Summary
Patiënt-afgeleide organoïden (BOB) zijn een driedimensionale (3D) cultuur die de tumoromgeving in vitro kan nabootsen. Bij hooggradige sereuze eierstokkanker vertegenwoordigen BOB's een model om nieuwe biomarkers en therapieën te bestuderen.
Abstract
Organoïden zijn 3D-dynamische tumormodellen die met succes kunnen worden gekweekt uit van de patiënt afgeleid ovariumtumorweefsel, ascites of pleuravocht en helpen bij de ontdekking van nieuwe therapieën en voorspellende biomarkers voor eierstokkanker. Deze modellen recapituleren klonale heterogeniteit, de tumormicro-omgeving en cel-cel- en cel-matrixinteracties. Bovendien is aangetoond dat ze morfologisch, cytologisch, immunohistochemisch en genetisch overeenkomen met de primaire tumor. Organoïden vergemakkelijken dus onderzoek naar tumorcellen en de micro-omgeving van de tumor en zijn superieur aan cellijnen. Het huidige protocol beschrijft verschillende methoden om patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden te genereren uit patiënttumoren, ascites en pleurale vloeistofmonsters met een succespercentage van meer dan 97%. De patiëntmonsters worden gescheiden in cellulaire suspensies door zowel mechanische als enzymatische spijsvertering. De cellen worden vervolgens verguld met behulp van een keldermembraanextract (BME) en worden ondersteund met geoptimaliseerde groeimedia die supplementen bevatten die specifiek zijn voor het kweken van hoogwaardige sereuze eierstokkanker (HGSOC). Na het vormen van initiële organoïden kunnen de BOB's een langdurige cultuur ondersteunen, inclusief het passeren voor uitbreiding voor volgende experimenten.
Introduction
In 2021 werden ongeveer 21.410 vrouwen in de Verenigde Staten nieuw gediagnosticeerd met epitheliale eierstokkanker en stierven 12.940 vrouwen aan deze ziekte1. Hoewel er voldoende vooruitgang is geboekt in chirurgie en chemotherapie, ontwikkelt meer dan 70% van de patiënten met een gevorderde ziekte chemotherapeutische resistentie en sterft binnen 5 jaar na diagnose 2,3. Daarom zijn nieuwe strategieën om deze dodelijke ziekte te behandelen en representatieve, betrouwbare modellen voor preklinisch onderzoek dringend nodig.
Kankercellijnen en patiënt-afgeleide xenografts (PDX) gemaakt van primaire eierstoktumoren zijn de belangrijkste instrumenten die worden gebruikt in onderzoek naar eierstokkanker. Een groot voordeel van kankercellijnen is hun snelle expansie. Hun voortdurende cultuur resulteert echter in fenotypische en genotypische veranderingen die ervoor zorgen dat de kankercellijnen afwijken van het oorspronkelijke primaire kankertumormonster. Vanwege de bestaande verschillen tussen de kankercellijn en de primaire tumor, hebben medicijntests met positieve effecten in cellijnen niet dezelfde effecten in klinische onderzoeken2. Om deze beperkingen te overwinnen, worden PDX-modellen gebruikt. Deze modellen worden gemaakt door vers eierstokkankerweefsel te implanteren in immunodeficiënte muizen. Omdat het in vivo modellen zijn, lijken ze nauwkeuriger op menselijke biologische kenmerken en zijn ze op hun beurt meer voorspellend voor de uitkomsten van geneesmiddelen. Deze modellen hebben echter ook aanzienlijke beperkingen, waaronder de kosten, tijd en middelen die nodig zijn om ze te genereren4.
BOB's bieden een alternatief model voor preklinisch onderzoek dat de beperkingen van zowel kankercellijnen als PDX-modellen overwint. BOB's recapituleren de tumor en tumormicro-omgeving van een patiënt en bieden zo een in vitro tracteerbaar model dat ideaal is voor preklinisch onderzoek 2,3,5. Deze 3D-modellen hebben zelforganisatiemogelijkheden die de primaire tumor modelleren, wat een kenmerk is dat hun tweedimensionale (2D) cellijn-tegenhangers niet bezitten. Verder is aangetoond dat deze modellen genetisch en functioneel hun oudertumoren vertegenwoordigen en dus betrouwbare modellen zijn voor het bestuderen van nieuwe therapieën en biologische processen. Kortom, ze bieden uitbreidings- en opslagmogelijkheden op lange termijn die vergelijkbaar zijn met cellijnen, maar omvatten ook de micro-omgeving en cel-celinteracties die inherent zijn aan muismodellen 4,6.
Het huidige protocol beschrijft de creatie van BOB's uit patiënt-afgeleide tumoren, ascites en pleuravloeistofmonsters met een succespercentage van meer dan 97%. De BOB-culturen kunnen vervolgens gedurende meerdere generaties worden uitgebreid en worden gebruikt om de gevoeligheid voor medicamenteuze therapie en voorspellende biomarkers te testen. Deze methode vertegenwoordigt een techniek die kan worden gebruikt om behandelingen te personaliseren op basis van de therapeutische reacties van BOB's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle menselijke weefselmonsters die voor onderzoek zijn verzameld, zijn verkregen volgens het door de Institutional Review Board (IRB) goedgekeurde protocol. De onderstaande protocollen werden uitgevoerd in een steriele menselijke weefselkweekomgeving. Geïnformeerde schriftelijke toestemming werd verkregen van menselijke proefpersonen. In aanmerking komende patiënten moesten een diagnose of vermoedelijke diagnose van eierstokkanker hebben, bereid en in staat zijn om geïnformeerde toestemming te ondertekenen en ten minste 18 jaar oud zijn. Tumorweefsel (kwaadaardige primaire tumor of gemetastaseerde plaatsen), ascites en pleuravocht werden verkregen van instemmende patiënten op het moment van hun procedure. Deze monsters werden onmiddellijk naar het laboratorium vervoerd en verwerkt voor het genereren van organoïden met behulp van de hieronder beschreven methoden.
1. Mediavoorbereiding
- Complete voorbereiding van organoïde media
- Bereid R-spondin 1/Noggin geconditioneerd medium voor volgens een eerder gepubliceerd rapport7.
OPMERKING: R-spondin-1/Noggin geconditioneerd medium is een betaalbaarder alternatief voor in de handel verkrijgbare recombinante eiwitten. HEK293T-cellen die stabiel R-spondin-1 en Noggin afscheiden via lentivirus-gemedieerde transductie waren een genereus geschenk van Ron Bose, Washington University School of Medicine in St. Louis, en Anil Rustgi, New York-Presbyterian / Columbia University Irving Medical Center 8,9,10. Commercieel geconditioneerd medium zou als substituut kunnen worden gebruikt (zie materiaaltabel).
- Bereid R-spondin 1/Noggin geconditioneerd medium voor volgens een eerder gepubliceerd rapport7.
- Om het volledige organoïde medium te maken, combineert u 10% R-spondin 1/Noggin geconditioneerd medium, 50 ng/ml EGF, 10 ng/ml FGF-10, 10 ng/ml FGF2, 1x B27, 10 mmol/l nicotinamide, 1,25 mmol/l N-acetylcysteïne, 1 μmol/l prostaglandine E2, 10 μmol/l SB202190, 500 nmol/L A83-01 en 10 μM ROCK-remmer (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Het medium kan maximaal 3 maanden bij 4 °C worden bewaard. Dit medium is overgenomen uit Hill et al.11. De concentraties en ingrediënten van het medium zijn hetzelfde, met toevoeging van een ROCK-remmer. - Bereid organoïde basismedium door 500 ml van een geavanceerde formulering van DMEM / F12 te combineren met 1% penicilline-streptomycine, 1x dipeptide, L-alanyl-L-glutamine en 1x HEPES (10 mM) (zie tabel met materialen).
2. Oogsten van organoïden uit ascites en pleuravocht
OPMERKING: Ascites en pleuravocht moeten zo snel mogelijk worden verwerkt voor de beste opbrengst van organoïden. Ontdooi eerder geïniformeerde BME-, DNase- I- en DNase I-reactiebuffer (zie materiaaltabel) door deze op ijs te plaatsen totdat de inhoud vloeibaar is.
- Verkrijg ascites en pleuravocht van instemmende patiënten op het moment van standaardzorgoperaties of -procedures en vervoer bij kamertemperatuur in een reiscontainer naar het laboratorium.
OPMERKING: Alle ascites- of pleuravochtverwerking moet worden uitgevoerd in een steriele omgeving. - Breng 50 ml ascites of pleuravocht over naar 50 ml conische buizen (het aantal buizen is afhankelijk van het volume van de verkregen ascites). Centrifugeer bij 1.650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gebruik na het centrifugeren een glazen Pasteurpipet om het supernatant voorzichtig op te zuigen.
- Ga verder door 50 ml ascites of pleuravloeistof toe te voegen aan de eerder gecentrifugeerde pellet en centrifugeer opnieuw bij 1.650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig het supernatant voorzichtig aan met een glazen Pasteurpipet. Herhaal deze stap totdat alle ascites of pleuravocht zijn verwerkt.
- Bereid een DNase I-oplossing van 100 μg/ml door 1.000 μl nucleasevrij water, 100 μl DNase I-reactiebuffer en 10 μl DNase I te combineren.
OPMERKING: De toegepaste DNase I-behandeling is voldoende om een eencellige suspensie te maken, ongeacht de aanwezigheid van celaggregaten in sommige patiëntmonsters12. - Suspendeerde elke celpellet in 1 ml 100 μg/ml DNase I-oplossing. Voeg de DNase I-oplossing druppelsgewijs voorzichtig toe en laat de buis 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
OPMERKING: Voeg minimaal 1 ml DNase I-oplossing toe. Als 1 ml niet genoeg is om de pellet te verstoren, voeg dan nog eens 1 ml toe. - Voeg na de incubatie 25 ml organoïde basismedium (stap 1.3) toe aan de cellen en keer voorzichtig om om te mengen. Centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 1.650 x g bij 4 °C. Na het centrifugeren zuigt u het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteurpipet.
- Resuspensie van de nieuw gevormde celkorrels in voorverwarmde 5 ml 1x rode bloedcel (RBC) lysisbuffer (zie materiaaltabel). Stel de vortex in op 458 x g en vortex de oplossingen in elke conische buis. Zodra de oplossingen homogeen zijn, gebruikt u een serologische pipet om de inhoud van alle conische buizen te combineren tot een enkele conische buis van 50 ml.
- Incubeer de conische buis met de vortexoplossing bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Zodra de incubatie is voltooid, centrifugeert u gedurende 5 minuten bij 1.650 x g bij 4 °C.
OPMERKING: Onderzoek de pellet. Een roze/rode pellet duidt op de aanwezigheid van RBC's, waardoor de RBC-lysisbufferstap moet worden herhaald totdat de pellet niet langer rood is. - Na het centrifugeren zuigt u het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteurpipet. Was vervolgens de pellet met 10 ml PBS, draai de oplossing op 458 x g en centrifugeer gedurende 5 minuten op 1.650 x g bij 4 °C.
- Als een grote celkorrel wordt gevormd, zuigt u de PBS op met behulp van een glazen Pasteurpipet en voegt u 1 ml organoïde basismedium (stap 1.3) toe aan de pellet. Vortex de oplossing op 458 x g en breng 300-400 μL over in een microcentrifugebuis. Centrifugeer de microcentrifugebuis bij 1.650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: Het deel van de celpellet dat niet in de microcentrifugebuis wordt geplaatst, kan worden ingevroren voor toekomstig gebruik (500 μL cellen tot 1 ml 10% DMSO in FBS). De bevroren celpellet kan wekenlang worden bewaard bij −80 °C en jarenlang bij plaatsing in vloeibare stikstof13. - Zuig het organoïde basismedium voorzichtig op (stap 1.3) met behulp van een glazen Pasteurpipet en resuspensie in BME (zie materiaaltabel) met behulp van koude uiteinden.
OPMERKING: De hoeveelheid BME is gebaseerd op de grootte van de pellet. Het wordt aanbevolen om 25% organoïde basismedium (stap 1.3) te gebruiken met geresuspendeerde cellen tot 75% BME. - Plaat 40 μL aliquots van de geresuspendeerde celoplossing op een 6-well plaat. Plaat maximaal vijf aliquots per put (figuur 1).
- Plaats de plaat onmiddellijk gedurende 20 minuten in een incubator van 37 °C om de BME te laten stollen. Voeg na de incubatie voorzichtig 2 ml volledig organoïde medium (stap 1.2) toe aan elk putje.
Figuur 1: Plating van patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden. Representatief beeld van de organoïde beplating. Aliquots van het organoïdemengsel worden zorgvuldig verguld, zodat er geen bubbels worden gevormd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Organoïden oogsten uit weefsel
OPMERKING: Weefsel moet zo snel mogelijk worden verwerkt voor de beste opbrengst van organoïden.
- Verzamel en transporteer de tumor op ijs in een reiscontainer met PBS.
- Plaats het monster op een weefselkweekschaal van 10 cm (figuur 2). Gebruik een wegwerp scalpel om het weefsel te hakken. Gebruik vervolgens het doffe uiteinde van een wegwerpspuit en plet het weefsel totdat een homogeen mengsel is gemaakt.
- Plaats met een tang het homogene weefselmengsel in een dissociatiebuis. Voeg voor elke 1-2 ml gehomogeniseerd weefsel 7-8 ml 1 mg/ml type II collagenaseoplossing (zie materiaaltabel) toe in organoïde basismedium (stap 1.3) en 1 ml DNase I-oplossing. Vortex de oplossing bij 458 x g.
OPMERKING: De hoeveelheid weefsel bepaalt de hoeveelheid collagenase-oplossing en het aantal benodigde buizen. - Gebruik de dissociatiemachine (zie materiaaltabel) om het weefsel vloeibaar te maken terwijl het zich in de collagenase-oplossing bevindt. Voer het programma 37C_h_TDK3 (1 uur) uit totdat het een eencellige suspensie is.
OPMERKING: Het programma moet opnieuw worden uitgevoerd als het resulterende mengsel niet homogeen is (d.w.z. als er nog weefselstukken in het mengsel aanwezig zijn). Als het weefsel wordt verteerd maar de oplossing stroperig is, verdun dan met organoïde basismedium (stap 1.3). - Breng het gehomogeniseerde mengsel over in een nieuwe conische buis van 50 ml en voeg 20-40 ml organoïde basismedium toe (stap 1.3). Filter vervolgens de oplossing door een 100 μm celzeef in een nieuw gelabelde conische buis van 50 ml.
- Centrifugeer het gefilterde mengsel gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 1.650 x g . Zuig vervolgens het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteur-pipet.
- Bereid een DNase I-oplossing van 100 μg/ml door 1.000 μl nucleasevrij water, 100 μl DNase I-reactiebuffer en 10 μl DNase I te combineren.
OPMERKING: De toegepaste DNase I-behandeling is voldoende om een eencellige suspensie te maken, ongeacht de aanwezigheid van celaggregaten in sommige patiëntmonsters12. - Resuspendie van de cellen in 1 ml 100 ug/ml DNase I-oplossing. Voeg de DNase I-oplossing druppelsgewijs voorzichtig toe en laat de buis 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
- Voeg na de incubatie 25 ml organoïde basismedium (stap 1.3) toe aan de cellen en keer voorzichtig om om te mengen. Centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 1.650 x g bij 4 °C. Na het centrifugeren zuigt u het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteurpipet.
- Resuspendie van de nieuw gevormde celkorrel in 5 ml voorverwarmde 1x RBC-lysisbuffer. Vortex de oplossingen in elke conische buis op 458 x g.
- Incubeer de conische buis met de celkorrel geresuspendeerd in de RBC-lysisbuffer gedurende 5 minuten. Zodra de incubatie is voltooid, centrifugeert u gedurende 5 minuten bij 1.650 x g bij 4 °C.
OPMERKING: Onderzoek de pellet. Een roze/rode pellet duidt op de aanwezigheid van RBC's, waardoor de RBC-lysisbufferstap moet worden herhaald totdat de pellet wit lijkt. - Na het centrifugeren zuigt u het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteurpipet. Was vervolgens de pellet met 10 ml PBS, draai de oplossing op 458 x g en centrifugeer gedurende 5 minuten op 1.650 x g bij 4 °C.
- Als een grote celkorrel wordt gevormd, zuigt u de PBS op met behulp van een glazen Pasteurpipet en voegt u 1 ml organoïde basismedium (stap 1.3) toe aan de pellet. Vortex de oplossing op 458 x g en breng 300-400 μL over in een microcentrifugebuis. Centrifugeer bij 1.650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: Het gedeelte van de celpellet dat niet in de microcentrifugebuis wordt geplaatst, kan worden ingevroren voor toekomstig gebruik (500 μL cellen tot 1 ml 10% DMSO in FBS) (stap 5.1). De bevroren celpellet kan wekenlang worden bewaard bij −80 °C en jarenlang bij plaatsing in vloeibare stikstof13. - Zuig het organoïde basismedium voorzichtig aan met een glazen Pasteurpipet en resuspensie in BME met behulp van koude uiteinden.
OPMERKING: De hoeveelheid BME is gebaseerd op de grootte van de pellet. Het toevoegen van 25% organoïde basismedium (stap 1.3) met geresuspendeerde cellen tot 75% BME wordt aanbevolen. - Plaats de geresuspendeerde celoplossing op een 6-wellsplaat in aliquots van 40 μL. Plaat maximaal vijf aliquots per put.
- Plaats de putplaat onmiddellijk gedurende 20 minuten in de incubator. Voeg na de incubatie voorzichtig 2 ml volledig organoïde medium (stap 1.2) toe aan elk putje.
Figuur 2: Tumorweefsel voorafgaand aan dissectie. Representatief beeld van tumorweefsel verkregen voor organoïde generatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Doorgifte van organoïden
OPMERKING: Als het monster confluent is, kan elke organoïde put wekelijks naar twee nieuwe putten worden doorgegeven.
- Voeg met behulp van een pipet van 1 ml 1 ml organoïde basismedium (stap 1.3) toe aan elk putje en pipetteer het medium rechtstreeks op de organoïde tabbladen om het te dissociëren. Verzamel al het medium met de geresuspendeerde pellets in een conische buis van 15 ml.
- Centrifugeer de conische buis van 15 ml met het mengsel gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 1.650 x g . Zuig vervolgens het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteur-pipet.
- Voeg 1 ml dierlijk, recombinant enzym (zie tabel met materialen) toe aan de celpellet, draai de oplossing op 458 x g en breng over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Laat de buis 15 minuten incuberen in een waterbad van 37 °C.
- Na incubatie, centrifugeer bij 1.650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig vervolgens het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteur-pipet.
- Resuspendeerde de pellet in BME.
OPMERKING: De hoeveelheid BME is gebaseerd op de grootte van de pellet. Het toevoegen van 25% organoïde basismedia (stap 1.3) met geresuspendeerde cellen tot 75% BME wordt aanbevolen. - Plaats de geresuspendeerde celoplossing in een 6-wellsplaat in aliquots van 40 μL. Plaat maximaal vijf aliquots per put. Zodra alle aliquots zijn verguld, plaatst u de putplaat onmiddellijk gedurende 20 minuten in de incubator. Voeg na de incubatie voorzichtig 2 ml volledig organoïde medium (stap 1.2) toe aan elk putje.
5. Invriezen en ontdooien van organoïden
- Invriezen van organoïden
- Begin met stap 4.1-4.4.
- Resuspendeer de celpellet in 0,5-1 ml vriesmedium voor herstelcelcultuur (zie tabel met materialen) en breng 1 ml over naar elke cryovial.
- Plaats de cryovialen vervolgens in een met isopropanol gevulde container bij −80 °C gedurende maximaal 2 weken voordat u ze overbrengt naar een tank met vloeibare stikstof voor langdurige opslag13.
- Ontdooien van organoïden
- Haal de monsters uit de tank met vloeibare stikstof en ontdooi bij een waterbad van 37 °C.
- Eenmaal ontdooid, overbrengen in een conische buis van 15 ml en centrifugeren bij 1.650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Na het centrifugeren zuigt u het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteurpipet.
- Resuspendeerde de pellet in BME.
OPMERKING: De hoeveelheid BME is gebaseerd op de grootte van de pellet. Het toevoegen van 25% organoïde basismedia (stap 1.3) met geresuspendeerde cellen tot 75% BME wordt aanbevolen. - Plaats de geresuspendeerde celoplossing op een 6-wellsplaat in aliquots van 40 μL. Plaats maximaal vijf aliquots per put.
- Plaats de plaat onmiddellijk gedurende 20 minuten in de incubator. Voeg na de incubatie voorzichtig 2 ml volledig organoïde medium (stap 1.2) toe aan de putjes.
6. Insluiten en genereren van formaline-fixed paraffine-embedded (FFPE) dia's om de organoïde samenstelling te evalueren
- Na het kweken van organoïden gedurende ten minste 10 dagen om voldoende grootte te garanderen, verwijdert u het volledige organoïde medium uit de putten en voegt u 1 ml 2% paraformaldehydefixatief (PFA) toe. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5-10 min.
- Was na incubatie de gekweekte organoïde aliquots 3x gedurende 5 minuten telkens met 1 ml PBS.
- Verwijder de PBS uit elk putje en voeg 1 ml warme 2% agar in gedeïoniseerd H2O toe aan elk putje. Til bij het toevoegen van de agar de gekweekte organoïde aliquots van de plaat op met behulp van een spatel.
OPMERKING: Het is belangrijk om de agar niet te laten verharden voordat u de gekweekte organoïde aliquots optilt.- Laat de agar bij kamertemperatuur in de put stollen.
- Maak met een kleine spatel de gestolde agar uit de put en bewaar deze in een cassette gedurende maximaal 48 uur (zie materiaaltabel) bij 4 °C in 70% ethanol tot verwerking14.
- Sluit de monsters in paraffine 15 in, snijd de dia's tot een dikte van 5 μm en bevlek de dia's met hematoxyline en eosine (H &E, zie materiaaltabel) kleuring met behulp van een standaardprotocol15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om BOB's te genereren, werden de monsters mechanisch en enzymatisch verteerd tot eencellige suspensies. De cellen werden vervolgens geresuspendeerd in BME en aangevuld met specifiek ontworpen media (figuur 3). Organoïden worden meestal vastgesteld over een tijdsbestek van 10 dagen, waarna ze discrete organoïden in cultuur vertonen (figuur 4).
Figuur 3: Schema van patiëntencollecties gevormd tot organoïden. Patiëntweefsel, ascites of pleuravocht worden mechanisch of enzymatisch verteerd. De eencellige suspensie wordt vervolgens verguld in BME, waar de cultuur zich vermenigvuldigt met behulp van gespecialiseerde groeimedia op maat van HGSOC. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve beelden van twee unieke patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden na 7 dagen groei. De organoïde beelden zijn genomen op 40x. De brightfieldschaalbalk op de linkerafbeelding is 100 μm en op de rechterafbeelding is 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Uit het gepresenteerde protocol werd een biobank van 23 organoïden geproduceerd en gedurende meer dan 5 maanden gekweekt met regelmatige passaging. De klinische kenmerken van de tumoren van oorsprong zijn weergegeven in tabel 1. De meerderheid van de tumoren was in een vergevorderd stadium (100%), hooggradig sereus carcinoom (92,9%) en naïef voor de behandeling (85,7%).
| N = 23 | |
| Leeftijd (jaren) | 63,5 ± 9,7 |
| FIGO-podium III IV Aanhangig |
13 (56.5) 9 (39.2) 1 (4.3) |
| Histologie Hoogwaardig sereus Carcinosarcoom Laagwaardig sereus |
21 (92.9) 1 (7.1) 1 (4.3) |
| BRCA-mutatie Ja Nee |
1 (4.3) 22 (95.7) |
| Eerdere lijnen van chemotherapie 0 1-5 ≥5 |
20 (85.7) 0 2 (14.2) |
Tabel 1: Kenmerken van de BOB-biobank. De tabel bevat de specifieke kenmerken van de organoïden die met behulp van dit protocol zijn gegenereerd. Deze kenmerken omvatten leeftijd, FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics) stadium, histologie, BRCA (BReast CAncer gen) mutatiestatus en eerdere lijnen van chemotherapie.
Organoïde culturen kunnen worden geëvalueerd door inbedding in agarose en evaluatie met H &E (figuur 5).
Figuur 5: Hematoxyline en eosine kleuring van BOB. Representatief beeld van H &E-kleuring van een eierstokkankerorganoïde gegenereerd uit een patiëntenmonster. De foto is gemaakt op 40x en de schaalbalk is 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eierstokkanker is uiterst dodelijk vanwege het gevorderde stadium bij de diagnose, evenals de gemeenschappelijke ontwikkeling van chemotherapieresistentie. Veel vooruitgang in het onderzoek naar eierstokkanker is gemaakt door gebruik te maken van kankercellijnen en PDX-modellen; Er is echter een duidelijke behoefte aan een representatiever en betaalbaarder in vitro model. BOB's hebben bewezen de tumorheterogeniteit, de tumormicro-omgeving en de genomische en transcriptomische kenmerken van hun primaire tumoren nauwkeurig weer te geven en zijn dus ideale preklinische modellen voor diverse onderzoeksbenaderingen, zoals de implementatie van organoïde modellen in medicamenteuze therapie16.
Het hier beschreven protocol is zeer effectief en betrouwbaar, zoals blijkt uit het slagingspercentage van 97%. Het is belangrijk om te benadrukken dat het huidige protocol kritische stappen bevat waaraan zorgvuldige aandacht moet worden besteed. Ten eerste is het bij het oogsten van organoïden uit weefsel essentieel om ervoor te zorgen dat het monster volledig wordt gehomogeniseerd. Hiervoor kan het nodig zijn om het dissociatieprogramma indien nodig meer dan eens uit te voeren. Als het monster niet homogeen is, kunnen de resterende stukjes weefsel de groei van organoïden in gevaar brengen. Ten tweede, aangezien de werktemperatuur van BME 2-8 °C is, is het belangrijk om alle stappen met betrekking tot dit reagens op ijs uit te voeren om polymerisatie te voorkomen. Bovendien is het bij resuspensie en plating met BME cruciaal om bubbels te vermijden, omdat dit de vergulde organoïde aliquots onstabiel maakt, waardoor ze loskomen van de plaat. Ten slotte werd de BME die in dit protocol wordt gebruikt, gegenereerd uit de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) -tumor en heeft daarom het potentieel voor inconsistente samenstelling tussen batches. Deze verschillen kunnen de productie en groei van organoïden beïnvloeden. Er is geen specifieke manier om deze beperking te overwinnen, omdat de auteurs niet op de hoogte zijn van alternatieve BME-opties17. Toekomstig onderzoek is nodig om alternatieve materialen voor BME of 3D-steigers vast te stellen. Gezien alle bovenstaande overwegingen is het belangrijk om te benadrukken dat deze methoden moeten worden aangepast en getest voor verschillende laboratoriumomgevingen en apparatuur.
Ondanks de vooruitgang die organoïden kunnen bieden aan onderzoek naar eierstokkanker, zijn er beperkingen aan de implementatie van organoïde modellen. Het genereren en onderhouden van organoïden zijn zowel langdurige als dure processen. De hoeveelheid tijd die nodig is voor de groei van organoïden maakt de introductie van verontreiniging mogelijk. Verder vereist groeivariabiliteit constant toezicht om ervoor te zorgen dat de hoeveelheid beschikbare media voldoende is voor de ontwikkeling van organoïden en dat er geen verontreiniging aanwezig is. Bovendien is de cellulaire samenstelling van de organoïden variabel. Immuuncellen zijn aanvankelijk aanwezig, maar blijven meestal niet na de tweede passage bestaan. Dit kan worden ondervangen met cytokine-suppletie in de media, maar valt buiten het bestek van ons huidige werk. Stromale cellen lijken te blijven bestaan door passaging, maar de componenten zijn sterk afhankelijk van het initiële monster18,19. Verder werk is nodig om de exacte cellulaire componenten en persistentie van elk celtype beter te begrijpen. Het genereren van organoïden van patiënten die verschillende chemotherapielijnen ondergaan, is een uitdaging en problematisch. Verdere studies zijn nodig om de impact van chemotherapie op de productie en ontwikkeling van organoïden te begrijpen. Ten slotte is in onze ervaring het aantal organoïden dat wordt gegenereerd uit een bepaalde hoeveelheid weefsel, ascites of pleuravocht onvoorspelbaar. Bijvoorbeeld, dezelfde hoeveelheid tumor, ascites of pleuravocht verzameld van twee verschillende patiënten zal resulteren in verschillende hoeveelheden organoïden. Verder onderzoek wordt uitgevoerd om inzicht te krijgen in de beste celtypen voor de overleving en levensvatbaarheid van organoïden.
Niettemin bieden BOB's unieke mogelijkheden voor preklinisch onderzoek in vergelijking met cellijnen en PDX-modellen. Hoewel er vooruitgang is geboekt met betrekking tot de diagnose en behandeling van eierstokkanker, is er nog veel werk te doen en BOB's zijn een speciaal hulpmiddel dat nodig is om het onderzoek naar eierstokkanker te bevorderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor de begeleiding van Ron Bose, MD, PhD, en de hulp van Barbara Blachut, MD, bij het opstellen van dit protocol. We willen ook de Washington University's School of Medicine in St. Louis's Department of Obstetrics and Gynecology en Division of Gynecologic Oncology, Washington University's Dean's Scholar Program en het Reproductive Scientist Development Program erkennen voor hun steun aan dit project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| 10 mL Serological Pipet | |||
| 100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
| 37 °C water bath | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Centrifuge | |||
| Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Microcentrifuge | |||
| Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipette with Tips | |||
| p200 Pipette with Tips | |||
| Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Controller | |||
| Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| Tissue Culture Hood | |||
| Tissue Embedding Cassette | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Drost, J., Clevers, H.
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment. Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).
- Yang, J., et al. Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).
- Yang, H., et al. Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment. Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Madison, B. B., et al. Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2. PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Murray, E., et al. HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Passarelli, M. C., et al. Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics. Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Stumm, M. M., et al. Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH). American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L.
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10, 12581 (2020).
- Mead, B. E., et al. Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation. Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).
