Summary
Een gedetailleerd protocol wordt hier verstrekt voor het vaststellen van menselijke borstorganoïden uit van de patiënt afgeleide borsttumorresecties of normaal borstweefsel. Het protocol biedt uitgebreide stapsgewijze instructies voor het kweken, bevriezen en ontdooien van menselijke patiënten afgeleide borstorganoïden.
Abstract
Borstkanker is een complexe ziekte die is ingedeeld in verschillende histologische en moleculaire subtypen. Patiënt-afgeleide borsttumor organoïden ontwikkeld in ons laboratorium bestaan uit een mix van meerdere tumor-afgeleide celpopulaties, en vertegenwoordigen dus een betere benadering van tumorceldiversiteit en -milieu dan de gevestigde 2D-kankercellijnen. Organoïden dienen als een ideaal in vitro model, waardoor cel-extracellulaire matrixinteracties mogelijk zijn, waarvan bekend is dat ze een belangrijke rol spelen in cel-celinteracties en kankerprogressie. Patiënt-afgeleide organoïden hebben ook voordelen ten opzichte van muismodellen omdat ze van menselijke oorsprong zijn. Bovendien is aangetoond dat ze de genomische, transcriptomische en metabole heterogeniteit van patiënttumoren samenvatten; Ze zijn dus in staat om tumorcomplexiteit en patiëntendiversiteit weer te geven. Als gevolg hiervan zijn ze klaar om nauwkeuriger inzicht te bieden in de ontdekking en validatie van doelen en gevoeligheidstests voor geneesmiddelen. In dit protocol geven we een gedetailleerde demonstratie van hoe patiënt-afgeleide borstorganoïden worden vastgesteld uit gereseceerde borsttumoren (kankerorganoïden) of reductief mammoplastiek-afgeleid borstweefsel (normale organoïden). Dit wordt gevolgd door een uitgebreid verslag van 3D-organoïdecultuur, expansie, passaging, bevriezing en ontdooiing van van de patiënt afgeleide borstorganoïde culturen.
Introduction
Borstkanker (BC) is de meest voorkomende maligniteit bij vrouwen, met naar schatting 287.850 nieuwe gevallen die in 2022 in de Verenigde Staten worden gediagnosticeerd1. Ondanks de recente vooruitgang in vroege detectie met jaarlijkse screenings, gerichte therapieën en een beter begrip van genetische aanleg, is het de tweede belangrijkste oorzaak van sterfgevallen door kanker bij vrouwen in de Verenigde Staten, met > 40.000 sterfgevallen toegeschreven aan borstkankerper jaar 1. Borstkanker wordt momenteel ingedeeld in meerdere subtypen op basis van histopathologische en moleculaire evaluatie van de primaire tumor. Betere subtypestratificatie heeft de patiëntresultaten verbeterd met subtypespecifieke behandelingsopties2. De identificatie van HER2 als een proto-oncogen3 heeft bijvoorbeeld geleid tot de ontwikkeling van Trastuzumab, waardoor dit zeer agressieve subtype bij de meeste patiënten beheersbaar is geworden4. Verder onderzoek naar de genetica en transcriptomica van deze complexe ziekte op een patiëntspecifieke manier zal helpen bij het ontwikkelen en voorspellen van betere patiëntspecifieke gepersonaliseerde behandelingsregimes 2,5. Patiënt-afgeleide organoïden (BOB's) zijn een veelbelovend nieuw model om inzicht te krijgen in kanker op moleculair niveau, nieuwe doelen of biomarkers te identificeren en nieuwe behandelingsstrategieën te ontwerpen 6,7,8.
BOB's zijn meercellige, driedimensionale (3D) structuren die zijn afgeleid van vers gereseceerde primaire weefselmonsters 8,9. Ze worden driedimensionaal gekweekt door ingebed te zijn in een hydrogelmatrix, meestal samengesteld uit een combinatie van extracellulaire matrix (ECM) -eiwitten, en kunnen daarom worden gebruikt om tumorcel-ECM-interacties te bestuderen. BOB's vertegenwoordigen de diversiteit van de patiënt en recapituleren cellulaire heterogeniteit en genetische kenmerken van de tumor10,11,12. Omdat het in vitro modellen zijn, maken ze genetische manipulatie en high-throughput medicijnscreeningsmogelijk 13,14,15. Verder kunnen BOB's plausibel worden gebruikt om de gevoeligheid en behandelingsstrategieën van patiënten parallel aan de kliniek te evalueren en de uitkomsten van de patiënt te helpen voorspellen16,17,18. Naast chemotherapie zijn bepaalde organoïde modellen ook gebruikt om individuele reacties van patiënten op chemoradiatiete onderzoeken 19,20. Gezien de veelbelovende toepasbaarheid van BOB's voor onderzoek en klinisch gebruik, heeft het National Cancer Institute een internationaal consortium geïnitieerd, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, om deze van tumoren afgeleide nieuwe kankermodellen te genereren en te leveren. Veel van de organoïde modellen van verschillende soorten kanker ontwikkeld via de HCMI zijn beschikbaar via de American Type Culture Collection (ATCC)22.
Van normale borstorganoïden is aangetoond dat ze bestaan uit verschillende epitheelcelpopulaties die aanwezig zijn in de borstklier 11,23 en dienen dus als geweldige modellen om fundamentele biologische processen te bestuderen, om drivermutaties te analyseren die tumorigenese veroorzaken, en voor kankercel-van-oorsprong afstammingsstudies 6,15 . Borsttumor organoïde modellen zijn gebruikt om nieuwe doelen te identificeren die de vooruitzichten voor het ontwikkelen van nieuwe therapieën aanmoedigen, met name voor resistente tumoren24,25,26. Met behulp van patiënt-afgeleide xenograft (PDX) en gematchte PDX-afgeleide organoïde (PDxO) modellen van behandelingsresistente borsttumoren, toonden Guillen et al. aan dat organoïden krachtige modellen zijn voor precisiegeneeskunde, die kunnen worden gebruikt om medicijnresponsen en directe therapiebeslissingen parallel te evalueren28. Bovendien biedt de ontwikkeling van nieuwe co-cultuurmethoden voor het kweken van BOB's met verschillende immuuncellen27,28,29, fibroblasten 30,31 en microben 32,33 een kans om de impact van de tumormicro-omgeving op kankerprogressie te bestuderen. Hoewel veel van dergelijke co-cultuurmethoden actief worden vastgesteld voor BOB's die zijn afgeleid van pancreas- of colorectale tumoren, zijn vergelijkbare gevestigde co-cultuurmethoden voor borst-BOB's alleen gemeld voor natural killer-cellen34 en fibroblasten35.
De eerste biobank van >100 patiënt-afgeleide organoïden die verschillende borstkankersubtypes vertegenwoordigen, werd ontwikkeld door de Hans Clevers-groep36,37. Als onderdeel van deze inspanning ontwikkelde de Clevers-groep ook het eerste complexe kweekmedium voor borstorganoïdegroei, dat momenteel veel wordt gebruikt36. Een vervolgstudie leverde een uitgebreid verslag op van de oprichting en kweek van borst-BOB's en van patiënten afgeleide organoïde xenografts (PDOXs)38. Het Welm-lab ontwikkelde een grote verzameling BC PDX-modellen en PDxO's die worden gekweekt in een relatief eenvoudiger groeimedium met foetaal runderserum (FBS) en minder groeifactoren39,40. We hebben onafhankelijk een groot aantal naïeve patiënt-afgeleide borstkanker organoïde modellen11 ontwikkeld en gekarakteriseerd en hebben deelgenomen aan de ontwikkeling van BC PDO-modellen als onderdeel van het HCMI-initiatief21. Hier willen we een praktische gids bieden met details over de methodologie die door ons wordt gebruikt bij het genereren van patiënt-afgeleide borstorganoïde modelsystemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tumorresecties van borstkankerpatiënten, samen met het distale en aangrenzende normale weefsel, werden verkregen van Northwell Health in overeenstemming met de protocollen IRB-03-012 en IRB 20-0150 van de Institutional Review Board en met schriftelijke geïnformeerde toestemming van de patiënten.
OPMERKING: Alle onderstaande procedures werden uitgevoerd in een BSL2-kamer voor weefselkweek bij zoogdieren die was aangewezen voor patiëntmonsters na goedkeuring van het bioveiligheidscomité. Alle procedures moeten worden uitgevoerd volgens veiligheidsprotocollen die aseptische omstandigheden in bioveiligheidskasten handhaven. Elke centrifugatiestap wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT), tenzij anders vermeld. Weefsel/organoïden en keldermembraanmatrixvoorraden worden altijd op ijs geplaatst, tenzij anders vermeld. Nieuwe platen worden 's nachts geïncubeerd voor voorverwarming. Het plateren van koepels op voorverwarmde platen zorgt voor de beste resultaten om afgeronde koepels te verkrijgen die niet afvlakken tijdens het plateren of later optillen van het plaatoppervlak.
1. Medium bereiding en recepten
- Bereid R-spondin1 geconditioneerde media voor zoals hieronder beschreven (alternatief kan commercieel worden gekocht).
- Bereid twee afzonderlijke groeimedia voor die zijn samengesteld uit Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM), 10% FBS, 5% penicilline-streptomycine en met of zonder 300 μg / ml zeocine-suppletie.
- Ontdooi een injectieflacon met HEK293T-HA-Rspondin1-Fc-cellen (verkregen uit het laboratorium van Calvin Kuo aan de Stanford University en ook in de handel verkrijgbaar) in een weefselkweekkolf van 75 cm2 met 15 ml medium.
- Splits de cellen in 2 x 175 cm2 kweekkolven, elk met 35 ml medium dat zeocin bevat.
- Passeer de cellen opnieuw om zoveel kolven te verkrijgen als nodig is voor het genereren van de gewenste partij R-spondin1 geconditioneerd medium. Gebruik groeimedium zonder zeocin.
- Wanneer de kolven met medium zonder zeocine samenvloeien, verwijdert u het groeimedium en vervangt u het door Ad-DF+++ (stap 1.2; Tabel 1). Plaats de cellen gedurende 1 week in een 37 °C incubator met 5% CO2 .
- Draai het medium gedurende 5 minuten op 400 x g om eventuele niet-vastgemaakte cellen te verwijderen. Filtreer het medium door een filter van 0,22 μm. Maak 25 ml aliquots en bewaar ze bij -20 °C (kan maximaal 6 maanden worden bewaard).
- Voer met behulp van HEK293T-cellen een dubbele luciferase TOPFLASH41,42-test uit met behulp van een commercieel DNA-transfectiereagens met een 4,8: 1-reagens tot DNA-verhouding met het verdunningsmiddel DMEM (hoog glucose, pyruvaat). Voeg 100 μL R-spondin1 geconditioneerd medium (of basaal medium voor de negatieve controle) toe aan 100 μL getransfecteerde cellen. Voer vervolgens de dubbele luciferasetest uit volgens het protocol van de fabrikant om de Wnt-activiteit van het R-spondin1-geconditioneerde medium te verifiëren.
OPMERKING: De test maakt gebruik van een TOP-plasmide met Firefly luciferase-activiteitsuitlezing en het FOP-plasmide wordt gebruikt als een negatieve controle.
- Bereid basaal medium (Ad-DF+++ medium, zoals eerder gepubliceerd door Sachs et al.36).
Reagens Voorraadconcentratie Eindconcentratie Geavanceerde DMEM/F12 1x 1x GlutaMax 100x 1x HEPES 1 m 10 mM Penicilline-Streptomycine 10.000 U/ml; 10.000 μg/ml 100 U/ml; 100 μg/ml
Tabel 1: Basale Ad-DF+++ medium samenstelling. - Bereid een compleet medium voor voor van de patiënt afgeleide borstorganoïden zoals eerder gepubliceerd door Sachs et al.36.
Reagens Voorraadconcentratie Eindconcentratie Ad-DF+++ medium 1x 1x R-spondin in eigen beheer 100% 10% B-27 supplement 50x 1x Nicotinamide 1 m 5 mM NAC 500 mM 1,25 mM Primocine 50 mg/ml 50 μg/ml Noggin 100 μg/ml 100 ng/ml Menselijk EFG 5 μg/ml 5 ng/ml Menselijke Heregulin β1/Neuregulin1 75 μg/ml 37,5 ng/ml Y-27632 Dihydrochloride (Rho-Kinase) 100 mM 5 μM A83-01 5 mM 500 nM Menselijke FGF-7 100 μg/ml 5 ng/ml Menselijke FGF-10 1 mg/ml 20 ng/ml p38i 30 mM 498 nM
Tabel 2: Volledige mediumsamenstelling voor van de patiënt afgeleide borstorganoïden. - Bereid 2 mg/ml collagenase IV-oplossing door de vereiste hoeveelheid collagenase IV-poeder te wegen en op te lossen in Ad-DF+++ basaal medium. Filter voor gebruik door een filter van 0,22 μm.
- Bereid 0,5% runderserumalbumine (BSA)-oplossing uit 7,5% stockoplossing met 1x Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) als verdunningsmiddel. Filter voor gebruik door een filter van 0,22 μm.
2. Vaststellen van borsttumor/normale organoïden uit gereseceerd weefsel (figuur 1)
- Transporteer een chirurgisch gereseceerd borsttumor / normaal weefselmonster naar het laboratorium in een conische buis van 50 ml met Ad-DF +++. Bewaar de buis op ijs tot het begin van de isolatie.
- Ontdooi een fles keldermembraanmatrix op ijs of een nacht bij 4 °C.
- Breng het gereseceerde weefsel over in een steriele petrischaal van 10 cm. Onderzoek het weefsel macroscopisch en noteer of het morfologisch vet, gevasculariseerd of necrotisch lijkt. Noteer bovendien de grootte en vorm van het weefsel. Maak idealiter een foto van het weefsel met een liniaal in het zicht (figuur 2).
- Hak het weefsel in zeer kleine stukjes (~ 1 mm3) met een steriel nr. 10 scalpel en breng het over in een conische buis van 50 ml.
- Voeg 10 ml collagenase IV-oplossing van 2 mg / ml toe en sluit de buis af met een transparante film. Plaats de buis op een orbitale shaker bij 37 °C bij 140 tpm gedurende 30-90 minuten in een schuine positie (~ 30 ° hoek).
- Plaats tijdens de incubatie een hoeveelheid volledig medium om voor te verwarmen in een kraal/waterbad van 37 °C.
- Resuspendeer het weefsel elke 15 minuten door krachtig op en neer te mengen met behulp van een steriele serologische pipet van 5 ml. Bedek de pipet vooraf met 0,5% BSA-oplossing om weefselverlies te voorkomen dat wordt veroorzaakt doordat het monster aan de pipet blijft plakken. Controleer de dissociatie in de loop van de tijd door de conische buis onder de microscoop te observeren bij een vergroting van 5x of hoger.
- Zodra het weefsel is gedissocieerd, centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant op, voeg 10 ml Ad-DF+++ toe en centrifugeer gedurende 5 minuten op 400 x g .
- Gooi het supernatant voorzichtig weg. Weefselkorrels kunnen af en toe los zitten, dus wees voorzichtig bij het aanzuigen. Herhaal de stap nogmaals.
- Als de weefselkorrel gedeeltelijk rood is, voeg dan 2 ml rode bloedcellysisbuffer toe en incuber gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Incubeer niet langer, omdat dit de levensvatbaarheid van de cel aanzienlijk zal verminderen.
- Voeg 10 ml Ad-DF+++ toe aan de buis, centrifugeer gedurende 5 minuten op 400 x g en gooi het supernatant weg. Resuspend de pellet in 50-300 μL onverdunde, koude keldermembraanmatrix en meng door voorzichtig te pipetteren om te voorkomen dat er bellen ontstaan.
OPMERKING: Het volume van de toegevoegde keldermembraanmatrix is afhankelijk van de pelletgrootte. Als u het niet zeker weet, plaatst u een kleine koepel van ~ 10 μL van de geresuspendeerde pellet en observeert u de samenvloeiing onder de microscoop. Pas aan door indien nodig meer keldermembraanmatrix toe te voegen. Zie figuur 3 (afbeelding van dag 1) voor een referentiezaaidichtheid. - Plaat 300 μL van keldermembraanmatrixkoepel met organoïden in elke put van een voorverwarmde, gelabelde, 6-well weefselkweekplaat. Raadpleeg tabel 3 voor de aanbevolen keldermembraanmatrix en middelgrote volumes bij gebruik van verschillende platen.
Aantal putten per plaat Keldermembraanmatrix per koepel (μL) Medium per put (μL) 6 300 3000 12 100 1000 24 50 500 48 25 250 96 10 (ophanging in plaats van koepel) 100
Tabel 3: Hoeveelheid keldermembraanmatrix en groeimedium aanbevolen per put op basis van plaatgrootte. - Laat de plaat 5 minuten ongestoord in de kap en plaats deze vervolgens voorzichtig gedurende 20-30 minuten in de incubator bij 37 °C zodat de keldermembraanmatrixkoepel volledig stolt.
- Voeg 3 ml voorverwarmd compleet medium druppelsgewijs toe aan elke put van een 6-putplaat en plaats in de incubator bij 37 °C en 5% CO2. Maak foto's van de organoïden met behulp van een 5x objectief op een omgekeerde brightfield microscoop.
- Vul het medium elke 4-8 dagen aan op basis van de groei van organoïden. Zuig het oude medium voorzichtig op zonder de koepel te verstoren en voeg vers, voorverwarmd medium druppelsgewijs toe.
OPMERKING: Het protocol is hetzelfde voor het vaststellen van borstkankerorganoïden afgeleid van de gereseceerde tumor en voor normale organoïden afgeleid van gereseceerd gezond borstweefsel (hetzij van aangrenzend en normaal borstweefsel van dezelfde patiënt of gezond borstweefsel verkregen van een reductieve mammoplastiechirurgie).
3. Het passeren en uitbreiden van patiënt-afgeleide borstorganoïden in cultuur
- Ontdooi een fles keldermembraanmatrix op ijs of een nacht bij 4 °C.
- Til de keldermembraanmatrixkoepel in het medium in de put met behulp van een celschraper of een pipetpunt van 1 ml.
- Coat de pipetpunt voor met 0,5% BSA-oplossing en breng vervolgens de drijvende koepel van de organoïden met medium over naar een conische buis van 15 ml of 50 ml, afhankelijk van het aantal putten dat wordt geoogst. Gebruik voor meer dan twee putten met 300 μL keldermembraanmatrixkoepels een conische buis van 50 ml. Voeg 1x DPBS toe om het volume te verhogen tot ten minste 5 ml.
- Draai de buizen op 400 x g gedurende 5 min. De keldermembraanmatrix met organoïden vormt onderaan een laag. Voorzichtig opzuigen om het supernatant te verwijderen.
- Voeg 5-20 ml 1x DPBS toe, afhankelijk van het aantal putten dat in een buis is gepoold. Coat een steriele wegwerppipet voor met 0,5% BSA en meng de organoïde-keldermembraanmatrixpellet in DPBS gelijkmatig door op en neer te pipetteren.
- Draai de buizen op 400 x g gedurende 5 min. Zuig het supernatant voorzichtig op en gooi het weg.
- Voeg celdissociatiereagens met driemaal het volume van de keldermembraanmatrix toe aan de buis. Gebruik een 0,5% BSA-gecoate pipetpunt om de organoïden in het celdissociatiereagens te resuspenderen.
- Plaats de buis op een orbitale shaker bij 37 °C bij 140 tpm gedurende 8-15 minuten in een schuine positie. Controleer de buis door deze elke 5 minuten onder de microscoop te observeren om ervoor te zorgen dat de organoïden worden afgebroken in kleinere clusters.
- Voeg basaal medium (d.w.z. Ad-DF+++) toe met een volume gelijk aan of groter dan het celdissociatiereagens en pipet om de organoïden te mengen. Draai op 400 x g gedurende 5 minuten bij RT om een organoïde pellet te verkrijgen.
- Als de pellet organoïden bevat die nog steeds zijn ingebed in de onopgeloste keldermembraanmatrix, herhaalt u stap 3.7-3.9 voor nog eens 5-8 minuten trypsinisatie.
- Zodra een witte organoïde pellet zonder onopgeloste keldermembraanmatrix is verkregen, gooit u het supernatant weg en voegt u 1 ml Ad-DF +++ toe om de pellet te resuspenderen door pipetteren. Voeg vervolgens meer Ad-DF +++ toe tot 10 ml.
- Draai op 400 x g gedurende 5 minuten bij RT voor de wasstap. Zuig het supernatant op en gooi het weg.
- Voeg de vereiste hoeveelheid keldermembraanmatrix toe aan de verteerde organoïden op basis van de juiste splitverhouding (dit zal sterk variëren voor elke organoïdelijn op basis van de groeisnelheid). Zie figuur 3 (afbeelding van dag 1) voor een voorbeeld van de zaaidichtheid. Meng door zachtjes op en neer te pipetteren om te voorkomen dat er bubbels ontstaan. Onmiddellijk op ijs plaatsen.
- Open en label een voorverwarmde 6-well plaat. Het wordt aanbevolen om een koepel van 10-20 μL in de hoek van een put te plaatsen om de samenvloeiing onder de microscoop te observeren. Als de organoïden confluent zijn, kan meer keldermembraanmatrix worden toegevoegd om de splitverhouding te verhogen.
- Plaat 300 μL koepels van organoïden geresuspendeerd in keldermembraanmatrix. Zorg ervoor dat u de buis op ijs houdt tijdens het bekleden van meerdere putten, zodat de keldermembraanmatrix in oplossing blijft.
- Laat de plaat 5 minuten ongestoord in de kap en plaats deze vervolgens voorzichtig in een 37 °C incubator met 5% CO2 zonder de koepels te verstoren.
- Na 20-30 min stollen de koepels. Voeg 3 ml voorverwarmd compleet medium toe aan elke put en plaats de plaat terug in de couveuse. Voeg elke 5-7 dagen vers medium toe. Voer routinetests uit van de culturen voor het detecteren van mycoplasmabesmetting.
OPMERKING: Het protocol voor de kweek van borsttumoren en normale organoïden is hetzelfde. In onze ervaring hebben normale organoïden echter de neiging om goed te groeien tot passage 6-8 voordat ze vertragen. Het is raadzaam om zoveel mogelijk vroege passagebestanden te maken voor toekomstig onderzoek.
4. Bevriezen van de patiënt afgeleide borstorganoïden
- Doorgang confluente putten van organoïden om elke keldermembraanmatrix te verwijderen, zoals vermeld in stappen 3.1-3.12.
- Resuspensie van de pellet van organoïden in celvriesmedium ('s nachts ontdooid bij 4 ºC) met 1 ml medium per 200-300 μL keldermembraanmatrixvolume voordat het passeert. Voer een celtelling uit voordat u bevriest ter referentie. Aliquoteer een klein volume (ten minste 100 μL) cellen om verdere trypsinisatie te ondergaan, indien nodig, om afzonderlijke cellen te krijgen en tel ze vervolgens met behulp van een celtellermachine.
- Breng 1 ml cellen over in 2 ml cryovialen gelabeld met organoïde lijnnummer, datum en passagenummer. Zorg ervoor dat u de buizen labelt met een permanente marker of gebruik cryolabels.
- Verplaats de injectieflacons naar een celvriescontainer en breng de container over naar een vriezer van -80 °C. Na incubatie 's nachts zijn de injectieflacons klaar om te worden verplaatst naar een vriezer voor opslag met vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
5. Ontdooien van de patiënt afgeleide borstorganoïden
- Ontdooi een fles keldermembraanmatrix op ijs of een nacht bij 4 °C. Verwarm Ad-DF+++ medium voor op 37 °C. Aliquot 9 ml voorverwarmd medium in 15 ml conische buisjes voor elke bevroren injectieflacon.
- Ontdooi de bevroren injectieflacon met organoïden snel door deze in een kralenbad van 37 °C te plaatsen. Spuit 70% ethanol en breng de buis over in de bioveiligheidskast.
- Spoel de pipetpunt af met 0,5% BSA-oplossing om organoïdeverlies te voorkomen. Meng de ontdooide organoïden voorzichtig door op en neer te pipetteren om eventuele bezonken organoïden in de buis te mengen.
- Breng 1 ml bevroren organoïden voorzichtig druppelsgewijs over op 9 ml voorverwarmde Ad-DF+++. Draai de cellen gedurende 5 minuten op 400 x g en gooi het supernatant vervolgens voorzichtig weg.
- Was de pellet door 10 ml vers voorverwarmd Ad-DF+++ toe te voegen aan de organoïde pellet en meng voorzichtig met een pipet die is voorbedekt met 0,5% BSA om de pellet te resuspenderen. Draai de cellen gedurende 5 minuten op 400 x g en gooi het supernatant voorzichtig weg.
- Plaats de organoïde pellet op ijs en verwijder eventuele restanten Ad-DF+++ voorzichtig met behulp van een pipetpunt met een kleiner volume. Resuspendeer de pellet in 300 μL keldermembraanmatrix en plaat in een voorverwarmde 6-putplaat. Plaats de plaat in een 37 °C incubator met 5% CO2.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een kleine koepel van 10 μL van de geresuspendeerde pellet in een hoek van de put te plaatsen om de samenvloeiing onder de microscoop te onderscheiden. Als de organoïden er confluent uitzien, verdun dan door 300 μL keldermembraanmatrix toe te voegen aan de plaat in twee putten van een 6-putplaat. - Voeg na een incubatie van 20-30 minuten 3 ml voorverwarmd medium toe aan de gestolde koepel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben een biobank opgezet van patiënt-afgeleide borsttumor organoïden bestaande uit verschillende subtypes11. Daarnaast hebben we meerdere normale borstorganoïde lijnen vastgesteld die zijn afgeleid van reductieve mammoplastiekweefselmonsters of aangrenzende / distale normale borst van BC-patiënten met behulp van de aanpak die is beschreven in figuur 1.
De verschillende van de patiënt afgeleide organoïde lijnen van borsttumoren verschillen in morfologie (figuur 2) en groeisnelheid (figuur 3). Normale borstorganoïden, en de weinige vroege ductale carcinoom in situ (DCIS)-afgeleide organoïden die we hebben vastgesteld, lijken op de normale borststructuur met een centraal lumen omgeven door ductale cellen (figuur 2A, B). Organoïden afgeleid van een invasief lobulair carcinoom (figuur 2C) hebben de neiging om losjes gehechte druiventrosachtige structuren te vormen, zoals eerder gemeld door andere laboratoria36,43. Ondertussen hebben organoïden afgeleid van invasieve ductale carcinomen (hormoonreceptorpositieve en triple negatieve borstkanker) de neiging om dichte, grote en ronde organoïden te vormen (figuur 2D, E). Organoïden werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde gevolgd door ingebed in 2% agarose mallen. Ze werden vervolgens paraffine ingebed en 10 μm-secties werden gekleurd met hematoxyline en eosine (zoals beschreven in Bhatia et al.11) om de morfologie te observeren.
Om de verschillen in de groeisnelheid van verschillende van de patiënt afgeleide borsttumororganoïde lijnen aan te tonen, werden 1.000 levensvatbare afzonderlijke cellen geplateerd in 10% keldermembraanmatrixsuspensieoplossing per 96-putplaat, met elk zes replicaties om de levensvatbaarheid van cellen op verschillende tijdstippen te bepalen om de groei gedurende een periode van 12 dagen te volgen (figuur 3B ). De organoïdevorming werd gemeten met behulp van een luminescerende cel levensvatbaarheidstest op dag 3, 6, 9 en 12, met een baseline meting op dag 1 na plating. Figuur 3A toont helderveldbeelden van dezelfde organoïden die in de loop van de tijd in 6-putplaten zijn uitgebreid. Sommige van de patiënt afgeleide organoïde lijnen hebben een verdubbelingstijd van 2 dagen, terwijl sommige 5 dagen duren (figuur 3B).
Figuur 1: Vaststellen van patiënt-afgeleide borstorganoïden. (A) Schematische weergave van de belangrijkste stappen in het vaststellen van patiënt-afgeleide borsttumoren of normale organoïden. (B) Representatieve beelden van de groei van DS117T-patiënt-afgeleide borsttumororganoïden van vestiging (passage 0) tot langetermijnkweek (passage 12). Blauwe pijlen = vezelig materiaal, gele pijlen = puin/dode cellen en rode pijlen = ondersteunende celtypen uit de micro-omgeving (voornamelijk fibroblasten). Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Van de patiënt afgeleide borstorganoïden die verschillende subtypen vertegenwoordigen. Bovenpaneel: morfologische verschillen tussen organoïde lijnen afgeleid van borsttumoren van patiënten (B-E) van verschillende histopathologische en moleculaire subtypen. (A) De figuur vertegenwoordigt organoïden afgeleid van normaal menselijk borstweefsel verkregen na reductieve mammoplastiechirurgie. Schaalbalk = 50 μm. Onderpaneel: H&E gekleurde afbeeldingen van dezelfde organoïde lijnen. Schaalbalk = 100 μm. Afkorting: TNBC = triple negatieve borstkanker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Groei in cultuur van verschillende patiënt-afgeleide borsttumor organoïden. Representatieve bright-field beelden en cel levensvatbaarheidscurven (A en B), zoals gemeten via een luminescerende cel levensvatbaarheidstest die de groei in cultuur van verschillende patiënt-afgeleide borsttumor organoïde lijnen gedurende 12 dagen laat zien. Schaalbalk = 50 μm. Foutbalken vertegenwoordigen SEM voor n = 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ons laboratorium heeft met succes de bovenstaande protocollen gebruikt om organoïden vast te stellen uit naïeve tumorresecties of schaafwonden. We hebben dit protocol ook gebruikt om normale organoïden te ontwikkelen uit borstweefsel verkregen via reductieve mammoplastieën of uit aangrenzend of distaal normaal borstweefsel van kankerpatiënten. Ongeveer 30%-40% van de gereseceerde primaire tumoren resulteerde in succesvolle langdurige (>passage 8) tumor organoïde culturen. De tumororganoïde lijnen die na een paar passages afliepen, hadden ofwel een uitgroei van normale organoïden of stromale cellen, of bestonden grotendeels uit niet-proliferatieve tumorcellen. Verdere evaluatie en modificatie van de mediumcomponenten die momenteel de uitgroei van epitheelcellen bevorderen, of andere middelen om de tumorcelpopulaties vooraf te selecteren, zou het slagingspercentage voor de vestiging en langetermijncultuur van BOB's moeten verbeteren. Bovendien wordt het ten zeerste aanbevolen om verschillende flacons met succesvol uitgebreide organoïden in te vriezen en ontdooiingstests uit te voeren op bevroren flacons voor elke gevestigde organoïde lijn om hun succes op lange termijn in cultuur te verifiëren.
Sommige succesvolle organoïde lijnen die soms vertragen in de cultuur of moeite hebben om te herstellen van een dooi, hebben vaak baat bij het verhogen van de zaaidichtheid. Hogere confluentie wordt waargenomen om te helpen bij het stimuleren van snellere groei voor de meeste lijnen, waarschijnlijk als gevolg van cel-cel interacties of uitgescheiden factoren. Bovendien kan het filteren van de organoïden (na trypsinisatie) door een filter van 70-100 μm helpen om puin te verwijderen dat zich heeft opgehoopt van dode organoïden die soms verschijnen na het ontdooien van sommige organoïde lijnen en de neiging hebben om hun groei te belemmeren. Er moet echter worden opgemerkt dat sommige gezonde organoïde materialen ook verloren gaan tijdens het filteren. Bepaalde organoïde lijnen die oestrogeenreceptor (ER +) tot expressie brengen, kunnen langzame groeiers zijn in vergelijking met TNBC en kunnen mogelijk profiteren van de toevoeging van oestradiol aan het medium. We bevelen aan dat de gevestigde patiënt-afgeleide borsttumor organoïde lijnen genomisch en transcriptomisch worden gekarakteriseerd. Dit kan worden gedaan door gebruik te maken van verschillende technieken, zoals immunohistochemie-evaluatie voor de pathologische en genetische kenmerken van patiënttumoren (expressie van oestrogeenreceptor, progesteronreceptor, menselijke epidermale groeifactor 2, Cadherin, Ki-67, enz.), RNA-sequencing, eencellige RNA-sequencing, DNA-sequencing voor kankerdrivergenen, variaties in het aantal kopieën, enz. Voor mechanistische en geneesmiddelresponsstudies moet men rekening houden met de specifieke remmers die componenten van het medium zijn en eventuele eerdere behandelingen die de patiënt vóór de operatie heeft ontvangen.
Tumororganoïde lijnen afgeleid van verschillende patiënten variëren in genomische mutaties, transcriptomica, morfologie, groeisnelheid, capaciteit om grote organoïden te vormen, aanwezigheid van heterogene celpopulaties, enz. Deze verschillen vormen uitdagingen bij het vaststellen en cultiveren ervan, maar ze maken ook organoïden robuuste modellen die zowel de diversiteit van de patiënt als de complexiteit van de tumor vertegenwoordigen. Van borsttumoren afgeleide organoïden is aangetoond dat ze de oorspronkelijke tumoren van de patiënt recapituleren op de genomische, transcriptomische11,36 en metabolomische niveaus44. Al deze factoren maken ze krachtige hulpmiddelen voor geneesmiddelenscreening en precisie-oncologie39. Patiënt-afgeleide organoïden zijn een opwindend nieuw modelsysteem dat zal dienen als driedimensionale in vitro modellen voor het bestuderen van kankerbiologie, evenals het onderzoeken van therapeutisch belangrijke vragen voor het bevorderen van het gebied van gepersonaliseerde geneeskunde. Normale en tumorborstorganoïden kunnen genetisch worden gemodificeerd via CRISPR-engineering15,38, waardoor ze gunstig worden gebruikt voor mechanistische genetische studies voor tumorigenese en kankerprogressie. Patiënt-afgeleide borsttumor organoïden zijn ook gebruikt om xenograftmodellen 11,38,39 te ontwikkelen die mogelijk tumorgroei bij patiënten kunnen nabootsen. Bovendien blijven patiënt-afgeleide borsttumor organoïde co-cultuursystemen een onderbelicht onderzoeksgebied dat krachtige inzichten kan bieden in het belang van overspraak tussen borstkankercellen en andere cellen, zoals stromale kanker-geassocieerde fibroblasten, immuuncellen, adipocyten, enz. in tumorprogressie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
We willen de leden van het Spector-lab bedanken voor de kritische discussies in de loop van dit werk. We bedanken Norman Sachs en Hans Clevers (Hubrecht Instituut, Nederland) voor het in eerste instantie verstrekken van hun organoïde kweekprotocol. We erkennen de CSHL Cancer Center Histology and Microscopy Shared Resources voor diensten en technische expertise (NCI 2P3OCA45508). Wij danken Dr. Qing Gao voor zijn hulp bij de voorbereiding van histologische monsters. We zijn dankbaar voor de steun van Dr. Karen Kostroff (Northwell Health) voor het verstrekken van tumormonsters van patiënten. We waarderen ook de inspanningen van het Northwell Health Biobanking-team voor monsterverwerving en we bedanken de patiënten en hun families voor het doneren van weefsels voor onderzoek. Dit onderzoek werd ondersteund door CSHL/Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.), en Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson en D.L.S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
| 175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
| 37 °C bead bath | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
| 50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
| 500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
| 6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
| 96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
| BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
| BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
| Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
| Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
| Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
| FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
| HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
| HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
| Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (~10 mg/mL protein concentration) | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
| Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
| Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
| N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
| Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
| P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
| p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
| Parafilm | transparent film | ||
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
| Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
| Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
| pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
| Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
| R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
| Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
| Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
| TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Greenwalt, I., Zaza, N., Das, S., Li, B. D. Precision Medicine and Targeted Therapies in Breast Cancer. Surgical Oncology Clinics of North America. 29 (1), 51-62 (2020).
- di Fiore, P. P., Pierce, J. H., Kraus, M. H., Segatto, O., King, C. R., Aaronson, S. A. erbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. Science. 237 (4811), 178 (1987).
- Hortobagyi, G. N., et al.
- Goutsouliak, K., et al. Towards personalized treatment for early stage HER2-positive breast cancer. Nature reviews. Clinical oncology. 17 (4), 233 (2020).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Huang, L., et al. PDX-derived organoids model in vivo drug response and secrete biomarkers. JCI Insight. 5 (21), (2020).
- Wood, L. D., Ewald, A. J. Organoids in cancer research: a review for pathologist-scientists. The Journal of Pathology. 254 (4), 395-404 (2021).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Sumbal, J., Budkova, Z., Traustadóttir, G. Á, Koledova, Z. Mammary Organoids and 3D Cell Cultures: Old Dogs with New Tricks. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 273-288 (2020).
- Bhatia, S., et al. Patient-derived triple negative breast cancer organoids provide robust model systems that recapitulate tumor intrinsic characteristics. Cancer Research. , (2022).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell– and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer. The EMBO Journal. 38 (15), (2019).
- Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. Modeling Breast Cancer Using CRISPR-Cas9–Mediated Engineering of Human Breast Organoids. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 112 (5), 540-544 (2020).
- Drost, J., Clevers, H.
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), 2574 (2019).
- Grossman, J. E., et al. Organoid Sensitivity Correlates with Therapeutic Response in Patients with Pancreatic Cancer. Clinical Cancer Research. 28 (4), 708-718 (2022).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
- Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- HCMI Catalog. , Available from: https://hcmi-searchable-catalog.ni.nih.gov/ (2022).
- Search ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/search#q=hcm&sort=relevancy&numberOfResults=24 (2022).
- Rosenbluth, J. M., et al. Organoid cultures from normal and cancer-prone human breast tissues preserve complex epithelial lineages. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Pal, P., et al. Endocrine Therapy-Resistant Breast Cancer Cells Are More Sensitive to Ceramide Kinase Inhibition and Elevated Ceramide Levels Than Therapy-Sensitive Breast Cancer Cells. Cancers. 14 (10), 2380 (2022).
- Ding, K., et al. Single cell heterogeneity and evolution of breast cancer bone metastasis and organoids reveals therapeutic targets for precision medicine. Annals of Oncology. , (2022).
- Sudhan, D. R., et al. Hyperactivation of TORC1 Drives Resistance to the Pan-HER Tyrosine Kinase Inhibitor Neratinib in HER2-Mutant Cancers. Cancer Cell. 37 (2), 183-199 (2020).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Tsai, S., et al. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 18 (1), 1-13 (2018).
- Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
- Liu, J., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Provide a Stromal Niche for Liver Cancer Organoids That Confers Trophic Effects and Therapy Resistance. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (2), 407-431 (2021).
- Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
- Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host & Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid Co-culture Methods to Capture Cancer Cell–Natural Killer Cell Interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER+ Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388 (2019).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- HUB Organoids: Patient in the lab. , Available from: https://www.huborganoids.nl (2022).
- Dekkers, J. F., et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nature Protocols. 16 (4), 1936-1965 (2021).
- Guillen, K. P., et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology. Nature Cancer. 3 (2), 232 (2022).
- PDX Portal. , Available from: https://pdxportal.research.bcm.edu/pdxportal/;jsessionid=3rrpefh3qlisqgbbq4vywfywc1dvn2vwaedbnizs.pdxportal?dswid=8217 (2022).
- Veeman, M. T., Slusarski, D. C., Kaykas, A., Louie, S. H., Moon, R. T. Zebrafish Prickle, a Modulator of Noncanonical Wnt/Fz Signaling, Regulates Gastrulation Movements. Current Biology. 13 (8), 680-685 (2003).
- Chen, X., Prywes, R. Serum-Induced Expression of the cdc25A Gene by Relief of E2F-Mediated Repression . Molecular and Cellular Biology. 19 (7), 4695-4702 (1999).
- Sflomos, G., et al. Atlas of lobular breast cancer models: Challenges and strategic directions. Cancers. 13 (21), 5396 (2021).
- Sharick, J. T., et al. Metabolic Heterogeneity in Patient Tumor-Derived Organoids by Primary Site and Drug Treatment. Frontiers in Oncology. 10, 1-17 (2020).
