Summary
Organoid-fibroblast co-kulturer giver en model til at studere in vivo stamcelleniche. Her beskrives en protokol for esophageal organoid-fibroblast co-kulturer. Derudover bruges helmonteret billeddannelse til at visualisere fibroblast-organoid-interaktionen.
Abstract
Epitelstamceller og stamceller bidrager til dannelsen og vedligeholdelsen af epitelbarrieren gennem hele livet. De fleste stam- og stamcellepopulationer er gemt væk på anatomisk forskellige steder, hvilket muliggør eksklusive interaktioner med nichesignaler, der opretholder stammen. Mens udviklingen af epitelorganoidkulturer giver et kraftfuldt værktøj til at forstå stam- og stamcellers rolle i homeostase og sygdom, er interaktionen inden for nichemiljøet stort set fraværende, hvilket forhindrer identifikation af faktorer, der påvirker stamcelleadfærd. Fibroblaster spiller en central rolle i styringen af epitelstammen og stamfaderens skæbne. Her præsenteres en omfattende organoid-fibroblast-cokulturprotokol, der muliggør afgrænsning af fibroblastsubpopulationer i esophageal stamcellefornyelse og differentiering. I denne protokol beskrives en metode til isolering af både epitelceller og fibroblaster parallelt fra spiserøret. Forskellige fluorescensaktiverede cellesorteringsstrategier til isolering af både esophageal stamceller såvel som fibroblast-subpopulationerne fra enten transgene reporter eller vildtypemus er skitseret. Denne protokol giver en alsidig tilgang, der kan tilpasses til at imødekomme isoleringen af specifikke fibroblastsubpopulationer. Etablering og overførsel af esophageal epitelorganoid monokulturer er inkluderet i denne protokol, hvilket muliggør en direkte sammenligning med co-kultursystemet. Derudover beskrives en 3D-clearing-tilgang, der muliggør detaljeret billedanalyse af epitel-fibroblast-interaktioner. Samlet beskriver denne protokol en komparativ og relativt høj gennemstrømningsmetode til identifikation og forståelse af esophageal stamcellenichekomponenter in vitro.
Introduction
Organoider anvendes som 3D in vitro-assays til at karakterisere stam- og stamceller samt til at forstå signalsignalsignalerne afledt af de cellulære komponenter i stamcellenichen 1,2,3,4. Mus esophageal organoider blev først beskrevet i 2014, og flere papirer har identificeret vækstfaktorer, som R-Spondin (RSPO), NOGGIN og epidermal vækstfaktor (EGF), der er nødvendige for at opretholde og passere esophageal organoider 5,6,7, idet de argumenterer for, at lignende signalsignaler er nødvendige for in vivo fornyelse af stamceller. Imidlertid tilsættes vækstfaktorer almindeligvis i ikke-fysiologiske koncentrationer, hvilket resulterer i organoide vækstbetingelser, som ikke nødvendigvis afspejler in vivo-signalmiljøet.
Fibroblaster er heterogene stromale cellepopulationer, der understøtter stamcelleegenskaber i mange stamcellenicher8. Kombination af epitelstamceller og fibroblaster i samme organoidkultur muliggør organoiddannelse i reducerede koncentrationer af eksogent supplerede vækstfaktorer. Organoid co-kultur systemer fra tarm og hepatisk epitel er beskrevet, men en protokol til etablering af esophageal organoid-fibroblast co-kulturer er stadig udestående 9,10,11.
I denne protokol skitseres to fluorescensaktiverede cellesorteringsstrategier (FACS) for fibroblaster fra spiserøret ved hjælp af enten transgene PdgfrαH2BeGFP-mus 12 eller vildtypemus med klassisk antistoffarvning. Forskellige subpopulationer af fibroblaster kan isoleres ved hjælp af valgte celleoverflademarkører, hvilket giver protokollen fleksibilitet. Derudover anvendes en 3D-fluorescensbilleddannelsesteknik, der bevarer organoidmorfologi, til at karakterisere fibroblast-organoidinteraktioner. Organoid clearing giver en hurtig metode til at øge lysindtrængningsdybden i organoiderne, forbedre visualiseringen af organoid-fibroblastforbindelser og muliggøre rekapitulation af organoidstrukturen i sin helhed. Denne protokol kombinerer esophageal organoid co-kultur med en hel mount imaging strategi, der muliggør funktionel karakterisering af fibroblast-organoid interaktion.
Protocol
Dyreforsøg til denne undersøgelse blev godkendt af Stockholms Norra djurförsöksetiska nämnd (etisk tilladelse nr. 14051-2019). Dyrene blev anbragt under patogenfrie forhold i henhold til anbefalingerne fra Federation of European Laboratory Animal Science Association.
1. Forberedelse
- Optø de enzymatiske stamopløsninger, der anvendes til dissociation (se materialetabel) på is. Der optøes en prøve af kældermembranmatrix (GFR) med vækstfaktorreduceret (GFR) ved 4 °C.
- Forbered kulturmediet. Brug det medium, der er beskrevet i tabel 1 for organoidkulturer og cokulturer, og forbered det, før protokollen påbegyndes.
2. Dissektion og adskillelse af spiserørepitel og stroma
BEMÆRK: Sørg for, at alle instrumenter, der anvendes til dissektion og vævsbehandling, er sterile. Forbered 2 ml dissociationsopløsning (se materialetabel) i Hanks' afbalancerede saltopløsning (HBSS) pr. tre spiserør.
- Brug en musestamme efter eget valg, såsom C57BL/6J-mus. Esophageal udvikling hos mus slutter efter postnatal dag (p) 70, så det anbefales at bruge mus, der er ældre end p7013. Brug fire eller fem mus, da de giver tilstrækkeligt materiale til at etablere 8-10 organoide samkulturer.
BEMÆRK: Organoiddannende effektivitet falder med musenes alder. Hvis specifikke fibroblastsubpopulationer er af interesse, er det muligt, at det lave fibroblastudbytte begrænser antallet af organoide cokulturer, der kan etableres. - Brug genetisk modificerede (f.eks. PdgfrαH2BeGFP) eller vildtypemus (WT) til isolering af fibroblastpopulationer. Når du bruger WT-mus, skal du udføre antistoffarvning for at isolere specifikke fibroblastsubpopulationer fra stroma via FACS.
- Aflive musene ved CO2 kvælning. Disseker spiserøret ved hjælp af tang og dissektionssaks. For at fjerne hele spiserøret skal du skære den distale ende af spiserøret direkte over maven og den proksimale ende i begyndelsen af luftrøret. Nedsænk spiserøret i PBS og læg det på is.
- Fjern muskulaturerne externa mekanisk ved hjælp af et dissektionsmikroskop (samlet forstørrelsesområde på 8x-40x) og tang. Hold den distale ende af den dissekerede spiserør ved hjælp af et par tang og brug de andre tang til at gribe og trække musklen fra den distale til den proksimale ende af den dissekerede spiserør. Fjern og kassér muskellaget.
- Åbn spiserøret i længderetningen. Dette fungerer bedst ved hjælp af mikrodissektionsfjedersaks med en kuglespids for at forhindre vævsskade. Hold den ene ende af spiserøret for at indsætte fjedersaksens kugle i spiserørets lumen og skære spiserøret op, mens du holder fast i enden.
- Placer spiserøret i et 1,5 ml mikrocentrifugerør eller en plade med 24 brønde. Det åbnede spiserør inkuberes i 0,5 mg/ml termolysin i HBSS ved 37 °C på en vipperyster i 15 minutter. Nedsænk spiserøret helt i termolysinopløsning.
BEMÆRK: Mængden af anvendt termolysinopløsning afhænger af brønden eller rørstørrelsen. Flere spiserør kan placeres og nedsænkes i samme brønd eller rør. - Tag spiserøret ud af termolysinopløsningen. Brug et dissektionsmikroskop til omhyggeligt at adskille spiserørets epitel fra stroma. Brug fine tang til at tage fat i både epitelsiden og stromasiden af vævet og langsomt trække dem fra hinanden for at adskille de to lag.
BEMÆRK: Stromaet identificeres ved sit hvide og uigennemsigtige udseende i modsætning til det gennemsigtige epitel. Stromaet indeholder lamina propria og submukosal lag. - Epitellaget og stromalaget overføres til to separate 1,5 ml mikrocentrifugeglas med 200 μL dissociationsopløsning i HBSS. Sæt på is.
3. Isolering af esophageal stamceller
BEMÆRK: Isoleringen af esophageal stamceller (trin 2) og fibroblaster (trin 3) kan udføres samtidigt. Forbered et 50 ml rør med 1% FBS i HBSS (1% FBS).
- Overfør det adskilte spiserørepitel fra 1,5 ml mikrocentrifugerøret (trin 2.8) til en ren petriskål, og brug en skarp skalpel til at hakke. Det hakkede væv fra petriskålen opsamles med 200 μL dissociationsopløsning og overføres tilbage til 1,5 ml mikrocentrifugeglasset.
BEMÆRK: Epitelet hakkes korrekt, når stykkerne kan placeres tilbage i 1,5 ml mikrocentrifugerøret ved hjælp af en 200 μL pipettespids. - Der tilsættes 800 μL frisk dissociationsopløsning til 1,5 ml mikrocentrifugerøret til et samlet volumen på 1 ml.
BEMÆRK: Det er vigtigt at tilføje en tilstrækkelig mængde dissociationsopløsning. Per en til tre spiserør anbefales 1 ml opløsning. Skaler op, når flere spiserør behandles på én gang. - Glasset med det hakkede epitellag anbringes på en vipperyster ved 37 °C i 60 minutter. Opløsningen pipetteres op og ned ca. 20 gange ved hjælp af en 200 μL pipettespids hvert 15. minut for at forbedre fordøjelsen.
- Efter 60 minutter pipetteres op og ned yderligere 20 gange ved hjælp af en 200 μL pipettespids. Før opløsningen gennem en 40 μm cellesi ind i et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør. Der centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Våd cellesien med 1% FBS, før cellerne belastes for at minimere cellernes vedhæftning til filteret. Epitelet fordøjes ikke fuldstændigt, og vævsstykker vil stadig være synlige. Længere inkubation vil dog nedsætte celleoverlevelsen og ikke resultere i et højere udbytte af levedygtige celler. - Supernatanten kasseres ved at fjerne overskydende væske med en 1 ml pipette og resuspenderes pelletten i 1 ml 1 % FBS. Der centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Under centrifugering fremstilles den konjugerede antistofblanding til FACS af esophageal stamceller.
- Bland 1 μL CD324-PE-Cy7 (ECADHERIN) og CD104-A647 (INTEGRIN-β4) i 200 μL 1% FBS pr. En million celler.
BEMÆRK: 1 μL antistof (200 μL slutvolumen) er tilstrækkeligt til en eller to spiserør. Når du behandler flere spiserør på én gang, øges volumenet af antistoffarvningsopløsningen.
- Resuspender pellet i 200 μL antistofblanding og overfør til et flowcytometrirør. Efter tilsætning af fluorescerende antistoffer skal cellesuspensionerne holdes i mørke for at undgå blegning af signal. Inkuber cellerne i 30 minutter ved 4 °C. Der tilsættes 3 ml 1 % FBS og centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C, og cellerne opslæmmes derefter igen i mindst 200 μL 1 % FBS.
BEMÆRK: 500 μL 1% FBS bruges til op til fire eller fem spiserør. Forøg volumenet, når flere spiserør behandles på én gang, så der kan opnås en FACS-strømningshastighed på 100-300 hændelser / s. Flere hændelser vil reducere sorteringseffektiviteten, og en stigning i strømningshastigheden vil reducere celleoverlevelsen. - Tilføj døde celle pletmarkør til en endelig koncentration på 1:10.000, 5 minutter før FACS-sortering for at isolere levende celler. Sorter stamcellerne ved hjælp af en FACS-maskine (se figur 1 for gating-strategi). Cellerne samles i 1,5 ml mikrocentrifugeglas fyldt med 200 μL basisk organoidmedium (tabel 1).
4. Isolering af fibroblaster fra stromallaget
- Klip stomilaget i fine stykker i et 1,5 ml rør indeholdende 200 μL dissociationsopløsning (trin 2.8) ved hjælp af en dissektionssaks. Vævet hakkes korrekt, når opløsningen kan pipetteres op og ned ved hjælp af en 200 μL pipettespids.
- Der tilsættes 800 μL frisk dissociationsopløsning til 1,5 ml mikrocentrifugerøret til et samlet volumen på 1 ml.
BEMÆRK: Det er vigtigt at tilføje en tilstrækkelig mængde dissociationsopløsning. Per en til tre spiserør anbefales 1 ml opløsning. Skaler op, når flere spiserør behandles på én gang. - Anbring tuben på en vipperyster ved 37 °C i 30 min. Efter 15 minutter pipetteres opløsningen op og ned ca. 20 gange ved hjælp af en 200 μL pipettespids for at forbedre fordøjelsen.
- Efter 30 minutters enzymatisk fordøjelse pipetteres op og ned yderligere 20 gange ved hjælp af en 200 μL pipettespids. Sil opløsningen gennem en 70 μm cellesi i et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør. Der centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Våd cellesien med 1% FBS, før cellerne belastes for at minimere cellernes vedhæftning til filteret. - Supernatanten kasseres ved at fjerne overskydende væske med en 1 ml pipette og resuspenderes pelletten i 1 ml 1 % FBS. Der centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Når du bruger en genetisk modificeret musestamme, der indeholder fluorescerende mærkede fibroblaster, er antistoffarvninger valgfrie. Hvis antistoffarvninger ikke er påkrævet, skal du fortsætte med trin 3.7 og overføre prøven til et flowcytometrirør.- Under centrifugering fremstilles den konjugerede antistofblanding til FACS-isolering af fibroblaster. Bland 1 μL CD26-APC (DPP4) i 200 μL 1% FBS pr. En million celler.
BEMÆRK: 1 μL antistof er tilstrækkeligt til en eller to spiserør. Når du behandler flere spiserør på én gang, øges volumenet af antistoffarvningsopløsningen.
- Under centrifugering fremstilles den konjugerede antistofblanding til FACS-isolering af fibroblaster. Bland 1 μL CD26-APC (DPP4) i 200 μL 1% FBS pr. En million celler.
- Resuspender pellet i 200 μL konjugeret antistofblanding i 1% FBS og overfør til et flowcytometrirør. Inkuber cellerne i 30 minutter ved 4 °C.
- Der tilsættes 3 ml 1 % FBS og centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C. Resuspender cellerne i mindst 200 μL af 1% FBS.
BEMÆRK: 500 μL 1% FBS bruges til op til fire eller fem spiserør. Forøg volumen, når flere spiserør behandles på én gang, så der kan opnås en strømningshastighed på 100-300 hændelser / s. Flere hændelser vil reducere sorteringseffektiviteten, og forøgelse af strømningshastigheden vil reducere celleoverlevelsen. Efter tilsætning af fluorescerende antistoffer skal cellesuspensioner holdes mørke for at undgå blegning af signalet. - Tilføj døde celle pletmarkør til en endelig koncentration på 1:10.000, 5 minutter før FACS-sortering for at isolere levende celler. Sorter cellerne ved hjælp af en FACS-maskine (se figur 1 for gating-strategi). Cellerne samles i 1,5 ml mikrocentrifugeglas fyldt med 200 μL basisk organoidmedium (tabel 1).
5. Etablering og kultur af esophageal organoider
BEMÆRK: Forvarm ERlav (organoid co-kultur), ENR (organoid) medium (se tabel 1 for beskrivelse) og en 48-brønds plade ved 37 °C. Den optøede matrix (fremstillet i trin 1) alikvote anbringes på is. Det anbefales at bruge matrixen, der leveres her (se materialetabel) til musespiserørorganoidkultur, da andre mærker af matrix påvirker organoiddannende effektivitet negativt.
- Til organoid co-kultur blandes de sorterede epitelceller og fibroblaster i et forhold på 1: 2 i et rør. For hver matrixkuppel skal du bruge 5.000 epitelceller og 10.000 fibroblaster. Når du forbereder dig på flere kupler, skal du tilføje et multiplum af 5.000 epitelceller og 10.000 fibroblaster til et rør. For organoidkulturer uden fibroblaster skal du bruge 5.000 epitelceller pr. Matrixkuppel.
- Den blandede cellepopulation centrifugeres ved 300 x g i 5 min. Supernatanten kasseres forsigtigt med en 200 μL pipette.
- Cellerne vaskes én gang ved at resuspendere pillen i koldt basisk organoidmedium og centrifugeres ved 300 x g i 5 min. Placer cellerne på is.
- Forbered en blanding bestående af 80% matrix og 20% koldt basisk organoidmedium. Placer alt på is, da matrixen størkner ved stuetemperatur (RT).
- Supernatanten kasseres efter centrifugering ved forsigtigt at fjerne den med en 200 μl pipette. Resuspender cellerne i 10 μL matrixblanding / kuppel og læg dem tilbage på is.
- Den forvarmede plade med 48 brønde tages fra inkubatoren med 37 °C, og der fremstilles én matrixkuppel pr. brønd ved hjælp af en 20 μL pipette. Hver kuppel indeholder 10 μL 80% matrix, 5.000 epitelceller, s og 10.000 fibroblaster. Overfør pladen på hovedet til en inkubator og lad kuplerne størkne i yderligere 20-30 minutter ved 37 °C.
BEMÆRK: Et fald i matrixkuppelvolumen og / eller en stigning i celleantal vil påvirke organoiddannende effektivitet. - Der tilsættes 200 μL forvarmetER-lavsubstrat (tabel 1) til matrixkuplerne indeholdende organoide cokulturer og ENR-medium (tabel 1) til de respektive matrixkupler, der kun indeholder epitelorganoider, og pladen anbringes i inkubatoren.
- Dyrk organoiderne ved 37 °C og 5% CO2. I de første 2 dage suppleres mediet med 10 μM Rock-hæmmer (Y-27623). Rockinhibitor forhindrer stressinduceret celledød og øger chancen for en vellykket etablering af organoidkulturer.
- Opdater mediet hver 2-3 dage. Sørg for, at mediet er varmt for at forhindre dissociation af den temperaturfølsomme matrix.
- Udfør analyser af eksperimentet 6 til 8 dage efter plettering. Organoiderne kan opbevares i kultur i op til 14 dage. Omkring dag 14 observeres tab af kuppelintegritet.
6. Passaging af organoider
BEMÆRK: Passaging af organoider dyrket i co-kultur resulterer i tab af fibroblaster. Derfor anbefales det at anvende ENR-medium til alle organoider, når de passeres. Forvarm ENR, PBS og en plade med 48 brønde ved 37 °C.
- Fjern mediet og vask brønden, der indeholder matrixkuplen, med forvarmet PBS. Tilsæt 200 μL kold 0,25% trypsinopløsning og pipette op og ned for at bryde matrixkuplen.
BEMÆRK: Brug af kold 0,25% trypsin anbefales, da matrixen er temperaturfølsom, og dette hjælper med at nedbryde matrixkuplerne. - Organoiderne inkuberes med trypsin ved 37 °C i ~20 min. Pipette op og ned efter 10 minutter for at øge dissociationen af organoiderne. Overvåg dissociationsprocessen med et mikroskop hvert 5-10 minut. Da trypsin nedsætter cellens levedygtighed, kan dette hjælpe med at identificere den ideelle dissociationstid.
- Efter 20 minutter pipetteres organoiderne op og ned med en 200 μL pipette for at adskille organoiderne. Opsaml cellerne i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, tilsæt 1 ml basisk organoidmedium og centrifuger ved 300 x g i 5 minutter ved RT.
- Valgfrit: For at sikre de bedste organoide vækstbetingelser, og at nye organoider stammer fra enkeltceller, siles cellerne gennem en forvædet 40 μm cellesi. Filtrering af cellesuspensionen resulterer i fjernelse af organoide kerner og celleklumper, der er svære at adskille.
- Forbered en matrixblanding bestående af 80% matrix og 20% koldt basisk organoidmedium. Placer alt på is, da matrixen størkner ved RT.
- Supernatanten kasseres forsigtigt med en 200 μL pipette, cellerne resuspenderes i 10 μL matrixblanding/kuppel, og blandingen lægges tilbage på is.
BEMÆRK: Organoider kan opdeles i forholdet 1: 5 til 1: 10 afhængigt af kuppeltætheden. Epitelceller kan også tælles og genbelægges til 5.000 celler / kuppel. - Tag den forvarmede 48-brønds plade fra 37 °C-inkubatoren, og lav en kuppel pr. Brønd. Overfør pladen på hovedet til en inkubator og lad kuplerne størkne i yderligere 20-30 minutter ved 37 °C.
- Der tilsættes 200 μL forvarmet ENR-medium til de respektive organoide kupler. Suppler substratet med 10 μM Rock-inhibitor (Y-27623) i de første 2 dage.
- Opdater mediet hver 2-3 dage. Sørg for, at mediet er varmt for at forhindre dissociation af den temperaturfølsomme matrix.
7. Organoidbehandling til helmonteret farvning
BEMÆRK: Overtræk spidserne og rørene med 10% FBS i PBS før brug for at undgå, at organoider klæber til plast. For pipettespidser er det tilstrækkeligt at pipette en eller to gange op og ned i 10% FBS/PBS-opløsning, før spidserne bruges. For rør fyldes røret med 10% FBS / PBS og fjernes derefter opløsningen.
- Fjern det organoide medium og tilsæt 200 μL iskold PBS til matrixkuplerne. Pladen lægges på is i 5-10 min.
- Pipetten pipetteres op og ned, og opløsningen overføres til 0,6 ml ikke-klæbende mikrocentrifugerør. Centrifuger kort i 30-60 s ved 100 x g for at lade organoiderne sætte sig i bunden.
BEMÆRK: Overskydende pipettering og lang centrifugering bryder organoiderne og forstyrrer fibroblast-organoid-interaktionen. - Fjern overskydende væske og tilsæt iskold PBS. Centrifuger kort i 30-60 s ved 100 x g for at lade organoiderne sætte sig i bunden.
- Fjern overskydende væske og fastgør organoiden med 200 μL kold 4% formaldehyd i PBS-opløsning i 30 minutter på is.
FORSIGTIG: Formaldehyd er giftigt og skal altid bruges i en kemisk damphætte. Nitrile handsker, sikkerhedsbriller og laboratoriefrakker skal altid bæres. - Fastgørelse af organoid får dem til at synke, og centrifugering er ikke længere nødvendig. Lad organoiderne synke ved at placere røret lodret og vent 2-3 min, fjern formaldehydet, og tilsæt 500 μL kold PBS for at vaske formaldehydet væk.
- Lad organoiderne synke, fjern overskydende PBS, og tilsæt 500 μL frisk kold PBS. Lad organoiderne synke, fjern overskydende PBS, og tilsæt 500 μL blokerende buffer (5% normalt æselserum, 1% BSA og 0,5% Triton X-100 i PBS). Sæt røret på en vipperyster i 60 minutter ved RT.
BEMÆRK: Blokering kan også udføres natten over (O/N) ved 4 °C. - Lad organoiderne synke, fjern blokeringsbufferen, og resuspender organoiderne i 200 μL blokerende buffer med primære antistoffer (se materialetabel). Opbevar organoiderne på en vippe-shaker O/N ved 4 °C.
BEMÆRK: For at forbedre farvningen af nukleare proteiner, lavt udtrykte proteiner eller antistoffer, der viser uspecifik farvning, kan inkubationstiden øges i 1 eller 2 dage ved 4 °C. Det er vigtigt at placere organoiderne på en vipperyster, da det forhindrer organoider i at klumpe sammen og øger farvningseffektiviteten. - Lad organoiderne synke, fjern den primære antistofblanding, og vask organoiderne ved hjælp af 500 μL 0,02% Triton X-100 i PBS (0,02% Tx) i 60 minutter ved RT. Gentag tre gange.
BEMÆRK: Når længere primær antistofinkubation er nødvendig, tilsættes et vasketrin med 0,02% Tx i PBS O/N ved 4 °C. - Lad organoiderne synke, fjern vaskebufferen, og tilsæt 200 μL fluorescenskonjugeret sekundært antistof i blokerende buffer O/N ved 4 °C. Efter tilsætning af fluorescerende sekundære antistoffer skal organoiderne holdes i mørke for at undgå blegning af signal.
- Lad organoiderne synke, fjern den sekundære antistofblanding, og vask organoiderne med 500 μL 0,02% Tx i 60 minutter ved RT. Gentag tre gange.
- Modbejdse organoiderne med 200 μL DAPI (0,25 μg / ml) opløsning til nuklear farvning, hvis det er nødvendigt. Inkuber prøverne i 60 minutter ved RT på en vipperyster.
- Lad organoiderne synke, fjern DAPI-opløsning, og vask organoiderne i 500 μL PBS i 15 minutter ved RT. Gentag tre gange.
- Lad organoiderne synke og fjern alt overskydende væske. Tilsæt 10 μL clearingopløsning til organoiderne og inkuber i 15 minutter ved RT.
BEMÆRK: Clearingopløsningen er tyktflydende, så skær den ydre del af en 20 μL pipettespids af, før du pipetterer clearingopløsningen. Mere rydningsløsning kan tilføjes, hvis der bruges en større afstandsstykke til billeddannelse. Monteringsopløsning kan bruges i stedet for clearingopløsningen, når organoiderne ikke ryddes. Rydningsløsningen reducerer baggrunden ved billeddannelse og øger billeddybden. - Placer en 0,05 mm dobbeltsidet klæbrig 4-brønds afstandsstykke på et mikroskopglas. Tilsæt 10 μL clearingopløsning med organoiderne i en brønd, og læg en dæksel oven på afstandsstykket.
BEMÆRK: Organoider kan også monteres uden brug af afstandsstykke. Afstandsstykket holder organoidformen intakt og forhindrer organoiderne i at blive fladtrykt. - Hold diaset ved RT O / N for at rydde organoiderne. Ved langtidsopbevaring opbevares objektglassene ved 4 °C. Hent billeder ved hjælp af et konfokalmikroskopisystem.
Representative Results
Spiserøret er opdelt i forskellige lag: epitel, lamina propria, submucosa og muscularis externa (figur 1A). Fibroblaster befinder sig i submucosa og lamina propria, kaldet stroma. I denne protokol fjernes muscularis externa mekanisk (figur 1B), hvilket ikke fører til tab af fibroblaster (PdgfrαH2BeGFP +), der er bosiddende i stroma (figur 1C). Før dissociation adskilles epitelet fra stromaet, hvilket resulterer i to vævssegmenter (figur 1B). Adskillelse af de to lag giver mulighed for at øge dissociationstiden for det mere robuste epitellag sammenlignet med det skrøbelige stromale lag. På denne måde etableres en effektiv isolationsprotokol, der giver både levedygtige epitelstamceller såvel som stromale fibroblaster (figur 1B). Esophageal stamceller sorteres baseret på deres høje INTEGRIN-β4 og E-CADHERIN ekspression (figur 1C, D).
Subpopulationer af fibroblaster kan isoleres ved hjælp af forskellige markører. I denne protokol tilvejebringes en strategi for fibroblastisolering baseret på almindeligt anvendte fibroblastmarkører PDGFRα og DPP4 (CD26). Isolering med enten PdgfrαH2BeGFP-reporterekspression eller DPP4-antistof viser, at omkring 50% af de isolerede celler er fibroblaster (figur 1E, F). Derudover er 70% af PDGFRα+ fibroblasterne DPP4+, hvilket indikerer, at der opnås en stort set overlappende, men ikke identisk, fibroblastpopulation. Efter isolering af både epitel- og stromale cellepopulationer dyrkes esophageal stamceller enten alene eller sammen med fibroblaster i en matrixkuppel. For at studere fibroblasters bidrag til organoiddannelse opretholdes cokulturen i et vækstfaktorreduceret medium (figur 1G).
Esophageal stamceller danner organoider i nærvær af EGF, NOGGIN og RSPO (ENR). Fjernelse af NOGGIN og reduktion af mængden af RSPO (25 ng/μL; ERlav) er tilstrækkelig til at forhindre organoiddannelse (figur 2A). Interessant nok genopretter tilføjelse af enten DPP4 + eller PDGFRα + fibroblaster til esophageal stamceller iER-lavmediet organoiddannende evne, hvilket viser en understøttende funktion for begge fibroblastpopulationer (figur 2A-D). Visualisering af PdgfrαH2BeGFP-transgenet viser, at fibroblaster er i tæt kontakt med epitelstamcellerne under organoiddannelse (figur 2A). På dag 6 er PdgfrαH2BeGFP+ fibroblaster stadig rigeligt til stede i co-kulturen. Fibroblaster er til stede i hele kuplen, nær og berører organoiderne (fuld pil) eller fastgjort til organoiderne (pilespids; Figur 2D).
Hele monteringsfarvning viser en 3D-repræsentation af interaktionen mellem fibroblasterne og organoiderne (figur 3). Selvom det er muligt at udføre hele monteringsprotokollen uden brug af en clearingopløsning, reducerer det organoidens gennemsigtighed og laserindtrængning (figur 3B, z-view). Ved montering af organoider hjælper afstandsstykket med at opretholde organoidmorfologi. I modsætning hertil flader plettering af dækslet direkte på organoiderne (uden afstandsstykke) organoiderne og resulterer i tab af organoidstruktur (figur 3A, B).
Både DPP4+ og PDGFRα+ fibroblasterne viser sig at være viklet rundt om organoiderne (figur 3C, Video1 og Video 2). Differentiering af esophageal organoider kan vurderes ved hjælp af forskellige markører. Figur 4 viser, at den medfølgende farvningsprotokol er egnet til keratiner, der er lettere at plette (KRT14/13) samt transkriptionsfaktorer, der er sværere at plette (TRP63/KLF4). Cokulturprotokollen genererer organoider med et lignende differentieringsmønster, som påvist in vivo13,14 og som set i organoider dyrket i ENR-medium; KRT14+ eller TRP63+ stamceller danner det ydre lag, og KRT13+ eller KLF4+ differentierede celler orienterer sig indad.
Denne protokol giver et værktøj til at studere esophageal stamcelleniche in vitro og visualiserer interaktionen mellem organoider og fibroblaster. Ved at implementere en protokol til isolering af fibroblaster ved hjælp af antistoffer kan metoden tilpasses og kan bruges til at studere fibroblastsubpopulationer uden behov for transgene mus.
Figur 1: Isolering af stamceller og fibroblastsubpopulationer fra spiserøret . (A) Skematisk oversigt over de forskellige lag i spiserøret. Stromaet indeholder lamina propria og submucosa. B) Skematisk oversigt over isolationsprotokollen. Musklen (muscularis externa) fjernes mekanisk ved hjælp af tang; Den resterende spiserør skæres åben og inkuberes i termolysin for at adskille epitellaget fra stroma. Epitelet og stroma adskilles, mekanisk hakket og enzymatisk fordøjes til enkeltcellesuspensioner. Dissocierede celler farves derefter og forberedes til FACS. (C) Tværsnit af spiserøret fjernet fra muscularis externa, der viser PdgfrαH2BeGFP+ fibroblaster i stroma. INTEGRIN-β4 (ITGβ4) og E-CADHERIN (ECAD) dobbelt positive celler er epitelstamcellerne i spiserøret. Skalabjælke = 100 μm. (D) Repræsentativt flowcytometriplot af epitelcelleisolering, der viser procentdelen af levende celler (øverste panel) fra alle enkeltceller. Det nederste panel viser procentdelen af isolerede ITGβ4+ ECAD+ stamceller (Prog.) fra alle levende celler. (E) Repræsentativt flowcytometriplot for stromal celleisolering, der viser procentdelen af levende celler (øverste venstre panel). Repræsentative flowcytometriplots, der viser procentdelen af isolerede DPP4+ fibroblaster (Fibr.; øverste højre panel) og Pdgfrα+ fibroblaster (nederste venstre panel) af alle levende celler. 70% af Pdgfrα+ fibroblasterne er også DPP4+ (nederste højre panel). (F) Repræsentativt flowcytometriplot for stromaet, der kun viser DPP4+-celler (2,5%), DPP4+ PDGFRα+-celler (37,5%) og PDGFRα+-celler (17,7%). Procentdelene er af alle levende celler. G) Kun epitelceller belægges i en matrixkuppel under tilstedeværelse af 50 ng/μL EGF, 100 ng/μL NOGGIN og 250 ng/μL RSPO (ENR) eller sammen med fibroblaster ved tilstedeværelse af EGF og en lav koncentration af RSPO (25 ng/μL). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative resultater af organoide samkulturer. (A) Brightfield-billeder, der viser organoidernes vækst fra dag 1 til dag 6. Brightfield-billederne med organoiderne dyrket sammen med Pdgfrα H2BeGFP + fibroblaster viser også det nukleareeGFP-signal. Skalabjælke = 25 μm. (B) Brightfield-billeder af hele matrixkuplen på dag 6. Den venstre kolonne viser organoide co-kulturer dyrket i nærvær af Pdgfrα+ fibroblaster i ER lav eller E lavRlav medium. Den midterste kolonne viser organoide co-kulturer dyrket i nærvær af DPP4+ fibroblaster i ER lav ellerE lav Rlav medium. Højre kolonne viser organoide monokulturer dyrket i ENR-medium. ENR-medium = EGF (50 ng/μL), NOGGIN (100 ng/μL) og RSPO (250 ng/μL). ERlav = EGF og 25 ng/μL RSPO. E lavRlav = 5 ng/μL EGF og 25 ng/μL RSPO. Skalabjælke = 500 μm. (C) Graf, der viser organoiddannende effektivitet (%) (dvs. procentdelen af celler, der danner organoider under forskellige dyrkningsbetingelser). Hver prik repræsenterer en matrixkuppel, og bjælken repræsenterer gennemsnittet af alle prikker pr. betingelse. (D) Brightfield og fluorescerende billede af dag 6 organoider dyrket sammen med PdgfrαH2BeGFP+ fibroblaster. PdgfrαH2BeGFP+ fibroblaster er til stede i hele kuplen, fastgjort til organoiderne (pilespids) og løsrevet, men i kontakt med organoiderne (fuld pil). Skalabjælke = 250 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Helmonteret farvningsprotokol til undersøgelse af fibroblast-organoid-interaktioner . (A) Skematisk oversigt over hele mount immunofluorescensprotokollen. AB = antistof. (B) Immunofluorescensbillede af uryddet helmonteret farvning, der viser en nedsat gennemsigtighed og penetration af laserlyset sammenlignet med de ryddede organoider. Fraværet af en spacer resulterer i udfladning af organoid og tab i organoid morfologi. (C) Hele monteringsbilleder af de samdyrkede organoider viser 3D-overflader af organoiderne med VIMENTIN + fibroblaster (Fibr.) viklet rundt om og i tæt kontakt med organoiden. 3D-tværsnit og 2D-planbilleder viser organoidens lumen. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Hele monterede billeder afslører forskellige basale og suprabasale cellepopulationer . (A) Helmonteret farvning af mono- og samdyrkede organoider med PdgfrαH2BeGFP+ fibroblaster, der viser KRT14+ basalceller i det ydre lag og KRT13+ differentierede suprabasale celler. Skalabjælke = 50 μm. (B) Helmonteret farvning af mono- og co-dyrkede organoider med PdgfrαH2BeGFP+ fibroblaster, der viser TRP63+ basalceller i det ydre lag og KLF4+ differentierede suprabasale celler. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Tabel, der beskriver organoidkulturmediekomponenterne. Klik her for at downloade denne tabel.
Video 1: PdgfrαH2BeGFP+ fibroblast viklet rundt om og i tæt kontakt med organoiden. Videoen ledsager det øverste panel i figur 3C. Skalabjælken i figur 3C er 50 μm, og organoiden er ~ 120 μm i diameter. VIMENTIN er vist i hvidt, E-CADHERIN i rødt, PdgfrαH2BeGFP i grønt og DAPI i blåt. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: DPP4+ fibroblast viklet rundt om og i tæt kontakt med organoiden. Videoen ledsager det nederste panel i figur 3C. Skalabjælken i figur 3C er 50 μm, og organoiden er ~ 120 μm i diameter. VIMENTIN er vist i hvidt, E-CADHERIN i rødt og DAPI i blåt. Klik her for at downloade denne video.
Discussion
Protokollen, der præsenteres her, etablerer en in vitro-model til undersøgelse af funktionelle esophageal epitel-fibroblast-interaktioner.
Epitellaget er adskilt fra stroma, hvilket giver mulighed for en optimeret dissociationsprotokol for både epitel- og stromalrummet. På trods af optimering af epiteldissociationsprotokollen forbliver vævsklumper tydelige. Kraftig pipettering op og ned hvert 15. minut reducerer antallet og størrelsen af klumper betydeligt. Andre protokoller bruger trypsin til yderligere at dissociere epitellaget, 5,6. Her anbefales det ikke at bruge trypsin eller øge dissociationstiden yderligere, da dette har tendens til at resultere i nedsat epitelcellelevedygtighed og organoiddannende effektivitet. I modsætning til epitelet adskilles stroma let, og 30 min i dissociationsopløsning resulterer i en enkeltcellesuspension med ~ 90% fibroblastlevedygtighed (figur 1E). Udelukkelse af epitel-stomale separationstrin i protokollen øger dissociationstiden betydeligt, hvilket resulterer i en nedsat fibroblastlevedygtighed og et lavere udbytte af epitelceller. Derudover giver adskillelse af epitelet fra stroma mulighed for at bestemme celleantallet for hver population og blande epitelceller og fibroblaster fra forskellige muselinjer, når co-kulturerne oprettes.
Undersøgelse af fibroblastfunktion på organoidvækst er en almindeligt anvendt metode i stamcellebiologi 9,10,11,15,16. Etablerede co-kultur medier er enten DMEM suppleret med 10% føtal kalveserum (FCS)9,15 eller vækstfaktor reduceret medium10,16. I denne protokol bruges vækstfaktorreduceret medium til at efterligne forholdene i in vivo-stamcellenichen, hvor fibroblaster stort set er hvilende. FCS er et vækstfaktorrigt serum, som resulterer i aktivering og proliferation af fibroblaster i co-kulturerne, sandsynligvis svarende til en fibroblastcelletilstand, der adskiller sig fra in vivo-tilstanden. Ved at udelukke FCS og reducere vækstfaktorer, så mediet alene (ERlav) ikke understøtter organoidvækst og ikke stimulerer fibroblastproliferation, er det muligt at isolere fibroblasternes virkning på organoidvæksten. I dette medium fjernes NOGGIN og RSPO reduceres til et minimum (10% RPSO). Både NOGGIN og RSPO har vist sig at være afgørende for esophageal organoid vækst6. EGF blev bibeholdt i samkulturmediet, da det ikke i sig selv understøtter organoidvækst. Imidlertid er fibroblaster også i stand til at understøtte organoidvækst i et EGF-reduceret medium (Elav Rlav; Figur 2B, D).
Organoid co-kulturer kan ikke opretholdes gennem passaging som fibroblaster går tabt under trypsinisering. Imidlertid blev organoid passaging inkluderet i protokollen, da esophageal organoider kan opretholdes, udvides og anvendes til yderligere eksperimenter som monokulturer. Passagede organoider fra monokulturer kan bruges til at oprette co-kulturer med frisk isolerede fibroblaster. En ulempe ved at bruge primære celler er antallet af mus, der er nødvendige for at oprette flere organoide cokulturer. Når man fokuserer på små subpopulationer af fibroblaster, er antallet af opnåede cokulturer begrænset. I andre protokoller udvides fibroblaster først i kultur, før de bruges til at oprette organoide cokulturer10. Imidlertid ændrer fibroblaster morfologi og identitet under passage, vist ved anvendelse af primære hud- og hjertefibroblaster17,18. Konventionel 2D-passaging af esophageal fibroblaster resulterer i både morfologi og fænotypeændringer, hvilket viser, at in vitro-berigelse af fibroblaster ikke er egnet til cokulturer, der sigter mod fænokopi af den endogene stamcelleniche.
Helmonteret farvning giver et værktøj til at opretholde og visualisere fibroblast-organoidinteraktion. Det skal bemærkes, at selvom ikke alle organoider vil have fibroblaster direkte knyttet til dem, er de fleste organoider i kontakt med fibroblaster (se figur 2C). For at opretholde epitel-fibroblast-interaktioner er det vigtigt at håndtere organoiderne med omhu og undgå kraftig pipettering, hvirvelstrøm og højhastighedsspinding. Optimal fiksering er vigtig for at opretholde 3D-vævsarkitektur samt holde endogen fluorescens. En 30 minutters fiksering er tilstrækkelig til at bevare H2BeGFP-signalet og er optimal for de antistoffer, der anvendes i denne protokol, men dette kan variere mellem de anvendte fluoroforer og antistoffer. Rydning af organoiderne reducerer lysspredning og forbedrer visualiseringen af hele 3D-strukturen betydeligt. Da organoiderne er små, er rydning let og hurtig; Imidlertid kan billeddannelse af hele organoider ved hjælp af laserscanningskonfokalmikroskopi være tidskrævende, da der skal laves flere Z-stakke. Konfokale mikroskoper, som den roterende skive, kan bruges til at reducere billeddannelsestiden.
Samlet set giver esophageal organoider dyrket i nærvær af fibroblaster et værdifuldt værktøj til at forstå aspekter af esophageal stamcelleniche. Derudover giver helmonteringsrydning en tilgængelig metode til at visualisere interaktionen mellem fibroblaster og organoider.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af ERC StG TroyCAN (851241). E.E. er postdoc i Cancerfonden. M.G. er Ragnar Söderberg Fellow og Cancerfonden Junior Investigator. Vi er taknemmelige for den tekniske assistance fra Karolinska Institutet kernefaciliteter, herunder Biomedicum Flow Cytometry Core Facility, Biomedicum Imaging Core (BIC) og Comparative Medicine Biomedicum (KMB) dyrefacilitet. Vi takker medlemmer af Genander-laboratoriet for omhyggeligt at læse og kommentere protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher (Gibco) | 17504001 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | fisher scientific | 356231 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher (Gibco) | 11320074 | |
| DPBS | Thermo Fisher (Gibco) | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher (Gibco) | 35050061 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher (Gibco) | 14175-129 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher (Gibco) | 15140122 | |
| Triton X-100 solution | Merck | 93443-100ML | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher (Gibco) | 25200-056 | |
| Chemicals, Peptides, and recombinant proteins | |||
| DAPI Solution | Thermo Fisher | 62248 | |
| Dissociation solution: 0.25 mg/ml Liberase TM, 0.25 mg/ml Dnase in HBSS | |||
| Dnase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Formaldehyde, 37%, with 10-15% methanol | Sigma-Aldrich | 252549-1L | |
| Liberase | Sigma-Aldrich | 5401127001 | |
| N-Acetyl-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-25G | |
| Noggin murine | Peprotech | 250-38 | |
| RapiClear 1.47 | SunJin Lab | #RC147001 | |
| Recombinant Mouse EGF Protein, CF | R&D systems | 2028-EG-200 | |
| R-spondin-1 murine | Peprotech | 315-32 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Thermo Fisher | S34857 | |
| Thermolysin | Sigma-Aldrich | T7902-25MG | |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503-5MG | |
| Plastic & Glassware | |||
| Corning Sterile Cell Strainers 40um | VWR | 15360801 | |
| Corning Sterile Cell Strainers 70um | VWR | 431751 | |
| Menzel Deckgläser/ cover slips | Thermo Fisher | Q10143263NR15 | |
| SafeSeal reaction tube, 1.5 mL, PP | Sarstedt | 72.706 | |
| Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes 0.6 mL | Thermo Fisher | 3446 | |
| SuperFrost Slides | VWR | 631-9483 | |
| Tools | |||
| 0.05 mm 4 circular well iSpacer | SunJin Lab | #IS204 | |
| Dumont #5 forceps, biology tip | F.S.T | 11252-20 | |
| ImmEdge Pen | VectorLaboratories | H-4000 | |
| Spring Scissors Angled to Side Ball Tip 8mm Cutting Edge | F.S.T | 15033-09 | |
| Instruments | |||
| Confocal microscope Stellaris 5 | Leica | ||
| Dissection microscope ZEISS Stemi 305 | Zeiss | ||
| FACS ARIA III | BD Biosciences | ||
| Conjugated Antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD104 Antibody Clone: 346-11A |
123608 | 123608 | |
| APC anti-mouse CD26 (DPP-4) Antibody | H194-112 | H194-112 | |
| PE/Cy7 anti-mouse/human CD324 (E-Cadherin) Antibody | 147310 | 147310 | |
| Antibodies for Immunofluorescence | |||
| CD104 (ß-integrin 4) Clone: 346-11A |
BioLegend | 553745 | |
| Cytokeratin 14 | Acris Antibodies (AbD Serotec) | BP5009 | |
| Cytokeratin13 Clone: EPR3671 |
abcam | ab92551 | |
| E-cadherin (CD324) Clone: 2.40E+11 |
Cell Signaling Technology | 3195 | |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified Clone: Poly9059 |
BioLegend | 905901 | |
| p63 Clone: 4a4 |
abcam | ab735 | |
| Recombinant Anti-KLF4 antibod Clone: EPR20753-25 |
abcam | ab214666 | |
| Vimentin | Sigma-Aldrich | AB5733 | |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-species* antibodies with fluorophore of choice | Jackson Immuno |
References
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Lohmussaar, K., et al. Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer. Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).
- Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
- DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).
- Kasagi, Y., et al. The esophageal organoid system reveals functional interplay between notch and cytokines in reactive epithelial changes. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (3), 333-352 (2018).
- Plikus, M. V., et al. Fibroblasts: Origins, definitions, and functions in health and disease. Cell. 184 (15), 3852-3872 (2021).
- McCarthy, N., et al. Distinct mesenchymal cell populations generate the essential intestinal BMP signaling gradient. Cell Stem Cell. 26 (3), 391-402 (2020).
- Cordero-Espinoza, L., et al. Dynamic cell contacts between periportal mesenchyme and ductal epithelium act as a rheostat for liver cell proliferation. Cell Stem Cell. 28 (11), 1907-1921 (2021).
- Pastula, A., et al. Three-dimensional gastrointestinal organoid culture in combination with nerves or fibroblasts: a method to characterize the gastrointestinal stem cell niche. Stem Cells International. 2016, 3710836 (2016).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- McGinn, J., et al. A biomechanical switch regulates the transition towards homeostasis in oesophageal epithelium. Nature Cell Biology. 23 (5), 511-525 (2021).
- Zhang, Y., Bailey, D., Yang, P., Kim, E., Que, J. The development and stem cells of the esophagus. Development. 148 (6), (2021).
- Ohlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. The Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
- Pentinmikko, N., et al. Notum produced by Paneth cells attenuates regeneration of aged intestinal epithelium. Nature. 571 (7765), 398-402 (2019).
- Janson, D., Rietveld, M., Willemze, R., El Ghalbzouri, A. Effects of serially passaged fibroblasts on dermal and epidermal morphogenesis in human skin equivalents. Biogerontology. 14 (2), 131-140 (2013).
- Landry, N. M., Rattan, S. G., Dixon, I. M. C. An improved method of maintaining primary murine cardiac fibroblasts in two-dimensional cell culture. Scientific Reports. 9 (1), 12889 (2019).
