Summary
Pasientavledede organoider (PUD) er en tredimensjonal (3D) kultur som kan etterligne tumormiljøet in vitro. I høygradig serøs eggstokkreft representerer PUD en modell for å studere nye biomarkører og terapi.
Abstract
Organoider er 3D-dynamiske tumormodeller som kan dyrkes vellykket fra pasientavledet ovarietumorvev, ascites eller pleuravæske og hjelpe til med oppdagelsen av nye terapier og prediktive biomarkører for eggstokkreft. Disse modellene rekapitulerer klonal heterogenitet, tumormikromiljøet og cellecelle- og cellematriseinteraksjoner. I tillegg har de vist seg å matche den primære svulsten morfologisk, cytologisk, immunhistokjemisk og genetisk. Dermed letter organoider forskning på tumorceller og tumormikromiljøet og er overlegne cellelinjer. Denne protokollen beskriver forskjellige metoder for å generere pasientavledede eggstokkreftorganoider fra pasienttumorer, ascites og pleuravæskeprøver med en høyere enn 97% suksessrate. Pasientprøvene separeres i cellulære suspensjoner ved både mekanisk og enzymatisk fordøyelse. Cellene blir deretter belagt ved hjelp av et kjellermembranekstrakt (BME) og støttes med optimaliserte vekstmedier som inneholder kosttilskudd som er spesifikke for dyrking av høyverdig serøs eggstokkreft (HGSOC). Etter å ha dannet innledende organoider, kan PUDene opprettholde langsiktig kultur, inkludert passasje for utvidelse for påfølgende eksperimenter.
Introduction
I 2021 ble omtrent 21,410 kvinner i USA nylig diagnostisert med epitelial eggstokkreft, og 12,940 kvinner døde av denne sykdommen1. Selv om det er gjort tilstrekkelige fremskritt innen kirurgi og kjemoterapi, utvikler over 70% av pasientene med avansert sykdom kjemoterapeutisk resistens og dør innen 5 år etter diagnose 2,3. Dermed er det behov for nye strategier for å behandle denne dødelige sykdommen og representative, pålitelige modeller for preklinisk forskning.
Kreftcellelinjer og pasientavledede xenotransplantater (PDX) opprettet fra primære eggstokktumorer er de viktigste instrumentene som brukes i eggstokkreftforskning. En stor fordel med kreftcellelinjer er deres raske ekspansjon. Imidlertid resulterer deres kontinuerlige kultur i fenotypiske og genotypiske endringer som får kreftcellelinjene til å avvike fra den opprinnelige primære krefttumorprøven. På grunn av de eksisterende forskjellene mellom kreftcellelinjen og primærtumoren, kan legemiddelanalyser som har positive effekter i cellelinjer ikke ha de samme effektene i kliniske studier2. For å overvinne disse begrensningene brukes PDX-modeller. Disse modellene er opprettet ved å implantere ferskt eggstokkreftvev i immundefekte mus. Som de er in vivo-modeller , ligner de mer nøyaktig menneskelige biologiske egenskaper og er i sin tur mer prediktive for legemiddelutfall. Disse modellene har imidlertid også betydelige begrensninger, inkludert kostnadene, tiden og ressursene som trengs for å generere dem4.
PUD tilbyr en alternativ modell for preklinisk forskning som overvinner begrensningene til både kreftcellelinjer og PDX-modeller. PUD rekapitulerer pasientens tumor- og tumormikromiljø og gir dermed en in vitro håndterbar modell ideell for preklinisk forskning 2,3,5. Disse 3D-modellene har selvorganiseringsfunksjoner som modellerer primærtumoren, som er en funksjon som deres todimensjonale (2D) cellelinje-kolleger ikke har. Videre har disse modellene vist seg å genetisk og funksjonelt representere deres foreldretumorer og er dermed pålitelige modeller for å studere nye terapier og biologiske prosesser. Kort sagt, de tilbyr langsiktige utvidelses- og lagringsmuligheter som ligner på cellelinjer, men omfatter også mikromiljøet og celle-celle-interaksjonene som ligger i musemodeller 4,6.
Den nåværende protokollen beskriver opprettelsen av PUD fra pasientavledede svulster, ascites og pleuravæskeprøver med en høyere enn 97% suksessrate. PUD-kulturene kan deretter utvides i flere generasjoner og brukes til å teste følsomhet for legemiddelbehandling og prediktive biomarkører. Denne metoden representerer en teknikk som kan brukes til å tilpasse behandlinger basert på terapeutiske responser fra PUD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle humane vevsprøver samlet for forskning ble oppnådd i henhold til Institutional Review Board (IRB) -godkjent protokoll. Protokollene som er skissert nedenfor ble utført i et sterilt humant vevskulturmiljø. Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra mennesker. Kvalifiserte pasienter måtte ha en diagnose eller antatt diagnose av eggstokkreft, være villige og i stand til å signere informert samtykke, og være minst 18 år. Tumorvev (malign primærtumor eller metastaserende steder), ascites og pleuravæske ble innhentet fra samtykkende pasienter på tidspunktet for prosedyren. Disse prøvene ble umiddelbart transportert til laboratoriet og behandlet for organoidgenerering ved hjelp av metodene som er skissert nedenfor.
1. Media forberedelse
- Komplett organoid media forberedelse
- Forbered R-spondin 1/Noggin betinget medium etter en tidligere publisert rapport7.
MERK: R-spondin-1 / Noggin betinget medium er et rimeligere alternativ til kommersielt tilgjengelige rekombinante proteiner. HEK293T-celler som stabilt utskiller R-spondin-1 og Noggin via lentivirusmediert transduksjon var en sjenerøs gave fra Ron Bose, Washington University School of Medicine i St. Louis, og Anil Rustgi, New York-Presbyterian/Columbia University Irving Medical Center 8,9,10. Kommersielt betinget medium kan brukes som erstatning (se Materialfortegnelse).
- Forbered R-spondin 1/Noggin betinget medium etter en tidligere publisert rapport7.
- For å lage det komplette organoidmediet, kombiner 10% R-spondin 1 / Noggin betinget medium, 50 ng / ml EGF, 10 ng / ml FGF-10, 10 ng / ml FGF2, 1x B27, 10 mmol / L nikotinamid, 1,25 mmol / L N-acetylcystein, 1 μmol / L prostaglandin E2, 10 μmol / L SB202190, 500 nmol / L A83-01 og 10 μM ROCK-hemmer (se materialtabell).
MERK: Mediet kan oppbevares ved 4 °C i opptil 3 måneder. Dette mediet ble tilpasset fra Hill et al.11. Konsentrasjonene og ingrediensene i mediet er de samme, med tilsetning av en ROCK-hemmer. - Forbered organoid basemedium ved å kombinere 500 ml av en avansert formulering av DMEM / F12 med 1% penicillin-streptomycin, 1x dipeptid, L-alanyl-L-glutamin og 1x HEPES (10 mM) (se materialtabell).
2. Høsting av organoider fra ascites og pleuravæske
MERK: Ascites og pleuravæske må behandles så snart som mulig for best mulig utbytte av organoider. Tine tidligere BME, DNase I og DNase I reaksjonsbuffer (se materialfortegnelse) ved å legge den på is til innholdet er flytende.
- Få ascites og pleuravæske fra samtykkende pasienter på tidspunktet for standard omsorg operasjoner eller prosedyrer, og transport ved romtemperatur i en reisebeholder til laboratoriet.
MERK: Alle ascites eller pleuravæskebehandling skal utføres i et sterilt miljø. - Overfør 50 ml ascites eller pleuravæske til 50 ml koniske rør (antall rør avhenger av volumet av ascites oppnådd). Sentrifuge ved 1 650 x g i 5 minutter ved 4 °C. Etter sentrifugering, bruk en glass Pasteur-pipette for å aspirere supernatanten forsiktig.
- Fortsett med å tilsette 50 ml ascites eller pleuravæske til den tidligere sentrifugerte pelleten, og sentrifuger igjen ved 1,650 x g i 5 minutter ved 4 °C. Aspirer supernatanten forsiktig med en Pasteur-pipette i glass. Gjenta dette trinnet til alle ascites eller pleuravæske har blitt behandlet.
- Forbered en 100 μg / ml DNase I-løsning ved å kombinere 1000 μL nukleasefritt vann, 100 μL DNase I-reaksjonsbuffer og 10 μL DNase I.
MERK: DNase I-behandlingen som påføres, er tilstrekkelig til å lage en enkeltcellesuspensjon uavhengig av tilstedeværelsen av celleaggregater i noen pasientprøver12. - Resuspender hver cellepellet i 1 ml 100 μg/ml DNase I-oppløsning. Tilsett forsiktig DNase I-løsningen dråpevis, og la røret ruge i 15 minutter ved romtemperatur.
MERK: Legg til minimum 1 ml DNase I-løsning. Hvis 1 ml ikke er nok til å forstyrre pelleten, tilsett ytterligere 1 ml. - Etter inkubering, tilsett 25 ml organoid basemedium (trinn 1,3) til cellene, og inverter forsiktig for å blande. Deretter sentrifuge ved 1 650 x g i 5 min ved 4 °C. Etter sentrifugering, aspirer supernatanten forsiktig med en Pasteur-pipette av glass.
- Resuspender de nydannede cellepellets i forvarmet 5 ml 1x røde blodlegemer (RBC) lysebuffer (se materialtabell). Sett virvelen til 458 x g, og virv løsningene i hvert koniske rør. Når løsningene er homogene, bruk en serologisk pipett for å kombinere innholdet i alle koniske rør i et enkelt 50 ml konisk rør.
- Inkuber det koniske røret som inneholder den virvelbaserte løsningen ved romtemperatur i 5 minutter. Når inkubasjonen er fullført, sentrifuger ved 1 650 x g i 5 minutter ved 4 °C.
MERK: Undersøk pelleten. En rosa / rød pellet indikerer tilstedeværelsen av RBC, noe som vil kreve at RBC-lysisbuffertrinnet gjentas til pelleten ikke lenger er rød. - Etter sentrifugering, aspirer supernatanten forsiktig med en Pasteur-pipette av glass. Vask deretter pelleten med 10 ml PBS, virvle oppløsningen ved 458 x g og sentrifuger ved 1,650 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Hvis en stor cellepellet dannes, aspirer PBS ved hjelp av en glass Pasteur-pipette, og tilsett 1 ml organoid basemedium (trinn 1.3) på toppen av pelleten. Vortex løsningen ved 458 x g, og overfør 300-400 μL til et mikrosentrifugerør. Sentrifuger mikrosentrifugerøret ved 1 650 x g i 5 minutter ved 4 °C.
MERK: Den delen av cellepelleten som ikke er plassert i mikrosentrifugerøret, kan fryses ned for fremtidig bruk (500 μL celler til 1 ml 10% DMSO i FBS). Den frosne cellepelleten kan lagres i uker ved -80 °C og i mange år hvis den plasseres i flytende nitrogen13. - Aspirer det organoide basemediet forsiktig (trinn 1.3) ved hjelp av en Pasteur-pipette av glass, og resuspender i BME (se materialfortegnelse) ved hjelp av kalde tupper.
MERK: Mengden BME er basert på størrelsen på pelleten. Det anbefales å bruke 25% organoid basemedium (trinn 1.3) med resuspenderte celler til 75% BME. - Plate 40 μL alikoter av den resuspenderte celleoppløsningen på en 6-brønnsplate. Plate opptil fem alikoter per brønn (figur 1).
- Plasser platen umiddelbart i en 37 °C inkubator i 20 minutter for å la BME stivne. Etter inkubering, tilsett forsiktig 2 ml komplett organoid medium (trinn 1,2) i hver brønn.
Figur 1 Plettering av pasientavledede eggstokkreftorganoider. Representativt bilde av organoid plating. Aliquots av organoidblandingen er nøye belagt, slik at ingen bobler dannes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Høsting av organoider fra vev
MERK: Vev må behandles så snart som mulig for best mulig utbytte av organoider.
- Samle og transporter svulsten på is i en reisebeholder som inneholder PBS.
- Legg prøven på et 10 cm vevskulturfat (figur 2). Bruk en engangs skalpell, hakk vevet. Deretter knuser du vevet ved hjelp av den kjedelige enden av en engangssprøyte til en homogen blanding er opprettet.
- Bruk tang, plasser den homogene vevsblandingen i et dissosiasjonsrør. For hver 1-2 ml homogenisert vev, tilsett 7-8 ml 1 mg / ml type II kollagenaseoppløsning (se materialtabell) i organoid basemedium (trinn 1,3) og 1 ml DNase I-løsning. Vortex løsningen ved 458 x g.
MERK: Mengden vev vil bestemme mengden kollagenaseoppløsning og antall rør som trengs. - Bruk dissosiasjonsmaskinen (se Materialfortegnelse) til å gjøre vevet flytende mens det er i kollagenaseoppløsningen. Kjør programmet 37C_h_TDK3 (1 time) til det er en encelles suspensjon.
MERK: Programmet må kjøres på nytt hvis den resulterende blandingen ikke er homogen (dvs. hvis vevstykker fortsatt er tilstede i blandingen). Hvis vevet fordøyes, men oppløsningen er tyktflytende, fortynnes med organoid basemedium (trinn 1.3). - Overfør den homogeniserte blandingen til et nytt 50 ml konisk rør, og tilsett 20-40 ml organoid basemedium (trinn 1,3). Filtrer deretter løsningen gjennom en 100 μm cellesil i et nylig merket 50 ml konisk rør.
- Sentrifuger den filtrerte blandingen ved 1 650 x g i 5 minutter ved 4 °C. Deretter aspirerer du supernatanten forsiktig med en Pasteur-pipette i glass.
- Forbered en 100 μg / ml DNase I-løsning ved å kombinere 1000 μL nukleasefritt vann, 100 μL DNase I-reaksjonsbuffer og 10 μL DNase I.
MERK: DNase I-behandlingen som påføres, er tilstrekkelig til å lage en enkeltcellesuspensjon uavhengig av tilstedeværelsen av celleaggregater i noen pasientprøver12. - Resuspender cellene i 1 ml 100 ug / ml DNase I-løsning. Tilsett forsiktig DNase I-løsningen dråpevis, og la røret ruge i 15 minutter ved romtemperatur.
- Etter inkubering, tilsett 25 ml organoid basemedium (trinn 1,3) til cellene, og inverter forsiktig for å blande. Deretter sentrifuge ved 1 650 x g i 5 min ved 4 °C. Etter sentrifugering, aspirer supernatanten forsiktig med en Pasteur-pipette av glass.
- Resuspender den nydannede cellepelleten i 5 ml forvarmet 1x RBC lysisbuffer. Vortex løsningene i hvert konisk rør ved 458 x g.
- Inkuber det koniske røret som inneholder cellepelleten resuspendert i RBC-lysebufferen i 5 minutter. Når inkubasjonen er fullført, sentrifuge ved 1,650 x g i 5 minutter ved 4 ° C.
MERK: Undersøk pelleten. En rosa / rød pellet indikerer tilstedeværelsen av RBC, noe som vil kreve at RBC-lysisbuffertrinnet gjentas til pelleten ser hvit ut. - Etter sentrifugering, aspirer supernatanten forsiktig med en Pasteur-pipette av glass. Vask deretter pelleten med 10 ml PBS, virvle oppløsningen ved 458 x g og sentrifuger ved 1,650 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Hvis en stor cellepellet dannes, aspirer PBS ved hjelp av en glass Pasteur-pipette, og tilsett 1 ml organoid basemedium (trinn 1.3) på toppen av pelleten. Vortex løsningen ved 458 x g, og overfør 300-400 μL til et mikrosentrifugerør. Sentrifuge ved 1 650 x g i 5 minutter ved 4 °C.
MERK: Den delen av cellepelleten som ikke er plassert i mikrosentrifugerøret, kan fryses ned for fremtidig bruk (500 μL celler til 1 ml 10% DMSO i FBS) (trinn 5.1). Den frosne cellepelleten kan lagres i uker ved -80 °C og i mange år hvis den plasseres i flytende nitrogen13. - Aspirer forsiktig organoidbasemediet ved hjelp av en glasspasteurpipette, og resuspender i BME ved hjelp av kalde tips.
MERK: Mengden BME er basert på størrelsen på pelleten. Det anbefales å legge til 25 % organoid basemedium (trinn 1,3) med resuspenderte celler til 75 % BME. - Plate den resuspenderte celleoppløsningen på en 6-brønnsplate i 40 μL alikoter. Plate opptil fem alikoter per brønn.
- Plasser brønnplaten umiddelbart i inkubatoren i 20 minutter. Etter inkubering, tilsett forsiktig 2 ml komplett organoid medium (trinn 1,2) i hver brønn.
Figur 2 Tumorvev før disseksjon. Representativt bilde av tumorvev oppnådd for organoid generasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Passasje av organoider
MERK: Hvis prøven er sammenflytende, kan hver organoidbrønn sendes ukentlig til to nye brønner.
- Bruk en 1 ml pipette, tilsett 1 ml organoid basemedium (trinn 1,3) til hver brønn, og pipetter mediet opp og ned direkte på organoidflikene for å dissosiere det. Samle alt mediet som inneholder de resuspenderte pellets i et 15 ml konisk rør.
- Sentrifuge det 15 ml koniske røret som inneholder blandingen ved 1 650 x g i 5 minutter ved 4 °C. Deretter aspirerer du supernatanten forsiktig med en Pasteur-pipette i glass.
- Tilsett 1 ml rekombinant enzym av animalsk opprinnelse (se materialfortegnelse) til cellepelleten, virvle oppløsningen ved 458 x g og overfør til et mikrosentrifugerør på 1,5 ml. La tuben ruge i 15 minutter i et vannbad på 37 °C.
- Etter inkubering, sentrifuge ved 1 650 x g i 5 minutter ved 4 °C. Deretter aspirerer du supernatanten forsiktig med en Pasteur-pipette i glass.
- Heng pelleten opp igjen i BME.
MERK: Mengden BME er basert på størrelsen på pelleten. Det anbefales å legge til 25 % organoid basemedia (trinn 1,3) med resuspenderte celler til 75 % BME. - Plate den resuspenderte celleoppløsningen i en 6-brønnsplate i 40 μL alikoter. Plate opptil fem alikoter per brønn. Når alle alikotene er belagt, plasser brønnplaten umiddelbart i inkubatoren i 20 minutter. Etter inkubering, tilsett forsiktig 2 ml komplett organoid medium (trinn 1,2) i hver brønn.
5. Frysing og tining av organoider
- Frysing av organoider
- Begynn med trinn 4.1-4.4.
- Resuspender cellepelleten i 0,5-1 ml frysemedium for gjenopprettingscellekultur (se materialfortegnelse), og overfør 1 ml til hver kryovial.
- Legg deretter kryovialene i en isopropanolfylt beholder ved -80 °C i opptil 2 uker før de overføres til en tank med flytende nitrogen for langtidsoppbevaring13.
- Tining av organoider
- Fjern prøvene fra tanken med flytende nitrogen, og tine ved 37 °C vannbad.
- Når det er tint, overfør til et 15 ml konisk rør og sentrifuge ved 1,650 x g i 5 minutter ved 4 °C. Etter sentrifugering, aspirer supernatanten forsiktig med en Pasteur-pipette av glass.
- Heng pelleten opp igjen i BME.
MERK: Mengden BME er basert på størrelsen på pelleten. Det anbefales å legge til 25 % organoid basemedia (trinn 1,3) med resuspenderte celler til 75 % BME. - Plate den resuspenderte celleoppløsningen på en 6-brønnsplate i 40 μL alikoter. Plasser opptil fem alikoter per brønn.
- Legg platen umiddelbart i inkubatoren i 20 minutter. Etter inkubering, tilsett forsiktig 2 ml komplett organoid medium (trinn 1,2) til brønnene.
6. Innebygging og generering av formalinfaste parafin-innebygde (FFPE) lysbilder for å evaluere organoidsammensetningen
- Etter dyrking av organoider i minst 10 dager for å sikre tilstrekkelig størrelse, fjern hele organoidmediet fra brønnene og tilsett 1 ml 2% paraformaldehydfiksativ (PFA). Inkuber ved romtemperatur i 5-10 min.
- Etter inkubering, vask de dyrkede organoidalikotene 3x i 5 minutter hver gang med 1 ml PBS.
- Fjern PBS fra hver brønn, og tilsett 1 ml varm 2% agar i avionisert H2O til hver brønn. Når du legger til agar, løft de dyrkede organoidalikotene fra platen ved hjelp av en slikkepott.
MERK: Det er viktig å ikke la agar herde før du løfter de dyrkede organoide alikotene.- La agar størkne i brønnen ved romtemperatur.
- Bruk en liten slikkepott til å frigjøre den størknede agaren fra brønnen, og oppbevar den i en kassett i opptil 48 timer (se materialfortegnelse) ved 4 °C i 70 % etanol til behandling14.
- Legg prøvene i parafin 15, klipp lysbildene til en tykkelse på 5 μm, og farg lysbildene med hematoksylin og eosin (H&E, se materialfortegnelse) farging ved hjelp av en standardprotokoll15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å generere PUD ble prøvene fordøyd mekanisk og enzymatisk til encellede suspensjoner. Cellene ble deretter resuspendert i BME og supplert med spesifikt konstruerte medier (figur 3). Organoider etableres typisk over en tidsramme på 10 dager, hvoretter de påviser diskrete organoider i kultur (figur 4).
Figur 3 Skjematisk fremstilling av pasientsamlinger formet til organoider. Pasientvev, ascites eller pleuravæske fordøyes mekanisk eller enzymatisk. Encellesuspensjonen blir deretter belagt i BME, hvor kulturen sprer seg ved hjelp av spesialiserte vekstmedier skreddersydd for HGSOC. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative bilder av to unike pasientavledede eggstokkreftorganoider etter 7 dagers vekst. Organoidbildene ble tatt ved 40x. Brightfield-skalalinjen på venstre bilde er 100 μm og på høyre bilde er 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Fra protokollen som ble presentert, ble en biobank med 23 organoider produsert og dyrket i over 5 måneder med regelmessig passasje. De kliniske karakteristika for opprinnelsessvulstene er presentert i tabell 1. De fleste svulstene var avansert stadium (100 %), høygradig serøs karsinom (92,9 %) og behandlingsnaivt (85,7 %).
| N = 23 | |
| Alder (år) | 63,5 ± 9,7 |
| FIGO-etappen III IV Ventende |
13 (56.5) 9 (39.2) 1 (4.3) |
| Histologi Høyverdig serøs Karsinosarkom Lavgradig serøs |
21 (92.9) 1 (7.1) 1 (4.3) |
| BRCA-mutasjon Ja Nei |
1 (4.3) 22 (95.7) |
| Tidligere linjer med kjemoterapi 0 1-5 ≥5 |
20 (85.7) 0 2 (14.2) |
Tabell 1: Egenskaper ved PUD-biobank. Tabellen inneholder de spesifikke egenskapene til organoider generert ved hjelp av denne protokollen. Disse egenskapene inkluderer alder, FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics) stadium, histologi, BRCA (BReast CAncer gen) mutasjonsstatus og tidligere linjer med kjemoterapi.
Organoide kulturer kan evalueres ved å legge inn i agarose og evaluere med H&E (figur 5).
Figur 5: Hematoksylin- og eosinfarging av PUD. Representativt bilde av H&E-farging av en eggstokkreftorganoid generert fra en pasientprøve. Bildet ble tatt på 40x, og skalaen bar er 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eggstokkreft er ekstremt dødelig på grunn av sitt avanserte stadium ved diagnose, samt den vanlige utviklingen av kjemoterapiresistens. Mange fremskritt innen eggstokkreftforskning har blitt gjort ved å bruke kreftcellelinjer og PDX-modeller; Det er imidlertid et åpenbart behov for en mer representativ og rimelig in vitro-modell . PUD har vist seg å nøyaktig representere tumorheterogeniteten, tumormikromiljøet og de genomiske og transkriptomiske egenskapene til deres primære svulster, og er dermed ideelle prekliniske modeller for ulike forskningsmetoder, for eksempel implementering av organoidmodeller i medisinering16.
Protokollen beskrevet her er svært effektiv og pålitelig, som indikert av 97% suksessrate. Det er viktig å understreke at denne protokollen har kritiske skritt som det bør tas nøye hensyn til. For det første, når du høster organoider fra vev, er det viktig å sikre at prøven er fullstendig homogenisert. Dette kan kreve å kjøre dissosiasjonsprogrammet mer enn en gang om nødvendig. Hvis prøven ikke er homogen, kan de resterende vevsbitene kompromittere organoidveksten. For det andre, siden BMEs arbeidstemperatur er 2-8 °C, er det viktig å utføre alle trinnene som involverer dette reagenset på is for å unngå polymerisering. I tillegg, når du resuspenderer og plater med BME, er det avgjørende å unngå bobler, da dette gjør de belagte organoidalikotene ustabile, noe som får dem til å løsne fra platen. Til slutt ble BME brukt i denne protokollen generert fra Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) tumor og har derfor potensial for inkonsekvent sammensetning mellom batchene. Disse forskjellene kan påvirke organoidgenerering og vekst. Det er ingen spesifikk måte å overvinne denne begrensningen på, da forfatterne ikke er klar over alternative BME-alternativer17. Fremtidig forskning er nødvendig for å etablere alternative materialer for BME eller 3D-stillas. Gitt alle de ovennevnte hensynene, er det viktig å understreke at disse metodene skal tilpasses og testes for ulike laboratorieinnstillinger og utstyr.
Til tross for fremskrittene som organoider kan gi til eggstokkreftforskning, er det begrensninger for implementeringen av organoide modeller. Organoidgenerering og vedlikehold er både langvarige og kostbare prosesser. Tiden som kreves for organoid vekst gjør det mulig å introdusere forurensning. Videre krever vekstvariabilitet konstant tilsyn for å sikre at mengden tilgjengelige medier er tilstrekkelig for organoidutvikling og at forurensning ikke er tilstede. I tillegg er den cellulære sammensetningen av organoider variabel. Immunceller er til stede i utgangspunktet, men vanligvis ikke vedvarer forbi den andre passasjen. Dette kan overvinnes med cytokintilskudd i media, men er utenfor omfanget av vårt nåværende arbeid. Stromale celler ser ut til å vedvare gjennom passering, men komponentene er svært avhengige av den første prøven18,19. Videre arbeid er nødvendig for å bedre forstå hver celletypes eksakte cellulære komponenter og utholdenhet. Generering av organoider fra pasienter som gjennomgår flere kjemoterapilinjer er utfordrende og problematisk. Videre studier er nødvendige for å forstå virkningen av kjemoterapi på organoid generering og utvikling. Til slutt, etter vår erfaring, er antall organoider generert fra en spesifisert mengde vev, ascites eller pleuravæske uforutsigbar. For eksempel vil samme mengde tumor, ascites eller pleuravæske samlet fra to forskjellige pasienter resultere i forskjellige mengder organoider. Videre forskning utføres for å få innsikt i de beste celletyper for organoid overlevelse og levedyktighet.
Likevel gir PUD unike muligheter for preklinisk forskning sammenlignet med cellelinjer og PDX-modeller. Mens det er gjort fremskritt når det gjelder diagnostisering og behandling av eggstokkreft, er det fortsatt betydelig arbeid å gjøre, og PUD er et spesielt verktøy som er nødvendig for å fremme eggstokkreftforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for veiledningen fra Ron Bose, MD, PhD, og hjelpen fra Barbara Blachut, MD, i etableringen av denne protokollen. Vi ønsker også å anerkjenne Washington University's School of Medicine i St. Louis Department of Obstetrics and Gynecology og Division of Gynecologic Oncology, Washington University's Dean's Scholar Program, og Reproductive Scientist Development Program for deres støtte til dette prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| 10 mL Serological Pipet | |||
| 100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
| 37 °C water bath | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Centrifuge | |||
| Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Microcentrifuge | |||
| Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipette with Tips | |||
| p200 Pipette with Tips | |||
| Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Controller | |||
| Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| Tissue Culture Hood | |||
| Tissue Embedding Cassette | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Drost, J., Clevers, H.
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment. Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).
- Yang, J., et al. Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).
- Yang, H., et al. Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment. Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Madison, B. B., et al. Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2. PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Murray, E., et al. HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Passarelli, M. C., et al. Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics. Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Stumm, M. M., et al. Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH). American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L.
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10, 12581 (2020).
- Mead, B. E., et al. Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation. Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).
