Summary
侵襲性を低減し、時空間分解能を向上させるためのグラフェンアレイベースの脳マッピング手順を紹介します。グラフェンアレイベースの表面電極は、長期的な生体適合性、機械的柔軟性、および複雑な脳における脳マッピングへの適合性を示します。このプロトコルにより、複数の形式の感覚マップを同時に逐次的に構築することができます。
Abstract
皮質マップは、大脳皮質の感覚運動刺激に対する位置依存的な神経応答の空間的構成を表し、生理学的に関連する行動の予測を可能にします。皮質マップを取得するために、貫通電極、脳波、陽電子放出断層撮影、脳磁図、および機能的磁気共鳴画像法などの様々な方法が用いられてきた。ただし、これらの方法は、時空間分解能が低く、信号対雑音比(SNR)が低く、コストが高く、生体適合性が低いか、脳に物理的損傷を引き起こすために制限されています。本研究では、従来の方法の欠点を克服し、優れた生体適合性、高い時空間分解能、望ましいSNR、および組織損傷の最小化を提供する電気コルチコグラフィーの特徴として、グラフェンアレイベースの体性感覚マッピング法を提案します。この研究は、ラットの体性感覚マッピングのためのグラフェン電極アレイの実現可能性を実証しました。提示されたプロトコルは、体性感覚野だけでなく、聴覚、視覚、運動野などの他の皮質にも適用でき、臨床実装のための高度な技術を提供します。
Introduction
皮質マップは、大脳皮質の感覚運動刺激に対する応答特性を表す一連の局所パッチです。それらはニューラルネットワークの空間的形成であり、知覚と認知の予測を可能にします。したがって、皮質マップは、外部刺激に対する神経応答を評価し、感覚運動情報を処理するのに役立ちます1,2,3,4。皮質マッピングには、侵襲的および非侵襲的な方法が利用可能です。最も一般的な侵襲的方法の1つは、5,6,7,8をマッピングするための皮質内(または貫通)電極の使用を含む。
貫通電極を用いたオンデマンドの高解像度皮質マップの評価は、いくつかの障害に直面しています。この方法は、まともなマップを取得するには面倒であり、臨床使用のために実装するには侵襲的すぎるため、さらなる開発が禁止されています。脳波記録(EEG)、陽電子放出断層撮影(PET)、脳磁図(MEG)、機能的磁気共鳴画像法(fMRI)などの最近の技術は、侵襲性が低く再現性が低いため、人気が高まっています。ただし、法外なコストと解像度の低さを考えると、限られた数のケースで使用されます9,10,11。近年、信号信頼性に優れたフレキシブル表面電極が注目されています。グラフェンベースの表面電極は、長期的な生体適合性および機械的柔軟性を示し、回旋脳において安定した記録を提供する12、13、14、15、16。私たちのグループは最近、皮質表面での高解像度記録と部位特異的神経刺激のためのグラフェンベースのマルチチャンネルアレイを開発しました。この技術により、感覚情報の皮質表現を長期間追跡することができます。
この記事では、30チャンネルのグラフェン多電極アレイを使用して体性感覚皮質の脳マップを取得する手順について説明します。脳の活動を測定するために、グラフェン電極アレイを皮質の硬膜下領域に配置し、前足、前肢、後足、後肢、体幹、およびひげを木の棒で刺激します。体性感覚誘発電位(SEP)は、体性感覚領域について記録されます。このプロトコルは、聴覚、視覚、運動野などの他の脳領域にも適用できます。
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Protocol
すべての動物の取り扱い手順は、仁川国立大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました(INU-ANIM-2017-08)。
1.手術のための動物の準備
注:この実験では、性別バイアスのないSprague Dawley Rat(8〜10週齢)を使用してください。
- 90 mg / kgのケタミンと10 mg / kgのキシラジンカクテルでラットを腹腔内に麻酔します。.手術中ずっと望ましい麻酔深度を維持するために、ラットが目覚めの兆候を示したときに、追加の45 mg / kgケタミンと5 mg / kgキシラジンカクテルを提供します。
- ラットが深い麻酔下にあることを確認し、つま先ピンチ、テールピンチ、角膜反射などの体の反射を定期的にチェックします。
- トリマーを使用して目と耳の後ろの間の毛皮を剃ります。
- 眼科用軟膏を目に塗り、乾燥を防ぎます。
2.皮質表面露出の手術
- ラットの頭を定位固定装置に固定します 定位固定アダプター。手術中に体温を37°Cに維持するには、ラットを温度制御された加熱パッドの上に置きます。
- 剃った部分をアルコールとポビドンヨードのスクラブを交互に3回滅菌します。
- 鉗子で頭皮をしっかりとつかみ、注射器でリドカイン0.1mL(2%)を直接頭皮に注入し、手術部位に局所麻酔を誘導します。
- メスで長さ2〜3cmの正中線を切開し、頭皮を引き離して頭蓋骨を露出させます。
- 頭蓋骨を露出させるために蚊の鉗子で頭皮を固定します。
- 鉗子で頭蓋骨の表面を引っ掻いて骨膜を取り除きます。
- 鈍い 後頭蓋骨の上の筋肉を解剖して、脊髄上部の軸の上に大槽を露出させます。
- 大槽を刃で切開して脳脊髄液を排出し、大槽の切開部内に滅菌ガーゼを入れて脳脊髄液を常に吸収し、脳浮腫を防ぎ、炎症を最小限に抑えます。
- 鉛筆を使用して、右半球のブレグマから前後軸で3 mm、右横方向に6 mmの長方形の窓を頭蓋骨に印を付けます。
注意: マーキングは、上矢状洞破裂を避けるために、正中線から1mmの距離を確保する必要があります。 - 固定装置座標に従ってマークされた領域をドリルし、骨ロンジャーで頭蓋骨を取り除きます。
- 硬膜を取り除くには、26 Gの針の先端を90°に曲げ、硬膜に穴を開け、硬膜を持ち上げ、その穴に鉗子を挿入し、鉗子で引き裂きます。
- 生理食塩水で湿らせたガーゼを体性感覚皮質に置き、乾燥を防ぎます。
3. 記録系に接続したグラフェン電極アレイの作製
- オムネティクスコネクタを備えたグラフェン電極アレイを準備します。
- 生理食塩水を適用して損傷を与えることなくグラフェン多電極アレイを取り外します。
- 基準線とアース線の外側カバーをコネクタから取り外します。
- ヘッドステージとグラフェン電極アレイをコネクタに接続します。
- ヘッドステージにリンクされているインターフェースケーブルを録音システムに接続します。
- グラフェン電極アレイ複合体を脳定位固定アームに固定します。
- すべてのチャネルからの神経信号をキャプチャするには、所定の定位固定座標に従って、曲がらずに体性感覚野上にアレイを配置します。
- 後頭骨の後ろの組織の下に基準線を置き、接地された光学テーブルにアース線を接続します。
4.マッピングのための物理的刺激と記録SEP
- ニューラル信号記録ソフトウェアを開きます。
- 録音ソフトウェア環境の設定:(1)SEPのサンプリングレートとノッチフィルター(60または50Hz、家庭用電力の周波数)を設定して、電源ラインからノイズを除去します。
- ウィスカマッピングの場合は、細いスティックでウィスカを曲げます。
- ボディマッピング用の木の棒で前足、前肢、後足、後肢、体幹を常に突く。
- データ取得システムに指示された時間、神経信号を記録します。
5.動物の安楽死
- すべての記録手順の後、>5%イソフルランを使用して麻酔でラットを犠牲にし、頸部解剖を行います。
6. 皮質マッピングのためのSEP測定
- 信号解析のためにコードネーム read_Intan_RHS2000_file.m の MATLAB を開きます。
注:read_Intan_RHS2000_file.mは「https://intantech.com/downloads.html?tabSelect=Software」からダウンロードできます。 - [実行]ボタンをクリックし、ファイル名拡張子が「.rhs」の録音ファイルを選択して、ファイルが処理されて読み取られるのを待ちます。
- コマンド「plot(t, amplifier_data("チャンネル番号",:))」を入力して、記録データの2Dラインプロットを作成し、SEPを見つけて、すべてのチャンネルのSEPの振幅を計算します。
注意: 「チャンネル番号」にチャンネル番号を入力します。たとえば、"plot(t, amplifier_data(1,:))" と指定すると、チャンネル 1 の 2D 折れ線グラフが作成されます。さらに、実験者が応答の振幅を計算するときに、各チャンネルから記録された応答を選択します。 - SEPの振幅に応じてグリッドを異なる色相で着色してデータを取得します。
注: MATLAB コマンド "imagesc" は、地形図をより迅速に取得するのに役立ちます。
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Representative Results
このプロトコルは、グラフェンマルチチャンネルアレイが脳の表面にどのように取り付けられるかを記述します。体性感覚マップは、物理的刺激に対する神経応答を取得し、応答の振幅を計算することによって構築されました。図1にこの実験の概略 図 を示す。
図2A は、グラフェン電極アレイの構造特性を示しています。電極間に基板の貫通穴があります。これらの穴は、電極が皮質表面にしっかりと接触するのに役立ちます(図2B)。皮質への電極の強い接着は、より少ないノイズで神経信号を記録するのに役立ちます。
図2C (左)は、異なる色でコード化されたひげ、体幹、足、および手足を刺激することによって獲得された位置依存性神経応答を示しています。ラットのミニチュア体であるラットホムンクルスは、体性感覚皮質マップの各色サイズの実際の比率で描かれています(図2C、右)。
図2D は、各身体部位に関連付けられた色で刺激特異的な反応を示しています。応答は、皮質の表面に配置されたグラフェン電極アレイを介して記録されます。グラフェンアレイから記録されたデータを使用して、SEPの振幅を計算し、振幅依存の体性感覚マップを取得します。
感覚刺激によって誘発される局所電界電位により、体性感覚マップの構築が可能になります。各身体刺激に対する反応サイズは、げっ歯類のホムンクルスを提起します。各色は異なる体の部分を表しています(図3)。
このプロトコルを使用して獲得された皮質マップは、ひげ、前足、前肢、後肢、後肢、および体幹に応答する体性感覚皮質内の特定の領域を明らかにします。これは、各身体部分の物理的刺激情報の処理における皮質領域の関与の程度についての洞察を提供します。
図1:実験セットアップの概略図。グラフェンベースの電極アレイは体性感覚野に取り付けられており、ひげやその他の体の部分は穏やかなタッチによって刺激されます。太い赤い線はケーブルを表し、細い赤と青の線はアース線と基準線を表します。黒い点はブレグマを示します。データ収集システムは、USB経由でコンピュータに接続されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:皮質表面上の脳マッピングのためのグラフェンベースの微小電極アレイ 。 (A)グラフェンベースの電極アレイの概略図。(B)皮質表面上のグラフェン電極アレイの光学像。(C)ラットの聴覚および体性感覚皮質。さまざまな周波数トーンと身体の各部分に適用される物理的刺激を伴う聴覚刺激に応答する聴覚および体性感覚領域の2つのマップ。 (d)皮質表面上のグラフェン電極アレイの30チャネル(参照電極および接地電極を除く)の記録。箱の色は皮質表面の地理的位置と相関しています。図はLee et al. (2021)から改作・修正されている。4この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:体性感覚マップ。 (A)皮質層を横断する神経記録の位置(左)。グラフェン電極アレイを用いて決定された皮質表面マップである。応答振幅を使用して構築され、ホムンクルスと重なった色分けされた体性感覚マップ(右)。(B)各身体部分の刺激後の記録された皮質SEPとマップ。この図は、Lee et al. (2021)から適応および変更されています。4この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
提示されたプロトコルは、グラフェン電極アレイを使用してラットの体性感覚応答にアクセスしてマッピングする方法を説明する詳細な段階的なプロセスを提供します。プロトコルで取得されたデータは、各身体部位にシナプス的にリンクされた体性感覚情報を提供するSEPです。
このプロトコルのいくつかの側面を考慮する必要があります。脳浮腫を予防し、炎症を軽減するために脳脊髄液を抽出する場合、実験者は大槽の前にある脳幹を損傷しないことが重要です。
顔のひげは、暗くて狭い環境など、周囲に関する触覚的な感覚情報を提供します。したがって、げっ歯類のウィスカーは、たわみ方向、刺激強度、および刺激されたウィスカーの位置を通じて物体を感知するのに十分に発達しています。体性感覚皮質は、各ウィスカーの曲げ方向、強度、および位置に異なる方法で応答します18,19。したがって、このプロトコルでは、すべてのウィスカーが一定の強度と方向で刺激されます。
このプロトコルは、グラフェン電極アレイが皮質表面に取り付けられているため、脳深部構造で誘発された信号を記録できません。したがって、実験者は、神経応答に関して柱状ネットワークがどのように階層的に構成されているかを特定することはできません。
このプロトコルは、グラフェン電極アレイが侵襲性が低く、適応性があり、生体適合性が低いため、以前の記録方法よりも優れています12、13、14、15、16。さらに、グラフェン電極アレイは、信号を記録するための>30チャネルを有するため、単一または四極管電極よりも高速な皮質マッピングを可能にする。このプロトコルは、必要に応じていつでも他の皮質領域にさらに適用することができる15,20。実験者は、電極アレイを聴覚または視覚野上に配置して、聴覚および視覚情報を聴覚または視覚マップとして抽出することができる。最後に、この方法は、脳卒中、てんかん、耳鳴り、パーキンソン病などの神経疾患の慢性移植および診断に実装できます。
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Disclosures
開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、仁川国立大学(国際協力)の支援を受けて、楊成谷宋のために行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| 3mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| Bone rongeur | Fine Science Tools | 16220-14 | remove the skull |
| connector | Gbrain | Connect graphene electrode to headstage | |
| drill | FALCON tool | grind the skull | |
| drill bits | Osstem implant | grind the skull | |
| Graefe iris forceps slightly curved serrated | vubu | vudu-02-73010 | remove the tissue from the skull or hold wiper |
| graphene multielectrode array | Gbrain | records signals from neuron | |
| isoflurane | Hana Pharm Corporation | sacrifce the subject | |
| ketamine | yuhan corporation | used for anesthesia | |
| lidocaine(2%) | Daihan pharmaceutical | local anesthetic | |
| Matlab R2021b | Mathworks | Data analysis Software | |
| mosquito hemostats | Fine Science Tools | 91309-12 | fasten the scalp |
| ointment | Alcon | prevent eye from drying out | |
| povidone | Green Pharmaceutical corporation | disinfect the incision area | |
| RHS 32ch Stim/Record headstage | intan technologies | M4032 | connect connector to interface cable and contain intan RHS stim/amplifier chip |
| RHS 6-ft (1.8m) Stim SPI interface cable | intan technologies | M3206 | connect graphene electrode to headstage |
| RHS Stim/Recording controller software | intan technologies | Data Acquisition Software | |
| RHS stimulation/ Recording controller | intan technologies | M4200 | |
| saline | JW Pharmaceutical | ||
| scalpel | Hammacher | HSB 805-03 | |
| stereotaxic instrument | stoelting | fasten the subject | |
| sterile Hypodermic Needle | KOREAVACCINE CORPORATION | remove the dura mater | |
| Steven Iris Tissue Forceps | KASCO | 50-2026 | remove the dura mater |
| surgical blade no.11 | FEATHER | inscise the scalp | |
| surgical sicssors | Fine Science Tools | 14090-09 | inscise the scalp and remove the dura mater |
| wooden stick | whisker stimulation | ||
| xylazine | Bayer Korea | used for anesthesia |
References
- Leergaard, T. B., et al. Rat somatosensory cerebropontocerebellar pathways: spatial relationships of the somatotopic map of the primary somatosensory cortex are preserved in a three-dimensional clustered pontine map. Journal of Comparative Neurology. 422 (2), 246-266 (2000).
- Craner, S. L., Ray, R. H. Somatosensory cortex of the neonatal pig: I. Topographic organization of the primary somatosensory cortex (SI). Journal of Comparative Neurology. 306 (1), 24-38 (1991).
- Benison, A. M., Rector, D. M., Barth, D. S. Hemispheric mapping of secondary somatosensory cortex in the rat. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 200-207 (2007).
- Lee, M., et al. Graphene-electrode array for brain map remodeling of the cortical surface. NPG Asia Materials. 13 (1), (2021).
- Yang, S. C., Weiner, B. D., Zhang, L. S., Cho, S. J., Bao, S. W. Homeostatic plasticity drives tinnitus perception in an animal model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (36), 14974-14979 (2011).
- Yang, S., Zhang, L. S., Gibboni, R., Weiner, B., Bao, S. W. Impaired development and competitive refinement of the cortical frequency map in tumor necrosis factor-alpha-deficient mice. Cerebral Cortex. 24 (7), 1956-1965 (2014).
- Miyakawa, A., et al. Tinnitus correlates with downregulation of cortical glutamate decarboxylase 65 expression but not auditory cortical map reorganization. Journal of Neuroscience. 39 (50), 9989-10001 (2019).
- Yang, S., Su, W., Bao, S. Long-term, but not transient, threshold shifts alter the morphology and increase the excitability of cortical pyramidal neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (6), 1567-1574 (2012).
- Beniczky, S., Schomer, D. L. Electroencephalography: basic biophysical and technological aspects important for clinical applications. Epileptic Disorders. 22 (6), 697-715 (2020).
- Kim, S. G., Richter, W., Uğurbil, K. Limitations of temporal resolution in functional MRI. Magnetic Resonance Medicine. 37 (4), 631-636 (1997).
- Cho, Z. H., et al. A fusion PET-MRI system with a high-resolution research tomograph-PET and ultra-high field 7.0 T-MRI for the molecular-genetic imaging of the brain. Proteomics. 8 (6), 1302-1323 (2008).
- Viventi, J., et al. Flexible, foldable, actively multiplexed, high-density electrode array for mapping brain activity in vivo. Nature Neuroscience. 14 (12), 1599-1605 (2011).
- Masvidal-Codina, E., et al. High-resolution mapping of infraslow cortical brain activity enabled by graphene microtransistors. Nature Materials. 18 (3), 280-288 (2019).
- Blaschke, B. M., et al. Mapping brain activity with flexible graphene micro-transistors. 2D Materials. 4 (2), 025040 (2017).
- Park, S. W., et al.
- Lim, J., et al. Hybrid graphene electrode for the diagnosis and treatment of epilepsy in free-moving animal models. NPG Asia Materials. 15 (1), 7 (2023).
- Hermanns, H., et al. Molecular mechanisms of action of systemic lidocaine in acute and chronic pain: a narrative review. British Journal of Anaesthesia. 123 (3), 335-349 (2019).
- Tchoe, Y., et al. Human brain mapping with multithousand-channel PtNRGrids resolves spatiotemporal dynamics. Science Translational Medicine. 14 (628), (2022).
- Wilent, W. B., Contreras, D. Dynamics of excitation and inhibition underlying stimulus selectivity in rat somatosensory cortex. Nature Neuroscience. 8 (10), 1364-1370 (2005).
- Insanally, M. N., Köver, H., Kim, H., Bao, S. Feature-dependent sensitive periods in the development of complex sound representation. Journal of Neuroscience. 29 (17), 5456-5462 (2009).
