Summary
We presenteren een op grafeenarray gebaseerde hersenkarteringsprocedure om de invasiviteit te verminderen en de spatiotemporale resolutie te verbeteren. Op grafeenarrays gebaseerde oppervlakte-elektroden vertonen biocompatibiliteit op lange termijn, mechanische flexibiliteit en geschiktheid voor hersenkartering in een ingewikkeld brein. Dit protocol maakt het mogelijk om meerdere vormen van sensorische kaarten tegelijkertijd en sequentieel te construeren.
Abstract
Corticale kaarten vertegenwoordigen de ruimtelijke organisatie van locatieafhankelijke neurale reacties op sensomotorische stimuli in de hersenschors, waardoor fysiologisch relevant gedrag kan worden voorspeld. Verschillende methoden, zoals penetrerende elektroden, elektro-encefalografie, positronemissietomografie, magneto-encefalografie en functionele magnetische resonantiebeeldvorming, zijn gebruikt om corticale kaarten te verkrijgen. Deze methoden worden echter beperkt door een slechte spatiotemporele resolutie, een lage signaal-ruisverhouding (SNR), hoge kosten en niet-biocompatibiliteit of veroorzaken fysieke schade aan de hersenen. Deze studie stelt een op grafeenarray gebaseerde somatosensorische mappingmethode voor als een kenmerk van elektrocorticografie die superieure biocompatibiliteit, hoge spatiotemporale resolutie, wenselijke SNR en minimale weefselschade biedt, waardoor de nadelen van eerdere methoden worden overwonnen. Deze studie toonde de haalbaarheid aan van een grafeenelektrode-array voor somatosensorische mapping bij ratten. Het gepresenteerde protocol kan niet alleen worden toegepast op de somatosensorische cortex, maar ook op andere cortices zoals de auditieve, visuele en motorische cortex, en biedt geavanceerde technologie voor klinische implementatie.
Introduction
Een corticale kaart is een verzameling lokale patches die reactie-eigenschappen vertegenwoordigen op sensomotorische stimuli in de hersenschors. Ze zijn een ruimtelijke formatie van neurale netwerken en maken voorspelling mogelijk voor perceptie en cognitie. Daarom zijn corticale kaarten nuttig bij het evalueren van neurale reacties op externe stimuli en het verwerken van sensomotorische informatie 1,2,3,4. Invasieve en niet-invasieve methoden zijn beschikbaar voor corticale mapping. Een van de meest voorkomende invasieve methoden omvat het gebruik van intracorticale (of penetrerende) elektroden voor het in kaart brengen van 5,6,7,8.
Het beoordelen van de on-demand corticale kaarten met hoge resolutie met behulp van penetrerende elektroden is op verschillende obstakels gestuit. De methode is te bewerkelijk om een fatsoenlijke kaart te verkrijgen en te invasief om te implementeren voor klinisch gebruik, waardoor verdere ontwikkeling wordt belemmerd. Meer recente technologieën zoals elektro-encefalografie (EEG), positronemissietomografie (PET), magneto-encefalografie (MEG) en functionele magnetische resonantiebeeldvorming (fMRI) hebben aan populariteit gewonnen omdat deze minder invasief en reproduceerbaar zijn. Gezien hun onbetaalbare kosten en slechte oplossing worden ze echter in een beperkt aantal gevallen gebruikt 9,10,11. Onlangs hebben flexibele oppervlakte-elektroden met superieure signaalbetrouwbaarheid veel aandacht getrokken. Op grafeen gebaseerde oppervlakte-elektroden tonen langdurige biocompatibiliteit en mechanische flexibiliteit, waardoor stabiele opnames in een ingewikkeld brein worden geboden 12,13,14,15,16. Onze groep heeft onlangs een op grafeen gebaseerde meerkanaalsarray ontwikkeld voor opname met hoge resolutie en locatiespecifieke neurostimulatie op het corticale oppervlak. Deze technologie stelt ons in staat om de corticale representaties van sensorische informatie gedurende een langere periode bij te houden.
Dit artikel beschrijft de stappen die betrokken zijn bij het verkrijgen van een hersenkaart van de somatosensorische cortex met behulp van een 30-kanaals grafeen multi-elektrode array. Om de hersenactiviteit te meten, wordt een grafeenelektrode-array op het subdurale gebied van de cortex geplaatst, terwijl de voorpoot, voorpoot, achterpoot, achterpoot, romp en snorharen worden gestimuleerd met een houten stok. De somatosensorisch-opgewekte-potentialen (SEP's) worden geregistreerd voor somatosensorische gebieden. Dit protocol kan ook worden toegepast op andere hersengebieden, zoals de auditieve, visuele en motorische cortex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures voor het hanteren van dieren werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Incheon National University (INU-ANIM-2017-08).
1. Voorbereiding van dieren op een operatie
OPMERKING: Gebruik Sprague Dawley Rat (8-10 weken oud) zonder de geslachtsbias voor dit experiment.
- Verdoof de rat met 90 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine cocktail intraperitoneaal. Om de gewenste diepte van anesthesie tijdens de operatie te behouden, geeft u een aanvullende 45 mg / kg ketamine en 5 mg / kg xylazinecocktail wanneer de rat tekenen van ontwaken vertoont.
- Bevestig dat de rat onder diepe anesthesie is en controleer regelmatig lichaamsreflecties zoals teenknijpen, staartknijpen en hoornvliesreflex.
- Scheer de vacht tussen de ogen en de achterkant van de oren met een trimmer.
- Breng een oogzalf aan op de ogen om te voorkomen dat ze uitdrogen.
2. Chirurgie voor blootstelling aan corticale oppervlakken
- Bevestig de rattenkop op het stereotaxische apparaat met een stereotaxische adapter. Om de lichaamstemperatuur van 37 °C tijdens de operatie te handhaven, plaatst u de rat op een temperatuurgeregeld verwarmingskussen.
- Steriliseer het geschoren gebied met afwisselend scrubs van alcohol en povidon-jodium drie keer.
- Gebruik een tang om de hoofdhuid stevig vast te pakken en injecteer 0,1 ml lidocaïne (2%) met een spuit rechtstreeks in de hoofdhuid om lokale anesthesie in het operatiegebied te induceren.
- Maak een 2-3 cm lange middellijnincisie met een scalpel en trek de hoofdhuid uit elkaar om de schedel bloot te leggen.
- Klem de hoofdhuid vast met een muggentang om de schedel bloot te leggen.
- Krab het oppervlak van de schedel met een tang om het botvlies te verwijderen.
- Stomp ontleed de spieren over de achterhoofdsschedel om de cisterna magna boven de as aan de bovenkant van het ruggenmerg bloot te leggen.
- Snijd de cisterna magna in met het mes om het hersenvocht af te voeren en plaats een steriel gaas in de incisie van de cisterna magna om het hersenvocht constant te absorberen om hersenoedeem te voorkomen en ontstekingen te minimaliseren.
- Markeer met een potlood op de schedel een rechthoekig venster van 3 mm in de anteroposterieure as en 6 mm in de rechter zijwaartse richting van het bregma van de rechterhersenhelft.
OPMERKING: Markering moet een afstand van 1 mm tot de middellijn beveiligen om superieure sagittale sinusruptuur te voorkomen. - Boor het gemarkeerde gebied volgens de stereotaxische coördinaat en verwijder de schedel met een bot rongeur.
- Om de dura mater te verwijderen, buigt u de punt van de naald van 26 G tot 90°, maakt u een gat in de dura mater, tilt u de dura mater op, steekt u een tang in dat gat en scheurt u deze met een tang.
- Plaats met zoutoplossing bevochtigd gaas op de somatosensorische cortex om te voorkomen dat deze uitdroogt.
3. Voorbereiding van grafeenelektrode-array aangesloten op het registratiesysteem
- Bereid een grafeenelektrode-array voor met een omneticaconnector.
- Maak de grafeen multi-elektrode array los zonder schade te veroorzaken door de zoutoplossing aan te brengen.
- Verwijder de buitenste bekleding van de referentie- en massadraden van de connector.
- Verbind het hoofdstadium met de grafeenelektrode-array met de connector.
- Sluit de interfacekabel die is gekoppeld aan het hoofdpodium aan op het opnamesysteem.
- Bevestig het grafeenelektrode-arraycomplex in de stereotaxische arm.
- Om neurale signalen van alle kanalen op te vangen, plaatst u de array op de somatosensorische cortex zonder enige buiging, volgens de vooraf bepaalde stereotaxische coördinaten.
- Plaats een referentiedraad onder het weefsel achter het achterhoofdsbeen en verbind de aarddraad met de geaarde optische tafel.
4. Fysieke stimulatie en registratie van SEP's voor het in kaart brengen
- Open de neurale signaalopnamesoftware.
- Stel de opnamesoftwareomgeving in: (1) stel de bemonsteringsfrequentie in voor SEP's en het inkepingsfilter (60 of 50 Hz, een frequentie van huishoudelijk elektrisch vermogen) om het geluid van de voedingslijn te verwijderen.
- Voor whisker mapping buig je de whisker met een fijne stick.
- Prik constant de voorpoot, voorpoot, achterpoot, achterpoot en romp met een houten stok voor body mapping.
- Registreer neurale signalen in het data-acquisitiesysteem voor de aangegeven tijd.
5. Euthanasie bij dieren
- Offer na alle opnameprocedures de ratten op met anesthesie met behulp van >5% isofluraan en voer cervicale dissectie uit.
6. SEP-meting voor corticale mapping
- Open MATLAB met codenaam read_Intan_RHS2000_file.m voor signaalanalyse.
OPMERKING: read_Intan_RHS2000_file.m kan worden gedownload van "https://intantech.com/downloads.html?tabSelect=Software". - Klik op de knop Uitvoeren , selecteer het opnamebestand met de bestandsextensie ".rhs" en wacht tot het bestand is verwerkt en gelezen.
- Voer het commando "plot (t, amplifier_data("kanaalnummer",:))" in om een 2D-lijnplot van de opnamegegevens te maken, de SEP's te vinden en de amplitude van SEP's in alle kanalen te berekenen.
OPMERKING: Voer het kanaalnummer in bij 'kanaalnummer'. Met 'plot(t, amplifier_data(1,:))' wordt bijvoorbeeld de 2D-lijnplot van kanaal 1 gemaakt. Wanneer de experimentator de amplitude van de respons berekent, kiest u bovendien de respons die van elk kanaal is opgenomen. - Verkrijg gegevens door het raster met een andere tint te kleuren, afhankelijk van de amplitude van de SEP's.
OPMERKING: MATLAB commando "imagesc" helpt sneller een topografische kaart te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol beschrijft hoe een grafeen meerkanaals array op het oppervlak van de hersenen is gemonteerd. De somatosensorische kaart werd geconstrueerd door neurale reacties op fysieke stimuli te verkrijgen en de amplitude van de respons te berekenen. Figuur 1 toont het schema van dit experiment.
Figuur 2A toont de structurele kenmerken van een grafeenelektrode-array. Er zitten steekgaten van het substraat tussen de elektroden. Deze gaten helpen de elektrode stevig contact te maken met het corticale oppervlak (figuur 2B). De sterke hechting van de elektrode aan de cortex helpt neurale signalen op te nemen met minder ruis.
Figuur 2C (links) toont de locatieafhankelijke neurale reacties die worden verkregen door het stimuleren van de snorharen, romp, poten en ledematen gecodeerd in verschillende kleuren. Een rat homunculus, het miniatuurlichaam van de rat, wordt getekend met de werkelijke verhouding van elke kleurgrootte in de somatosensorische cortexkaart (figuur 2C, rechts).
Figuur 2D toont stimuli-specifieke reacties met kleuren geassocieerd met elk lichaamsdeel. De reacties worden geregistreerd via een grafeenelektrode-array die op het oppervlak van de cortex wordt geplaatst. Met behulp van de gegevens die zijn geregistreerd uit de grafeenarray, wordt de amplitude van SEP's berekend om de amplitude-afhankelijke somatosensorische kaart te verkrijgen.
Sensorische stimulus-geïnduceerde lokale veldpotentialen maken de constructie van de somatosensorische kaart mogelijk. De reactiegrootte op elke lichaamsstimulus stelt knaagdier homunculus. Elke kleur vertegenwoordigt een ander lichaamsdeel (figuur 3).
De verworven cortexkaart met behulp van dit protocol onthult de specifieke regio's in de somatosensorische cortex die reageren op de snorharen, voorpoten, voorpoten, achterpoten, achterpoten en stammen. Het geeft inzicht in de mate van betrokkenheid van het corticale gebied bij het verwerken van fysieke stimulusinformatie voor elk lichaamsdeel.
Afbeelding 1: Schema van de opstelling van het experiment. De op grafeen gebaseerde elektrode-array is bevestigd aan de somatosensorische cortex en de snorharen of andere lichaamsdelen worden gestimuleerd door zachte aanraking. De dikke rode lijn vertegenwoordigt de kabel en de dunne rode en blauwe lijnen vertegenwoordigen de grond- en referentiedraden. De zwarte stip geeft de bregma aan. Het data-acquisitiesysteem is via USB op de computer aangesloten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Op grafeen gebaseerde micro-elektrode-array voor het in kaart brengen van de hersenen op het corticale oppervlak. (A) Schema van de op grafeen gebaseerde elektrode-array. (B) Optisch beeld van de grafeenelektrode-array op het corticale oppervlak. (C) Auditieve en somatosensorische cortices van ratten. Twee kaarten van auditieve en somatosensorische gebieden die reageren op auditieve stimuli met verschillende frequentietonen en fysieke stimuli toegepast op elk lichaamsdeel. (D) De 30-kanaals (exclusief de referentie- en grondelektroden) registratie van de grafeen-elektrode-array op het corticale oppervlak. Dooskleuren correleren met de geografische locaties van het corticale oppervlak. De cijfers zijn aangepast en aangepast van Lee et al. (2021). 4Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Somatosensorische kaart. (A) Locatie van neurale opnames over corticale lagen (links). Een corticale oppervlaktekaart bepaald met behulp van een grafeenelektrode-array. Een kleurgecodeerde somatosensorische kaart geconstrueerd met behulp van de responsamplitudes en overlappend met de homunculus (rechts). (B) Geregistreerde corticale SEP's en kaarten na de stimulatie van elk lichaamsdeel. Dit cijfer is aangepast en aangepast van Lee et al. (2021). 4Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gepresenteerde protocol biedt een diepgaand, stapsgewijs proces dat uitlegt hoe de somatosensorische reacties van ratten kunnen worden geopend en in kaart gebracht met behulp van een grafeenelektrode-array. De door het protocol verkregen gegevens zijn SEP's die somatosensorische informatie leveren die synaptisch is gekoppeld aan elk lichaamsdeel.
Verschillende aspecten van dit protocol moeten in overweging worden genomen. Bij het extraheren van hersenvocht om hersenoedeem te voorkomen en ontstekingen te verminderen, is het cruciaal voor de experimentator om de hersenstam voor de cisterna magna niet te beschadigen.
Gezichtssnorharen bieden tactiele zintuiglijke informatie over de omgeving, zoals een donkere en smalle omgeving. Dienovereenkomstig zijn knaagdier snorharen goed ontwikkeld genoeg om een object te voelen door de afbuigingsrichtingen, stimulusintensiteit en locatie van de gestimuleerde snorharen. De somatosensorische cortex reageert anders op de buigrichting, intensiteit en locatie van elke snorharen18,19. Daarom worden alle snorharen in dit protocol met constante intensiteit en richting gestimuleerd.
Dit protocol kan geen signalen opnemen die worden opgeroepen in diepe hersenstructuren omdat onze grafeenelektrode-array op het corticale oppervlak is gemonteerd. De experimentator kan dus niet identificeren hoe het kolomvormige netwerk hiërarchisch is georganiseerd met betrekking tot neurale reacties.
Dit protocol is superieur aan eerdere opnamemethoden omdat de grafeenelektrode-array minder invasief, aanpasbaar en biocompatibel is 12,13,14,15,16. Bovendien heeft de grafeenelektrode-array >30 kanalen voor het opnemen van signalen, waardoor een snellere corticale mapping mogelijk is dan een enkele of tetrode-elektrode. Dit protocol kan verder worden toegepast op andere corticale gebieden wanneer dat nodig is15,20. De experimentator kan de elektrode-array op de auditieve of visuele cortex plaatsen om auditieve en visuele informatie te extraheren als de auditieve of visuele kaarten. Ten slotte kan deze methode worden geïmplementeerd voor chronische implantatie en diagnose van neurale ziekten, zoals beroerte, epilepsie, tinnitus en de ziekte van Parkinson.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Incheon National University (International Cooperative) voor Sunggu Yang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| 3mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| Bone rongeur | Fine Science Tools | 16220-14 | remove the skull |
| connector | Gbrain | Connect graphene electrode to headstage | |
| drill | FALCON tool | grind the skull | |
| drill bits | Osstem implant | grind the skull | |
| Graefe iris forceps slightly curved serrated | vubu | vudu-02-73010 | remove the tissue from the skull or hold wiper |
| graphene multielectrode array | Gbrain | records signals from neuron | |
| isoflurane | Hana Pharm Corporation | sacrifce the subject | |
| ketamine | yuhan corporation | used for anesthesia | |
| lidocaine(2%) | Daihan pharmaceutical | local anesthetic | |
| Matlab R2021b | Mathworks | Data analysis Software | |
| mosquito hemostats | Fine Science Tools | 91309-12 | fasten the scalp |
| ointment | Alcon | prevent eye from drying out | |
| povidone | Green Pharmaceutical corporation | disinfect the incision area | |
| RHS 32ch Stim/Record headstage | intan technologies | M4032 | connect connector to interface cable and contain intan RHS stim/amplifier chip |
| RHS 6-ft (1.8m) Stim SPI interface cable | intan technologies | M3206 | connect graphene electrode to headstage |
| RHS Stim/Recording controller software | intan technologies | Data Acquisition Software | |
| RHS stimulation/ Recording controller | intan technologies | M4200 | |
| saline | JW Pharmaceutical | ||
| scalpel | Hammacher | HSB 805-03 | |
| stereotaxic instrument | stoelting | fasten the subject | |
| sterile Hypodermic Needle | KOREAVACCINE CORPORATION | remove the dura mater | |
| Steven Iris Tissue Forceps | KASCO | 50-2026 | remove the dura mater |
| surgical blade no.11 | FEATHER | inscise the scalp | |
| surgical sicssors | Fine Science Tools | 14090-09 | inscise the scalp and remove the dura mater |
| wooden stick | whisker stimulation | ||
| xylazine | Bayer Korea | used for anesthesia |
References
- Leergaard, T. B., et al. Rat somatosensory cerebropontocerebellar pathways: spatial relationships of the somatotopic map of the primary somatosensory cortex are preserved in a three-dimensional clustered pontine map. Journal of Comparative Neurology. 422 (2), 246-266 (2000).
- Craner, S. L., Ray, R. H. Somatosensory cortex of the neonatal pig: I. Topographic organization of the primary somatosensory cortex (SI). Journal of Comparative Neurology. 306 (1), 24-38 (1991).
- Benison, A. M., Rector, D. M., Barth, D. S. Hemispheric mapping of secondary somatosensory cortex in the rat. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 200-207 (2007).
- Lee, M., et al. Graphene-electrode array for brain map remodeling of the cortical surface. NPG Asia Materials. 13 (1), (2021).
- Yang, S. C., Weiner, B. D., Zhang, L. S., Cho, S. J., Bao, S. W. Homeostatic plasticity drives tinnitus perception in an animal model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (36), 14974-14979 (2011).
- Yang, S., Zhang, L. S., Gibboni, R., Weiner, B., Bao, S. W. Impaired development and competitive refinement of the cortical frequency map in tumor necrosis factor-alpha-deficient mice. Cerebral Cortex. 24 (7), 1956-1965 (2014).
- Miyakawa, A., et al. Tinnitus correlates with downregulation of cortical glutamate decarboxylase 65 expression but not auditory cortical map reorganization. Journal of Neuroscience. 39 (50), 9989-10001 (2019).
- Yang, S., Su, W., Bao, S. Long-term, but not transient, threshold shifts alter the morphology and increase the excitability of cortical pyramidal neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (6), 1567-1574 (2012).
- Beniczky, S., Schomer, D. L. Electroencephalography: basic biophysical and technological aspects important for clinical applications. Epileptic Disorders. 22 (6), 697-715 (2020).
- Kim, S. G., Richter, W., Uğurbil, K. Limitations of temporal resolution in functional MRI. Magnetic Resonance Medicine. 37 (4), 631-636 (1997).
- Cho, Z. H., et al. A fusion PET-MRI system with a high-resolution research tomograph-PET and ultra-high field 7.0 T-MRI for the molecular-genetic imaging of the brain. Proteomics. 8 (6), 1302-1323 (2008).
- Viventi, J., et al. Flexible, foldable, actively multiplexed, high-density electrode array for mapping brain activity in vivo. Nature Neuroscience. 14 (12), 1599-1605 (2011).
- Masvidal-Codina, E., et al. High-resolution mapping of infraslow cortical brain activity enabled by graphene microtransistors. Nature Materials. 18 (3), 280-288 (2019).
- Blaschke, B. M., et al. Mapping brain activity with flexible graphene micro-transistors. 2D Materials. 4 (2), 025040 (2017).
- Park, S. W., et al.
- Lim, J., et al. Hybrid graphene electrode for the diagnosis and treatment of epilepsy in free-moving animal models. NPG Asia Materials. 15 (1), 7 (2023).
- Hermanns, H., et al. Molecular mechanisms of action of systemic lidocaine in acute and chronic pain: a narrative review. British Journal of Anaesthesia. 123 (3), 335-349 (2019).
- Tchoe, Y., et al. Human brain mapping with multithousand-channel PtNRGrids resolves spatiotemporal dynamics. Science Translational Medicine. 14 (628), (2022).
- Wilent, W. B., Contreras, D. Dynamics of excitation and inhibition underlying stimulus selectivity in rat somatosensory cortex. Nature Neuroscience. 8 (10), 1364-1370 (2005).
- Insanally, M. N., Köver, H., Kim, H., Bao, S. Feature-dependent sensitive periods in the development of complex sound representation. Journal of Neuroscience. 29 (17), 5456-5462 (2009).
