Summary
Gli organoidi derivati dal paziente (PDO) sono una coltura tridimensionale (3D) che può imitare l'ambiente tumorale in vitro. Nel carcinoma ovarico sieroso di alto grado, le DOP rappresentano un modello per studiare nuovi biomarcatori e terapie.
Abstract
Gli organoidi sono modelli tumorali dinamici 3D che possono essere coltivati con successo da tessuto tumorale ovarico derivato dal paziente, ascite o liquido pleurico e aiutano nella scoperta di nuove terapie e biomarcatori predittivi per il cancro ovarico. Questi modelli ricapitolano l'eterogeneità clonale, il microambiente tumorale e le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice. Inoltre, hanno dimostrato di corrispondere al tumore primario morfologicamente, citologicamente, immunoistochimicamente e geneticamente. Pertanto, gli organoidi facilitano la ricerca sulle cellule tumorali e sul microambiente tumorale e sono superiori alle linee cellulari. Il presente protocollo descrive metodi distinti per generare organoidi di cancro ovarico derivati dal paziente da tumori del paziente, ascite e campioni di liquido pleurico con un tasso di successo superiore al 97%. I campioni del paziente vengono separati in sospensioni cellulari mediante digestione meccanica ed enzimatica. Le cellule vengono quindi placcate utilizzando un estratto di membrana basale (BME) e sono supportate con terreni di crescita ottimizzati contenenti integratori specifici per la coltura del carcinoma ovarico sieroso di alto grado (HGSOC). Dopo aver formato gli organoidi iniziali, le DOP possono sostenere la cultura a lungo termine, incluso il passaggio per l'espansione per esperimenti successivi.
Introduction
Nel 2021, circa 21.410 donne negli Stati Uniti sono state diagnosticate di recente con cancro ovarico epiteliale e 12.940 donne sono morte di questa malattia1. Sebbene siano stati fatti progressi sufficienti in chirurgia e chemioterapia, oltre il 70% dei pazienti con malattia avanzata sviluppa resistenza chemioterapica e muore entro 5 anni dalla diagnosi 2,3. Pertanto, sono urgentemente necessarie nuove strategie per trattare questa malattia mortale e modelli rappresentativi e affidabili per la ricerca preclinica.
Le linee cellulari tumorali e gli xenotrapianti derivati dal paziente (PDX) creati da tumori ovarici primari sono i principali strumenti utilizzati nella ricerca sul cancro ovarico. Uno dei principali vantaggi delle linee cellulari tumorali è la loro rapida espansione. Tuttavia, la loro coltura continua provoca alterazioni fenotipiche e genotipiche che causano le linee cellulari tumorali a deviare dal campione di tumore primario originale. A causa delle differenze esistenti tra la linea cellulare tumorale e il tumore primario, i test farmacologici che hanno effetti positivi nelle linee cellulari non riescono ad avere questi stessi effetti negli studi clinici2. Per superare queste limitazioni, vengono utilizzati i modelli PDX. Questi modelli sono creati impiantando tessuto fresco del cancro ovarico in topi immunodeficienti. Poiché sono modelli in vivo , assomigliano più accuratamente alle caratteristiche biologiche umane e, a loro volta, sono più predittivi dei risultati dei farmaci. Tuttavia, questi modelli hanno anche limitazioni significative, tra cui il costo, il tempo e le risorse necessarie per generarli4.
Le PDO offrono un modello alternativo per la ricerca preclinica che supera i limiti sia delle linee cellulari tumorali che dei modelli PDX. Le PDO ricapitolano il tumore e il microambiente tumorale di un paziente e, quindi, forniscono un modello trattabile in vitro ideale per la ricerca preclinica 2,3,5. Questi modelli 3D hanno capacità di auto-organizzazione che modellano il tumore primario, che è una caratteristica che le loro controparti bidimensionali (2D) della linea cellulare non possiedono. Inoltre, questi modelli hanno dimostrato di rappresentare geneticamente e funzionalmente i loro tumori genitori e, quindi, sono modelli affidabili per lo studio di nuove terapie e processi biologici. In breve, offrono capacità di espansione e stoccaggio a lungo termine simili alle linee cellulari, ma comprendono anche il microambiente e le interazioni cellula-cellula inerenti ai modelli murini 4,6.
Il presente protocollo descrive la creazione di DOP da tumori derivati dal paziente, ascite e campioni di liquido pleurico con un tasso di successo superiore al 97%. Le colture DOP possono quindi essere espanse per più generazioni e utilizzate per testare la sensibilità alla terapia farmacologica e i biomarcatori predittivi. Questo metodo rappresenta una tecnica che potrebbe essere utilizzata per personalizzare i trattamenti in base alle risposte terapeutiche delle DOP.
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Protocol
Tutti i campioni di tessuto umano raccolti per la ricerca sono stati ottenuti secondo il protocollo approvato dall'Institutional Review Board (IRB). I protocolli descritti di seguito sono stati eseguiti in un ambiente di coltura di tessuti umani sterili. Il consenso scritto informato è stato ottenuto da soggetti umani. Le pazienti eleggibili dovevano avere una diagnosi o una presunta diagnosi di cancro ovarico, essere disposte e in grado di firmare il consenso informato e avere almeno 18 anni di età. Il tessuto tumorale (tumore primario maligno o siti metastatici), ascite e liquido pleurico sono stati ottenuti da pazienti consenzienti al momento della procedura. Questi campioni sono stati immediatamente trasportati in laboratorio e trattati per la generazione di organoidi utilizzando i metodi descritti di seguito.
1. Preparazione dei supporti
- Preparazione completa dei media organoidi
- Preparare il terreno condizionato R-spondin 1/Noggin seguendo un rapporto precedentemente pubblicato7.
NOTA: Il mezzo condizionato da R-spondina-1/Noggin è un'alternativa più economica alle proteine ricombinanti disponibili in commercio. Le cellule HEK293T che secernono stabilmente R-spondina-1 e Noggin tramite trasduzione mediata da lentivirus sono state un generoso dono di Ron Bose, Washington University School of Medicine di St. Louis, e Anil Rustgi, New York-Presbyterian / Columbia University Irving Medical Center 8,9,10. Il mezzo commerciale condizionato potrebbe essere utilizzato come sostituto (vedi Tabella dei materiali).
- Preparare il terreno condizionato R-spondin 1/Noggin seguendo un rapporto precedentemente pubblicato7.
- Per ottenere il mezzo organoide completo, combinare il 10% di terreno condizionato R-spondina 1/Noggin, 50 ng/mL EGF, 10 ng/mL FGF-10, 10 ng/mL FGF2, 1x B27, 10 mmol/L nicotinamide, 1,25 mmol/L N-acetilcisteina, 1 μmol/L prostaglandina E2, 10 μmol/L SB202190, 500 nmol/L A83-01 e 10 μM inibitore ROCK (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: Il terreno può essere conservato a 4 °C per un massimo di 3 mesi. Questo mezzo è stato adattato da Hill et al.11. Le concentrazioni e gli ingredienti del mezzo sono gli stessi, con l'aggiunta di un inibitore ROCK. - Preparare il terreno base organoide combinando 500 ml di una formulazione avanzata di DMEM/F12 con 1% di penicillina-streptomicina, 1x dipeptide, L-alanil-L-glutammina e 1x HEPES (10 mM) (vedere Tabella dei materiali).
2. Raccolta di organoidi da ascite e liquido pleurico
NOTA: L'ascite e il liquido pleurico devono essere trattati il prima possibile per la migliore resa degli organoidi. Scongelare precedentemente il tampone di reazione BME, DNasi I e DNasi I (vedi Tabella dei materiali) mettendolo su ghiaccio fino a quando il contenuto non è liquefatto.
- Ottenere ascite e liquido pleurico da pazienti consenzienti al momento di interventi chirurgici o procedure di cura standard e trasportare a temperatura ambiente in un contenitore da viaggio al laboratorio.
NOTA: Tutta la lavorazione dell'ascite o del liquido pleurico deve essere eseguita in ambiente sterile. - Trasferire 50 ml di ascite o liquido pleurico in tubi conici da 50 ml (il numero di tubi dipende dal volume di ascite ottenuto). Centrifugare a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta Pasteur di vetro per aspirare con cura il surnatante.
- Continuare aggiungendo 50 ml di ascite o liquido pleurico al pellet precedentemente centrifugato e centrifugare nuovamente a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare con cura il surnatante con una pipetta Pasteur di vetro. Ripetere questo passaggio fino a quando tutta l'ascite o il liquido pleurico sono stati elaborati.
- Preparare una soluzione di DNasi I da 100 μg/mL combinando 1.000 μL di acqua priva di nucleasi, 100 μL di tampone di reazione DNasi I e 10 μL di DNasi I.
NOTA: Il trattamento con DNasi I applicato è sufficiente per effettuare una sospensione unicellulare indipendentemente dalla presenza di aggregati cellulari in alcuni campioni di pazienti12. - Risospendere ogni pellet cellulare in 1 mL di soluzione di 100 μg/mL di DNasi I. Aggiungere delicatamente la soluzione di DNasi I a goccia e lasciare incubare il tubo per 15 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Aggiungere almeno 1 mL di soluzione di DNasi I. Se 1 mL non è sufficiente per disturbare il pellet, aggiungere un altro 1 mL. - Dopo l'incubazione, aggiungere 25 ml di terreno base organoide (fase 1.3) alle cellule e invertire delicatamente per mescolare. Quindi, centrifugare a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione, aspirare con cura il surnatante con una pipetta Pasteur di vetro.
- Risospendere i pellet cellulari appena formati in 5 ml preriscaldati di 1x tampone di lisi dei globuli rossi (RBC) (vedere Tabella dei materiali). Impostare il vortice su 458 x g e vortice le soluzioni in ciascun tubo conico. Una volta che le soluzioni sono omogenee, utilizzare un pipetta sierologica per combinare il contenuto di tutti i tubi conici in un unico tubo conico da 50 ml.
- Incubare il tubo conico contenente la soluzione vortexata a temperatura ambiente per 5 min. Una volta completata l'incubazione, centrifugare a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C.
NOTA: Esaminare il pellet. Un pellet rosa/rosso indica la presenza di globuli rossi, che richiederebbe la ripetizione della fase tampone di lisi dei globuli rossi fino a quando il pellet non è più rosso. - Dopo la centrifugazione, aspirare con cura il surnatante con una pipetta Pasteur di vetro. Quindi, lavare il pellet con 10 ml di PBS, vortice la soluzione a 458 x g e centrifugare a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Se si forma un pellet a cellule grandi, aspirare il PBS usando una pipetta Pasteur di vetro e aggiungere 1 mL di base organoide (fase 1.3) sopra il pellet. Vortice la soluzione a 458 x g e trasferire 300-400 μL in una provetta da microcentrifuga. Centrifugare il tubo della microcentrifuga a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C.
NOTA: La porzione di pellet cellulare non inserita nel tubo della microcentrifuga può essere congelata per un uso futuro (500 μL di cellule a 1 mL di DMSO al 10% in FBS). Il pellet cellulare congelato può essere conservato per settimane a -80 °C e per anni se posto in azoto liquido13. - Aspirare con cautela il mezzo base organoide (punto 1.3) utilizzando una pipetta Pasteur in vetro e risospendere in BME (vedere Tabella dei materiali) utilizzando punte fredde.
NOTA: La quantità di BME si basa sulla dimensione del pellet. Si raccomanda di utilizzare il 25% di terreno base organoide (fase 1.3) con cellule risospese al 75% di BME. - Piastra 40 μL aliquote della soluzione di cella risospesa su una piastra a 6 pozzetti. Placcare fino a cinque aliquote per pozzetto (Figura 1).
- Posizionare immediatamente la piastra in un incubatore a 37 °C per 20 minuti per consentire al BME di solidificarsi. Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente 2 ml di mezzo organoide completo (fase 1.2) in ciascun pozzetto.
Figura 1: Placcatura di organoidi di cancro ovarico derivati da pazienti. Immagine rappresentativa della placcatura organoide. Le aliquote della miscela organoide sono accuratamente placcate, assicurando che non si formino bolle. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
3. Raccolta di organoidi dal tessuto
NOTA: Il tessuto deve essere lavorato il prima possibile per la migliore resa di organoidi.
- Raccogliere e trasportare il tumore sul ghiaccio in un contenitore da viaggio contenente PBS.
- Porre il campione su una capsula di coltura di tessuto di 10 cm (Figura 2). Usando un bisturi usa e getta, tritare il tessuto. Quindi, utilizzando l'estremità opaca di una siringa monouso, schiacciare il tessuto fino a creare una miscela omogenea.
- Usando una pinza, posizionare la miscela di tessuto omogeneo in un tubo di dissociazione. Per ogni 1-2 mL di tessuto omogeneizzato, aggiungere 7-8 mL di soluzione di collagenasi di tipo II 1 mg/mL (vedere Tabella dei materiali) in mezzo base organoide (fase 1.3) e 1 mL di soluzione di DNasi I. Vortice la soluzione a 458 x g.
NOTA: La quantità di tessuto determinerà la quantità di soluzione di collagenasi e il numero di tubi necessari. - Utilizzare la macchina di dissociazione (vedere Tabella dei materiali) per liquefare il tessuto mentre si trova nella soluzione di collagenasi. Eseguire il programma 37C_h_TDK3 (1 ora) fino a quando non è una sospensione a cella singola.
NOTA: il programma dovrà essere rieseguito se la miscela risultante non è omogenea (cioè se nella miscela sono ancora presenti pezzi di tessuto). Se il tessuto è digerito ma la soluzione è viscosa, diluire con un mezzo base organoide (punto 1.3). - Trasferire la miscela omogeneizzata in un nuovo tubo conico da 50 mL e aggiungere 20-40 mL di terreno base organoide (fase 1.3). Quindi, filtrare la soluzione attraverso un filtro cellulare da 100 μm in un tubo conico da 50 ml appena etichettato.
- Centrifugare la miscela filtrata a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C. Quindi, aspirare con cura il surnatante usando una pipetta Pasteur di vetro.
- Preparare una soluzione di DNasi I da 100 μg/mL combinando 1.000 μL di acqua priva di nucleasi, 100 μL di tampone di reazione DNasi I e 10 μL di DNasi I.
NOTA: Il trattamento con DNasi I applicato è sufficiente per effettuare una sospensione unicellulare indipendentemente dalla presenza di aggregati cellulari in alcuni campioni di pazienti12. - Risospendere le cellule in 1 mL di soluzione di 100 ug/mL DNasi I. Aggiungere delicatamente la soluzione di DNasi I a goccia e lasciare incubare il tubo per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo l'incubazione, aggiungere 25 ml di terreno base organoide (fase 1.3) alle cellule e invertire delicatamente per mescolare. Quindi, centrifugare a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione, aspirare con cura il surnatante con una pipetta Pasteur di vetro.
- Risospendere il pellet cellulare appena formato in 5 ml di tampone di lisi 1x RBC preriscaldato. Vortice le soluzioni in ciascun tubo conico a 458 x g.
- Incubare il tubo conico contenente il pellet cellulare risospeso nel tampone di lisi dei globuli rossi per 5 minuti. Una volta completata l'incubazione, centrifugare a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C.
NOTA: Esaminare il pellet. Un pellet rosa/rosso indica la presenza di globuli rossi, che richiederebbe la ripetizione della fase del tampone di lisi dei globuli rossi fino a quando il pellet appare bianco. - Dopo la centrifugazione, aspirare con cura il surnatante con una pipetta Pasteur di vetro. Quindi, lavare il pellet con 10 ml di PBS, vortice la soluzione a 458 x g e centrifugare a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Se si forma un pellet a cellule grandi, aspirare il PBS usando una pipetta Pasteur di vetro e aggiungere 1 mL di base organoide (fase 1.3) sopra il pellet. Vortice la soluzione a 458 x g e trasferire 300-400 μL in una provetta da microcentrifuga. Centrifugare a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C.
NOTA: La porzione di pellet cellulare non inserita nel tubo della microcentrifuga può essere congelata per un uso futuro (500 μL di cellule a 1 mL di DMSO al 10% in FBS) (fase 5.1). Il pellet cellulare congelato può essere conservato per settimane a -80 °C e per anni se posto in azoto liquido13. - Aspirare con cura il mezzo base organoide utilizzando una pipetta Pasteur di vetro e risospendere in BME utilizzando punte fredde.
NOTA: La quantità di BME si basa sulla dimensione del pellet. Si raccomanda di aggiungere il 25% di terreno base organoide (fase 1.3) con cellule risospese al 75% di BME. - Placcare la soluzione cellulare risospesa su una piastra a 6 pozzetti in aliquote da 40 μL. Impiattare fino a cinque aliquote per pozzetto.
- Posizionare immediatamente la piastra del pozzetto nell'incubatore per 20 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente 2 ml di mezzo organoide completo (fase 1.2) in ciascun pozzetto.
Figura 2: Tessuto tumorale prima della dissezione. Immagine rappresentativa del tessuto tumorale ottenuto per la generazione di organoidi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
4. Passaggio degli organoidi
NOTA: Se il campione è confluente, ogni pozzetto organoide può essere fatto passare settimanalmente in due nuovi pozzi.
- Utilizzando una pipetta da 1 mL, aggiungere 1 mL di terreno base organoide (punto 1.3) a ciascun pozzetto e pipettare il fluido su e giù direttamente sulle linguette organoidi per dissociarlo. Raccogliere tutto il mezzo contenente i pellet risospesi in un tubo conico da 15 ml.
- Centrifugare il tubo conico da 15 mL contenente la miscela a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C. Quindi, aspirare con cura il surnatante usando una pipetta Pasteur di vetro.
- Aggiungere 1 mL di enzima ricombinante privo di origine animale (vedi Tabella dei materiali) al pellet cellulare, vortice la soluzione a 458 x g e trasferire in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Lasciare incubare il tubo per 15 minuti a bagnomaria a 37 °C.
- Dopo l'incubazione, centrifugare a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C. Quindi, aspirare con cura il surnatante usando una pipetta Pasteur di vetro.
- Risospendere il pellet in BME.
NOTA: La quantità di BME si basa sulla dimensione del pellet. Si raccomanda di aggiungere il 25% di media base organoidi (fase 1.3) con cellule risospese al 75% di BME. - Placcare la soluzione di cella risospesa in una piastra a 6 pozzetti in aliquote da 40 μL. Impiattare fino a cinque aliquote per pozzetto. Una volta che tutte le aliquote sono state placcate, posizionare immediatamente la piastra del pozzetto nell'incubatrice per 20 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente 2 ml di mezzo organoide completo (fase 1.2) in ciascun pozzetto.
5. Congelamento e scongelamento degli organoidi
- Congelamento di organoidi
- Iniziare con i passaggi 4.1-4.4.
- Risospendere il pellet cellulare in 0,5-1 mL di terreno di congelamento della coltura cellulare di recupero (vedere Tabella dei materiali) e trasferire 1 mL a ciascun crioviale.
- Quindi, posizionare i crioviali in un contenitore riempito di isopropanolo a -80 °C per un massimo di 2 settimane prima di trasferirli in un serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine13.
- Scongelamento degli organoidi
- Prelevare i campioni dal serbatoio di azoto liquido e scongelarli a bagnomaria a 37 °C.
- Una volta scongelato, trasferire in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 1.650 x g per 5 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione, aspirare con cura il surnatante con una pipetta Pasteur di vetro.
- Risospendere il pellet in BME.
NOTA: La quantità di BME si basa sulla dimensione del pellet. Si raccomanda di aggiungere il 25% di media base organoidi (fase 1.3) con cellule risospese al 75% di BME. - Placcare la soluzione cellulare risospesa su una piastra a 6 pozzetti in aliquote da 40 μL. Posizionare fino a cinque aliquote per pozzetto.
- Posizionare immediatamente la piastra nell'incubatore per 20 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente 2 ml di mezzo organoide completo (fase 1.2) ai pozzetti.
6. Incorporamento e generazione di vetrini incorporati in paraffina fissati in formalina (FFPE) per valutare la composizione organoide
- Dopo aver coltivato gli organoidi per almeno 10 giorni per garantire dimensioni adeguate, rimuovere l'intero mezzo organoide dai pozzetti e aggiungere 1 ml di fissativo paraformaldeide al 2% (PFA). Incubare a temperatura ambiente per 5-10 min.
- Dopo l'incubazione, lavare le aliquote organoidi coltivate 3 volte per 5 minuti ogni volta con 1 mL di PBS.
- Rimuovere il PBS da ciascun pozzetto e aggiungere 1 ml di agar caldo al 2% in H2O deionizzato a ciascun pozzetto. Quando si aggiunge l'agar, sollevare le aliquote organoidi coltivate dal piatto usando una spatola.
NOTA: È importante non lasciare che l'agar si indurisca prima di sollevare le aliquote organoidi coltivate.- Lasciare che l'agar si solidifichi nel pozzetto a temperatura ambiente.
- Utilizzando una piccola spatola, liberare l'agar solidificato dal pozzetto e conservarlo in una cassetta per un massimo di 48 ore (vedi Tabella dei materiali) a 4 °C in etanolo al 70% fino alla lavorazione14.
- Incorporare i campioni nella paraffina 15, tagliare i vetrini a uno spessore di 5 μm e colorare i vetrini con la colorazione di ematossilina ed eosina (H & E, vedi Tabella dei materiali) utilizzando un protocollo standard15.
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Representative Results
Per generare PDO, i campioni sono stati digeriti meccanicamente ed enzimaticamente in sospensioni monocellulari. Le cellule sono state quindi risospese in BME e integrate con mezzi specificamente ingegnerizzati (Figura 3). Gli organoidi sono tipicamente stabiliti in un arco di tempo di 10 giorni, dopo di che dimostrano organoidi discreti in coltura (Figura 4).
Figura 3: Schema delle collezioni di pazienti formate in organoidi. Il tessuto del paziente, l'ascite o il liquido pleurico vengono digeriti meccanicamente o enzimaticamente. La sospensione unicellulare viene quindi placcata in BME, dove la coltura prolifera con l'aiuto di terreni di crescita specializzati su misura per HGSOC. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Immagini rappresentative di due organoidi unici di cancro ovarico derivati da pazienti dopo 7 giorni di crescita. Le immagini organoidi sono state scattate a 40x. La barra della scala a campo chiaro sull'immagine a sinistra è di 100 μm e l'immagine a destra è di 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Dal protocollo presentato, è stata prodotta una biobanca di 23 organoidi e coltivati per oltre 5 mesi con passaggio regolare. Le caratteristiche cliniche dei tumori di origine sono presentate nella Tabella 1. La maggior parte dei tumori era in stadio avanzato (100%), carcinoma sieroso di alto grado (92,9%) e naïve al trattamento (85,7%).
| N = 23 | |
| Età (anni) | 63,5 ± 9,7 |
| Tappa FIGO III IV In sospeso |
13 (56.5) 9 (39.2) 1 (4.3) |
| Istologia Sieroso di alto grado Carcinosarcoma sieroso di basso grado |
21 (92.9) 1 (7.1) 1 (4.3) |
| Mutazione BRCA Sì No |
1 (4.3) 22 (95.7) |
| Linee precedenti di chemioterapia 0 1-5 ≥5 |
20 (85.7) 0 2 (14.2) |
Tabella 1: Caratteristiche della biobanca DOP. La tabella contiene le caratteristiche specifiche degli organoidi generati utilizzando il presente protocollo. Queste caratteristiche includono l'età, lo stadio FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics), l'istologia, lo stato di mutazione BRCA (gene BReast CAncer) e le precedenti linee di chemioterapia.
Le colture organoidi possono essere valutate incorporando nell'agarosio e valutando con H & E (Figura 5).
Figura 5: Colorazione di ematossilina ed eosina della DOP. Immagine rappresentativa della colorazione H&E di un organoide di cancro ovarico generato da un campione di paziente. L'immagine è stata scattata a 40x e la barra della scala è di 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il cancro ovarico è estremamente mortale a causa del suo stadio avanzato alla diagnosi, così come lo sviluppo comune della resistenza alla chemioterapia. Molti progressi nella ricerca sul cancro ovarico sono stati fatti utilizzando linee cellulari tumorali e modelli PDX; Tuttavia, vi è un'evidente necessità di un modello in vitro più rappresentativo e conveniente. Le PDO hanno dimostrato di rappresentare accuratamente l'eterogeneità del tumore, il microambiente tumorale e le caratteristiche genomiche e trascrittomiche dei loro tumori primari e, quindi, sono modelli preclinici ideali per diversi approcci di ricerca, come l'implementazione di modelli organoidi nella terapia farmacologica16.
Il protocollo qui descritto è molto efficace e affidabile, come indicato dal tasso di successo del 97%. È importante sottolineare che il presente protocollo prevede passaggi critici ai quali occorre prestare particolare attenzione. In primo luogo, quando si raccolgono organoidi dal tessuto, è essenziale assicurarsi che il campione sia completamente omogeneizzato. Ciò potrebbe richiedere l'esecuzione del programma di dissociazione più di una volta, se necessario. Se il campione non è omogeneo, i restanti pezzi di tessuto possono compromettere la crescita organoide. In secondo luogo, poiché la temperatura di lavoro del BME è di 2-8 °C, è importante eseguire tutte le fasi che coinvolgono questo reagente sul ghiaccio per evitare la polimerizzazione. Inoltre, durante la risospensione e la placcatura con BME, è fondamentale evitare le bolle, poiché ciò rende instabili le aliquote organoidi placcate, causandone lo spostamento dalla piastra. Infine, il BME utilizzato in questo protocollo è stato generato dal tumore Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) e, pertanto, ha il potenziale per una composizione incoerente tra i lotti. Queste differenze possono influenzare la generazione e la crescita degli organoidi. Non esiste un modo specifico per superare questa limitazione in quanto gli autori non sono a conoscenza delle opzioni BME alternative17. La ricerca futura è necessaria per stabilire materiali alternativi per BME o scaffold 3D. Date tutte le considerazioni di cui sopra, è importante sottolineare che questi metodi dovrebbero essere adattati e testati per diversi ambienti e attrezzature di laboratorio.
Nonostante i progressi che gli organoidi possono fornire alla ricerca sul cancro ovarico, ci sono limitazioni all'implementazione di modelli organoidi. La generazione e la manutenzione degli organoidi sono processi lunghi e costosi. La quantità di tempo necessaria per la crescita degli organoidi consente l'introduzione della contaminazione. Inoltre, la variabilità della crescita richiede una supervisione costante per garantire che la quantità di mezzi disponibili sia sufficiente per lo sviluppo di organoidi e che la contaminazione non sia presente. Inoltre, la composizione cellulare degli organoidi è variabile. Le cellule immunitarie sono presenti inizialmente, ma di solito non persistono oltre il secondo passaggio. Questo può essere superato con l'integrazione di citochine nei media, ma è al di fuori dello scopo del nostro lavoro attuale. Le cellule stromali sembrano persistere attraverso il passaggio, ma i componenti dipendono fortemente dal campione iniziale18,19. Sono necessari ulteriori lavori per comprendere meglio i componenti cellulari esatti di ciascun tipo di cellula e la persistenza. La generazione di organoidi da pazienti sottoposti a diverse linee di chemioterapia è impegnativa e problematica. Sono necessari ulteriori studi per comprendere l'impatto della chemioterapia sulla generazione e lo sviluppo degli organoidi. Infine, nella nostra esperienza, il numero di organoidi generati da una determinata quantità di tessuto, ascite o liquido pleurico è imprevedibile. Ad esempio, la stessa quantità di tumore, ascite o liquido pleurico raccolto da due pazienti diversi si tradurrà in quantità diverse di organoidi. Ulteriori ricerche sono in corso per ottenere informazioni sui migliori tipi di cellule per la sopravvivenza e la vitalità degli organoidi.
Tuttavia, le PDO offrono opportunità uniche per la ricerca preclinica rispetto alle linee cellulari e ai modelli PDX. Mentre sono stati fatti progressi per quanto riguarda la diagnosi e il trattamento del cancro ovarico, c'è ancora molto lavoro da fare, e le DOP sono uno strumento speciale necessario per far progredire la ricerca sul cancro ovarico.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati per la guida di Ron Bose, MD, PhD, e l'assistenza di Barbara Blachut, MD, nello stabilire questo protocollo. Vorremmo anche riconoscere la Scuola di Medicina della Washington University nel Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia di St. Louis e la Divisione di Oncologia Ginecologica, il Dean's Scholar Program della Washington University e il Reproductive Scientist Development Program per il loro sostegno a questo progetto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| 10 mL Serological Pipet | |||
| 100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
| 37 °C water bath | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Centrifuge | |||
| Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Microcentrifuge | |||
| Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipette with Tips | |||
| p200 Pipette with Tips | |||
| Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Controller | |||
| Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| Tissue Culture Hood | |||
| Tissue Embedding Cassette | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
References
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