Summary
İnvazivliği azaltmak ve uzay-zamansal çözünürlüğü iyileştirmek için grafen dizisi tabanlı bir beyin haritalama prosedürü sunuyoruz. Grafen dizisi tabanlı yüzey elektrotları, kıvrımlı bir beyinde uzun vadeli biyouyumluluk, mekanik esneklik ve beyin haritalaması için uygunluk sergiler. Bu protokol, aynı anda ve sırayla birden fazla duyusal harita biçiminin oluşturulmasına izin verir.
Abstract
Kortikal haritalar, serebral korteksteki sensorimotor uyaranlara konuma bağlı sinirsel tepkilerin uzamsal organizasyonunu temsil eder ve fizyolojik olarak ilgili davranışların tahmin edilmesini sağlar. Kortikal haritaların elde edilmesinde penetran elektrotlar, elektroensefalografi, pozitron emisyon tomografisi, manyetoensefalografi ve fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme gibi çeşitli yöntemler kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemler zayıf uzay-zamansal çözünürlük, düşük sinyal-gürültü oranı (SNR), yüksek maliyetler ve biyouyumsuzluk ile sınırlıdır veya beyinde fiziksel hasara neden olur. Bu çalışma, elektrokortikografinin bir özelliği olarak, üstün biyouyumluluk, yüksek uzay-zamansal çözünürlük, arzu edilen SNR ve en aza indirilmiş doku hasarı sunan ve önceki yöntemlerin dezavantajlarının üstesinden gelen grafen dizisi tabanlı bir somatosensoriyel haritalama yöntemi önermektedir. Bu çalışma, sıçanlarda somatosensoriyel haritalama için bir grafen elektrot dizisinin fizibilitesini göstermiştir. Sunulan protokol sadece somatosensoriyel kortekse değil, aynı zamanda işitsel, görsel ve motor korteks gibi diğer kortekslere de uygulanabilir ve klinik uygulama için ileri teknoloji sağlar.
Introduction
Kortikal harita, serebral korteksteki sensorimotor uyaranlara yanıt özelliklerini temsil eden bir dizi yerel yamadır. Sinir ağlarının uzamsal bir oluşumudur ve algı ve biliş için tahmin sağlarlar. Bu nedenle, kortikal haritalar, dış uyaranlara verilen sinirsel tepkilerin değerlendirilmesinde ve sensorimotor bilgilerin işlenmesindeyararlıdır 1,2,3,4. Kortikal haritalama için invaziv ve noninvaziv yöntemler mevcuttur. En yaygın invaziv yöntemlerden biri, 5,6,7,8'i haritalamak için intrakortikal (veya penetran) elektrotların kullanılmasını içerir.
Penetran elektrotlar kullanarak isteğe bağlı yüksek çözünürlüklü kortikal haritaların değerlendirilmesi çeşitli engellerle karşı karşıya kalmıştır. Yöntem, düzgün bir harita elde etmek için çok zahmetlidir ve klinik kullanım için uygulanamayacak kadar invazivdir, bu da daha fazla gelişmeyi yasaklar. Elektroensefalografi (EEG), pozitron emisyon tomografisi (PET), manyetoensefalografi (MEG) ve fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme (fMRI) gibi daha yeni teknolojiler, daha az invaziv ve tekrarlanabilir oldukları için popülerlik kazanmıştır. Bununla birlikte, engelleyici maliyetleri ve zayıf çözünürlükleri göz önüne alındığında, sınırlı sayıda durumda kullanılırlar 9,10,11. Son zamanlarda, üstün sinyal güvenilirliğine sahip esnek yüzey elektrotları büyük ilgi görmüştür. Grafen bazlı yüzey elektrotları, kıvrımlı bir beyindekararlı kayıtlar sağlayarak uzun vadeli biyouyumluluk ve mekanik esneklik gösterir 12,13,14,15,16. Grubumuz yakın zamanda kortikal yüzeyde yüksek çözünürlüklü kayıt ve bölgeye özgü nörostimülasyon için grafen tabanlı çok kanallı bir dizi geliştirmiştir. Bu teknoloji, duyusal bilginin kortikal temsillerini uzun süre takip etmemizi sağlar.
Bu makale, 30 kanallı bir grafen multielektrot dizisi kullanarak somatosensoriyel korteksin beyin haritasını elde etmeyle ilgili adımları açıklamaktadır. Beyin aktivitesini ölçmek için korteksin subdural bölgesine bir grafen elektrot dizisi yerleştirilirken, ön ayak, ön ayak, arka pençe, arka bacak, gövde ve bıyıklar tahta bir çubukla uyarılır. Somatosensoriyel alanlar için somatosensoriyel uyarılmış potansiyeller (SEP'ler) kaydedilir. Bu protokol işitsel, görsel ve motor korteks gibi diğer beyin bölgelerine de uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan işleme prosedürleri, Incheon Ulusal Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (INU-ANIM-2017-08) tarafından onaylanmıştır.
1. Ameliyat için hayvan hazırlığı
NOT: Bu deney için cinsiyet yanlılığı olmadan Sprague Dawley Rat'ı (8-10 haftalık) kullanın.
- Sıçan intraperitoneal olarak 90 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg ksilazin kokteyli ile uyuşturulur. Ameliyat boyunca istenen anestezi derinliğini korumak için, sıçan uyanma belirtileri gösterdiğinde ek olarak 45 mg/kg ketamin ve 5 mg/kg ksilazin kokteyli sağlayın.
- Sıçanın derin anestezi altında olduğunu doğrulayın ve ayak parmağı tutam, kuyruk kıstırma ve kornea refleksi gibi vücut yansımalarını düzenli olarak kontrol edin.
- Bir düzeltici kullanarak gözler arasındaki kürkü ve kulakların arkasını tıraş edin.
- Kurumasını önlemek için gözlere oftalmik bir merhem sürün.
2. Kortikal yüzey maruziyeti cerrahisi
- Sıçan kafasını stereotaksik bir adaptörle stereotaksik aparata sabitleyin. Ameliyat sırasında vücut ısısını 37 °C'de tutmak için, fareyi sıcaklık kontrollü bir ısıtma yastığına yerleştirin.
- Tıraşlı bölgeyi üç kez değişen alkol ve povidon-iyot fırçalarıyla sterilize edin.
- Saç derisini sıkıca kavramak için forseps kullanın ve ameliyat bölgesinde lokal anesteziyi indüklemek için bir şırınga ile doğrudan kafa derisine 0.1 mL lidokain (% 2) enjekte edin.
- Bir neşter ile 2-3 cm uzunluğunda bir orta hat kesisi yapın ve kafatasını ortaya çıkarmak için kafa derisini ayırın.
- Kafatasını ortaya çıkarmak için kafa derisini sivrisinek forseps ile sıkıştırın.
- Periosteumu çıkarmak için kafatasının yüzeyini forseps ile çizin.
- Künt, omuriliğin tepesindeki eksenin üzerindeki cisterna magna'yı ortaya çıkarmak için oksipital kafatası üzerindeki kasları inceleyin.
- Beyin omurilik sıvısını boşaltmak için cisterna magna'yı bıçakla kesin ve beyin ödemini önlemek ve iltihabı en aza indirmek için beyin omurilik sıvısını sürekli emmek için cisterna magna'nın kesisine steril bir gazlı bez koyun.
- Bir kalem kullanarak, kafatası üzerinde anteroposterior eksende 3 mm ve sağ hemisferin bregmasından sağ yanal yönde 6 mm ölçülerinde dikdörtgen bir pencere işaretleyin.
NOT: Üstün sagital sinüs rüptürünü önlemek için işaretleme orta hattan 1 mm'lik bir mesafeyi güvence altına almalıdır. - İşaretli alanı stereotaksik koordinata göre delin ve kafatasını bir kemik rongeur ile çıkarın.
- Dura mater'i çıkarmak için 26 G iğnenin ucunu 90° bükün, dura mater'de bir delik açın, dura mater'i kaldırın, bu deliğe forseps yerleştirin ve forseps ile yırtın.
- Kurumasını önlemek için somatosensoriyel korteksin üzerine tuzlu suyla ıslatılmış gazlı bez yerleştirin.
3. Kayıt sistemine bağlı grafen elektrot dizisinin hazırlanması
- Omnetics konektörlü bir grafen elektrot dizisi hazırlayın.
- Salin solüsyonunu uygulayarak grafen çoklu elektrot dizisini hasara neden olmadan ayırın.
- Referans ve topraklama kablolarının dış kaplamasını konektörden çıkarın.
- Grafen elektrot dizisi ile kafa aşamasını konektöre bağlayın.
- Kafa aşamasına bağlı arabirim kablosunu kayıt sistemine takın.
- Grafen elektrot dizisi kompleksini stereotaksik kola sabitleyin.
- Tüm kanallardan gelen nöral sinyalleri yakalamak için, önceden belirlenmiş stereotaksik koordinatları takip ederek diziyi herhangi bir bükülme olmadan somatosensoriyel korteks üzerine konumlandırın.
- Oksipital kemiğin arkasındaki dokunun altına bir referans kablosu yerleştirin ve topraklama kablosunu topraklanmış optik masaya bağlayın.
4. Haritalama için fiziksel stimülasyon ve SEP'lerin kaydedilmesi
- Nöral sinyal kayıt yazılımını açın.
- Kayıt yazılımı ortamını ayarlayın: (1) güç hattındaki gürültüyü gidermek için SEP'ler ve çentik filtresi (60 veya 50 Hz, ev tipi elektrik gücü frekansı) için örnekleme hızını ayarlayın.
- Bıyık haritalaması için bıyığı ince bir çubukla bükün.
- Vücut haritalaması için ön papa, ön ayak, arka pençe, arka bacak ve gövdeyi tahta bir çubukla sürekli olarak dürtün.
- Belirtilen süre boyunca veri toplama sistemindeki sinirsel sinyalleri kaydedin.
5. Hayvan ötenazisi
- Tüm kayıt işlemlerinden sonra,% >5 izofluran kullanarak sıçanları anestezi ile feda edin ve servikal diseksiyon yapın.
6. Kortikal haritalama için SEP ölçümü
- Sinyal analizi için read_Intan_RHS2000_file.m kod adlı MATLAB'ı açın.
NOT: read_Intan_RHS2000_file.m "https://intantech.com/downloads.html?tabSelect=Software" adresinden indirilebilir. - Çalıştır düğmesine tıklayın, ".rhs" dosya adı uzantısına sahip kayıt dosyasını seçin ve dosyanın işlenmesini ve okunmasını bekleyin.
- Kayıt verilerinin 2B çizgi grafiğini oluşturmak, SEP'leri bulmak ve tüm kanallardaki SEP'lerin genliğini hesaplamak için "plot (t, amplifier_data("kanal numarası",:))" komutunu girin.
NOT: "Kanal numarası" alanına kanal numarasını girin. Örneğin, "plot(t, amplifier_data(1,:))" kanal 1'in 2B çizgi grafiğini oluşturur. Ek olarak, deneyci yanıtın genliğini hesaplarken, her kanaldan kaydedilen yanıtı seçin. - SEP'lerin genliğine göre ızgarayı farklı bir tonla renklendirerek veri elde edin.
NOT: MATLAB komutu "imagesc", topografik haritanın daha hızlı elde edilmesine yardımcı olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, grafen çok kanallı bir dizinin beynin yüzeyine nasıl monte edildiğini açıklar. Somatosensoriyel harita, fiziksel uyaranlara nöral yanıtlar alınarak ve yanıtın genliği hesaplanarak oluşturulmuştur. Şekil 1'de bu deneyin şeması gösterilmektedir.
Şekil 2A , bir grafen elektrot dizisinin yapısal özelliklerini sunar. Elektrotlar arasında alt tabakanın delikleri vardır. Bu delikler elektrotun kortikal yüzeye sıkıca temas etmesine yardımcı olur (Şekil 2B). Elektrotun kortekse güçlü yapışması, nöral sinyallerin daha az gürültüyle kaydedilmesine yardımcı olur.
Şekil 2C (solda), farklı renklerde kodlanmış bıyıkların, gövdenin, pençelerin ve uzuvların uyarılmasıyla elde edilen konuma bağlı sinirsel tepkileri göstermektedir. Sıçanın minyatür gövdesi olan bir sıçan homunculus, somatosensoriyel korteks haritasındaki her bir renk boyutunun gerçek oranıyla çizilir (Şekil 2C, sağda).
Şekil 2D , her bir vücut parçasıyla ilişkili renklerle uyaranlara özgü tepkileri sunar. Yanıtlar, korteksin yüzeyine yerleştirilmiş bir grafen elektrot dizisi aracılığıyla kaydedilir. Grafen dizisinden kaydedilen veriler kullanılarak, genliğe bağlı somatosensoriyel haritayı elde etmek için SEP'lerin genliği hesaplanır.
Duyusal uyaranla indüklenen lokal alan potansiyelleri, somatosensoriyel haritanın oluşturulmasını sağlar. Her vücut uyaranına verilen tepki büyüklüğü kemirgen homunculus'u oluşturur. Her renk farklı bir vücut bölümünü temsil eder (Şekil 3).
Bu protokolü kullanarak edinilen korteks haritası, somatosensoriyel korteks içinde bıyıklara, ön ayaklara, ön ayaklara, arka pençelere, arka ayaklara ve gövdelere yanıt veren belirli bölgeleri ortaya çıkarır. Her vücut parçası için fiziksel uyaran bilgilerinin işlenmesinde kortikal alanın katılımının kapsamı hakkında fikir verir.
Şekil 1: Deney düzeneğinin şeması. Grafen bazlı elektrot dizisi somatosensoriyel kortekse bağlanır ve bıyıklar veya diğer vücut kısımları hafif dokunuşla uyarılır. Kalın kırmızı çizgi kabloyu, ince kırmızı ve mavi çizgiler ise toprak ve referans kablolarını temsil eder. Siyah nokta bregmayı gösterir. Veri toplama sistemi bilgisayara USB üzerinden bağlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kortikal yüzeyde beyin haritalaması için grafen tabanlı mikroelektrot dizisi . (A) Grafen bazlı elektrot dizisinin şeması. (B) Kortikal yüzeydeki grafen elektrot dizisinin optik görüntüsü. (C) Sıçanın işitsel ve somatosensoriyel korteksleri. İşitsel uyaranlara çeşitli frekans tonları ve her vücut parçasına uygulanan fiziksel uyaranlarla yanıt veren işitsel ve somatosensoriyel alanların iki haritası. (D) Kortikal yüzeydeki grafen elektrot dizisinin 30 kanallı (referans ve toprak elektrotları hariç) kaydı. Kutu renkleri, kortikal yüzeyin coğrafi konumları ile ilişkilidir. Rakamlar Lee ve ark. (2021). 4Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Somatosensoriyel harita. (A) Kortikal katmanlar boyunca nöral kayıtların konumu (solda). Bir grafen elektrot dizisi kullanılarak belirlenen bir kortikal yüzey haritası. Yanıt genlikleri kullanılarak oluşturulan ve homunculus (sağda) ile örtüşen renk kodlu bir somatosensoriyel harita. (B) Kaydedilmiş kortikal SEP'ler ve her vücut parçasının uyarılmasını takiben haritalar. Bu rakam Lee ve ark. (2021). 4Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sunulan protokol, bir grafen elektrot dizisi kullanarak sıçanların somatosensoriyel tepkilerine nasıl erişileceğini ve haritalanacağını açıklayan derinlemesine, adım adım bir süreç sağlar. Protokolle elde edilen veriler, her bir vücut parçasına sinaptik olarak bağlı somatosensoriyel bilgi sağlayan SEP'lerdir.
Bu protokolün çeşitli yönleri dikkate alınmalıdır. Beyin ödemini önlemek ve iltihabı hafifletmek için beyin omurilik sıvısı çıkarılırken, deneycinin cisterna magna'nın önünde bulunan beyin sapına zarar vermemesi çok önemlidir.
Yüz bıyıkları, karanlık ve dar bir ortam gibi çevre hakkında dokunsal duyusal bilgiler sağlar. Buna göre, kemirgen bıyıkları, bir nesneyi sapma yönleri, uyaran yoğunluğu ve uyarılan bıyıkların konumu aracılığıyla algılayacak kadar iyi gelişmiştir. Somatosensoriyel korteks, her bıyığın bükülme yönüne, yoğunluğuna ve konumuna farklıtepki verir 18,19. Bu nedenle, bu protokolde tüm bıyıklar sabit yoğunluk ve yön ile uyarılır.
Bu protokol, grafen elektrot dizilimimiz kortikal yüzeye monte edildiğinden derin beyin yapılarında uyarılan sinyalleri kaydedemez. Bu nedenle, deneyci, sütunlu ağın sinirsel tepkilerle ilgili olarak hiyerarşik olarak nasıl organize edildiğini tanımlayamaz.
Bu protokol önceki kayıt yöntemlerinden daha üstündür çünkü grafen elektrot dizisi daha az invaziv, uyarlanabilir ve biyouyumludur 12,13,14,15,16. Ayrıca, grafen elektrot dizisi, sinyalleri kaydetmek için >30 kanala sahiptir, böylece tek veya tetrode elektrottan daha hızlı kortikal haritalama sağlar. Bu protokol gerektiğinde diğer kortikal bölgelere de uygulanabilir15,20. Deneyci, işitsel veya görsel haritalar olarak işitsel ve görsel bilgileri çıkarmak için elektrot dizisini işitsel veya görsel korteks üzerine yerleştirebilir. Son olarak, bu yöntem kronik implantasyon ve inme, epilepsi, kulak çınlaması ve Parkinson hastalığı gibi nöral hastalıkların teşhisi için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Sunggu Yang için Incheon Ulusal Üniversitesi (Uluslararası Kooperatif) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| 3mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| Bone rongeur | Fine Science Tools | 16220-14 | remove the skull |
| connector | Gbrain | Connect graphene electrode to headstage | |
| drill | FALCON tool | grind the skull | |
| drill bits | Osstem implant | grind the skull | |
| Graefe iris forceps slightly curved serrated | vubu | vudu-02-73010 | remove the tissue from the skull or hold wiper |
| graphene multielectrode array | Gbrain | records signals from neuron | |
| isoflurane | Hana Pharm Corporation | sacrifce the subject | |
| ketamine | yuhan corporation | used for anesthesia | |
| lidocaine(2%) | Daihan pharmaceutical | local anesthetic | |
| Matlab R2021b | Mathworks | Data analysis Software | |
| mosquito hemostats | Fine Science Tools | 91309-12 | fasten the scalp |
| ointment | Alcon | prevent eye from drying out | |
| povidone | Green Pharmaceutical corporation | disinfect the incision area | |
| RHS 32ch Stim/Record headstage | intan technologies | M4032 | connect connector to interface cable and contain intan RHS stim/amplifier chip |
| RHS 6-ft (1.8m) Stim SPI interface cable | intan technologies | M3206 | connect graphene electrode to headstage |
| RHS Stim/Recording controller software | intan technologies | Data Acquisition Software | |
| RHS stimulation/ Recording controller | intan technologies | M4200 | |
| saline | JW Pharmaceutical | ||
| scalpel | Hammacher | HSB 805-03 | |
| stereotaxic instrument | stoelting | fasten the subject | |
| sterile Hypodermic Needle | KOREAVACCINE CORPORATION | remove the dura mater | |
| Steven Iris Tissue Forceps | KASCO | 50-2026 | remove the dura mater |
| surgical blade no.11 | FEATHER | inscise the scalp | |
| surgical sicssors | Fine Science Tools | 14090-09 | inscise the scalp and remove the dura mater |
| wooden stick | whisker stimulation | ||
| xylazine | Bayer Korea | used for anesthesia |
References
- Leergaard, T. B., et al. Rat somatosensory cerebropontocerebellar pathways: spatial relationships of the somatotopic map of the primary somatosensory cortex are preserved in a three-dimensional clustered pontine map. Journal of Comparative Neurology. 422 (2), 246-266 (2000).
- Craner, S. L., Ray, R. H. Somatosensory cortex of the neonatal pig: I. Topographic organization of the primary somatosensory cortex (SI). Journal of Comparative Neurology. 306 (1), 24-38 (1991).
- Benison, A. M., Rector, D. M., Barth, D. S. Hemispheric mapping of secondary somatosensory cortex in the rat. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 200-207 (2007).
- Lee, M., et al. Graphene-electrode array for brain map remodeling of the cortical surface. NPG Asia Materials. 13 (1), (2021).
- Yang, S. C., Weiner, B. D., Zhang, L. S., Cho, S. J., Bao, S. W. Homeostatic plasticity drives tinnitus perception in an animal model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (36), 14974-14979 (2011).
- Yang, S., Zhang, L. S., Gibboni, R., Weiner, B., Bao, S. W. Impaired development and competitive refinement of the cortical frequency map in tumor necrosis factor-alpha-deficient mice. Cerebral Cortex. 24 (7), 1956-1965 (2014).
- Miyakawa, A., et al. Tinnitus correlates with downregulation of cortical glutamate decarboxylase 65 expression but not auditory cortical map reorganization. Journal of Neuroscience. 39 (50), 9989-10001 (2019).
- Yang, S., Su, W., Bao, S. Long-term, but not transient, threshold shifts alter the morphology and increase the excitability of cortical pyramidal neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (6), 1567-1574 (2012).
- Beniczky, S., Schomer, D. L. Electroencephalography: basic biophysical and technological aspects important for clinical applications. Epileptic Disorders. 22 (6), 697-715 (2020).
- Kim, S. G., Richter, W., Uğurbil, K. Limitations of temporal resolution in functional MRI. Magnetic Resonance Medicine. 37 (4), 631-636 (1997).
- Cho, Z. H., et al. A fusion PET-MRI system with a high-resolution research tomograph-PET and ultra-high field 7.0 T-MRI for the molecular-genetic imaging of the brain. Proteomics. 8 (6), 1302-1323 (2008).
- Viventi, J., et al. Flexible, foldable, actively multiplexed, high-density electrode array for mapping brain activity in vivo. Nature Neuroscience. 14 (12), 1599-1605 (2011).
- Masvidal-Codina, E., et al. High-resolution mapping of infraslow cortical brain activity enabled by graphene microtransistors. Nature Materials. 18 (3), 280-288 (2019).
- Blaschke, B. M., et al. Mapping brain activity with flexible graphene micro-transistors. 2D Materials. 4 (2), 025040 (2017).
- Park, S. W., et al.
- Lim, J., et al. Hybrid graphene electrode for the diagnosis and treatment of epilepsy in free-moving animal models. NPG Asia Materials. 15 (1), 7 (2023).
- Hermanns, H., et al. Molecular mechanisms of action of systemic lidocaine in acute and chronic pain: a narrative review. British Journal of Anaesthesia. 123 (3), 335-349 (2019).
- Tchoe, Y., et al. Human brain mapping with multithousand-channel PtNRGrids resolves spatiotemporal dynamics. Science Translational Medicine. 14 (628), (2022).
- Wilent, W. B., Contreras, D. Dynamics of excitation and inhibition underlying stimulus selectivity in rat somatosensory cortex. Nature Neuroscience. 8 (10), 1364-1370 (2005).
- Insanally, M. N., Köver, H., Kim, H., Bao, S. Feature-dependent sensitive periods in the development of complex sound representation. Journal of Neuroscience. 29 (17), 5456-5462 (2009).
