Schritt 1.3) mit resuspendierten Zellen zu 75 % BME zuzusetzen. - Die resuspendierte Zelllösung wird in 40-μl-Aliquoten auf eine 6-Well-Platte aufgetragen. Platten mit bis zu fünf Aliquoten pro Vertiefung.
- Legen Sie die Well-Platte sofort für 20 Minuten in den Inkubator. Nach der Inkubation vorsichtig 2 ml vollständiges organoides Medium (Schritt 1.2) in jede Vertiefung geben.
Abbildung 2: Tumorgewebe vor der Dissektion. Repräsentatives Bild von Tumorgewebe, das für die Organoiderzeugung gewonnen wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
4. Passage von Organoiden
HINWEIS: Wenn die Probe konfluent ist, kann jede Organoid-Vertiefung wöchentlich zu zwei neuen Vertiefungen geleitet werden.
- Geben Sie mit einer 1-ml-Pipette 1 ml Organoid-Basismedium (Schritt 1.3) in jede Vertiefung und pipettieren Sie das Medium direkt auf die Organoid-Tabs, um es zu dissoziieren. Sammeln Sie das gesamte Medium, das die resuspendierten Pellets enthält, in einem konischen 15-ml-Röhrchen.
- Das konische 15-ml-Röhrchen mit der Mischung wird bei 1.650 x g 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Anschließend den Überstand vorsichtig mit einer Glaspasteurpipette absaugen.
- 1 ml des rekombinanten Enzyms tierischen Ursprungs (siehe Materialtabelle) in das Zellpellet geben, die Lösung bei 458 x g wirbeln und in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Lassen Sie das Röhrchen 15 Minuten in einem 37 °C warmen Wasserbad inkubieren.
- Nach der Inkubation bei 1.650 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Anschließend den Überstand vorsichtig mit einer Glaspasteurpipette absaugen.
- Resuspendieren Sie das Pellet in BME.
HINWEIS: Die BME-Menge richtet sich nach der Größe des Pellets. Es wird empfohlen, 25 % organoide Basismedien (Schritt 1.3) mit resuspendierten Zellen zu 75 % BME hinzuzufügen. - Die resuspendierte Zelllösung wird in eine 6-Well-Platte in 40-μl-Aliquoten gegeben. Platten mit bis zu fünf Aliquoten pro Vertiefung. Sobald alle Aliquots plattiert sind, legen Sie die Well-Platte sofort für 20 Minuten in den Inkubator. Nach der Inkubation vorsichtig 2 ml vollständiges organoides Medium (Schritt 1.2) in jede Vertiefung geben.
5. Einfrieren und Auftauen von Organoiden
- Einfrieren von Organoiden
- Beginnen Sie mit den Schritten 4.1-4.4.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 0,5-1 ml Gefriermedium der Wiederherstellungszellkultur (siehe Materialtabelle) und geben Sie 1 ml in jedes Kryo.
- Anschließend werden die Kryozellen bis zu 2 Wochen lang bei −80 °C in einen mit Isopropanol gefüllten Behälter gegeben, bevor sie zur Langzeitlagerung in einen Flüssigstickstofftanküberführt werden 13.
- Auftauen von Organoiden
- Nehmen Sie die Proben aus dem Flüssigstickstofftank und tauen Sie sie bei einem Wasserbad bei 37 °C auf.
- Nach dem Auftauen in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführen und bei 1.650 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig mit einer Glaspasteurpipette absaugen.
- Resuspendieren Sie das Pellet in BME.
HINWEIS: Die BME-Menge richtet sich nach der Größe des Pellets. Es wird empfohlen, 25 % organoide Basismedien (Schritt 1.3) mit resuspendierten Zellen zu 75 % BME hinzuzufügen. - Die resuspendierte Zelllösung wird in 40-μl-Aliquoten auf eine 6-Well-Platte aufgetragen. Platzieren Sie bis zu fünf Aliquote pro Vertiefung.
- Stellen Sie die Platte sofort für 20 Minuten in den Inkubator. Nach der Inkubation vorsichtig 2 ml vollständiges organoides Medium (Schritt 1.2) in die Vertiefungen geben.
6. Einbetten und Erzeugen von formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Objektträgern zur Bewertung der Organoidzusammensetzung
- Nachdem Sie die Organoide mindestens 10 Tage lang kultiviert haben, um eine ausreichende Größe zu gewährleisten, entfernen Sie das gesamte Organoidmedium aus den Vertiefungen und fügen Sie 1 ml 2% Paraformaldehyd-Fixiermittel (PFA) hinzu. Bei Raumtemperatur 5-10 Minuten inkubieren.
- Nach der Inkubation waschen Sie die kultivierten Organoid-Aliquots 3x für jeweils 5 min mit 1 ml PBS.
- Entfernen Sie das PBS aus jeder Vertiefung und geben Sie 1 ml warmen 2% igen Agar in deionisiertem H2O in jede Vertiefung. Wenn Sie den Agar hinzufügen, heben Sie die kultivierten Organoid-Aliquots mit einem Spatel von der Platte.
HINWEIS: Es ist wichtig, den Agar nicht aushärten zu lassen, bevor die kultivierten organoiden Aliquote angehoben werden.- Lassen Sie den Agar bei Raumtemperatur in der Vertiefung erstarren.
- Befreien Sie den erstarrten Agar mit einem kleinen Spatel aus der Vertiefung und lagern Sie ihn bis zu 48 h in einer Kassette (siehe Materialtabelle) bei 4 °C in 70 % Ethanol bis zur Verarbeitung14.
- Betten Sie die Proben in Paraffin 15 ein, schneiden Sie die Objektträger auf eine Dicke von 5 μm und färben Sie die Objektträger mit Hämatoxylin und Eosin (H & E, siehe Materialtabelle) unter Verwendung eines Standardprotokolls15.
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Representative Results
Um PDOs zu erzeugen, wurden die Proben mechanisch und enzymatisch zu Einzelzellsuspensionen aufgeschlossen. Die Zellen wurden dann in BME resuspendiert und mit speziell hergestellten Medien ergänzt (Abbildung 3). Organoide werden in der Regel über einen Zeitraum von 10 Tagen etabliert, danach zeigen sie diskrete Organoide in Kultur (Abbildung 4).
Abbildung 3: Schematische Darstellung von Patientensammlungen, die zu Organoiden geformt wurden. Patientengewebe, Aszites oder Pleuraflüssigkeit werden mechanisch oder enzymatisch verdaut. Die einzellige Suspension wird dann zu BME plattiert, wo sich die Kultur mit Hilfe von speziellen, auf HGSOC zugeschnittenen Wachstumsmedien vermehrt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative Bilder von zwei einzigartigen, von Patientinnen stammenden Ovarialkarzinom-Organoiden nach 7 Tagen Wachstum. Die Organoidbilder wurden mit 40x aufgenommen. Der Hellfeld-Maßstabsbalken im linken Bild beträgt 100 μm und im rechten Bild 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Aus dem vorgestellten Protokoll wurde eine Biobank mit 23 Organoiden hergestellt und über 5 Monate lang unter regelmäßiger Passage kultiviert. Die klinischen Merkmale der Ursprungstumoren sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Mehrzahl der Tumoren befand sich im fortgeschrittenen Stadium (100 %), ein hochgradiges seröses Karzinom (92,9 %) und eine naive Behandlung (85,7 %).
| N = 23 | |
| Alter (Jahre) | 63,5 ± 9,7 |
| FIGO Bühne III IV Anhängig |
13 (56.5) 9 (39.2) 1 (4.3) |
| Histologie Hochwertig serös Karzinosarkom Minderwertig serös |
21 (92.9) 1 (7.1) 1 (4.3) |
| BRCA-Mutation Ja Nein |
1 (4.3) 22 (95.7) |
| Frühere Linien der Chemotherapie 0 1-5 ≥5 |
20 (85.7) 0 2 (14.2) |
Tabelle 1: Merkmale der g.U.-Biobank. Die Tabelle enthält die spezifischen Eigenschaften der Organoide, die mit dem vorliegenden Protokoll erzeugt wurden. Zu diesen Merkmalen gehören Alter, FIGO-Stadium (International Federation of Gynecology and Obstetrics), Histologie, BRCA-Mutationsstatus (BReast CAncer Gen) und frühere Chemotherapielinien.
Organoide Kulturen können durch Einbettung in Agarose und Bewertung mit H & E bewertet werden (Abbildung 5).
Abbildung 5: Hämatoxylin- und Eosin-Färbung von PDO. Repräsentatives Bild der H&E-Färbung eines Ovarialkarzinom-Organoids, das aus einer Patientenprobe generiert wurde. Das Bild wurde mit 40x aufgenommen und der Maßstabsbalken beträgt 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Eierstockkrebs ist aufgrund seines fortgeschrittenen Stadiums bei der Diagnose sowie der häufigen Entwicklung einer Chemotherapieresistenz extrem tödlich. Viele Fortschritte in der Eierstockkrebsforschung wurden durch die Verwendung von Krebszelllinien und PDX-Modellen erzielt. Es besteht jedoch ein offensichtlicher Bedarf an einem repräsentativeren und erschwinglicheren In-vitro-Modell . PDOs repräsentieren nachweislich die Tumorheterogenität, die Tumormikroumgebung sowie die genomischen und transkriptomischen Merkmale ihrer Primärtumoren genau und sind daher ideale präklinische Modelle für verschiedene Forschungsansätze, wie z.B. die Implementierung von Organoidmodellen in der medikamentösen Therapie16.
Das hier beschriebene Protokoll ist sehr effektiv und zuverlässig, wie die Erfolgsquote von 97% zeigt. Es ist wichtig zu betonen, dass das vorliegende Protokoll kritische Schritte enthält, denen besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden sollte. Erstens ist bei der Entnahme von Organoiden aus Gewebe unbedingt darauf zu achten, dass die Probe vollständig homogenisiert ist. Dies kann erfordern, dass das Dissoziationsprogramm bei Bedarf mehr als einmal ausgeführt wird. Wenn die Probe nicht homogen ist, können die verbleibenden Gewebestücke das Organoidwachstum beeinträchtigen. Zweitens, da die Arbeitstemperatur von BME 2-8 °C beträgt, ist es wichtig, alle Schritte, die dieses Reagenz beinhalten, auf Eis durchzuführen, um eine Polymerisation zu vermeiden. Darüber hinaus ist es beim Resuspendieren und Plattieren mit BME wichtig, Blasen zu vermeiden, da dies die plattierten organoiden Aliquote instabil macht und sich von der Platte löst. Schließlich wurde der in diesem Protokoll verwendete BME aus dem Engelbreth-Holm-Swarm-Tumor (EHS) generiert und hat daher das Potenzial für eine inkonsistente Zusammensetzung zwischen den Chargen. Diese Unterschiede können die Bildung und das Wachstum von Organoiden beeinflussen. Es gibt keine spezifische Möglichkeit, diese Einschränkung zu überwinden, da den Autoren alternative BME-Optionen nicht bekannt sind17. Zukünftige Forschung ist notwendig, um alternative Materialien für BME- oder 3D-Gerüste zu etablieren. Angesichts all der oben genannten Überlegungen ist es wichtig zu betonen, dass diese Methoden für verschiedene Laborumgebungen und -geräte angepasst und getestet werden sollten.
Trotz der Fortschritte, die Organoide für die Eierstockkrebsforschung bieten können, gibt es Einschränkungen bei der Implementierung von Organoidmodellen. Die Erzeugung und Wartung von Organoiden ist ein langwieriger und teurer Prozess. Die Zeit, die für das Wachstum von Organoiden benötigt wird, ermöglicht das Einbringen von Kontaminationen. Darüber hinaus erfordert die Wachstumsvariabilität eine ständige Überwachung, um sicherzustellen, dass die Menge der verfügbaren Medien für die Entwicklung von Organoiden ausreicht und keine Kontamination vorhanden ist. Darüber hinaus ist die zelluläre Zusammensetzung der Organoide variabel. Immunzellen sind zunächst vorhanden, bleiben aber in der Regel nicht über die zweite Passage hinaus bestehen. Dies kann durch eine Zytokin-Supplementierung in den Medien überwunden werden, liegt aber außerhalb des Rahmens unserer aktuellen Arbeit. Stromazellen scheinen während der Passage zu persistieren, aber die Komponenten hängen stark von der Ausgangsprobe18,19 ab. Weitere Arbeiten sind notwendig, um die genauen zellulären Komponenten und die Persistenz jedes Zelltyps besser zu verstehen. Die Herstellung von Organoiden von Patienten, die sich mehreren Chemotherapielinien unterziehen, ist eine Herausforderung und problematisch. Weitere Studien sind notwendig, um die Auswirkungen der Chemotherapie auf die Erzeugung und Entwicklung von Organoiden zu verstehen. Schließlich ist nach unserer Erfahrung die Anzahl der Organoide, die aus einer bestimmten Menge an Gewebe, Aszites oder Pleuraflüssigkeit erzeugt werden, unvorhersehbar. Zum Beispiel führt die gleiche Menge an Tumor, Aszites oder Pleuraflüssigkeit, die von zwei verschiedenen Patienten gesammelt wird, zu unterschiedlichen Mengen an Organoiden. Weitere Forschungen werden durchgeführt, um Einblicke in die besten Zelltypen für das Überleben und die Lebensfähigkeit von Organoiden zu erhalten.
Nichtsdestotrotz bieten PDOs im Vergleich zu Zelllinien und PDX-Modellen einzigartige Möglichkeiten für die präklinische Forschung. Obwohl Fortschritte bei der Diagnose und Behandlung von Eierstockkrebs erzielt wurden, gibt es noch viel zu tun, und PDOs sind ein spezielles Instrument, das für die Weiterentwicklung der Eierstockkrebsforschung erforderlich ist.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir sind dankbar für die Anleitung von Ron Bose, MD, PhD, und die Unterstützung von Barbara Blachut, MD, bei der Erstellung dieses Protokolls. Wir möchten uns auch bei der School of Medicine der Washington University in der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie und der Abteilung für gynäkologische Onkologie, dem Dean's Scholar Program der Washington University und dem Reproductive Scientist Development Program für die Unterstützung dieses Projekts bedanken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| 10 mL Serological Pipet | |||
| 100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
| 37 °C water bath | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Centrifuge | |||
| Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Microcentrifuge | |||
| Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipette with Tips | |||
| p200 Pipette with Tips | |||
| Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Controller | |||
| Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| Tissue Culture Hood | |||
| Tissue Embedding Cassette | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
References
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