Summary
نصف هنا طريقة قائمة على التألق المناعي لتحديد مستويات الحمض النووي أحادي الشريط في الخلايا. يمكن استخدام هذه الطريقة الفعالة والقابلة للتكرار لفحص إجهاد النسخ المتماثل ، وهي سمة شائعة في العديد من سرطانات المبيض. بالإضافة إلى ذلك ، يتوافق هذا الفحص مع خط أنابيب التحليل الآلي ، مما يزيد من كفاءته.
Abstract
إجهاد النسخ المتماثل هو السمة المميزة للعديد من سرطانات المبيض. يمكن أن ينشأ إجهاد النسخ المتماثل من مصادر متعددة ، بما في ذلك فواصل الشريط المزدوج ، أو تعارضات النسخ والتكرار ، أو تضخم الجينات المسرطنة ، مما يؤدي حتما إلى توليد الحمض النووي أحادي الشريط (ssDNA). وبالتالي ، فإن القياس الكمي ل ssDNA يمثل فرصة لتقييم مستوى إجهاد النسخ المتماثل في أنواع الخلايا المختلفة وتحت ظروف أو علاجات مختلفة مدمرة للحمض النووي. تشير الأدلة الناشئة أيضا إلى أن ssDNA يمكن أن يكون مؤشرا على الاستجابات لأدوية العلاج الكيميائي التي تستهدف إصلاح الحمض النووي. هنا ، نصف منهجية مفصلة قائمة على التألق المناعي لتحديد ssDNA. تتضمن هذه المنهجية تسمية الجينوم بنظير ثيميدين ، يليه الكشف القائم على الأجسام المضادة للتناظرية في الكروماتين في ظل ظروف عدم تغيير طبيعة الجينوم. يمكن تصور امتدادات ssDNA كبؤر تحت مجهر مضان. يرتبط عدد وشدة البؤر ارتباطا مباشرا بمستوى ssDNA الموجود في النواة. نصف أيضا خط أنابيب آلي لتحديد إشارة ssDNA. الطريقة سريعة وقابلة للتكرار. علاوة على ذلك ، فإن بساطة هذه المنهجية تجعلها قابلة للتطبيقات عالية الإنتاجية مثل الأدوية والشاشات الجينية.
Introduction
كثيرا ما يتعرض الحمض النووي الجينومي لاعتداءات متعددة من مصادر داخلية وخارجيةمختلفة 1. يرتبط تواتر الضرر الداخلي ارتباطا مباشرا بمستويات المنتجات الثانوية الأيضية ، مثل أنواع الأكسجين التفاعلية أو الألدهيدات ، والتي تكون أعلى جوهريا في أنواع متعددة من السرطان ، بما في ذلك سرطانات المبيض 2,3. من الضروري حل تلف الحمض النووي بكفاءة. خلاف ذلك ، يمكن أن تعزز الآفات السمية الجينية ، وبالتالي ، الطفرات. تعتمد قدرة الخلايا على إصلاح الآفات السامة للجينات على وظائف مسارات إصلاح الحمض النووي الخالية من الأخطاء والتنظيم الفعال لتطور دورة الخلية استجابة لتلف الحمض النووي. والجدير بالذكر أن العديد من سرطانات المبيض تحمل طفرات معطلة وظيفيا في p53 ، وبالتالي ، لديها نقطة تفتيش G1 / S معيبة ، مما يؤدي بالخلايا إلى بدء تكرار الحمض النووي على الرغم من وجود آفات جينومية لم يتم إصلاحها 4,5. تتفاقم درجة تلف الحمض النووي في سرطانات المبيض من خلال ملاحظة أن أكثر من 50٪ من سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة (HGSOC) لديها عيوب في إعادة التركيب المتماثل بوساطة BRCA1 و BRCA2 ، ومسار إصلاح الحمض النووي الخالي من الأخطاء ، وحوالي 20٪ لديهم تضخيم في الجين CCNE1 ، الذي يدفع خلايا G1 قبل الأوان إلى المرحلةS 6 . إن التكرار العالي لتلف الحمض النووي الداخلي ، ونقاط التفتيش المعيبة ، ومسارات الإصلاح المعطلة تعزز بشكل كبير تراكم الآفات الجينومية في سرطانات المبيض. يمكن أن تكون هذه الآفات بمثابة عوائق أمام تقدم العمليات الخلوية الحرجة مثل تكرار الحمض النووي والنسخ. كما نوقش أدناه ، تحفز هذه العوائق توليد الحمض النووي أحادي الشريط (ssDNA) في الخلايا.
يعد اللولب المزدوج للحمض النووي أمرا بالغ الأهمية لحماية الجينوم من عمليات الطفرات المتعددة ، مثل التطهير التلقائي وإزالة الحرارة ، ونشاط deaminases السيتوزين ، وتلف الحمض النووي التأكسدي 1,7. في المقابل ، فإن ssDNA معرض بشدة لهذه الأحداث الطفرة. يمكن أن تؤدي العمليات المتعددة في الخلايا إلى توليد ssDNA (الشكل 1). وتشمل هذه ما يلي:
(ط) توقف آلية تكرار الحمض النووي: يؤدي هذا إلى فصل لولب الحمض النووي والبلمرة ، تاركا امتدادات من ssDNA 8,9.
(ii) توقف آلية النسخ: يؤدي التوقف المستمر لبوليميراز الحمض النووي الريبي إلى توليد هياكل هجينة ثلاثية الخيوط من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي تسمى حلقات R. يكشف تكوين الحلقة R الحمض النووي النازح وغير المنسوخ كشريط واحد10.
(iii) استئصال نهاية الحمض النووي: يتطلب بدء الإصلاح الموجه بالتماثل توليد ssDNA 3 'لتحفيز البحث عن تسلسل متماثل11.
(iv) حلقة D: يمكن أن يؤدي غزو الشريط أثناء إعادة التركيب المتماثل إلى إزاحة الشريط المكمل غير القالب ، مما يؤدي إلى ssDNA12.
(v) الفجوات المقترنة بالتكرار: أثناء تكرار الحمض النووي ، يحدث تخليق الشريط المتأخر بطريقة متقطعة ، حيث يتم إنشاء شظايا أوكازاكي أولا ثم ربطها. يمكن أن يؤدي التأخير أو العيب في معالجة شظايا أوكازاكي أيضا إلى تكوين ssDNA. أخيرا ، إذا واجهت شوكة النسخ المتماثل على حبلا رائدا آفة توقف ، بوليميراز الحمض النووي ، والبريماز ، يمكن ل PRIMPOL إعادة تنظيم التوليف في اتجاه مجرى النهر ، تاركا فجوة ssDNA خلف13,14.
من الواضح أن معظم هذه الأحداث تحدث إما عندما تواجه آلية تكرار الحمض النووي آفات جينومية أو أثناء الإصلاح المقترن بالتكرار ، مما يشير إلى أن تلف الحمض النووي العالي يؤدي إلى زيادة مستويات ssDNA. نظرا لأن العديد من هذه الأحداث مرتبطة بالنسخ المتماثل ، فإن تكوين ssDNA يعتبر علامة "إجهاد النسخ المتماثل" في الخلايا15,16.
هنا ، نصف مقايسة يمكن استخدامها لتحديد كمية ssDNA في الخلايا بشكل موثوق. إن بساطة هذا النهج وقابليته للتكرار وفوائد التكلفة تجعله قابلا للاستخدام لتقييم استجابة إجهاد النسخ المتماثل في الخلايا. كشفت الدراسات الناشئة أن مستوى ssDNA يمكن أن يكون أيضا مؤشرا على الاستجابات للعلاج الكيميائي ، مثل مثبطات إنزيمات PARP1 / 2 ، ATR ، و Wee1 kinase17،18،19،20،21. يتم متابعة هذه المثبطات في نظام العلاج للعديد من HGSOCs22. لذلك ، يمكن أن يكون هذا الفحص أيضا أداة مفيدة للتنبؤ بالاستجابات العلاجية الكيميائية في خلايا سرطان المبيض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم استخدام خط خلايا سرطان المبيض ، OVCAR3 ، في هذه الخطوات ، ولكن هذا البروتوكول ينطبق على نطاق واسع على خطوط خلايا أخرى متعددة ، بما في ذلك تلك المشتقة من مصادر غير مبيضية. يظهر رسم تخطيطي للبروتوكول في الشكل 2.
1. تصفيح الخلايا
- اصنع أغطية مغلفة بولي-L-lysine.
- أضف أغطية معقمة بقطر 12 مم إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل بمحلول بولي-إل-ليسين ، وضعها على كرسي متأرجح لمدة 15 دقيقة.
- نضح الحل في غطاء زراعة الأنسجة. اغسل أغطية الغطاء بإضافة الماء المعقم ، وضع الأنبوب الذي يحتوي على أغطية الأغطية مرة أخرى على الروك لمدة 5 دقائق. كرر خطوة الغسيل هذه ثلاث مرات.
- انشر أغطية الغطاء المطلية على طبق معقم ، ونضح أي ماء متبقي. اترك أغطية الغطاء تجف في غطاء زراعة الأنسجة لمدة 1 ساعة أو حتى لا تبقى قطرات الماء. بمجرد أن يجف ، أغلق الطبق بالبارافيلم وضعه على حرارة 4 درجات مئوية.
- ضع غطاء واحد مطلي بالبولي L-lysine في كل بئر من صفيحة 24 بئرا. يعد استخدام أغطية البولي ليسين أمرا بالغ الأهمية لمنع انفصال الخلايا عن أغطية الغطاء أثناء خطوة ما قبل الاستخراج.
- التربسين خلايا OVCAR3 بمجرد وصولها إلى التقاء 70٪ -80٪.
- لتثريبسين طبق استزراع 10 سم متلاقى بنسبة 70٪ -80٪ ، قم بشفط الوسط من الطبق ، واغسله ب 5-7 مل من برنامج تلفزيوني.
- نضح PBS ، أضف 1 مل من 0.25٪ تربسين ، وضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 8-10 دقائق ، أو حتى تنطلق الخلايا من قاع الطبق.
- جمع الخلايا مع 5-10 مل من المتوسطة ، وإضافة إلى أنبوب مخروطي.
- عد الخلايا يدويا باستخدام مقياس الدم باستخدام الإجراءات القياسية.
- قم بتخفيف 25000 خلية / مل ، وأضف 1 مل من الخلايا على أغطية poly-L-lysine الموضوعة في آبار ألواح 24 بئرا. بالنسبة لأي خط خلية آخر ، حدد رقما بحيث تكون الخلايا متقاربة بنسبة 70٪ -80٪ بعد مضاعفة ثلاث مجموعات.
- تنمو الخلايا في وسط الثقافة في ظل الظروف القياسية.
2. الخلايا النابضة مع IdU
- لكي تنتشر الخلايا بشكل صحيح على أغطية الغطاء ، يكفي مضاعفة عدد السكان. بعد مضاعفة مجموعة واحدة ، نبض الخلايا ب 10 ميكرومتر 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) (انظر جدول المواد حول كيفية إعادة تكوين IdU) لمضاعفة السكان اللاحقة.
ملاحظة: لقد جربنا نظائر ثيميدين مختلفة ، بما في ذلك برومودوكيوريدين (BrdU) ، 5-كلورو-2′-ديوكيوريدين (CIdU) ، و IdU. من بين النظائر الثلاثة ، يعطي IdU أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء. يوضح الشكل 3 صورا مقارنة للخلايا النابضة بنظائرها الثلاثة المختلفة. نوصي باستخدام اثنين من عناصر التحكم السلبية: (i) عينة نابضة بدون IdU ، و (ii) عدم وجود تحكم أولي في الأجسام المضادة. إذا كان تشكيل ssDNA يحتاج إلى تقييم بسبب علاج معين ، فإننا نوصي بإضافة الدواء بعد الجولة الأولى من مضاعفة IdU. - بعد النبض مع IdU لمضاعفة عدد السكان ، احصد الخلايا للتصوير.
- استبدل الوسط بالثلج البارد 0.5٪ PBSTx (PBS + 0.5٪ Triton X-100) على الثلج لمدة 5 دقائق. تساعد خطوة ما قبل الاستخراج هذه على إطلاق البروتينات السيتوبلازمية وغير المرتبطة بالكروماتين ، مما يترك البروتينات المرتبطة بالكروماتين سليمة. يمكن أن تتقشر خطوط خلايا معينة بسهولة أثناء الاستخراج المسبق. في مثل هذا السيناريو ، يمكن للمرء استخدام محلول CSK بنسبة 0.5٪ (أنابيب 10 مللي مول (درجة الحموضة 6.8) ، 100 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 300 مللي مول سكروز ، 3 مللي مول MgCl2 ، 1 mM EGTA و 0.5٪ Triton X-100).
3. التثبيت
- نضح PBSTx ، واحتضان لمدة 15 دقيقة مع 3٪ PFA (جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة ، تليها ثلاث إلى أربع غسلات مع 1x PBS. يمكن الاحتفاظ بالخلايا الثابتة عند 4 درجات مئوية حتى خطوات أخرى.
تنبيه: PFA شديد السمية ومسرطن. تجنب ملامسة الجلد والعينين والأغشية المخاطية. نفذ جميع الخطوات باستخدام PFA في غطاء الدخان ، وتخلص من المواد بشكل صحيح.
4. النفاذية والحجب
- بعد التثبيت ، تخلل الخلايا باستخدام 0.5٪ PBSTx على الجليد لمدة 5 دقائق. استخدم حجما كافيا لتغطية غطاء الغطاء بالكامل (عادة بين 500 ميكرولتر و 1 مل).
- اغسل الخلايا ثلاث إلى أربع مرات باستخدام 0.2٪ PBST (1X PBS + 0.2٪ Tween-20) في درجة حرارة الغرفة. واحد مل من PBST يكفي لغسل كل بئر. أداء يغسل الظهر إلى الخلف دون أي حضانات.
- قم بنضح PBST ، وقم بحظر العينات باستخدام 5٪ BSA (جدول المواد) المصنوع في 1x PBS (حاجز الحظر) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
5. تلطيخ المناعة مع الجسم المضاد IdU
- للتلطيخ المناعي ، قم بإعداد غرفة مرطبة (منشفة ورقية مبللة على Tupperware مسطحة القاع). قم بتغطية غطاء اللوحة المكونة من 24 بئرا بالأغشية ، وضعها في الغرفة المرطب ، وضع أغطية الغطاء على غطاء اللوحة.
- قم بإعداد الجسم المضاد للفأر الأساسي المضاد ل BrdU (جدول المواد) عن طريق تخفيفه 1: 200 في المخزن المؤقت للحظر من الخطوة 4.2 ، وقد ثبت سابقا أن الجسم المضاد ل BrdU يكتشف IdU.
- أضف 60 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة IdU أعلى أغطية الغطاء. احتضان أغطية لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- بدلا من ذلك ، استخدم محلول أقل للأجسام المضادة إذا تم قلب أغطية الغطاء على قطرة (20-25 ميكرولتر) من مخفف الأجسام المضادة 1: 200 ماصة على parafilm. هذا يقلل أيضا من احتمال جفاف المحلول أثناء الحضانة.
- بعد الحضانة 1 ساعة ، نضح الجسم المضاد الأساسي. أعد أغطية الغطاء إلى طبق مكون من 24 بئرا ، واغسلها أربع مرات بنسبة 0.2٪ PBST.
- بالنسبة للجسم المضاد الثانوي ، استخدم نفس الغرفة المرطبة الموضحة في الخطوة 5.1. تمييع الجسم المضاد الثانوي المترافق المضاد للفأر (جدول المواد) في المخزن المؤقت للحجب (1: 200). أضف 60 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية إلى أغطية الغطاء ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 1 ساعة ، وهذا الجسم المضاد الثانوي حساس للضوء.
- نضح الجسم المضاد الثانوي. أعد أغطية الغطاء مرة أخرى إلى اللوحة المكونة من 24 بئرا ، واغسلها أربع مرات بنسبة 0.2٪ PBST.
- قم بتسمية شرائح المجهر ، وقم بتركيب أغطية الغطاء على الشرائح باستخدام وسيط تركيب DAPI (جدول المواد). تخزين الشرائح في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. يوصى بالحضانة لمدة 24 ساعة إذا كان وسط التركيب بحاجة إلى المعالجة أو التصلب.
ملاحظة: يمكن بعد ذلك تخزين الشرائح في درجة حرارة 4 درجات مئوية قبل تصويرها على مجهر مضان. يوضح الشكل 4 صورة تمثيلية.
6. القياس الكمي الآلي لبؤر IdU
ملاحظة: تكمن قوة هذا الفحص في القدرة على أتمتة التحليل من أجل القياس الكمي السريع والفعال. نقدم هنا خط أنابيب تحليل آلي يمكن استخدامه لتحديد بؤر IdU في حقل صورة معين. من المهم أن يتم التقاط جميع الصور في تجربة معينة بنفس إعدادات التعرض ؛ خلاف ذلك ، فإن القياس الكمي لن يكون موثوقا به. قد يكون من المفيد أيضا تضمين عنصر تحكم غير ملطخ كعنصر تحكم سلبي ، على الأقل لأول مرة يتم تشغيل هذه التجربة (الشكل 5). البروتوكول أدناه خاص ببرنامج التحليل العام NIS ، ولكن يمكن تطبيق نفس المبادئ مع البرامج التجارية الأخرى أيضا.
- في علامة التبويب عرض ، انتقل إلى عناصر التحكم في التحليل | مستكشف التحليل. يؤدي هذا إلى فتح نافذة جانبية جديدة تسمى Analysis Explorer. انقر فوق إنشاء جديد | التحليل العام 3. يؤدي هذا إلى فتح برنامج إنشاء المخطط الانسيابي لمستكشف التحليل.
- انتقل إلى علامة التبويب المصادر ، واسحب أمر القنوات من القائمة اليسرى إلى منطقة العمل. ستظهر قناتا بؤر DAPI و IdU تلقائيا كمربعات ثنائية (كما هو موضح في الشكل 5 كمربعات ذات مخططات حمراء).
- انتقل إلى علامة التبويب المعالجة المسبقة ، واسحب أمر التباين المحلي من القائمة اليسرى إلى منطقة العمل. قم بتوصيل التباين المحلي بقناة بؤر IdU. من علامة تبويب التجزئة ، اسحب أمر العتبة (واحد لكل قناة).
- قم بتوصيل كل قناة بأمر عتبة . لإزالة أي نوى عند حدود الصورة، انتقل إلى علامة تبويب المعالجة الثنائية ، واسحب أمر لمس الحدود ، واتصل بعتبة DAPI.
- دمج البيانات من القناتين باستخدام الأمر تجميع العناصر التابعة في علامة التبويب القياس . حدد قناة DAPI على أنها الأصل (A) وقناة البؤر على أنها تابعة (B). في القائمة المنسدلة في الأمر تجميع الأطفال ، حدد الخيار الطفل داخل الأصل. تساعد هذه الخطوة في حساب عدد البؤر (الطفل) لكل نواة (الوالد).
- لتصدير البيانات بتنسيق جدولي ، انقر فوق الأمر تعديل الأعمدة في علامة التبويب إدارة البيانات . في القائمة المنسدلة من أمر تعديل الأعمدة ، حدد DAPI-ID (يساعد هذا في تعيين رقم فريد لكل نواة داخل صورة معينة) وعدد IdU (يوفر هذا عدد بؤر IdU في كل نواة). لتصدير البيانات بتنسيق CSV، استخدم الأمر جدول إلى CSV في علامة التبويب مرجع . يمكن الآن حفظ GA3 بعنوان وصفي.
- للتحليل ، افتح صورة في البرنامج.
- افتح علامة التبويب مستكشف التحليل كما تم في الخطوة 6.1 ، وحدد موقع GA3 الذي تم إنشاؤه حديثا. انقر نقرا مزدوجا فوق ملف GA3 ، الذي يفتح نافذة جديدة تسمى GA3 Wizard حيث يمكن للمرء تعيين عتبة قنوات DAPI و IdU.
- استخدم شريط التمرير في النافذة لتعيين الحد الأدنى والحد الأقصى لكل قناة ، وبالتالي تحديد الإشارة. قيمة العتبة الجيدة هي المكان الذي يتم فيه تحديد حدود كل نواة وتركيز IdU بوضوح. بمجرد الرضا عن قيم العتبة، احتفظ بهذه الأرقام لتحليل جميع الملفات في تجربة معينة.
- انقر فوق الزر "تشغيل" للحصول على عدد بؤر IdU / لكل نواة.
ملاحظة: يقوم البرنامج بإنشاء جدول للبؤر لكل نواة ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لأي أغراض بيانية (الشكل 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 4 الصور التمثيلية والقياس الكمي لبؤر IdU من النوى المشتقة من الخلايا غير المعالجة والخلايا المعالجة ب 0.5 mM هيدروكسي يوريا لمدة 24 ساعة. كلتا النواتين ملطختان ويمكن التعرف عليهما في قناة DAPI. يتكون تحليل هذه الصور من تحديد عدد البؤر في كل نواة. عدد البؤر يتناسب مع درجة إجهاد النسخ المتماثل.
الشكل 1: آليات توليد ssDNA. تخطيطي لإظهار الآليات المختلفة التي يمكن من خلالها إنشاء ssDNA في الخلية. وهذا يشمل (أ) توقف آلية النسخ المتماثل ، (ب) توقف آلية النسخ ، مما يؤدي إلى حلقات R ، (ج) استئصال نهاية الحمض النووي ، (د) تكوين حلقات D ، أو (ه) فجوات مقترنة بالتكرار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رسم تخطيطي لوضع العلامات على IdU. يتم نبض الخلايا باستخدام IdU لمضاعفة عدد السكان. إذا كانت هناك حاجة إلى أي علاج دوائي ، فيجب إعطاؤه بعد تضاعف عدد السكان الأول في وجود IdU. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة إشارة البؤر التي تم الحصول عليها بعد النبض مع IdU أو BrdU أو CldU. صور تمثيلية للخلايا النابضة بثلاثة نظائر مختلفة من الثيميدين . يتم عرض DAPI و GFP (التي تمثل بؤر IdU المسماة Alexa-488) والقنوات المدمجة. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: زيادة بؤر IdU في خلايا OVCAR3 الناتجة عن إجهاد النسخ المتماثل . (أ) صور النوى التمثيلية الملطخة ب IdU و DAPI و (ب) القياس الكمي للخلايا المعالجة ب 0.5 mM هيدروكسي يوريا لمدة 24 ساعة. **** p < 0.0001 (اختبار مان ويتني). شريط المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: التحليل الآلي التمثيلي لخط أنابيب GA3. يمكن إنجاز التحليل الآلي GA3 عن طريق إنشاء خط أنابيب لعتبة النوى بناء على DAPI (كما هو موضح باللون البرتقالي) وبؤر IdU (كما هو موضح باللون الأصفر). يؤدي تجميع هاتين العتبتين إلى ملء عدد بؤر IdU لكل نواة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كما ذكر في البروتوكول ، من المفيد تضمين بعض الضوابط التجريبية لضمان عمل الفحص. وتشمل هذه العينة التي لا تعالج ب IdU بالإضافة إلى عينة معالجة بالأجسام المضادة الأولية. يجب أن ينتج عن كلا العنصرين السلبيين خلايا ملطخة بواسطة DAPI ولكنها لا تحتوي على إشارة IdU.
بناء على الظروف التجريبية وخطوط الخلايا المستخدمة ، قد تكون هناك حاجة إلى تخفيفات مختلفة للأجسام المضادة للحصول على أفضل إشارة فلورية. قد يؤدي الكثير من الإشارة إلى عدم القدرة على تحديد البؤر الفردية ، في حين أن الإشارة القليلة جدا قد تعني أنه لا يمكن تحديد الاختلافات التجريبية بين العينات. قد يساعد ضبط أوقات ما قبل الاستخراج والنفاذية أيضا إذا كان هناك الكثير من إشارات الخلفية ، والتي قد تنشأ من محتويات النيوكليوبلازم غير المستخرجة.
نظرا لأن هذا البروتوكول يتطلب دمج IdU على مضاعفة عدد السكان ، فمن المهم حساب وقت مضاعفة كل خط خلوي. عند مقارنة خطين خلويين لهما أوقات مضاعفة مختلفة ، من الضروري ضبط طول نبض IdU لوقت مضاعفة كل خط خلية. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي هذا إلى مستوى معين من الاختلاف. وبالتالي ، فإن تطبيق هذا الفحص يكون أكثر فاعلية عند مقارنة خطوط الخلايا بأوقات مضاعفة مماثلة. إذا كانت أوقات المضاعفة غير معروفة ، فقد يتطلب ذلك تحسينا تجريبيا مسبقا.
بالإضافة إلى ذلك ، قد يقلل هذا الفحص من كمية ssDNA الموجودة في الخلية في أي وقت. لا يمكن التعرف على ssDNA إلا على أنه بؤر عندما يتم تمييز الشريط المقابل ب IdU. وبالتالي ، إذا لم يتم تسمية الشريط المقابل ل ssDNA ، فلن يتم اكتشافه. على سبيل المثال ، إذا كان الحمض النووي الأبوي غير المسمى به آفات تؤدي إلى حدوث فجوات ، فلن يتم اكتشاف هذه الآفات (الشكل 2). للحصول على تحليل أكثر حساسية ، سيكون النهج البديل هو فحص الخلايا بحثا عن بروتين النسخ المتماثل A (RPA). RPA هو بروتين ملزم للحمض النووي يغطي ssDNA بشكل تفضيلي لمنعه من تكوين هياكل ثانوية والحماية من نشاط النيوكلياز23,24. أثناء التلف المقترن بالنسخ المتماثل ، يتم فسفرة RPA عند سيرين 33 ، وبالتالي ، يمكن استخدام pRPA S33 كعلامة لإجهاد النسخ المتماثل. في ظل ظروف التلف المفرط ، يتم فسفرة pRPA S33 بشكل أكبر على S4 / S8 بواسطة DNA-PK25. ومن ثم ، من خلال فحص أشكال مختلفة من RPA المرتبطة بالكروماتين ، يمكن للمرء تقييم استجابات إجهاد النسخ المتماثل المختلفة في الخلايا. يمكن إجراء هذين النهجين المتكاملين (بؤر IdU وتلطيخ RPA) بالتوازي للتحقق من صحة مستويات ssDNA باستخدام منهجيات متميزة.
يوفر هذا الفحص طريقة سهلة المتابعة وقابلة للتكرار وفعالة لتحديد ssDNA في نوع معين من الخلايا. يمكن تعديله للسماح بتطبيق علاجات دوائية مختلفة وأنواع مختلفة من الخلايا وأدوات تحليل متعددة. إنه قابل للعديد من طرق القياس الكمي الآلي, بما في ذلك برنامج تحليل NIS. على عكس التقنيات الأخرى لتحديد ssDNA ، مثل الفحص القائم على المذنب ، فإن مقايسة بؤر IdU أكثر جدوى للتطبيقات عالية الإنتاجية.
يمكن استخدام هذا الفحص للعديد من التطبيقات. يمكن استخدام زيادة وجود ssDNA كعلامة على إجهاد النسخ المتماثل وللتنبؤ باستجابات العلاج الكيميائي في سرطانات المبيض المختلفة. علاوة على ذلك ، فإن تضخيم الجينات المسرطنة المعروفة بتعطيل النسخ المتماثل أو تنظيم دورة الخلية يمكن أن يتسبب في تراكم الآفات التي تؤدي إلى زيادة ssDNA. وبالتالي ، يمكن استخدام هذا الفحص أيضا لفحص تأثير تضخيم الجينات المسرطنة على تراكم ssDNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
يتم دعم PV من خلال منحة Pedal the Cause الافتتاحية من قبل مركز Alvin J. Siteman للسرطان من خلال مؤسسة مستشفى بارنز اليهودي ، ومنحة الأبحاث التجريبية من مركز مارشا ريفكين لأبحاث سرطان المبيض ، ومنحة أبحاث السرطان من مؤسسة ماري كاي آش ومؤسسة V. يتم دعم NR من خلال منحة تدريب المعاهد الوطنية للصحة على الخلايا والبيولوجيا الجزيئية T32 لجامعة واشنطن ، سانت لويس.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | NC0179595 | 10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C |
| 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) | Sigma Aldrich | I7125-5G | MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C |
| Anti-BrdU antibody | BD Biosciences | 347580 | Storage: Store in 4 °C |
| Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody | Thermo Scientific | A32766 | Light sensitive - keep in dark Storage: Store in 4 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G | Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C |
| Circular Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| NIS GA3 Software | Nikon | 77010604 | |
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma Aldrich | P4832-50ML | Storage: Store in 4 °C |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Thermo Scientific | P36962 | Storage: Store in 4 °C |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Genesee Scientific | 25-510 | Storage: Store in 4 °C |
| Water, sterile-filtered | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | Storage: Store in 4 °C |
References
- Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
- Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D'Andrea, A. D. Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamental vulnerability of ovarian cancer. Cancer Discovery. 5 (11), 1137-1154 (2015).
- Gee, M. E., Faraahi, Z., McCormick, A., Edmondson, R. J. DNA damage repair in ovarian cancer: Unlocking the heterogeneity. Journal of Ovarian Research. 11, 50 (2018).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nature communications. 8, 1093 (2017).
- Kroeger, P. T., Drapkin, R. Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).
- Patch, A. -M., et al. Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer. Nature. 521 (7553), 489-494 (2015).
- Alexandrov, L. B., et al. The repertoire of mutational signatures in human cancer. Nature. 578 (7793), 94-101 (2020).
- Byun, T. S., Pacek, M., Yee, M. -C., Walter, J. C., Cimprich, K. A. Functional uncoupling of MCM helicase and DNA polymerase activities activates the ATR-dependent checkpoint. Genes & Development. 19 (9), 1040-1052 (2005).
- Toledo, L. I., et al. ATR prohibits replication catastrophe by preventing global exhaustion of RPA. Cell. 155 (5), 1088-1103 (2013).
- Brickner, J. R., Garzon, J. L., Cimprich, K. A. Walking a tightrope: The complex balancing act of R-loops in genome stability. Molecular Cell. 82 (12), 2267-2297 (2022).
- Cejka, P., Symington, L. S. DNA end resection: Mechanism and control. Annual Review of Genetics. 55, 285-307 (2021).
- Kowalczykowski, S. C. An overview of the molecular mechanisms of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (11), 016410 (2015).
- Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A.
- Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: An essential regulator of genome integrity. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (8), 616-627 (2008).
- Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Xu, H., et al. CCNE1 copy number is a biomarker for response to combination WEE1-ATR inhibition in ovarian and endometrial cancer models. Cell Reports. Medicine. 2 (9), 100394 (2021).
- Konstantinopoulos, P. A., et al. A Replication stress biomarker is associated with response to gemcitabine versus combined gemcitabine and ATR inhibitor therapy in ovarian cancer. Nature Communications. 12, 5574 (2021).
- Buisson, R., Boisvert, J. L., Benes, C. H., Zou, L. Distinct but concerted roles of ATR, DNA-PK, and Chk1 in countering replication stress during S phase. Molecular Cell. 59 (6), 1011-1024 (2015).
- Belan, O., et al. POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells. Molecular Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).
- da Costa, A. A. B. A., et al. Targeting replication stress in cancer therapy. Nature Reviews. Drug Discovery. 22 (1), 38-58 (2023).
- Chen, R., Wold, M. S. Replication protein A: Single-stranded DNA's first responder: Dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair. BioEssays. 36 (12), 1156-1161 (2014).
- Bhat, K. P., Cortez, D. RPA and RAD51: Fork reversal, fork protection, and genome stability. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (6), 446-453 (2018).
- Maréchal, A., Zou, L. RPA-coated single-stranded DNA as a platform for post-translational modifications in the DNA damage response. Cell Research. 25 (1), 9-23 (2015).
