Summary
Hasta kaynaklı organoidler (PDO), tümör ortamını in vitro olarak taklit edebilen üç boyutlu (3D) bir kültürdür. Yüksek dereceli seröz over kanserinde, PDO'lar yeni biyobelirteçleri ve terapötikleri incelemek için bir model oluşturur.
Abstract
Organoidler, hasta kaynaklı yumurtalık tümör dokusundan, asitlerinden veya plevral sıvıdan başarıyla yetiştirilebilen ve yumurtalık kanseri için yeni terapötiklerin ve prediktif biyobelirteçlerin keşfine yardımcı olan 3D dinamik tümör modelleridir. Bu modeller klonal heterojenliği, tümör mikroçevresini ve hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini özetler. Ek olarak, primer tümörü morfolojik, sitolojik, immünohistokimyasal ve genetik olarak eşleştirdikleri gösterilmiştir. Böylece, organoidler tümör hücreleri ve tümör mikroçevresi üzerinde araştırmayı kolaylaştırır ve hücre hatlarından üstündür. Mevcut protokol, %97'den daha yüksek başarı oranına sahip hasta tümörleri, asitler ve plevral sıvı örneklerinden hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidleri üretmek için farklı yöntemler tanımlamaktadır. Hasta örnekleri hem mekanik hem de enzimatik sindirim ile hücresel süspansiyonlara ayrılır. Hücreler daha sonra bir bazal membran ekstresi (BME) kullanılarak kaplanır ve yüksek dereceli seröz yumurtalık kanserinin (HGSOC) kültürlenmesine özgü takviyeler içeren optimize edilmiş büyüme ortamı ile desteklenir. İlk organoidleri oluşturduktan sonra, PDO'lar sonraki deneyler için genişleme için pasaj da dahil olmak üzere uzun vadeli kültürü sürdürebilir.
Introduction
2021 yılında, Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık 21.410 kadına yeni epitel yumurtalık kanseri teşhisi kondu ve 12.940 kadın bu hastalıktan öldü1. Cerrahi ve kemoterapide yeterli ilerlemeler kaydedilmesine rağmen, ilerlemiş hastalığı olan hastaların %70'inden fazlası kemoterapötik direnç geliştirir ve tanıdan sonraki 5 yıl içinde ölür 2,3. Bu nedenle, bu ölümcül hastalığı tedavi etmek için yeni stratejilere ve klinik öncesi araştırmalar için temsili, güvenilir modellere acilen ihtiyaç duyulmaktadır.
Kanser hücre hatları ve primer over tümörlerinden oluşturulan hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX), yumurtalık kanseri araştırmalarında kullanılan başlıca araçlardır. Kanser hücre hatlarının en büyük avantajı, hızlı genişlemeleridir. Bununla birlikte, sürekli kültürleri, kanser hücresi hatlarının orijinal birincil kanser tümör örneğinden sapmasına neden olan fenotipik ve genotipik değişikliklerle sonuçlanır. Kanser hücre hattı ile primer tümör arasındaki mevcut farklılıklar nedeniyle, hücre hatlarında olumlu etkileri olan ilaç tahlilleri klinik çalışmalarda aynı etkilere sahip olamamaktadır2. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için PDX modelleri kullanılır. Bu modeller, taze yumurtalık kanseri dokusunun immün yetmezlikli farelere implante edilmesiyle oluşturulur. İn vivo modeller oldukları için, insan biyolojik özelliklerine daha doğru bir şekilde benzerler ve sırayla ilaç sonuçlarının daha öngörücüsüdürler. Bununla birlikte, bu modellerin bunları oluşturmak için gereken maliyet, zaman ve kaynaklar dahil olmak üzere önemli sınırlamaları da vardır4.
PDO'lar, hem kanser hücre hatlarının hem de PDX modellerinin sınırlamalarının üstesinden gelen klinik öncesi araştırmalar için alternatif bir model sunar. PDO'lar hastanın tümörünü ve tümör mikroçevresini özetler ve böylece klinik öncesi araştırmalar için ideal olan in vitro izlenebilir bir model sağlar 2,3,5. Bu 3D modeller, iki boyutlu (2D) hücre hattı muadillerinin sahip olmadığı bir özellik olan birincil tümörü modelleyen kendi kendine organizasyon yeteneklerine sahiptir. Ayrıca, bu modellerin genetik ve işlevsel olarak ebeveyn tümörlerini temsil ettiği gösterilmiştir ve bu nedenle, yeni terapötikleri ve biyolojik süreçleri incelemek için güvenilir modellerdir. Kısacası, hücre hatlarına benzer uzun vadeli genişleme ve depolama yetenekleri sunarlar, ancak aynı zamanda fare modellerine özgü mikro ortamı ve hücre-hücre etkileşimlerini de kapsarlar 4,6.
Mevcut protokol, %97'den daha yüksek başarı oranına sahip hasta kaynaklı tümörler, asitler ve plevral sıvı örneklerinden PDO'ların oluşturulmasını açıklamaktadır. PDO kültürleri daha sonra birden fazla nesil boyunca genişletilebilir ve ilaç tedavisi duyarlılığını ve prediktif biyobelirteçleri test etmek için kullanılabilir. Bu yöntem, PDO'ların terapötik yanıtlarına dayanarak tedavileri kişiselleştirmek için kullanılabilecek bir tekniği temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Araştırma için toplanan tüm insan dokusu örnekleri, Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onaylı protokole göre elde edilmiştir. Aşağıda özetlenen protokoller steril bir insan doku kültürü ortamında gerçekleştirilmiştir. İnsan deneklerden bilgilendirilmiş yazılı onam alındı. Uygun hastaların yumurtalık kanseri tanısı veya varsayılan tanısı olması, bilgilendirilmiş onam imzalamaya istekli ve yetenekli olması ve en az 18 yaşında olması gerekiyordu. Tümör dokusu (malign primer tümör veya metastatik bölgeler), asit ve plevral sıvı onay veren hastalardan işlem sırasında elde edildi. Bu örnekler derhal laboratuvara taşındı ve aşağıda özetlenen yöntemler kullanılarak organoid üretimi için işlendi.
1. Medya hazırlığı
- Komple organoid medya hazırlığı
- Daha önce yayınlanmış bir rapor7'yi takiben R-spondin 1/Noggin şartlandırılmış ortamını hazırlayın.
NOT: R-spondin-1/Noggin şartlandırılmış ortam, ticari olarak temin edilebilen rekombinant proteinlere daha uygun fiyatlı bir alternatiftir. Lentivirüs aracılı transdüksiyon yoluyla R-spondin-1 ve Noggin'i istikrarlı bir şekilde salgılayan HEK293T hücreleri, St. Louis'deki Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi Ron Bose'den ve New York-Presbiteryen / Columbia Üniversitesi Irving Tıp Merkezi 8,9,10'dan Anil Rustgi'den cömert bir hediyeydi. Ticari şartlandırılmış ortam bir yedek olarak kullanılabilir (bkz.
- Daha önce yayınlanmış bir rapor7'yi takiben R-spondin 1/Noggin şartlandırılmış ortamını hazırlayın.
- Tam organoid ortamı yapmak için,% 10 R-spondin 1 / Noggin şartlandırılmış ortam, 50 ng / mL EGF, 10 ng / mL FGF-10, 10 ng / mL FGF2, 1x B27, 10 mmol / L nikotinamid, 1.25 mmol / L N-asetilsistein, 1 μmol / L prostaglandin E2, 10 μmol / L SB202190, 500 nmol / L A83-01 ve 10 μM ROCK inhibitörü birleştirin (bkz.
NOT: Ortam, 4 °C'de 3 aya kadar saklanabilir. Bu ortam Hill ve ark.11'den uyarlanmıştır. Ortamın konsantrasyonları ve bileşenleri, bir ROCK inhibitörü ilavesiyle aynıdır. - DMEM / F12'nin gelişmiş bir formülasyonunun 500 mL'sini% 1 penisilin-streptomisin, 1x dipeptid, L-alanil-L-glutamin ve 1x HEPES (10 mM) ile birleştirerek organoid baz ortamı hazırlayın (bkz.
2. Asit ve plevral sıvıdan organoidlerin toplanması
NOT: Asit ve plevral sıvı, organoidlerin en iyi verimi için mümkün olan en kısa sürede işlenmelidir. Daha önce BME, DNase I ve DNase I reaksiyon tamponunu (bkz. Malzeme Tablosu) içeriği sıvılaştırılana kadar buz üzerine yerleştirerek çözdü.
- Standart bakım ameliyatları veya prosedürleri sırasında rıza gösteren hastalardan asit ve plevral sıvı alın ve oda sıcaklığında bir seyahat kabında laboratuvara taşıyın.
NOT: Tüm asit veya plevral sıvı işleme steril bir ortamda yapılmalıdır. - 50 mL asit veya plevral sıvıyı 50 mL konik tüplere aktarın (tüp sayısı, elde edilen asit hacmine bağlıdır). 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dikkatlice aspire etmek için bir cam Pasteur pipet kullanın.
- Daha önce santrifüj edilmiş pelete 50 mL asit veya plevral sıvı ekleyerek devam edin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de tekrar santrifüj yapın. Bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin. Tüm asit veya plevral sıvı işlenene kadar bu adımı tekrarlayın.
- 1.000 μL nükleaz içermeyen suyu, 100 μL DNaz I reaksiyon tamponunu ve 10 μL DNaz I'i birleştirerek 100 μg/mL DNaz I çözeltisi hazırlayın.
NOT: Uygulanan DNaz I tedavisi, bazı hasta örneklerinde hücre agregalarının varlığından bağımsız olarak tek hücreli bir süspansiyon yapmak için yeterlidir12. - Her hücre peletini 1 mL'lik 100 μg / mL DNaz I çözeltisinde yeniden askıya alın. DNase I çözeltisini damla damla yavaşça ekleyin ve tüpün oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe olmasına izin verin.
NOT: En az 1 mL DNase I çözeltisi ekleyin. Pelet'i rahatsız etmek için 1 mL yeterli değilse, ek 1 mL ekleyin. - Kuluçkadan sonra, hücrelere 25 mL organoid baz ortamı (adım 1.3) ekleyin ve karıştırmak için yavaşça ters çevirin. Ardından, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin.
- Yeni oluşan hücre peletlerini önceden ısıtılmış 5 mL 1x kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponunda yeniden askıya alın (bkz. Vorteksi 458 x g'ye ayarlayın ve her konik tüpteki çözeltileri vorteksleyin. Çözeltiler homojen hale geldiğinde, tüm konik tüplerin içeriğini tek bir 50 mL konik tüpte birleştirmek için serolojik bir pipet kullanın.
- Girdaplı çözeltiyi içeren konik tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçka tamamlandıktan sonra, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj yapın.
NOT: Pelet'i inceleyin. Pembe / kırmızı bir pelet RBC'lerin varlığını gösterir, bu da RBC lizis tampon adımının pelet artık kırmızı olmayana kadar tekrarlanmasını gerektirir. - Santrifüjlemeden sonra, bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin. Ardından, peleti 10 mL PBS ile yıkayın, çözeltiyi 458 x g'de vorteksleyin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj yapın.
- Büyük hücreli bir pelet oluşursa, PBS'yi bir cam Pasteur pipet kullanarak aspire edin ve peletin üzerine 1 mL organoid baz ortamı (adım 1.3) ekleyin. Çözeltiyi 458 x g'da vorteksleyin ve 300-400 μL'yi bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Mikrosantrifüj tüpünü 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj yapın.
NOT: Hücre peletinin mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilmeyen kısmı ileride kullanılmak üzere dondurulabilir (FBS'de 500 μL hücreden 1 mL'ye %10 DMSO). Dondurulmuş hücre peleti -80 ° C'de haftalarca ve sıvı azot13'e yerleştirilirse yıllarca saklanabilir. - Cam bir Pasteur pipet kullanarak organoid baz ortamını (adım 1.3) dikkatlice aspire edin ve soğuk uçlar kullanarak BME'de yeniden askıya alın (bkz.
NOT: BME miktarı, peletin boyutuna bağlıdır. % 75 BME'ye kadar yeniden askıya alınmış hücrelerle% 25 organoid baz ortam (adım 1.3) kullanılması önerilir. - Plaka 40 μL, 6 delikli bir plaka üzerine yeniden askıya alınmış hücre çözeltisinin alikotları. Kuyu başına beş alikot kadar plaka (Şekil 1).
- BME'nin katılaşmasını sağlamak için plakayı hemen 20 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Kuluçkadan sonra, her bir kuyucuğa nazikçe 2 mL tam organoid ortam (adım 1.2) ekleyin.
Şekil 1: Hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidlerinin kaplanması. Organoid kaplamanın temsili görüntüsü. Organoid karışımın alikotları dikkatlice kaplanır ve kabarcıkların oluşmamasını sağlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. Organoidlerin dokudan toplanması
NOT: Organoidlerin en iyi verimi için doku mümkün olan en kısa sürede işlenmelidir.
- Tümörü PBS içeren bir seyahat kabında buz üzerinde toplayın ve taşıyın.
- Numuneyi 10 cm'lik bir doku kültürü kabına yerleştirin (Şekil 2). Tek kullanımlık bir neşter kullanarak, dokuyu kıyın. Daha sonra, tek kullanımlık bir şırınganın donuk ucunu kullanarak, homojen bir karışım oluşana kadar dokuyu ezin.
- Forseps kullanarak, homojen doku karışımını bir ayrışma tüpüne yerleştirin. Her 1-2 mL homojenize doku için, organoid baz ortamında (adım 1.3) 7-8 mL 1 mg/mL tip II kollajenaz çözeltisi (bkz. Malzeme Tablosu) ve 1 mL DNaz I çözeltisi ekleyin. Vorteks çözeltisi 458 x g'de.
NOT: Doku miktarı, kollajenaz çözeltisinin miktarını ve ihtiyaç duyulan tüp sayısını belirleyecektir. - Kollajenaz çözeltisindeyken dokuyu sıvılaştırmak için ayrışma makinesini kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Programı tek hücreli bir süspansiyon olana kadar 37C_h_TDK3 (1 saat) çalıştırın.
NOT: Elde edilen karışım homojen değilse (yani, karışımda hala doku parçaları mevcutsa) programın yeniden çalıştırılması gerekecektir. Doku sindirilirse ancak çözelti viskoz ise, organoid baz ortamı kullanarak seyreltin (adım 1.3). - Homojenize edilmiş karışımı yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın ve 20-40 mL organoid baz ortamı ekleyin (adım 1.3). Ardından, çözeltiyi 100 μm'lik bir hücre süzgecinden yeni etiketlenmiş 50 mL konik bir tüpe filtreleyin.
- Filtrelenmiş karışımı 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj edin. Ardından, bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin.
- 1.000 μL nükleaz içermeyen suyu, 100 μL DNaz I reaksiyon tamponunu ve 10 μL DNaz I'i birleştirerek 100 μg/mL DNaz I çözeltisi hazırlayın.
NOT: Uygulanan DNaz I tedavisi, bazı hasta örneklerinde hücre agregalarının varlığından bağımsız olarak tek hücreli bir süspansiyon yapmak için yeterlidir12. - Hücreleri 1 mL'lik 100 ug / mL DNaz I çözeltisinde yeniden askıya alın. DNase I çözeltisini damla damla yavaşça ekleyin ve tüpün oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe olmasına izin verin.
- Kuluçkadan sonra, hücrelere 25 mL organoid baz ortamı (adım 1.3) ekleyin ve karıştırmak için yavaşça ters çevirin. Ardından, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin.
- Yeni oluşan hücre peletini 5 mL önceden ısıtılmış 1x RBC lizis tamponunda yeniden askıya alın. Her konik tüpteki çözeltileri 458 x g'de vorteksleyin.
- RBC lizis tamponunda 5 dakika boyunca yeniden asılı kalan hücre peletini içeren konik tüpü inkübe edin. Kuluçka tamamlandıktan sonra, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj yapın.
NOT: Pelet'i inceleyin. Pembe / kırmızı bir pelet RBC'lerin varlığını gösterir, bu da RBC lizis tampon adımının pelet beyaz görünene kadar tekrarlanmasını gerektirir. - Santrifüjlemeden sonra, bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin. Ardından, peleti 10 mL PBS ile yıkayın, çözeltiyi 458 x g'de vorteksleyin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj yapın.
- Büyük hücreli bir pelet oluşursa, PBS'yi bir cam Pasteur pipet kullanarak aspire edin ve peletin üzerine 1 mL organoid baz ortamı (adım 1.3) ekleyin. Çözeltiyi 458 x g'da vorteksleyin ve 300-400 μL'yi bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj.
NOT: Hücre peletinin mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilmeyen kısmı, gelecekte kullanılmak üzere dondurulabilir (FBS'de 500 μL hücreden 1 mL'ye% 10 DMSO'ya) (adım 5.1). Dondurulmuş hücre peleti -80 ° C'de haftalarca ve sıvı azot13'e yerleştirilirse yıllarca saklanabilir. - Cam bir Pasteur pipet kullanarak organoid baz ortamını dikkatlice aspire edin ve soğuk uçlar kullanarak BME'de yeniden askıya alın.
NOT: BME miktarı, peletin boyutuna bağlıdır. % 75 BME'ye% 75 yeniden askıya alınmış hücrelerle% 25 organoid baz ortam (adım 1.3) eklenmesi önerilir. - Yeniden askıya alınmış hücre çözeltisini 40 μL alikotlarda 6 delikli bir plaka üzerine yerleştirin. Kuyu başına beş aliquots'a kadar plaka.
- Kuyu plakasını hemen 20 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Kuluçkadan sonra, her bir kuyucuğa nazikçe 2 mL tam organoid ortam (adım 1.2) ekleyin.
Şekil 2: Diseksiyon öncesi tümör dokusu. Organoid jenerasyon için elde edilen tümör dokusunun temsili görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
4. Organoidlerin geçişi
NOT: Numune birleşikse, her organoid kuyucuk haftalık olarak iki yeni kuyuya geçirilebilir.
- 1 mL'lik bir pipet kullanarak, her bir oyuğa 1 mL organoid baz ortamı (adım 1.3) ekleyin ve ortamı ayırmak için doğrudan organoid tırnakların üzerine yukarı ve aşağı pipetleyin. Askıya alınmış peletleri içeren tüm ortamları 15 mL'lik bir konik tüp içinde toplayın.
- Karışımı içeren 15 mL konik tüpü 1.650 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Ardından, bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin.
- Hücre peletine 1 mL hayvansal kökenli olmayan, rekombinant enzim (bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin, çözeltiyi 458 x g'de vorteksleyin ve 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpün 37 ° C'lik bir su banyosunda 15 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin.
- Kuluçkadan sonra, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüjleyin. Ardından, bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin.
- BME'deki peleti yeniden askıya alın.
NOT: BME miktarı, peletin boyutuna bağlıdır. %75 VKİ'ye yeniden askıya alınmış hücrelerle %25 organoid baz media (adım 1.3) eklenmesi önerilir. - Yeniden askıya alınmış hücre çözeltisini 40 μL alikotlarda 6 delikli bir plakaya yerleştirin. Kuyu başına beş aliquots'a kadar plaka. Tüm alikotlar kaplandıktan sonra, kuyu plakasını derhal 20 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Kuluçkadan sonra, her bir kuyucuğa nazikçe 2 mL tam organoid ortam (adım 1.2) ekleyin.
5. Organoidlerin dondurulması ve çözülmesi
- Organoidlerin dondurulması
- 4.1-4.4 arası adımlarla başlayın.
- Hücre peletini 0.5-1 mL geri kazanım hücre kültürü dondurma ortamında yeniden askıya alın (bakınız Malzeme Tablosu) ve her kriyovale 1 mL aktarın.
- Daha sonra, kriyovyalleri uzun süreli depolama için bir sıvı azot tankına aktarmadan önce 2 haftaya kadar -80 ° C'de izopropanol dolu bir kaba koyun13.
- Organoidlerin çözülmesi
- Numuneleri sıvı azot tankından çıkarın ve 37 °C su banyosunda çözün.
- Çözüldükten sonra, 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin.
- BME'deki peleti yeniden askıya alın.
NOT: BME miktarı, peletin boyutuna bağlıdır. %75 VKİ'ye yeniden askıya alınmış hücrelerle %25 organoid baz media (adım 1.3) eklenmesi önerilir. - Yeniden askıya alınmış hücre çözeltisini 40 μL alikotlarda 6 delikli bir plaka üzerine yerleştirin. Kuyu başına en fazla beş aliquot yerleştirin.
- Plakayı hemen 20 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Kuluçkadan sonra, kuyucuklara nazikçe 2 mL tam organoid ortam (adım 1.2) ekleyin.
6. Organoid bileşimi değerlendirmek için formalin-sabit parafin-gömülü (FFPE) slaytların gömülmesi ve üretilmesi
- Yeterli boyutu sağlamak için organoidleri en az 10 gün boyunca kültürledikten sonra, tüm organoid ortamı kuyucuklardan çıkarın ve 1 mL% 2 paraformaldehit fiksatif (PFA) ekleyin. Oda sıcaklığında 5-10 dakika kuluçkaya yatırın.
- Kuluçkadan sonra, kültürlenmiş organoid alikotları her seferinde 1 mL PBS ile 5 dakika boyunca 3x yıkayın.
- PBS'yi her bir kuyucuktan çıkarın ve her bir kuyucuğa deiyonize H2 O'da 1 mL sıcak%2agar ekleyin. Agar'ı eklerken, kültürlenmiş organoid alikotları bir spatula kullanarak plakadan kaldırın.
NOT: Kültürlü organoid alikotları kaldırmadan önce agarın sertleşmesine izin vermemek önemlidir.- Agarın oda sıcaklığında kuyuda katılaşmasına izin verin.
- Küçük bir spatula kullanarak, katılaşmış agar'ı kuyudan boşaltın ve14 işlenene kadar% 70 etanol içinde 4 ° C'de 48 saate kadar bir kaset içinde saklayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Numuneleri parafin 15'e gömün, slaytları 5 μm kalınlığa kadar kesin ve slaytları standart bir protokol15 kullanarak hematoksilin ve eozin (H & E, bkz. Malzeme Tablosu) boyama ile boyayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PDO'lar üretmek için, numuneler mekanik ve enzimatik olarak tek hücreli süspansiyonlara sindirildi. Hücreler daha sonra BME'de yeniden askıya alındı ve özel olarak tasarlanmış ortamlarla desteklendi (Şekil 3). Organoidler tipik olarak 10 günlük bir zaman diliminde kurulur, daha sonra kültürde ayrı organoidler gösterirler (Şekil 4).
Şekil 3: Organoidler halinde oluşturulan hasta koleksiyonlarının şeması. Hasta dokusu, asit veya plevral sıvı mekanik veya enzimatik olarak sindirilir. Tek hücreli süspansiyon daha sonra HGSOC'ye uyarlanmış özel büyüme medyasının yardımıyla kültürün çoğaldığı BME'ye kaplanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 7 günlük büyümeden sonra iki benzersiz hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidinin temsili görüntüleri. Organoid görüntüler 40x'te çekildi. Soldaki görüntüdeki parlak alan ölçek çubuğu 100 μm ve sağdaki görüntüde 200 μm'dir .
Sunulan protokolden, 23 organoidden oluşan bir biyobanka üretildi ve düzenli olarak pasajla 5 aydan fazla bir süre boyunca kültürlendi. Menşeli tümörlerin klinik özellikleri Tablo 1'de sunulmuştur. Tümörlerin çoğunluğu ileri evre (%100), yüksek dereceli seröz karsinom (%92.9) ve tedavi naif (%85.7) idi.
| N = 23 | |
| Yaş (yıl) | 63,5 ± 9,7 |
| FIGO Aşaması III IV Beklemede |
13 (56.5) 9 (39.2) 1 (4.3) |
| Histoloji Yüksek Dereceli Seröz Karsinosarkom Düşük Dereceli Seröz |
21 (92.9) 1 (7.1) 1 (4.3) |
| BRCA Mutasyonu Evet Hayır |
1 (4.3) 22 (95.7) |
| Önceki Kemoterapi Hatları 0 1-5 ≥5 |
20 (85.7) 0 2 (14.2) |
Tablo 1: PDO biyobanka özellikleri. Tablo, mevcut protokol kullanılarak üretilen organoidlerin spesifik özelliklerini içerir. Bu özellikler yaş, FIGO (Uluslararası Jinekoloji ve Obstetrik Federasyonu) evresi, histoloji, BRCA (BReast CAncer geni) mutasyon durumu ve önceki kemoterapi hatlarını içerir.
Organoid kültürler agaroz içine gömülerek ve H&E ile değerlendirilerek değerlendirilebilir (Şekil 5).
Şekil 5: PDO'nun hematoksilin ve eozin boyanması. Bir hasta örneğinden üretilen bir yumurtalık kanseri organoidinin H&E boyamasının temsili görüntüsü. Görüntü 40x'te çekilmiştir ve ölçek çubuğu 50 μm'dir . Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yumurtalık kanseri, tanıdaki ileri aşaması ve kemoterapi direncinin ortak gelişimi nedeniyle son derece ölümcüldür. Yumurtalık kanseri araştırmalarında kanser hücre hatları ve PDX modelleri kullanılarak birçok ilerleme kaydedilmiştir; Bununla birlikte, daha temsili ve uygun fiyatlı bir in vitro modele belirgin bir ihtiyaç vardır. PDO'ların tümör heterojenliğini, tümör mikroçevresini ve primer tümörlerinin genomik ve transkriptomik özelliklerini doğru bir şekilde temsil ettiği kanıtlanmıştır ve bu nedenle, ilaç tedavisinde organoid modellerin uygulanması gibi çeşitli araştırma yaklaşımları için ideal preklinik modellerdir16.
Burada açıklanan protokol,% 97 başarı oranı ile gösterildiği gibi çok etkili ve güvenilirdir. Mevcut protokolün dikkatli bir şekilde dikkat edilmesi gereken kritik adımlara sahip olduğunu vurgulamak önemlidir. İlk olarak, organoidleri dokudan toplarken, numunenin tamamen homojenize edilmesini sağlamak önemlidir. Bu, gerekirse ayrıştırma programının birden çok kez çalıştırılmasını gerektirebilir. Numune homojen değilse, kalan doku parçaları organoid büyümeyi tehlikeye atabilir. İkincisi, BME'nin çalışma sıcaklığı 2-8 ° C olduğundan, polimerizasyonu önlemek için bu reaktifi içeren tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirmek önemlidir. Ek olarak, BME ile yeniden askıya alırken ve kaplanırken, kabarcıklardan kaçınmak çok önemlidir, çünkü bu, kaplanmış organoid alikotları dengesiz hale getirir ve plakadan kaymalarına neden olur. Son olarak, bu protokolde kullanılan BME, Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) tümöründen üretilmiştir ve bu nedenle partiler arasında tutarsız kompozisyon potansiyeline sahiptir. Bu farklılıklar organoid oluşumunu ve büyümesini etkileyebilir. Yazarlar alternatif BME seçeneklerinden haberdar olmadıkları için bu sınırlamanın üstesinden gelmenin belirli bir yolu yoktur17. BME veya 3D iskele için alternatif malzemeler oluşturmak için gelecekteki araştırmalar gereklidir. Yukarıdaki tüm hususlar göz önüne alındığında, bu yöntemlerin farklı laboratuvar ortamları ve ekipmanları için uyarlanması ve test edilmesi gerektiğini vurgulamak önemlidir.
Organoidlerin yumurtalık kanseri araştırmalarına sağlayabileceği ilerlemelere rağmen, organoid modellere uygulanmasında sınırlamalar vardır. Organoid üretimi ve bakımı hem uzun hem de pahalı süreçlerdir. Organoid büyüme için gereken süre, kontaminasyonun ortaya çıkmasına izin verir. Ayrıca, büyüme değişkenliği, mevcut ortam miktarının organoid gelişim için yeterli olduğundan ve kontaminasyonun mevcut olmadığından emin olmak için sürekli denetim gerektirir. Ek olarak, organoidlerin hücresel bileşimi değişkendir. Bağışıklık hücreleri başlangıçta mevcuttur, ancak genellikle ikinci geçişten sonra devam etmezler. Bu, medyada sitokin takviyesi ile aşılabilir, ancak mevcut çalışmalarımızın kapsamı dışındadır. Stromal hücreler pasaj yoluyla devam ediyor gibi görünmektedir, ancak bileşenler büyük ölçüde ilk örnek 18,19'a bağlıdır. Her hücre tipinin tam hücresel bileşenlerini ve kalıcılığını daha iyi anlamak için daha fazla çalışma gereklidir. Birkaç kemoterapi hattı geçiren hastalardan organoid üretmek zor ve sorunludur. Kemoterapinin organoid üretimi ve gelişimi üzerindeki etkisini anlamak için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Son olarak, deneyimlerimize göre, belirli miktarda doku, asit veya plevral sıvıdan üretilen organoidlerin sayısı tahmin edilemez. Örneğin, iki farklı hastadan toplanan aynı miktarda tümör, asit veya plevral sıvı, farklı miktarlarda organoidlere neden olacaktır. Organoid sağkalımı ve yaşayabilirliği için en iyi hücre tipleri hakkında fikir edinmek için daha fazla araştırma yapılmaktadır.
Bununla birlikte, PDO'lar hücre hatları ve PDX modellerine kıyasla klinik öncesi araştırmalar için benzersiz fırsatlar sunmaktadır. Yumurtalık kanserinin tanı ve tedavisi konusunda ilerleme kaydedilmiş olsa da, hala yapılması gereken önemli işler vardır ve PDO'lar yumurtalık kanseri araştırmalarını ilerletmek için gerekli özel bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Ron Bose, MD, PhD'nin rehberliği ve bu protokolün oluşturulmasında Barbara Blachut, MD'nin yardımı için minnettarız. Ayrıca, St. Louis'in Kadın Hastalıkları ve Doğum Bölümü ve Jinekolojik Onkoloji Bölümü'ndeki Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi'ne, Washington Üniversitesi Dekan'ın Akademik Programı'na ve Üreme Bilim İnsanı Geliştirme Programı'na bu projeye verdikleri destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| 10 mL Serological Pipet | |||
| 100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
| 37 °C water bath | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Centrifuge | |||
| Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Microcentrifuge | |||
| Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipette with Tips | |||
| p200 Pipette with Tips | |||
| Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Controller | |||
| Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| Tissue Culture Hood | |||
| Tissue Embedding Cassette | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Drost, J., Clevers, H.
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment. Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).
- Yang, J., et al. Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).
- Yang, H., et al. Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment. Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Madison, B. B., et al. Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2. PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Murray, E., et al. HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Passarelli, M. C., et al. Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics. Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Stumm, M. M., et al. Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH). American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L.
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10, 12581 (2020).
- Mead, B. E., et al. Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation. Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).
