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Biology

क्रायोप्रिजर्व्ड एपिथेलियल क्रिप्ट्स से पिगलेट इंटेस्टाइनल 3 डी ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति और सेल मोनोलेयर की स्थापना

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64917
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 2, 4, 1, 1
1GenPhySE, Université de Toulouse, INRAE, ENVT, 2Lallemand Animal Nutrition, 3Institut NuMeCan, INRAE, INSERM, Université de Rennes, 4FG 16: Mycotic and Parasitic Agents and Mycobacteria, Robert Koch-Institute

Summary

यहां, हम क्रायोप्रिजर्व्ड एपिथेलियल क्रिप्ट्स से सुअर आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम 3 डी ऑर्गेनोइड्स से प्राप्त सेल मोनोलेयर स्थापित करने के लिए एक विधि का भी वर्णन करते हैं, जिससे उपकला कोशिकाओं के एपिकल पक्ष तक पहुंच की अनुमति मिलती है।

Abstract

आंतों के ऑर्गेनोइड्स का उपयोग पाचन रोग मॉडलिंग के लिए आंत उपकला का अध्ययन करने के लिए, या दवाओं, पोषक तत्वों, मेटाबोलाइट्स, रोगजनकों और माइक्रोबायोटा के साथ बातचीत की जांच करने के लिए किया जा रहा है। आंतों के ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के तरीके अब सूअरों सहित कई प्रजातियों के लिए उपलब्ध हैं, जो एक खेत जानवर के रूप में और मनुष्यों के लिए एक ट्रांसलेशनल मॉडल के रूप में प्रमुख रुचि की एक प्रजाति है, उदाहरण के लिए, जूनोटिक रोगों का अध्ययन करने के लिए। यहां, हम जमे हुए उपकला क्रिप्ट से सुअर आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रिया का गहन विवरण देते हैं। प्रोटोकॉल बताता है कि सुअर की आंत से उपकला क्रिप्ट्स को कैसे क्रायोप्रिजर्व किया जाए और 3 डी आंतों के ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए बाद की प्रक्रियाएं। इस पद्धति के मुख्य लाभ हैं (i) 3 डी ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति से क्रिप्ट्स के अलगाव का अस्थायी पृथक्करण, (ii) कई आंतों के खंडों और कई जानवरों से एक साथ प्राप्त क्रायोसंरक्षित क्रिप्ट्स के बड़े स्टॉक की तैयारी, और इस प्रकार (iii) जीवित जानवरों से ताजा ऊतकों का नमूना लेने की आवश्यकता में कमी। हम उपकला कोशिकाओं के एपिकल पक्ष तक पहुंच की अनुमति देने के लिए 3 डी ऑर्गेनोइड्स से प्राप्त सेल मोनोलेयर स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का भी विस्तार करते हैं, जो पोषक तत्वों, रोगाणुओं या दवाओं के साथ बातचीत की साइट है। कुल मिलाकर, यहां वर्णित प्रोटोकॉल पशु चिकित्सा और जैव चिकित्सा अनुसंधान में सुअर आंतों के उपकला का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी संसाधन है।

Introduction

आंतों के उपकला का निर्माण ल्यूमिनल वातावरण के साथ इंटरफ़ेस पर पाचन श्लेष्म को कवर करने वाली कोशिकाओं के एक मोनोलेयर द्वारा किया जाता है। यह स्थिति पोषक तत्व अवशोषण और बाधा समारोह जैसे विविध कार्यों से जुड़ी हुई है, जो स्टेम कोशिकाओं और कई विभेदित उपकला कोशिका प्रकारों (अवशोषक, एंटरोएंडोक्राइन, पनेथ और गोब्लेट कोशिकाओं) की उपस्थिति द्वारा समर्थित हैं। पारंपरिक रूप से उपकला कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली अमर कोशिका लाइनों की प्रमुख सीमाएं हैं, क्योंकि वे आंतों के उपकला की सेलुलर जटिलता को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं औरजीनोमिक असामान्यताएं प्रस्तुत करते हैं। सातो एट अल.3 द्वारा त्रि-आयामी (3 डी) ऑर्गेनोइड्स के विकास ने आंतों के उपकला का अध्ययन करने के लिए एक नया मॉडल प्रदान किया, जिसमें एक बेहतर शारीरिक प्रासंगिकता थी। दरअसल, आंतों के ऑर्गेनोइड गैर-रूपांतरित स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त होते हैं, कई सेल प्रकारों से बने होते हैं, और आंतों के उपकला की कार्यक्षमता को पुन: उत्पन्न करते हैं। आंतों के ऑर्गेनोइड्स का उपयोग आंतों के उपकला के विकास और कार्यों और रोगजनकों, पोषक तत्वों, विषाक्त पदार्थों, दवाओं, माइक्रोबायोटा और इसके मेटाबोलाइट्सके साथ इसकी बातचीत को समझने के लिए किया जा रहा है।

प्रारंभ में मनुष्यों और चूहों के लिए विकसित, आंतों के ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों को हाल हीमें सूअरों सहित अन्य प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया गया है। गोंजालेस एट अल.5 जेजुनम से सुअर ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति करने वाले पहले व्यक्ति थे; तब से, पोर्सिन ऑर्गेनोइड्स को अन्य आंत खंडों (ग्रहणी, इलियम और बृहदान्त्र) 6,7,8 के लिए वर्णित किया गया है, और एक स्थान-विशिष्ट फेनोटाइप 9,10,11 को बनाए रखने के लिए दिखाया गया है। सुअर आंतों 3 डी ऑर्गेनोइड्स का उपयोग अब आमतौर पर पोषक तत्वों12,13 या एंटरिक संक्रमण 6,8,14 के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जाता है।

अधिकांश अध्ययनों ने ताजा पृथक उपकला क्रिप्ट्स से शुरू होने वाले आंतों के ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति का वर्णन किया है। हालांकि, यह हमेशा तार्किक कारणों से संभव नहीं होता है, विशेष रूप से सूअरों जैसे बड़े जानवरों के साथ काम करते समय। दरअसल, सूअरों के लिए पशु सुविधाएं प्रयोगशाला से दूर स्थित हो सकती हैं जहां ऑर्गेनोइड सुसंस्कृत होते हैं, जो कार्य संगठन को जटिल बनाता है। इसके अलावा, ऑर्गेनॉइड संस्कृति समय लेने वाली है; इस प्रकार, एक साथ कई ऑर्गेनॉइड लाइनों को विकसित करना व्यावहारिक नहीं है, उदाहरण के लिए, विभिन्न आंत खंडों या कई जानवरों से। इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, मनुष्यों, घोड़ों और सूअरों में कुछ अध्ययनों ने जमे हुए आंतों के ऊतकों (या बायोप्सी) या पृथक उपकला क्रिप्ट 4,15,16,17 से ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के तरीकों का वर्णन किया है। ये विधियां एक ही जानवर के कई आंत खंडों से आंतों के उपकला स्टेम कोशिकाओं के क्रायोप्रिजर्वेशन की अनुमति देती हैं, जिसका उपयोग तब आवश्यकता होने पर ऑर्गेनोइड्स को विकसित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, यह स्टेम कोशिकाओं के दाताओं के रूप में उपयोग किए जाने वाले जीवित जानवरों की संख्या में एक मजबूत कमी की अनुमति देता है, क्योंकि क्रायोप्रिजर्व्ड क्रिप्ट्स के बड़े स्टॉक बनाए जा सकते हैं (3 आर के सिद्धांत)। इस विधि का एक और लाभ फेनोटाइपिक या जीनोटाइपिक परिणाम प्राप्त करने के बाद केवल रुचि के जानवरों से आंतों के ऑर्गेनोइड्स का विकास है, जो अत्यधिक लागत प्रभावी है।

विवो में, आंतों के उपकला कोशिकाओं को ध्रुवीकृत किया जाता है, जिसमें एपिकल पक्ष लुमेन की ओर निर्देशित होता है। विट्रो में, 3 डी ऑर्गेनोइड्स में, उपकला कोशिकाओं का एपिकल पक्ष भी लुमेन (यानी, ऑर्गेनोइड्स के अंदर) का सामना कर रहा है। यह संगठन एपिकल पक्ष तक पहुंच को रोकता है, जो उपकला कोशिकाओं पर ल्यूमिनल घटकों (जैसे, पोषक तत्वों, रोगाणुओं, मेटाबोलाइट्स) के प्रभावों का अध्ययन करते समय एक मुद्दा है। इस नुकसान को दरकिनार करने के लिए, कई तरीकों को विकसित किया गया है, जैसे कि 2 डी मोनोलेयर, माइक्रोइंजेक्शन और पोलैरिटी रिवर्सल ("एपिकल-आउट ऑर्गेनोइड्स") 18,19 के रूप में ऑर्गेनॉइड कोशिकाओं की संस्कृति। ऑर्गेनॉइड सेल मोनोलेयर की संस्कृति सबसे कुशल और वापस लेने योग्य प्रणाली के रूप में उभर रही है। सिद्धांत 3 डी ऑर्गेनोइड्स को एकल कोशिकाओं में अलग करना है और उन्हें एक सेल कल्चर पोत पर बीज देना है जो पहले बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) 20 की एक पतली परत के साथ लेपित था। इन संस्कृति स्थितियों में, उपकला कोशिकाओं का एपिकल पक्ष ऊपर की ओर है, और इस प्रकार प्रयोगात्मक उपचार20 के लिए सुलभ है। ऑर्गेनॉइड सेल मोनोलेयर की संस्कृति को हाल ही में सुअर आंत21,22 के लिए अनुकूलित किया गया था; सुअर 3 डी ऑर्गेनोइड्स से प्राप्त सेल मोनोलेयर का उपयोग कई अनुप्रयोगों के लिए किया गया है, जिसमें एंटरिक संक्रमण 6,23,24,25, पोषक तत्वों का परिवहन9, और पाचन रोग मॉडलिंग26 शामिल हैं।

यहां, यह अध्ययन पहले क्रायोप्रिजर्व्ड एपिथेलियल क्रिप्ट्स (चित्रा 1) से प्राप्त सुअर आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति और रखरखाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। फिर, सुअर आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स से सेल मोनोलेयर स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। यहां वर्णित विधियां प्रयोगात्मक उपकरण प्रदान करती हैं जिनका उपयोग पोषक तत्व परिवहन, बाधा समारोह और मेजबान-सूक्ष्मजीव इंटरैक्शन के लिए सुअर आंतों के उपकला का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Protocol

इस प्रोटोकॉल को वैज्ञानिक उद्देश्यों (2010/63/ ईयू) के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों की सुरक्षा पर यूरोपीय निर्देश के अनुसार स्थानीय नैतिकता समिति (एन ° TOXCOM / 0136 / PP) द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल को एक उदाहरण के रूप में जेजुनम के लिए वर्णित किया गया है, लेकिन इसका उपयोग छोटी और बड़ी आंत (ग्रहणी, जेजुनम, इलियम, बृहदान्त्र) के प्रत्येक खंड के लिए किया जा सकता है।

1. पिगलेट आंत से उपकला क्रिप्ट का अलगाव

नोट: डीएमईएम के साथ पूर्ण डलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएमसी) का एक स्टॉक तैयार करें, जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) शामिल हैं। 50 एमएल एलिकोट तैयार करें और उन्हें 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

  1. समाधान की तैयारी (क्रिप्ट अलगाव के दिन किया जाना है)
    1. फॉस्फेट बफर्ड सलाइन (पीबीएस), 3 एमएम डिथियोथ्रेइटोल (डीटीटी), 9 एमएम एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए), 10 μM Y27632 रॉक अवरोधक, और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) युक्त पृथक्करण समाधान तैयार करें और बर्फ पर स्टोर करें।
    2. डीएमईएमसी, 10% एफबीएस, 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ), और 10 μM Y27632 रॉक अवरोधक युक्त फ्रीजिंग समाधान तैयार करें और बर्फ पर स्टोर करें (अंतिम एफबीएस एकाग्रता 18% है)।
    3. 1% पी / एस के साथ पूरक ठंडे पीबीएस युक्त परिवहन समाधान तैयार करें और इसे बर्फ पर स्टोर करें।
  2. उपकला क्रिप्ट का अलगाव
    1. इलेक्ट्रॉनआर्कोसिस द्वारा एक पिगलेट का वध करने के बाद उत्सर्जन।
    2. वध के तुरंत बाद, एक स्केलपेल के साथ पिगलेट के पेट को खोलें और पूरी आंत को हटा दें।
    3. आंतों के खंड के लगभग 2 सेमी एकत्र करें और इसे ठंडे परिवहन समाधान में संग्रहीत करें। सेगमेंट को बर्फ पर रखें जब तक कि क्रिप्ट अलगाव (2 घंटे तक)।
    4. ऊतक को पेट्री डिश में रखें। आंतों के खंड को अनुदैर्ध्य रूप से खोलें और आंतों की सामग्री को हटाने के लिए 1% पी / एस के साथ पूरक ठंडे पीबीएस में ऊतक को सावधानीपूर्वक धोएं।
    5. ऊतक को 1% पी / एस के साथ पूरक 10 एमएल ठंडे पीबीएस से भरे एक नए पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
    6. ऊतक को चिमटी के साथ पकड़ें और माइक्रोस्कोप स्लाइड के साथ स्क्रैप करके विली और शेष बलगम को हटा दें।
      नोट: विली (जीभ के आकार की संरचना) को हटाने की जांच सतह पर तैरने वाले के सूक्ष्म अवलोकन द्वारा की जा सकती है।
    7. ऊतक को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 5 एमएल बर्फ-ठंडा पृथक्करण समाधान होता है और एक घूर्णन शेकर (15 आरपीएम) पर कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    8. ऊतक को एक नए पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और 1% पी / एस के साथ पूरक 10 एमएल ठंडा पीबीएस जोड़ें।
    9. माइक्रोस्कोप स्लाइड के साथ म्यूकोसा को मजबूती से स्क्रैप करके क्रिप्ट्स को यांत्रिक रूप से अलग करें।
      नोट: एक माइक्रोस्कोप के तहत, पीबीएस (चित्रा 2 ए) में उपकला क्रिप्ट की उपस्थिति को सत्यापित करें।
    10. एक सीरोलॉजिकल पाइप के साथ क्रिप्ट समाधान को एस्पिरेट करें और 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 100 μm सेल छन्नी के माध्यम से फ़िल्टर करें।
    11. समाधान का 10 μL पाइप करें और माइक्रोस्कोप के तहत क्रिप्ट की उपस्थिति को सत्यापित करें। सेंट्रीफ्यूज 300 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    12. एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत, सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और 10 μM Y27632 रॉक अवरोधक के साथ पूरक 10 एमएल ठंडे DMEMc में क्रिप्ट्स की गोली को फिर से निलंबित करें।
    13. क्रिप्ट समाधान के 10 μL को 48-वेल प्लेट में डालें। मैन्युअल रूप से 10x आवर्धन के साथ माइक्रोस्कोप के तहत क्रिप्ट्स की संख्या की गणना करें, और समाधान के प्रति एमएल क्रिप्ट की एकाग्रता की गणना करें।
      नोट: पृथक क्रिप्ट्स का उपयोग सीधे आंतों के ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, प्रत्येक पिगलेट से क्रिप्ट के एक बड़े बैच को क्रायोप्रिजर्व करना और बाद में ऑर्गेनॉइड कल्चर के लिए उनका उपयोग करना अक्सर अधिक सुविधाजनक होता है।
  3. उपकला क्रिप्ट्स का जमना
    1. 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 900 क्रिप्ट के अनुरूप मात्रा स्थानांतरित करें। सेंट्रीफ्यूज 300 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. सतह पर तैरने वाला छोड़ दें और फ्रीजिंग घोल के 1 एमएल में क्रिप्ट्स की गोली को फिर से निलंबित करें। एक क्रायोट्यूब में स्थानांतरित करें और शीशी को सेल-फ्रीजिंग कंटेनर में रखें।
    3. सेल फ्रीजिंग कंटेनर को 24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और फिर शीशियों को दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।

2. जमे हुए उपकला क्रिप्ट से पिगलेट आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड की स्थापना

नोट: पिगलेट आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स को मानव ऑर्गेनोइड्स के विकास के लिए तैयार एक वाणिज्यिक संस्कृति माध्यम में संवर्धित किया जाता है, प्राथमिक कोशिकाओं के लिए एक रोगाणुरोधी एजेंट के 1% पी / एस और 100 μg / mL के साथ पूरक किया जाता है, और 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। एक ट्यूमर-व्युत्पन्न बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) का उपयोग 3 डी ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति के लिए किया जाता है। वाणिज्यिक उत्पादों के सभी संदर्भ सामग्री की तालिका में प्रस्तुत किए गए हैं।

  1. सामग्री तैयार करना
    1. पिपेट युक्तियों को -20 डिग्री सेल्सियस (कम से कम रात भर) पर रखें।
    2. ईसीएम (500 μL) के जमे हुए एलिकोट को कम से कम 1 घंटे पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में एक 48-वेल प्लेट को प्री-वार्म करें।
    4. आरटी पर संस्कृति माध्यम रखें।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान को पहले गर्म करें।
    6. सड़न रोकनेवाली परिस्थितियों में हुड के नीचे एक छोटी बर्फ की बाल्टी रखें।
  2. जमे हुए उपकला क्रिप्ट का पिघलना
    1. 37 डिग्री सेल्सियस (5 मिनट से कम) पर पानी के स्नान में 900 जमे हुए क्रिप्ट युक्त एक शीशी को जल्दी से पिघलाएं।
    2. क्रिप्ट समाधान को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    3. RT पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाले को हटा दें
    4. ईसीएम के प्रति 25 μL पर 150 क्रिप्ट की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए ठंडा युक्तियों के साथ ईसीएम का 150 μL जोड़ें। ईसीएम में क्रिप्ट्स का समरूप निलंबन प्राप्त करने के लिए 10 बार ऊपर और नीचे करें।
      नोट: पोलीमराइजेशन से बचने के लिए हमेशा ईसीएम को बर्फ पर रखें। ईसीएम में हेरफेर करने के लिए हमेशा -20 डिग्री सेल्सियस पर प्री-चिल्ड पिपेट युक्तियों का उपयोग करें। ईसीएम में हवा के बुलबुले बनाने से बचने के लिए धीरे-धीरे पाइप करें। छोटी बूंदों को ढहने से रोकने के लिए इस चरण में एक अनडिल्यूटेड ईसीएम का उपयोग किया जाता है।
    5. पहले से गर्म 48-वेल प्लेट में ठंडा युक्तियों के साथ प्रति कुएं 25 μL बूंद के साथ छह कुओं को बीज दें।
      नोट: टिप को कुएं के केंद्र में ऊर्ध्वाधर रखें, और गुंबद प्राप्त करने के लिए हवा पेश किए बिना धीरे-धीरे पाइप करें। यहां, 48-वेल प्लेटों का उपयोग किया जाता है, क्योंकि जमे हुए क्रिप्ट से शुरू करते समय ऑर्गेनॉइड संख्या आमतौर पर कम होती है।
    6. ईसीएम के पोलीमराइजेशन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. RT में कल्चर माध्यम के 250 μL प्रति कुएं जोड़ें। 37 °C, 5% CO 2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें और हर2-3 दिनों में कल्चर माध्यम बदलें
      नोट: पिघलने की प्रक्रिया के बाद क्रिप्ट आमतौर पर दिखाई नहीं देते हैं, और अधिकांश कोशिकाएं ईसीएम (चित्रा 2 बी) में अलग हो जाती हैं।

3. जमे हुए क्रिप्ट्स से प्राप्त पिगलेट आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स का पारित होना

नोट: जमे हुए क्रिप्ट्स से ऑर्गेनोइड प्राप्त करने का समय आमतौर पर ताजा क्रिप्ट से शुरू होने की तुलना में लंबा होता है। ऑर्गेनोइड आमतौर पर पिघलने के 10 दिन बाद विभाजित करने के लिए तैयार होते हैं (चित्रा 2 बी)।

  1. सामग्री तैयार करना
    1. ईसीएम (500 μL) के जमे हुए एलिकोट को कम से कम 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. 24-वेल प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर प्री-वार्म करें।
    3. पीबीएस और एंजाइम पृथक्करण अभिकर्मक को 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 10 μM Y27632 रॉक अवरोधक के साथ पूरक किया जाता है।
    4. आरटी पर संस्कृति माध्यम रखें।
    5. सड़न रोकनेवाली परिस्थितियों में हुड के नीचे एक छोटी बर्फ की बाल्टी रखें।
  2. जमे हुए क्रिप्ट से प्राप्त 3 डी ऑर्गेनोइड्स का पारित होना
    1. कल्चर मीडिया को हटा दें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 250 μL पूर्व-गर्म पीबीएस के साथ धो लें।
    2. प्रत्येक कुएं में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 μM Y27632 रॉक अवरोधक के साथ पूरक पूर्व-गर्म एंजाइम पृथक्करण अभिकर्मक के 250 μL जोड़ें।
      नोट: ऑर्गेनोइड्स की कम संख्या के कारण, ऑर्गेनोइड्स का पृथक्करण सीधे प्रत्येक कुएं में किया जाता है।
    3. पी 1000 पिपेट के साथ स्क्रैप करके ईसीएम में ऑर्गेनोइड्स को अलग करें, और पांच बार पाइपिंग करके सावधानीपूर्वक समरूप करें।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। पी 1000 पिपेट का उपयोग करके 10 बार ऊपर और नीचे पाइप करके कोशिकाओं को अलग करें।
      नोट: उद्देश्य पृथक कोशिकाओं या छोटे सेल क्लस्टर (<10 कोशिकाओं) को प्राप्त करना है। माइक्रोस्कोप के तहत पृथक्करण को सत्यापित करें। यदि ऑर्गेनोइड्स के बड़े टुकड़े अभी भी देखे जाते हैं, तो चरण 3.2.4 दोहराएं।
    5. अलग-थलग कोशिकाओं वाले प्रत्येक कुएं में डीएमईएमसी के 500 μL जोड़ें, और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 12 कुओं तक पूल करें जिसमें 3 एमएल ठंडा DMEMc होता है।
    6. सेंट्रीफ्यूज 500 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और गोली को 1 एमएल ठंडे डीएमईएमसी में फिर से निलंबित करें।
    7. सेल काउंटर के साथ ट्रिपैन ब्लू में 1: 2 के कमजोर पड़ने के साथ कोशिकाओं की गणना करें।
      नोट: स्वचालित सेल काउंटर मौजूद होने पर छोटे समूहों के भीतर कोशिकाओं की गणना कर सकता है।
    8. सेल समाधान की आवश्यक मात्रा को सेंट्रीफ्यूज करें जिसमें प्रति गुंबद (24-वेल प्लेट का एक गुंबद प्रति कुआं) 500 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 x g पर 3,000 जीवित कोशिकाएं हों।
    9. बर्फ पर प्रति 3,000 जीवित कोशिकाओं में 17 μL ठंडे DMEMc के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित किया। मात्रा को कुओं की आवश्यक संख्या में समायोजित करें।
    10. धीरे-धीरे प्रति 3,000 जीवित कोशिकाओं में ठंडा युक्तियों के साथ ठंडा ईसीएम का 33 μL जोड़ें और बुलबुले बनाए बिना बर्फ पर समरूप करें। मात्रा को कुओं की आवश्यक संख्या में समायोजित करें।
      नोट: कोशिकाओं को 1/3 डीएमईएमसी और 2/3 ईसीएम युक्त समाधान में पुन: निलंबित किया जाता है। प्रत्येक गुंबद के लिए, इस समाधान के 50 μL की आवश्यकता होती है। पतला ईसीएम सस्ता और पाइप करने में आसान है।
    11. कुओं को पूर्व-गर्म 24 अच्छी तरह से प्लेट में ठंडा युक्तियों के साथ प्रति कुएं ईसीएम-सेल सस्पेंशन के 50 μL के साथ बीज दें।
    12. ईसीएम के पोलीमराइजेशन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    13. प्रति अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम के 500 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें और हर 2-3 दिनों में संस्कृति माध्यम को बदलें
      नोट: ऑर्गेनोइड्स का उपयोग या तो सीधे प्रयोगों के लिए किया जा सकता है i) प्रयोगों के लिए, ii) 3 डी ऑर्गनॉइड संस्कृति का रखरखाव, iii) ठंड, या iv) ऑर्गेनोइड सेल मोनोलेयर की सीडिंग (चित्रा 1)। ऑर्गेनोइड्स को विभाजित करने के लिए इष्टतम समय चुनने के लिए हर दिन माइक्रोस्कोप के साथ ऑर्गेनोइड्स के विकास की जांच करें। ऑर्गेनोइड्स में एक स्पष्ट और खाली लुमेन और अच्छी तरह से परिभाषित किनारे होने चाहिए। लुमेन में काले मलबे के साथ परिपक्व ऑर्गेनोइड्स का उपयोग विभाजन के लिए नहीं किया जाना चाहिए (चित्रा 3)।

4. 3 डी में ऑर्गेनॉइड संस्कृति का रखरखाव

नोट: पासिंग के लिए, ऑर्गेनोइड्स को एक खाली लुमेन के साथ स्पष्ट दिखाई देना चाहिए। विभाजन के लगभग 5 दिन बाद लुमेन में काला मलबा दिखाई देता है और मृत कोशिकाओं की उपस्थिति को इंगित करता है। पासिंग के समय मृत कोशिकाओं की संख्या को सीमित करना संस्कृति के इष्टतम रखरखाव के लिए बेहतर है। इस प्रकार परिपक्वता के इस चरण तक पहुंचने से बचने के लिए अनुसूची को अनुकूलित किया जाना चाहिए।

  1. सामग्री की तैयारी
    1. कम से कम 1 घंटे के लिए पिघलने के लिए ईसीएम (500 μL) के एलिकोट को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 24-अच्छी प्लेट को प्री-वार्म करें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 10 μM Y27632 रॉक अवरोधक के साथ पूरक एंजाइम पृथक्करण अभिकर्मक को पूर्व-गर्म करें।
    4. आरटी पर संस्कृति माध्यम रखें।
    5. सड़न रोकनेवाली परिस्थितियों में हुड के नीचे एक छोटी बर्फ की बाल्टी रखें।
  2. आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स का पारित होना
    1. पी 1000 पिपेट के साथ स्क्रैप करके ईसीएम के साथ ऑर्गेनोइड्स को अलग करें। संस्कृति माध्यम में पाइपिंग द्वारा सावधानीपूर्वक समरूप करें, और बर्फ पर 5 एमएल ठंडे डीएमईएमसी युक्त 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: 24-वेल प्लेटों में 50 μL गुंबदों में संवर्धित ऑर्गेनोइड्स के 12 कुओं वाले पूल के लिए एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब की आवश्यकता होती है।
    2. एकत्रित ऑर्गेनोइड्स को 500 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: ऑर्गेनोइड ट्यूब के तल पर एक सफेद गोली बनाते हैं। यदि ऑर्गेनोइड्स सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद भी ईसीएम में निलंबन में हैं, तो ऊपरी सतह पर तैरने वाले (ईसीएम परत को छूने के बिना) को सावधानीपूर्वक एस्पिरेटेड करें, पी 1000 पिपेट के साथ 10 बार पाइप करके समरूप करें, और सेंट्रीफ्यूजेशन चरण को दोहराएं। इस प्रक्रिया के बाद ईसीएम परत दिखाई नहीं देनी चाहिए।
    3. सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें और सेल पेलेट को 10 μM Y27632 रॉक अवरोधक के साथ पूरक पूर्व-गर्म एंजाइम पृथक्करण अभिकर्मक के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें। ऑर्गेनोइड्स के पृथक्करण को शुरू करने के लिए 10 बार ऊपर और नीचे करें।
    4. एंजाइमेटिक पाचन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. यांत्रिक रूप से पी 1000 पिपेट के साथ 10 बार पाइप करके ऑर्गेनोइड्स को बाधित करता है। माइक्रोस्कोप के तहत सेल निलंबन की जांच करें।
      नोट: उद्देश्य पृथक कोशिकाओं या छोटे सेल क्लस्टर प्राप्त करना है। यदि बड़े ऑर्गेनोइड टुकड़े अभी भी देखे जाते हैं, तो इनक्यूबेशन (चरण 4.2.4) और यांत्रिक व्यवधान (चरण 4.2.5) को दोहराएं।
    6. बर्फ-ठंडा डीएमईएमसी के 4 एमएल जोड़ें। सेंट्रीफ्यूज 500 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर
    7. सुपरनैटेंट को छोड़ दें और डीएमईएमसी के 1 एमएल में ऑर्गेनॉइड सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें।
    8. ऊपर वर्णित (चरण 3.2.7 से 3.2.13) के रूप में आगे बढ़ें ताकि कोशिकाओं की गणना की जा सके और पूर्व-गर्म 24-वेल प्लेटों में 3000 जीवित कोशिकाओं वाले ईसीएम गुंबदों के 50 μL में ऑर्गेनोइड कोशिकाओं को बीज दिया जा सके।

5. 3 डी ऑर्गेनोइड्स का फ्रीजिंग

  1. 10% एफबीएस, 10% डीएमएसओ, और 10 μM Y27632 रॉक अवरोधक के साथ पूरक डीएमईएमसी युक्त ठंड समाधान की आवश्यक मात्रा (दो गुंबदों के पूल के लिए 1 एमएल) तैयार करें और बर्फ पर स्टोर करें (अंतिम एफबीएस एकाग्रता 18% है)।
  2. जमे हुए कुओं से संस्कृति माध्यम को हटा दें।
  3. जमे हुए होने के लिए पहले कुएं में ठंड के घोल का 1 एमएल जोड़ें, ईसीएम को स्क्रैप करके अलग करें, और पिपेट टिप के साथ समरूप करें।
  4. ऑर्गेनॉइड सस्पेंशन को पहले कुएं से दूसरे कुएं में फ्रीज करने के लिए स्थानांतरित करें।
  5. दो कुओं के पूल को क्रायोट्यूब में स्थानांतरित करें और शीशी को सेल-फ्रीजिंग कंटेनर में रखें।
  6. सेल फ्रीजिंग कंटेनर को 24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, और फिर शीशियों को दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।

6. 3 डी ऑर्गेनोइड्स से प्राप्त सेल मोनोलेयर की संस्कृति

नोट: सुअर ऑर्गेनॉइड कोशिकाओं के मोनोलेयर को 20% एफबीएस के साथ पूरक 3 डी ऑर्गेनोइड्स के लिए उपयोग किए जाने वाले संस्कृति माध्यम से बने 2 डी माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है।

  1. सामग्री तैयार करना
    1. 2 डी माध्यम तैयार करें और इसे आरटी पर रखें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 10 μM Y27632 रॉक अवरोधक के साथ पूरक एंजाइम पृथक्करण अभिकर्मक को पूर्व-गर्म करें।
  2. संस्कृति की कोटिंग डालें
    1. चिमटी की एक जोड़ी को निष्फल करें और उन्हें जैव सुरक्षा कैबिनेट में स्थानांतरित करें।
    2. सेल कल्चर इंसर्ट (0.33 सेमी2) को चिमटी के साथ 24-वेल प्लेट में रखें।
    3. ठंडे पीबीएस में 50 μg / mL पर पतला कोलेजन IV युक्त कोटिंग समाधान तैयार करें। मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पाइप करें
    4. प्रत्येक सेल कल्चर इंसर्ट में पतला कोलेजन IV समाधान का 150 μL जोड़ें, जो 22.7 μg /cm2 से मेल खाता है।
      नोट: ध्यान से पारगम्य झिल्ली के केंद्र में लंबवत रूप से पाइप को उन्मुख करें और जांचें कि कोलेजन समाधान सभी झिल्ली को कवर करता है।
    5. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें और रात भर (या न्यूनतम 3 घंटे के लिए) छोड़ दें।
  3. सेल कल्चर में 3 डी ऑर्गेनोइड कोशिकाओं का बीज डालना
    1. चरण 4.2.1 से 4.2.7 में वर्णित 3 डी ऑर्गेनोइड्स से एक सेल निलंबन तैयार करें।
    2. सेल काउंटर के साथ ट्रिपैन ब्लू में 1: 2 के कमजोर पड़ने के साथ कोशिकाओं की गणना करें, और 7.6 x 10 5 कोशिकाओं / सेमी 2 के अनुरूप प्रति संस्कृति2.5 x 105 कोशिकाओं को बीज करने के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें।
    3. सेंट्रीफ्यूज सेल निलंबन की आवश्यक मात्रा 500 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    4. सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान, कल्चर इंसर्ट से कोटिंग घोल को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें, और 5 मिनट के लिए ढक्कन के बिना हुड के नीचे आरटी पर सूखने दें।
    5. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सुपरनैटेंट को छोड़ दें और सेल पेलेट को 2 डी माध्यम की आवश्यक मात्रा में 10 μM Y27632 रॉक अवरोधक के साथ पूरक करें। प्रत्येक सम्मिलित के लिए कोशिकाओं से युक्त 2 डी माध्यम के 200 μL की मात्रा की आवश्यकता होती है।
    6. लेपित पारगम्य झिल्ली (एपिकल साइड) पर सेल निलंबन (2.5 x 105 कोशिकाओं) का बीज 200 μL (चित्रा 4 ए)।
      नोट: पाइप को धीरे-धीरे झिल्ली के केंद्र में रखें और नोक को ऊर्ध्वाधर रखें।
    7. निचले डिब्बे (बेसल साइड) में 10 μM Y27632 रॉक अवरोधक के साथ पूरक 2 D माध्यम के 500 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
    8. बीज बोने के एक दिन बाद, वाई 27632 रॉक अवरोधक के बिना एपिकल और बेसल मीडिया को ताजा 2 डी माध्यम से बदलें।
    9. प्रत्येक दिन 2 डी माध्यम बदलें। मोनोलेयर बीज बोने के 1 दिन बाद कंफ्लुएंट हो जाता है, और फिर प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
      नोट: रिक्त स्थान के ऊपर एक ट्रांसएपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध (टीईईआर) मान (कोशिकाओं के बिना सम्मिलित) पुष्टि करता है कि कंफ्लुएंसी तक पहुंच गया है (चित्रा 4 बी)।

7. ऑर्गेनॉइड सेल मोनोलेयर का इम्यूनोस्टेनिंग

  1. समाधान तैयार करना
    नोट: दाग वाले कुओं की संख्या के अनुसार समाधान की मात्रा समायोजित करें; एक कुएं के लिए प्रत्येक चरण में समाधान के 200 μL की आवश्यकता होती है। सामग्री की तालिका में सभी वाणिज्यिक उत्पादों के संदर्भ प्रदान किए गए हैं।
    1. पीबीएस के 35 एमएल में 32% पीएफए के 5 एमएल जोड़कर रासायनिक हुड के तहत 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान तैयार करें। 10 एमएल एलिकोट तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      सावधानी: नाइट्राइल दस्ताने पहनते समय, हमेशा रासायनिक हुड के तहत पीएफए में हेरफेर करें।
    2. उपयोग से तुरंत पहले 1 एमएल पीबीएस में ट्राइटन एक्स 100 के 2 μL को जोड़कर 0.2% ट्राइटन X100-PBS का समाधान तैयार करें। आरटी पर रखें।
    3. पीबीएस के 1 एमएल में 100 मिलीग्राम बीएसए जोड़कर 10% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए)-पीबीएस समाधान तैयार करें। आरटी पर रखें।
    4. पीबीएस के 1 एमएल में 10 मिलीग्राम बीएसए जोड़कर 1% बीएसए-पीबीएस समाधान तैयार करें। आरटी पर रखें।
    5. 1% पीबीएस बीएसए के 995 μL में प्राथमिक एंटीबॉडी के 5 μL जोड़कर 1:200 पर पतला ऑक्लुडिन प्राथमिक एंटीबॉडी का समाधान तैयार करें। घोल को बर्फ पर रखें।
    6. 1% बीएसए-पीबीएस के 999 μL में द्वितीयक एंटीबॉडी के 1 μL जोड़कर 1: 1,000 पर पतला द्वितीयक एंटीबॉडी का समाधान तैयार करें। घोल को बर्फ पर रखें, प्रकाश से सुरक्षित रखें।
    7. 1 मिलीग्राम/एमएल से 990 μL PBS में TRITC के 10 μL जोड़कर 10 μg/mL पर फैलोइडिन TRITC का घोल तैयार करें। बर्फ पर रखें, प्रकाश से सुरक्षित रहें।
  2. इम्यूनोस्टेनिंग
    नोट: जब तक अन्यथा संकेत नहीं दिया जाता है, सभी ऊष्मायन आरटी में किए जाते हैं, एक रॉकिंग प्लेटफॉर्म (30 आरपीएम) पर धीमी गति से आंदोलन के तहत। इम्यूनोस्टेनिंग सीधे सेल कल्चर इंसर्ट में किया जाता है।
    1. बेसल और एपिकल माध्यम को हटा दें। प्लेट को रासायनिक हुड के नीचे रखें।
    2. मोनोलेयर को आरटी पर पीबीएस के 200 μL के साथ दो बार धोएं और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. आरटी पर 4% पीएफए के 200 μL के साथ सेल मोनोलेयर को ठीक करें और RT पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. मोनोलेयर को आरटी पर पीबीएस के 200 μL के साथ दो बार धोएं और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: निर्धारण और धोने के चरणों के बाद, मोनोलेयर को 1 सप्ताह के लिए पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
    5. पीबीएस को हटा दें, 0.2% ट्राइटन एक्स 100-पीबीएस के 200 μL के साथ परमेबिलाइज करें, और 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. मोनोलेयर को आरटी पर पीबीएस के 200 μL के साथ दो बार धोएं और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. 1% बीएसए-पीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 200 μL जोड़ें और एक रॉकिंग प्लेटफॉर्म पर धीमी गति से आंदोलन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना केवल 1% बीएसए-पीबीएस जोड़कर एक नकारात्मक नियंत्रण अच्छी तरह से शामिल करें।
    8. आरटी पर पीबीएस के 200 μL के साथ मोनोलेयर को तीन बार धोएं और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    9. 1% बीएसए-पीबीएस में 200 μL द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ें और प्रकाश से सुरक्षित 2 घंटे के लिए RT पर इनक्यूबेट करें।
    10. आरटी पर पीबीएस के 200 μL के साथ मोनोलेयर को तीन बार धोएं और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    11. 10 μg/mL पर 200 μL phalloidin TRITC जोड़ें और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    12. मोनोलेयर को आरटी पर पीबीएस के 200 μL के साथ दो बार धोएं और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    13. पीबीएस को हटा दें और एक स्केलपेल के साथ झिल्ली को काट लें।
    14. चिमटी की एक जोड़ी के साथ झिल्ली को पुनर्प्राप्त करें और इसे माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखें, जिसमें एपिकल साइड ऊपर की ओर हो।
    15. झिल्ली पर सीधे 1: 1,000 पर DAPI के साथ पूरक माउंटिंग माध्यम के 15 μL जोड़ें। एक कवरलिप और सील रखें।
    16. इमेजिंग तक प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के बाद, उपकला क्रिप्ट्स सुअर की आंत से प्राप्त किए जाते हैं और तरल नाइट्रोजन (चित्रा 1 और चित्रा 2 ए) में दीर्घकालिक भंडारण के लिए क्रायोसंरक्षित होते हैं। पिघलने के बाद, क्रिप्ट स्टेम कोशिकाओं को ईसीएम (चित्रा 2 बी) में बीज दिया जाता है। ईसीएम में क्रिप्ट संरचना के विघटन के कारण, इस चरण के बाद क्रिप्ट संरचना आमतौर पर खो जाती है। ऑर्गेनोइड्स को 3-4 दिनों के भीतर देखा जा सकता है, और फिर तेजी से बढ़ता है और नवोदित संरचनाओं को विकसित करता है (चित्रा 2 बी)। हमने >80% प्रयासों में जमे हुए क्रिप्ट को पिघलाने के बाद सफलतापूर्वक ऑर्गेनोइड प्राप्त किए। पिघलने के लगभग 10 दिन बाद (ऑर्गेनोइड्स की वृद्धि दर के अनुसार), संस्कृति का विस्तार करने के लिए ऑर्गेनोइड्स का एक मार्ग किया जाता है (चित्रा 3)। ऑर्गेनोइड विभाजित होने के बाद तेजी से बढ़ते हैं, और वे कुछ सिस्टिक और अधिकांश उभरते ऑर्गेनोइड्स के साथ विविध आकृति विज्ञान प्रस्तुत करते हैं। संस्कृति के इष्टतम रखरखाव के लिए, पासिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले ऑर्गेनोइड्स को एक स्पष्ट और खाली लुमेन और अच्छी तरह से परिभाषित किनारों (हरे तीरों द्वारा इंगित उदाहरण) को प्रस्तुत करना चाहिए, जिसमें लुमेन में कोई काला मलबा नहीं है (लाल तीर द्वारा इंगित), जैसा कि परिपक्व ऑर्गेनोइड्स (चित्रा 3) में देखा गया है। हमने पाया कि ब्लैक सेल का मलबा 6 वें दिन के आसपास जमा होना शुरू हो जाता है। इस प्रकार, 4-5 दिन के बाद ऑर्गेनोइड्स को विभाजित या फ्रीज करने की सिफारिश की जाती है।

सेल मोनोलेयर प्राप्त करने में ऑर्गेनोइड्स का परिपक्वता चरण भी एक महत्वपूर्ण बिंदु है। उन्नत परिपक्वता वाले ऑर्गेनोइड्स (लुमेन में काले सेल मलबे की उपस्थिति से संकेत मिलता है) बीज मोनोलेयर के लिए इष्टतम नहीं हैं। हम आमतौर पर 2 डी संस्कृति के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए पारित होने के 4 दिन बाद 3 डी ऑर्गेनोइड्स को अलग करते हैं। ईसीएम के प्रति 50 μL गुंबद में 3,000 कोशिकाओं पर संवर्धित 3 डी ऑर्गेनोइड्स के लगभग एक से तीन कुओं को 2.5 x10 5 कोशिकाओं के साथ एक कल्चर डालने के लिए आवश्यक है। कोशिकाएं 1 दिन के भीतर एक पूरी तरह से कॉन्फ्लुएंट मोनोलेयर को जोड़ती हैं और बनाती हैं (चित्रा 4 ए), जिसकी पुष्टि लगभग 700 Ω सेमी2 (चित्रा 4 बी) के उच्च टीईआर द्वारा की जाती है। हालांकि, सेल किनारों को इस शुरुआती समय बिंदु पर ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना करना मुश्किल है, शायद कम भेदभाव स्तर के कारण। टीईआर 3 दिनों के लिए उच्च रहता है (चित्रा 4 बी)।

एक्टिन धुंधला होना इंगित करता है कि उपकला कोशिकाओं का एपिकल पक्ष 3 डी ऑर्गेनोइड्स (चित्रा 5 ए) में लुमेन की ओर उन्मुख है। संस्कृति में बीजित ऑर्गेनोइड कोशिकाएं उपकला कोशिकाओं की एक कंफ्लुएंट एकल परत बनाती हैं, जिसमें एपिकल पक्ष ऊपरी डिब्बे (चित्रा 4 बी, सी) की ओर उन्मुख होता है। ऑक्लुडिन धुंधला होने से 3 डी ऑर्गेनोइड्स और सेल मोनोलेयर (चित्रा 5 ए-सी) में उपकला कोशिकाओं के एपिकल साइड पर तंग जंक्शनों की उपस्थिति का पता चलता है।

Figure 1
चित्रा 1: ऑर्गेनोइड्स से प्राप्त 3 डी ऑर्गेनोइड्स और सेल मोनोलेयर को कल्चर करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एपिथेलियल क्रिप्ट्स को पिगलेट आंत से अलग किया जाता है। इन क्रिप्ट्स का उपयोग तुरंत 3 डी ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए किया जा सकता है या ii) तरल नाइट्रोजन में बायोबैंक में जमे हुए और संग्रहीत किया जा सकता है। क्रायोप्रिजर्व्ड क्रिप्ट्स को पिघलाया जा सकता है और 3 डी ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। 3 डी ऑर्गेनॉइड संस्कृति को क्रमिक विभाजन के साथ बनाए रखा जा सकता है, या बायोबैंक में जमे हुए और संग्रहीत किया जा सकता है। कोशिकाओं के एपिकल पक्ष तक पहुंच की अनुमति देने और उपकला बाधा समारोह का अध्ययन करने के लिए सेल मोनोलेयर को 3 डी ऑर्गेनॉइड संस्कृति से प्राप्त किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: क्रायोप्रिजर्व्ड एपिथेलियल क्रिप्ट्स से सुअर आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति। (ए) ताजा पृथक जेजुनल क्रिप्ट्स की प्रतिनिधि सूक्ष्म छवि। (बी) जेजुनल क्रिप्ट्स के पिघलने के बाद प्राप्त 3 डी ऑर्गेनोइड्स की प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियां। ऑर्गेनोइड्स को 48-वेल प्लेट में ईसीएम के 25 μL गुंबद में सुसंस्कृत किया गया था। यह आंकड़ा 4, 7, 8, 9 और 10 दिनों के बाद 3 डी ऑर्गेनोइड्स की छवियों को दिखाता है। स्केल पट्टी 500 μm का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: पहले मार्ग के बाद क्रायोप्रिजर्व्ड एपिथेलियल क्रिप्ट से प्राप्त सुअर आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स की आकृति विज्ञान। प्रतिनिधि सूक्ष्म चित्र जो दिन 4 से दिन 7 तक पहले मार्ग के बाद क्रायोसंरक्षित जेजुनम क्रिप्ट्स से प्राप्त ऑर्गेनोइड्स के विकास को दर्शाते हैं। हरे तीर मोनोलेयर के मार्ग या सीडिंग के लिए उपयुक्त स्पष्ट ऑर्गेनोइड्स का संकेत देते हैं। लाल तीर परिपक्व ऑर्गेनोइड्स को इंगित करते हैं जो मोनोलेयर को विभाजित या सीडिंग के लिए उपयुक्त नहीं हैं; इस प्रकार, इस आकृति विज्ञान के मूल्यांकन से पहले कुओं का उपयोग किया जाना चाहिए। स्केल पट्टी 500 μm का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: सुअर आंतों 3 डी ऑर्गेनोइड्स से प्राप्त सेल मोनोलेयर की विशेषताएं। (ए) 3 दिनों में मोनोलेयर आकृति विज्ञान की प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियां। जेजुनम ऑर्गेनॉइड कोशिकाओं को 2.5 x 105 कोशिकाओं में 0.33 सेमी2 सेल कल्चर इंसर्ट में 50 एनजी / एमएल पर कोलेजन IV के साथ लेपित किया गया था। स्केल बार 3 दिनों में ऑर्गेनॉइड सेल मोनोलेयर के 500 μm. (B) ट्रांसएपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध (TEER) का प्रतिनिधित्व करता है। एक रेखा से जुड़े बिंदु अलग-अलग समय पर एक ही कुएं के अनुरूप होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: 3 डी या 2 डी में संवर्धित सुअर जेजुनम ऑर्गेनोइड्स की इमेजिंग। विभाजन के 5 दिन बाद (ए) 3 डी ऑर्गेनोइड्स की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और सीडिंग के 3 दिन बाद (बी, सी) ऑर्गेनॉइड सेल मोनोलेयर (बी: एक्सजेड सेक्शन; सी: एक्सवाई अनुभाग)। डीएनए (नीला) DAPI के साथ सना हुआ था। एक्टिन (लाल) फेलोइडिन से सना हुआ था। ऑक्लुडिन (हरा) एक पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी से सना हुआ था। सफेद तीर तंग जंक्शन पर स्थानीयकृत ऑक्लुडिन का संकेत देते हैं। स्केल पट्टी 20 μm का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यह प्रोटोकॉल लंबे समय तक भंडारण और 3 डी ऑर्गेनोइड्स की बाद की संस्कृति के लिए पिगलेट आंत से उपकला क्रिप्ट को क्रायोप्रिजर्व करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधि का वर्णन करता है। यह प्रोटोकॉल डीएमएसओ, एफबीएस, वाई 27632 रॉक अवरोधक, डीएमईएम और एंटीबायोटिक दवाओं वाले फ्रीजिंग समाधान का उपयोग करता है। सूअरों में एक अन्य अध्ययन ने क्रिप्ट्स क्रायोप्रिजर्व से ऑर्गेनोइड प्राप्त किए, जो एक समान ठंड समाधान में संरक्षित थे लेकिन रॉक अवरोधक15 के बिना। वाई 27632 रॉक अवरोधक को एपोप्टोसिस को रोकने और स्टेम सेल पूल को बनाए रखने के लिए शामिल किया गया था, क्योंकि पिघलने के बाद, उपकला क्रिप्ट कोशिकाओं को अलग कर दिया जाता है, जिससे कोशिका मृत्यु ('एनोइकिस') 27,28 हो सकती है। दिलचस्प बात यह है कि इक्वाइन एंटरोइड्स को केवल डीएमईएम और डीएमएसओ16 युक्त संस्कृति माध्यम में जमे उपकला क्रिप्ट से प्राप्त किया गया है; इस सरल विधि का अभी तक सुअर उपकला क्रिप्ट के लिए परीक्षण नहीं किया गया है। उपकला क्रिप्ट 4,17 के बजाय जमे हुए ऊतकों या बायोप्सी से मानव और सुअर ऑर्गेनोइड विकसित करने के लिए अन्य तरीकों को प्रकाशित किया गया है। इस विधि का लाभ क्रिप्ट अलगाव प्रक्रिया किए बिना आंतों के ऊतकों को सीधे क्रायोप्रिजर्व करने की क्षमता है, जिसके लिए समय और प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता होती है। यह सुविधाजनक हो सकता है जब ऊतकों को प्रयोगशाला से दूर एकत्र किया जाना चाहिए। हालांकि, वध के तुरंत बाद क्रिप्ट्स को अलग करते समय, आंत के बड़े खंडों को बहुत अधिक संख्या में क्रिप्ट प्राप्त करने के लिए संसाधित किया जा सकता है, जो कि छोटे जमे हुए ऊतक टुकड़ों से शुरू करते समय ऐसा नहीं होता है। एपिथेलियल क्रिप्ट्स के पिघलने के बाद, ऑर्गेनोइड्स को सीडिंग के 3-4 दिनों के बाद देखा गया और 10 दिनों के बाद विभाजित किया गया। यह ताजा उपकला क्रिप्ट्स से संस्कृति शुरू करते समय की तुलना में धीमी वृद्धि दर है, जिसके लिए ऑर्गेनोइड्स को बीजारोपण के बाद दिन 1 से प्राप्त किया गया था, और आमतौर पर लगभग 511 वें दिन विभाजित किया जा सकता है। खलील एट अल ने जमे हुए क्रिप्ट्स15 से शुरू होने पर सुअर एंटरोइड्स के विलंबित विकास की भी सूचना दी, यह सुझाव देते हुए कि स्टेम कोशिकाओं को अपनी प्रोलिफेरेटिव क्षमता को ठीक करने के लिए समय की आवश्यकता हो सकती है। हमने ताजा क्रिप्ट्स की तुलना में जमे हुए क्रिप्ट्स से शुरू होने पर ऑर्गेनोइड्स की कम संख्या भी प्राप्त की, जो ठंड प्रक्रिया के दौरान स्टेम कोशिकाओं की मृत्यु के कारण हो सकता है। क्रिप्ट्स पिघलने (<20%) के कुछ प्रयासों में, हमने जमे हुए क्रिप्ट्स से ऑर्गेनोइड प्राप्त नहीं किए, शायद एक सबऑप्टिमल क्रायोप्रिजर्वेशन प्रक्रिया के कारण (उदाहरण के लिए, क्रिप्ट अलगाव के बाद ठंड में देरी)। इस प्रकार, हम गिनती तक क्रिप्ट्स को बर्फ पर रखने की सलाह देते हैं, और जितनी जल्दी हो सके उन्हें फ्रीज करते हैं।

3 डी ऑर्गेनोइड्स के लिए, हमने मनुष्यों के लिए तैयार किए गए एक वाणिज्यिक ऑर्गेनॉइड संस्कृति माध्यम का उपयोग करना चुना। दरअसल, पिछली रिपोर्टों से पता चला है कि सुअर आंतों के ऑर्गेनोइड इस माध्यम 8,11,14,19,25,26,29,30 के साथ कुशलता से बढ़ते हैं। इस संस्कृति माध्यम के लिए उपयोग के लिए तैयार होना और एक बैच के भीतर विकास कारकों की एक मानकीकृत एकाग्रता होना दिलचस्प है। हालांकि, यह संस्कृति माध्यम महंगा है, इसकी संरचना अज्ञात है, और इस प्रकार इसकी संरचना को संशोधित करना संभव नहीं है। इसके विपरीत, अन्य अध्ययनों ने फार्माकोलॉजिकल इनहिबिटर, पुनः संयोजक विकास कारक और / या वातानुकूलित मीडिया 5,6,7,21 युक्त अनुकूलित मीडिया में सुअर आंतों के ऑर्गेनोइड्स को सुसंस्कृत किया है। हालांकि अत्यधिक लचीला और सस्ता, यह विधि वातानुकूलित मीडिया के उत्पादन के लिए समय लेने वाली है और वातानुकूलित मीडिया में विकास कारकों की एकाग्रता में संभावित परिवर्तनशीलता के कारण प्रजनन क्षमता की कमी हो सकती है। इस प्रकार, वातानुकूलित मीडिया के प्रत्येक बैच की गुणवत्ता को ऑर्गेनोइड विकास या मार्कर जीन अभिव्यक्ति31 को मापकर मान्य किया जाना चाहिए।

एक अध्ययन से पता चला है कि यहां उपयोग किए जाने वाले एक ही वाणिज्यिक ऑर्गेनॉइड कल्चर माध्यम में संवर्धित पिग जेजुनल ऑर्गेनोइड तेजी से बढ़े और कम विभेदित लग रहे थे, जबकि पुनः संयोजक विकास कारक और / या वातानुकूलित मीडिया23 वाले मीडिया के साथ संवर्धित एंटरोइड्स की तुलना में। एक उच्च प्रोलिफेरेटिव अवस्था 3 डी ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति की सुविधा प्रदान करती है, लेकिन आंतों की शारीरिक विशेषताओं के अधिक प्रतिनिधि होने के लिए भेदभाव को प्रेरित करने की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रोटोकॉल में, 3 डी ऑर्गेनोइड्स के पारित होने के लिए, कोशिकाओं को गिनती के लिए पूरी तरह से अलग कर दिया जाता है, जिससे ईसीएम में बीजित कोशिकाओं की संख्या को नियंत्रित करने की अनुमति मिलती है। यह ऑर्गेनोइड्स के फेनोटाइप की प्रजनन क्षमता को बढ़ाता है, जो उनके घनत्व से अत्यधिक प्रभावित होता है। इसके अलावा, कोशिकाओं की गिनती बहुत कम या भीड़भाड़ वाली संस्कृति प्राप्त करने से बचती है, जिसके लिए संस्कृति अनुसूची को अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। अधिकांश अन्य अध्ययनों ने ऑर्गेनॉइड टुकड़े तैयार किए जो एकल कोशिकाओं से पूरी तरह से अलग नहीं थे, और पासिंग के लिए कमजोर पड़ने वाले अनुपात का उपयोग किया। यह विधि अधिक सरल है, लेकिन संस्कृति के ऑर्गेनॉइड घनत्व के अनुसार परिवर्तनशीलता को प्रेरित कर सकती है।

मोनोलेयर में संस्कृति के लिए, ऑर्गेनोइड कोशिकाओं को संस्कृति में बीज दिया जाता है, जो ईसीएम की एक पतली परत के साथ प्रीकोटेड होता है, जो कोशिकाओं के लगाव की अनुमति देता है लेकिन 3 डी में ऑर्गेनोइड के विकास से बचता है। इस प्रोटोकॉल ने कोलेजन टाइप IV को ईसीएम प्रोटीन के रूप में इस्तेमाल किया, जैसा कि पहलेसूअरों 23 में वर्णित है। सुअर ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर के साथ अन्य अध्ययनों ने 3 डी ऑर्गेनोइड्स 6,8,9,21,25,30 को कल्चर करने के लिए यहां उपयोग किए जाने वाले उसी ट्यूमर-व्युत्पन्न ईसीएम का उपयोग किया। कोलेजन का उपयोग करने का लाभ पूरी तरह से परिभाषित संरचना के साथ प्रोटीन एकाग्रता को मानकीकृत करने की क्षमता है, जो ट्यूमर-व्युत्पन्न ईसीएम में नहीं है। सेल मोनोलेयर की संस्कृति की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण कदम अग्रदूत 3 डी ऑर्गेनोइड्स की दृश्य उपस्थिति पर ध्यान देना है, जिसमें अच्छी तरह से परिभाषित किनारे और काले मलबे के बिना एक खाली लुमेन होना चाहिए। दरअसल, उच्च परिपक्वता स्तर और कम प्रोलिफेरेटिव दर वाले ऑर्गेनोइड 2 डी संस्कृति के लिए कोशिकाओं का उपयुक्त स्रोत नहीं हैं। इस प्रकार, एकल कोशिकाओं में 3 डी ऑर्गेनोइड्स के पृथक्करण का समय इस कदम की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है।

एकल कोशिकाओं से 2 डी मोनोलेयर की संस्कृति बीजित कोशिकाओं की संख्या को मानकीकृत करने की अनुमति देती है, जो ऑर्गेनॉइड टुकड़ों से शुरू करते समय अधिक कठिन होती है, जैसा कि कुछ अन्य तरीकों में किया जाता है। हमने प्रति सेमी2 में 7.6 x 105 कोशिकाओं को बीज दिया, जोसूअरों में 21,22,23 अन्य अध्ययनों की तुलना में अधिक है, जो कम सेल घनत्व का उपयोग करते थे, जो 0.25 x 105 कोशिकाओं प्रति सेमी2 से 1.78 x 105 कोशिकाओं प्रति सेमी2 तक होता है। ऑर्गेनॉइड कोशिकाओं की एक उच्च संख्या की आवश्यकता इस प्रोटोकॉल की एक सीमा का गठन करती है, लेकिन इसने हमें 1 दिन के बाद कल्चर इंसर्ट को पूरी तरह से कवर करते हुए जल्दी से एक कॉन्फ्लुएंट मोनोलेयर प्राप्त करने की अनुमति दी। इसके विपरीत, वर्मीयर एट अल.23 ने 4-7 दिनों के बाद बीजित कोशिकाओं के कम घनत्व (0.25 x 105 कोशिकाओं / सेमी2 से 0.4 x 105 कोशिकाओं / सेमी2 तक) के साथ संयोजन प्राप्त किया। कुछ अध्ययनों ने सुअर ऑर्गेनॉइड सेल मोनोलेयर का भी उपयोग किया है जो वायरस 8,30 के साथ संक्रमण के लिए संस्कृति की सतहको पूरी तरह से कवर नहीं करते हैं। इन स्थितियों में, उपकला कोशिकाओं का एपिकल पक्ष उपचार के लिए सुलभ है, लेकिन यदि उद्देश्य पोषक तत्व अवशोषण या उपकला पारगम्यता का अध्ययन करना है तो पूरी तरह से कॉन्फ्लुएंट मोनोलेयर की आवश्यकता होती है।

ऑर्गेनोइड सेल मोनोलेयर के लिए, 20% एफबीएस के साथ पूरक एक वाणिज्यिक ऑर्गेनॉइड कल्चर माध्यम का उपयोग किया गया था, जो गोजातीय एंटरोइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर32 पर हाल के अध्ययन पर आधारित था। हमारे परीक्षणों में, 20% एफबीएस के साथ पूरक पूरी तरह से कॉन्फ्लुएंट मोनोलेयर प्राप्त करने के लिए आवश्यक था, शायद उच्च विकास कारक की आवश्यकता के कारण। इसके विपरीत, एक ही वाणिज्यिक माध्यम का उपयोग करने वाले अन्य अध्ययनों ने अतिरिक्त एफबीएस 8,25,30 के बिना मोनोलेयर स्थापित किए हैं, लेकिन पूर्ण सामंजस्य तक पहुंचने के बिना। अन्य अध्ययनों ने सुअर ऑर्गेनॉइड सेल मोनोलेयर 21,22 की संस्कृति के लिए एक अनुकूलित माध्यम में20% एफबीएस के साथ पूरक का भी उपयोग किया है। हमारे प्रयोगों में, टीईआर बीजारोपण के 1 दिन बाद उच्च होता है (लगभग 700 Ω सेमी2), और दिन 3 तक उच्च रहता है (लगभग 1,500 Ω सेमी2; यह तंग जंक्शनों के गठन के अनुरूप है, जैसा कि ऑक्लुडिन की अभिव्यक्ति से संकेत मिलता है। वैन डेर ही एट अल ने जेजुनम ऑर्गेनॉइड सेल मोनोलेयर21 के लिए 72 घंटे से अधिक समान टीईआर मान प्राप्त किए। उन्होंने यह भी दिखाया कि मोनोलेयर को दैनिक मीडिया परिवर्तनों के साथ 12-15 दिन तक बनाए रखा जा सकता है। इसके विपरीत, अन्य अध्ययनों ने सुअर ऑर्गेनॉइड सेल मोनोलेयर 6,22 के लिए बहुत कम टीईआर मान (लगभग200 Ω सेमी 2) की सूचना दी है। अध्ययनों के बीच ये अंतर अध्ययन किए गए आंत खंड या उपकला भेदभाव को प्रभावित करने वाले मीडिया से संबंधित हो सकते हैं।

अंत में, जमे हुए उपकला क्रिप्ट्स से सुअर आंतों के 3 डी ऑर्गेनोइड्स को विकसित करने के लिए उपरोक्त प्रोटोकॉल संस्कृति कार्य के संगठन की सुविधा प्रदान करता है। यह जीवित जानवरों से प्राप्त किए जाने वाले ताजा ऊतकों की आवश्यकता को कम करता है। हम यह भी बताते हैं कि 3 दिनों से कम समय में सुअर ऑर्गेनोइड्स से प्राप्त पूरी तरह से कंफ्लुएंट सेल मोनोलेयर कैसे स्थापित किए जाएं। इस प्रकार, हमारे प्रोटोकॉल पशु चिकित्सा या जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए सुअर आंतों के उपकला का अध्ययन करने वाले वैज्ञानिकों के लिए उपयोगी संसाधन हो सकते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को इंस्टीट्यूट कार्नोट फ्रांस फ्यूचर एलीवेज ("ऑर्गेनोपिग" परियोजना) और INRAE HOLOFLUX ("होलोपिग" परियोजना) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक जीनोटौल कोर सुविधाओं (टीआरआई) के आभारी हैं। हम सावधानीपूर्वक प्रूफरीडिंग के लिए क्रिस्टेल नुडसेन (जेनफिज़, आईएनआरएई, टूलूज़) को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9260G Store at room temperature.
15 mL conical tube Sarstedt 62.554.502
24-well cell culture plate Corning 003526
48-well cell culture plate Corning 003548
50 mL polypropylene conical tube Falcon 352070
Bovine Serum Albumine (BSA) Euromedex A6003 Store at 4 °C.
Centrifuge Universal 320 R Hettich 1406
Collagene type IV from human placenta Sigma C5533 Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (500 µL) and store at -20 °C.
CoolCell LX Cell Freezing Container Corning 432003 Used to cryopreserve crypts and organoids.
Countess 3 Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific 16842556
Coverslips, 22 mm x 50 mm VWR 630-1845
Cryotube ClearLine 1 mL Clear line 390706 Used to cryopreserve crypts and organoids.
DAPI Invitrogen D1306 Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer’s recommendation. Aliquot (20 µL) and store at -20 °C
Dithiothreitol (DTT) Merck 10197777001 Store at 4 °C.
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 31966047 Store at 4 °C.
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) Corning 25-950-CQC Store at room temperature.
Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide VWR 631-9483
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 10270-106 Store 5 mL aliquots at -20 °C.
Fisherbrand Sterile Cell Strainers Thermo Fisher Scientific 22363549 Used for crypt isolation.
Fixed Tilt 3D Platform Rotator VWR 97025-564 Used for incubations in the immunostaining protocol.
Gibco PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010015 Store at 4 °C.
Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red Thermo Fisher Scientific 12605-010 Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.
Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008 Secondary antibody. Store at 4 °C. Working dilution 1:1000.
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) Stem Cell Technology 6010 Organoid culture medium. Store at -20 °C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 °C for up to 1 week.
Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells Corning 353095
Inverted microscope Nikon Eclipse TS2
Matrigel Basement Membrane Matrix Corning 354234 Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 µL aliquots and store at -20 °C.
Mounting medium for fluorescence with DAPI Vectashield H1250 Store at 4 °C.
Occludin polyclonal antibody Thermo Fisher Scientific 71-1500 Primary antibody. Store at -20 °C. Working dilution 1:200.
Paraformaldehyde 32% Electron microscopy science 15714 Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 °C.
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333 Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 °C.
Phalloidin TRITC Sigma P1951 Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 °C.
Primocin InvivoGen ant-pm-05 Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 °C.
ROCK Inhibitor (Y27632) ATCC ACS-3030 Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer's recommendation and store aliquots (50 µL) at -20 °C.
Rotating shaker mix XL Clear line 062646CL Used for crypt isolation.
Stripette Serological Pipets 10 mL Corning 4488
Tissue Culture Dish TPP 93100
Triton X100 Sigma 8787 Store at room temperature.
Trypan Blue stain 0.4% Thermo Fisher Scientific T10282 Store at room temperature.
Vacuum system Vacusip Integra 159000 Used to remove the medium of organoid wells.

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जीव विज्ञान अंक 192
क्रायोप्रिजर्व्ड एपिथेलियल क्रिप्ट्स से पिगलेट इंटेस्टाइनल 3 डी ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति और सेल मोनोलेयर की स्थापना
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Mussard, E., Lencina, C., Boudry,… More

Mussard, E., Lencina, C., Boudry, G., Achard, C. S., Klotz, C., Combes, S., Beaumont, M. Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers. J. Vis. Exp. (192), e64917, doi:10.3791/64917 (2023).

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