Summary
Здесь мы описываем основанный на иммунофлуоресценции метод количественной оценки уровней одноцепочечной ДНК в клетках. Этот эффективный и воспроизводимый метод может быть использован для изучения стресса репликации, который является общей чертой при некоторых видах рака яичников. Кроме того, этот анализ совместим с автоматизированным конвейером анализа, что еще больше повышает его эффективность.
Abstract
Репликационный стресс является отличительной чертой нескольких видов рака яичников. Репликационный стресс может возникать из нескольких источников, включая двухцепочечные разрывы, конфликты транскрипции-репликации или амплифицированные онкогены, что неизбежно приводит к генерации одноцепочечной ДНК (ссДНК). Таким образом, количественная оценка ssDNA дает возможность оценить уровень репликационного стресса в различных типах клеток и при различных условиях или методах лечения, повреждающих ДНК. Новые данные также свидетельствуют о том, что ssDNA может быть предиктором ответов на химиотерапевтические препараты, которые нацелены на репарацию ДНК. Здесь мы подробно описываем основанную на иммунофлуоресценции методологию количественного определения ssDNA. Эта методология включает маркировку генома аналогом тимидина с последующим обнаружением аналога хроматина на основе антител в условиях без денатурации. Участки ssDNA можно визуализировать в виде очагов под флуоресцентным микроскопом. Количество и интенсивность очагов напрямую коррелируют с уровнем ссДНК, присутствующей в ядре. Мы также описываем автоматизированный конвейер для количественной оценки сигнала ssDNA. Метод быстрый и воспроизводимый. Кроме того, простота этой методологии делает ее пригодной для высокопроизводительных приложений, таких как скрининг лекарств и генетический скрининг.
Introduction
Геномная ДНК часто подвергается множественным атакам из различных эндогенных и экзогенных источников1. Частота эндогенных повреждений напрямую коррелирует с уровнями побочных продуктов метаболизма, таких как активные формы кислорода или альдегиды, которые по своей природе выше при нескольких типах рака, включая рак яичников 2,3. Крайне важно, чтобы повреждение ДНК было эффективно устранено; в противном случае он может способствовать генотоксическим поражениям и, следовательно, мутагенезу. Способность клеток восстанавливать генотоксические поражения зависит от функциональности безошибочных путей репарации ДНК и эффективной регуляции прогрессирования клеточного цикла в ответ на повреждение ДНК. Примечательно, что многие виды рака яичников имеют функционально инактивирующие мутации в р53 и, таким образом, имеют дефектную контрольную точку G1 / S, что приводит к тому, что клетки инициируют репликацию ДНК, несмотря на наличие невосстановленных геномных поражений 4,5. Степень повреждения ДНК при раке яичников еще больше усугубляется наблюдением, что более 50% серозной карциномы яичников высокой степени злокачественности (HGSOC) имеют дефекты в гомологичной рекомбинации, опосредованной BRCA1 и BRCA2, безошибочном пути репарации ДНК, и около 20% имеют амплификацию в гене CCNE1, который преждевременно выталкивает клетки G1 в S-фазу6 . Вместе высокая частота эндогенных повреждений ДНК, дефектные контрольные точки и неисправные пути восстановления экспоненциально усиливают накопление геномных поражений при раке яичников. Эти поражения могут служить препятствием для прогрессирования критических клеточных процессов, таких как репликация ДНК и транскрипция. Как обсуждается ниже, такие препятствия катализируют генерацию одноцепочечной ДНК (ssDNA) в клетках.
Двойная спираль ДНК имеет решающее значение для защиты генома от множественных мутагенных процессов, таких как спонтанная депуринация и депиримидинация, активность цитозиндезаминаз и окислительное повреждение ДНК 1,7. Напротив, ssDNA очень уязвима к этим мутационным событиям. Множественные процессы в клетках могут привести к генерации ssDNA (рис. 1). К ним относятся следующие:
(i) Остановка механизма репликации ДНК: это приводит к разъединению геликазы ДНК и полимеразы, оставляя участки ssDNA 8,9.
(ii) Остановка транскрипционного механизма: стойкая остановка РНК-полимеразы приводит к образованию трехцепочечных гибридных структур ДНК/РНК, называемых R-петлями. Образование R-петли обнажает смещенную, нетранскрибируемую ДНК в виде одной цепи10.
(iii) Резекция конца ДНК: Инициация репарации, направленной на гомологию, требует генерации 3'-ссДНК для катализа поиска гомологичной последовательности11.
(iv) D-петля: инвазия цепи во время гомологичной рекомбинации может привести к смещению нематричной комплементарной цепи, что приводит к ssDNA12.
(v) Разрывы, связанные с репликацией: Во время репликации ДНК синтез запаздывающей цепи происходит прерывистым образом, в результате чего фрагменты Окадзаки сначала генерируются, а затем лигируются. Задержка или дефект в обработке фрагментов Окадзаки также может привести к образованию ssDNA. Наконец, если репликационная вилка на ведущей цепи сталкивается с остановившимся повреждением, ДНК-полимеразой и праймазой, PRIMPOL может перепрограммировать синтез ниже по течению, оставляя разрыв ssDNA позади13,14.
Очевидно, что большинство из этих событий происходит либо тогда, когда механизм репликации ДНК сталкивается с геномными повреждениями, либо во время репарации, связанной с репликацией, что позволяет предположить, что более высокое повреждение ДНК приводит к повышению уровня ссДНК. Поскольку многие из этих событий связаны с репликацией, образование ssDNA считается маркером «репликационного стресса» в клетках15,16.
Здесь мы описываем анализ, который может быть использован для надежного количественного определения ssDNA в клетках. Простота, воспроизводимость и экономическая выгода этого подхода позволяют использовать его для оценки реакции репликации-стресса в клетках. Новые исследования показали, что уровень ssDNA также может быть предиктором ответов на химиотерапию, таких как ингибиторы ферментов PARP1/2, ATR и киназы Wee1 17,18,19,20,21. Эти ингибиторы используются в схеме лечения нескольких HGSOCs22. Таким образом, этот анализ также может быть полезным инструментом для прогнозирования химиотерапевтических реакций в клетках рака яичников.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная линия рака яичников OVCAR3 использовалась на этих этапах, но этот протокол широко применим к множеству других клеточных линий, в том числе полученных из источников, не связанных с яичниками. Схема протокола показана на рисунке 2.
1. Покрытие ячеек
- Сделайте покровные стекла с покрытием из поли-L-лизина.
- Добавьте автоклавные покровные стекла диаметром 12 мм в коническую пробирку объемом 50 мл с раствором поли-L-лизина и поместите на коромысло на 15 минут.
- Аспирируйте раствор в тканевый культуральный колпак. Промойте покровные стекла, добавив стерильную воду, и поместите пробирку с защитными стеклами обратно на коромысло на 5 минут. Повторите этот шаг стирки три раза.
- Выложите покрытые покровные стекла на стерильную посуду и аспирируйте оставшуюся воду. Дайте покровным стеклам высохнуть в колпаке для культивирования тканей в течение 1 часа или до тех пор, пока не останется капель воды. После высыхания закройте посуду парапленкой и поставьте при температуре 4 °C.
- Поместите по одному покрытому поли-L-лизином покровному предмету в каждую лунку 24-луночной пластины. Использование полилизиновых покровных листов имеет решающее значение для предотвращения отрыва клеток от покровных стекол на этапе предварительной экстракции.
- Трипсинизируйте клетки OVCAR3, как только они достигнут слияния 70-80%.
- Чтобы трипсинизировать 10-сантиметровую культуральную чашку, которая на 70-80% сливается, аспирируйте среду из тарелки и промойте 5-7 мл PBS.
- Аспирируйте PBS, добавьте 1 мл 0,25% трипсина и поместите чашку в инкубатор с температурой 37 ° C на 8-10 минут или до тех пор, пока клетки не оторвутся от дна тарелки.
- Соберите клетки с 5-10 мл среды и добавьте в коническую пробирку.
- Подсчитайте клетки вручную с помощью гемоцитометра, используя стандартные процедуры.
- Сделайте разведение 25 000 клеток / мл и добавьте 1 мл клеток на поли-L-лизиновые покровные стекла, помещенные в лунки 24-луночных планшетов. Для любой другой клеточной линии определите число таким образом, чтобы клетки сливались примерно на 70-80% после трех удвоений популяции.
- Выращивайте клетки в питательной среде в стандартных условиях.
2. Пульсирующие ячейки с IdU
- Для того, чтобы клетки правильно распределились по покровным стеклам, достаточно одного удвоения популяции. После удвоения одной популяции импульсируйте клетки 10 мкМ 5-йодо-2'-дезоксиуридином (IdU) (см. Таблицу материалов о том, как восстановить IdU) для двух последующих удвоений популяции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы пробовали различные аналоги тимидина, включая бромдезоксиуридин (BrdU), 5-хлор-2'-дезоксиуридин (CIdU) и IdU. Среди трех аналогов IdU дает лучшее соотношение сигнал/шум. Сравнительные изображения ячеек, пульсирующих с тремя различными аналогами, показаны на рисунке 3. Мы рекомендуем использовать два отрицательных контроля: (i) импульсный образец без IdU и (ii) без первичного контроля антител. Если необходимо оценить образование ssDNA в связи с данным лечением, мы рекомендуем добавлять препарат после первого раунда удвоения IdU. - После пульсации с IdU в течение двух удвоений популяции соберите клетки для визуализации.
- Замените среду ледяным 0,5% PBSTx (PBS + 0,5% Triton X-100) на льду в течение 5 мин. Эта стадия предварительной экстракции помогает высвобождать цитоплазматические и нехроматин-связанные белки, оставляя хроматин-связанные белки нетронутыми. Некоторые клеточные линии могут легко отслаиваться во время предварительной экстракции. В таком сценарии можно использовать 0,5% буфер CSK (10 мМ PIPES (pH 6,8), 100 мМ NaCl, 300 мМ сахарозы, 3 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA и 0,5% Triton X-100).
3. Фиксация
- Аспирируйте PBSTx и инкубируйте в течение 15 минут с 3% PFA (таблица материалов) при комнатной температуре, а затем три-четыре промывки 1x PBS. Фиксированные ячейки можно хранить при температуре 4 °C до дальнейших шагов.
ВНИМАНИЕ: PFA очень токсичен и канцерогенен. Избегайте контакта с кожей, глазами и слизистыми оболочками. Выполните все действия с PFA в вытяжном шкафу и правильно утилизируйте материалы.
4. Пермеабилизация и блокировка
- После фиксации пермеабилизируют клетки с помощью 0,5% PBSTx на льду в течение 5 мин. Используйте достаточный объем, чтобы покрыть все покровное стекло (обычно от 500 мкл до 1 мл).
- Промойте клетки три-четыре раза 0,2% PBST (1X PBS + 0,2% Tween-20) при комнатной температуре. Одного мл PBST достаточно для промывки каждой скважины. Выполняйте стирки спина к спине без каких-либо инкубинаций.
- Аспирируйте PBST и заблокируйте образцы, используя 5% BSA (таблица материалов), изготовленную в 1x PBS (блокирующий буфер) в течение 30 минут при комнатной температуре.
5. Иммуноокрашивание антителом IdU
- Для иммуноокрашивания подготовьте увлажненную камеру (влажное бумажное полотенце на посуде Tupperware с плоским дном). Накройте крышку 24-луночной пластины парапленкой, поместите в увлажненную камеру и положите покровные стекла на крышку тарелки.
- Подготовьте первичное антитело против BrdU мыши (таблица материалов), разбавив его в соотношении 1:200 в блокирующем буфере из шага 4.2.Ранее было показано, что антитело против BrdU обнаруживает IdU.
- Добавьте 60 мкл разведения антител IdU в верхнюю часть покровных стекол. Инкубировать покровные стекла в течение 1 ч при 37 °C.
- В качестве альтернативы используйте раствор с меньшим количеством антител, если покровные стекла переворачиваются на каплю (20-25 мкл) разведения антител 1:200, пипетку на парапленку. Это также снижает вероятность высыхания раствора во время инкубации.
- После 1 ч инкубации аспирируют первичное антитело. Верните покровные стекла обратно в 24-луночную пластину и промойте их четыре раза 0.2% PBST.
- Для вторичного антитела используйте ту же увлажненную камеру, описанную на шаге 5.1. Разбавьте конъюгированное вторичное антитело против мыши (таблица материалов) в блокирующем буфере (1:200). Добавьте 60 мкл вторичного антитела к покровным стеклам и инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение 1 ч. Это вторичное антитело чувствительно к свету.
- Аспирируйте вторичное антитело. Верните покровные стекла обратно на 24-луночную пластину и промойте четыре раза 0,2% PBST.
- Пометьте предметные стекла микроскопа и закрепите покровные стекла на предметных стеклах с помощью монтажного носителя DAPI (Таблица материалов). Хранить предметные стекла в темноте при комнатной температуре в течение 24 ч. 24-часовая инкубация рекомендуется, если монтажная среда нуждается в отверждении или затвердевании.
ПРИМЕЧАНИЕ: Затем предметные стекла можно хранить при температуре 4 °C перед отображением на флуоресцентном микроскопе. Репрезентативное изображение показано на рисунке 4.
6. Автоматизированная количественная оценка очагов IdU
ПРИМЕЧАНИЕ: Сила этого анализа заключается в способности автоматизировать анализ для быстрой и эффективной количественной оценки. Мы представляем здесь автоматизированный конвейер анализа, который можно использовать для количественной оценки очагов IdU в заданном поле изображения. Важно, чтобы все изображения в рамках данного эксперимента были сделаны с одинаковыми настройками экспозиции; В противном случае количественная оценка не будет надежной. Также может быть полезно включить неокрашенный контроль в качестве отрицательного контроля, по крайней мере, в первый раз, когда этот эксперимент проводится (рис. 5). Приведенный ниже протокол относится к NIS General Analysis Software, но те же принципы могут быть применены и к другому коммерческому программному обеспечению.
- На вкладке " Вид " перейдите в раздел " Элементы управления анализом" | Обозреватель анализа. Откроется новое боковое окно с именем Analysis Explorer. Нажмите « Создать» | Общий анализ 3. Откроется программа для создания блок-схем Analysis Explorer.
- Перейдите на вкладку « Источники » и перетащите команду «Каналы » из левого меню в рабочую область. Два канала для фокусов DAPI и IdU автоматически появятся в виде двоичных блоков (показанных на рисунке 5 в виде прямоугольников с красными контурами).
- Перейдите на вкладку « Предварительная обработка » и перетащите команду «Локальный контраст» из левого меню в рабочую область. Подключите локальный контраст к каналу фокусов IdU. На вкладке « Сегментация » перетащите команду «Порог » (по одной для каждого канала).
- Подключите каждый канал к команде Threshold . Чтобы удалить ядра на границе изображения, перейдите на вкладку « Двоичная обработка », перетащите команду «Касание границ» и подключитесь к пороговому значению DAPI.
- Объедините данные из двух каналов с помощью команды « Агрегировать дочерние элементы » на вкладке «Измерение ». Определите канал DAPI как родительский (A), а канал фокусов как дочерний (B). В раскрывающемся меню команды «Агрегатировать дочерние элементы » выберите параметр, который находится внутри родительского элемента. Этот шаг помогает подсчитать количество очагов (дочерних) на ядро (родитель).
- Чтобы экспортировать данные в табличный формат, нажмите на команду « Изменить столбцы » на вкладке « Управление данными ». В раскрывающемся меню команды «Изменить столбцы » выберите DAPI-ID (это помогает присвоить уникальный номер каждому ядру в данном изображении) и количество IdU (это обеспечивает количество фокусов IdU в каждом ядре). Чтобы экспортировать данные в формате CSV, используйте команду « Таблица в CSV » на вкладке «Ссылка ». GA3 теперь можно сохранить с описательным заголовком.
- Для анализа откройте изображение в программном обеспечении.
- Откройте вкладку Analysis Explorer , как это было сделано на шаге 6.1, и найдите только что созданный GA3. Дважды щелкните файл GA3, после чего откроется новое окно под названием GA3 Wizard , в котором можно установить порог для каналов DAPI и IdU.
- Используйте ползунок в окне, чтобы установить минимальный и максимальный порог для каждого канала и, следовательно, определить сигнал. Хорошее пороговое значение - это когда границы для каждого ядра и фокуса IdU четко определены. После того, как вы удовлетворитесь пороговыми значениями, сохраните эти числа для анализа всех файлов в данном эксперименте.
- Нажмите кнопку «Выполнить», чтобы получить количество очагов IdU на ядро.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение генерирует таблицу фокусов на ядро, которая впоследствии может быть использована для любых графических целей (рис. 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Репрезентативные изображения и количественная оценка очагов IdU из ядер, полученных из необработанных клеток и клеток, обработанных 0,5 мМ гидроксимочевиной в течение 24 часов, показаны на рисунке 4. Оба ядра окрашены и идентифицируются в канале DAPI. Анализ этих изображений заключается в количественной оценке количества очагов в каждом ядре. Количество очагов пропорционально степени репликационного стресса.
Рисунок 1: Механизмы генерации ssDNA. Схема, показывающая различные механизмы, с помощью которых ssDNA может быть сгенерирована в клетке. Это включает в себя (А) остановку репликационного механизма, (Б) остановку транскрипционного механизма, приводящую к R-петлям, (C) резекцию конца ДНК, (D) образование D-петель или (E) разрывы, связанные с репликацией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Схема маркировки IdU. Клетки пульсируют с IdU для двух удвоений популяции. Если требуется какое-либо медикаментозное лечение, его следует назначать после удвоения первой популяции в присутствии IdU. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Сравнение сигнала фокусов, полученного после пульсации, с IdU, BrdU или CldU. Репрезентативные изображения клеток, пульсирующих с тремя различными аналогами тимидина. Показаны DAPI, GFP (представляющие очаги IdU, помеченные Alexa-488) и объединенные каналы. Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Увеличение очагов IdU в клетках OVCAR3, вызванное репликационным стрессом . (A) репрезентативные изображения ядер, окрашенных IdU и DAPI, и (B) количественное определение клеток, обработанных 0,5 мМ гидроксимочевиной, в течение 24 ч. **** p < 0,0001 (тест Манна-Уитни). Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Репрезентативный конвейер автоматизированного анализа GA3. Автоматизированный анализ GA3 может быть выполнен путем создания конвейера для порогового значения ядер на основе фокусов DAPI (показаны оранжевым цветом) и IdU (показаны желтым цветом). Агрегирование этих двух пороговых значений заполняет количество очагов IdU на ядро. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как было упомянуто в протоколе, полезно включить несколько экспериментальных контролей, чтобы убедиться, что анализ работает. К ним относятся образец, не обработанный IdU, а также образец, обработанный первичными антителами. Оба отрицательных элемента управления должны давать клетки, окрашенные DAPI, но не содержащие сигнала IdU.
Основываясь на экспериментальных условиях и используемых клеточных линиях, для получения наилучшего флуоресцентного сигнала могут потребоваться различные разведения антител. Слишком большой сигнал может привести к невозможности количественной оценки отдельных очагов, тогда как слишком маленький сигнал может означать, что экспериментальные различия между образцами не могут быть идентифицированы. Корректировка времени предварительной экстракции и пермеабилизации также может помочь, если слишком много фонового сигнала, который может возникнуть из-за неэкстрагированного нуклеоплазматического содержимого.
Поскольку этот протокол требует включения IdU в течение двух удвоений популяции, важно учитывать время удвоения каждой клеточной линии. При сравнении двух клеточных линий с разным временем удвоения необходимо отрегулировать длину пульсации IdU в соответствии со временем удвоения каждой клеточной линии. Однако это может привести к некоторому уровню вариаций. Таким образом, применение этого анализа наиболее эффективно при сравнении клеточных линий с одинаковым временем удвоения. Если время удвоения неизвестно, это может потребовать предварительной экспериментальной оптимизации.
Кроме того, этот анализ может недооценивать количество ssДНК, присутствующей в клетке в любой момент времени. ssDNA может быть идентифицирована как очаги только тогда, когда противоположная цепь была помечена IdU. Таким образом, если цепь, противоположная ссДНК, не была помечена, она не будет обнаружена. Например, если родительская немеченая ДНК имеет повреждения, которые приводят к разрывам, эти поражения не будут обнаружены (рис. 2). Для более чувствительного анализа альтернативным подходом было бы исследование клеток на предмет репликации белка А (RPA). RPA представляет собой ДНК-связывающий белок, который преимущественно покрывает ssDNA, чтобы предотвратить образование вторичных структур и защитить от нуклеазной активности23,24. Во время повреждения, связанного с репликацией, RPA фосфорилируется серином 33, и, следовательно, pRPA S33 можно использовать в качестве маркера репликационного стресса. В условиях чрезмерного повреждения pRPA S33 далее фосфорилируется на S4/S8ДНК-PK 25. Следовательно, исследуя различные формы RPA, связанные с хроматином, можно оценить различные реакции репликационного стресса в клетках. Эти два взаимодополняющих подхода (очаги IdU и окрашивание RPA) могут выполняться параллельно для проверки уровней ssDNA с использованием различных методологий.
Этот анализ обеспечивает простой в использовании, высоковоспроизводимый и эффективный метод количественного определения ssDNA в данном типе клеток. Его можно отрегулировать, чтобы можно было применять различные лекарственные препараты, различные типы клеток и несколько инструментов анализа. Он поддается различным автоматизированным методам количественной оценки, включая программное обеспечение для анализа NIS. В отличие от других методов количественной оценки ssDNA, таких как анализ на основе COMET, анализ очагов IdU более применим для высокопроизводительных приложений.
Этот анализ может быть использован для множества применений. Повышенное присутствие ssDNA может быть использовано в качестве маркера репликационного стресса и для прогнозирования ответов на химиотерапию при различных видах рака яичников. Кроме того, амплификация онкогенов, которые, как известно, нарушают репликацию или регуляцию клеточного цикла, может вызвать накопление поражений, которые приводят к увеличению ссДНК. Таким образом, этот анализ также может быть использован для изучения влияния амплификации онкогенов на накопление ssDNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никакой.
Acknowledgments
PV поддерживается грантом Inaugural Pedal the Cause от Онкологического центра Элвина Дж. NR поддерживается грантом NIH Cell and Molecular Biology Training T32 для Вашингтонского университета в Сент-Луисе.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | NC0179595 | 10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C |
| 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) | Sigma Aldrich | I7125-5G | MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C |
| Anti-BrdU antibody | BD Biosciences | 347580 | Storage: Store in 4 °C |
| Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody | Thermo Scientific | A32766 | Light sensitive - keep in dark Storage: Store in 4 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G | Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C |
| Circular Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| NIS GA3 Software | Nikon | 77010604 | |
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma Aldrich | P4832-50ML | Storage: Store in 4 °C |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Thermo Scientific | P36962 | Storage: Store in 4 °C |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Genesee Scientific | 25-510 | Storage: Store in 4 °C |
| Water, sterile-filtered | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | Storage: Store in 4 °C |
References
- Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
- Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D'Andrea, A. D. Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamental vulnerability of ovarian cancer. Cancer Discovery. 5 (11), 1137-1154 (2015).
- Gee, M. E., Faraahi, Z., McCormick, A., Edmondson, R. J. DNA damage repair in ovarian cancer: Unlocking the heterogeneity. Journal of Ovarian Research. 11, 50 (2018).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nature communications. 8, 1093 (2017).
- Kroeger, P. T., Drapkin, R. Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).
- Patch, A. -M., et al. Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer. Nature. 521 (7553), 489-494 (2015).
- Alexandrov, L. B., et al. The repertoire of mutational signatures in human cancer. Nature. 578 (7793), 94-101 (2020).
- Byun, T. S., Pacek, M., Yee, M. -C., Walter, J. C., Cimprich, K. A. Functional uncoupling of MCM helicase and DNA polymerase activities activates the ATR-dependent checkpoint. Genes & Development. 19 (9), 1040-1052 (2005).
- Toledo, L. I., et al. ATR prohibits replication catastrophe by preventing global exhaustion of RPA. Cell. 155 (5), 1088-1103 (2013).
- Brickner, J. R., Garzon, J. L., Cimprich, K. A. Walking a tightrope: The complex balancing act of R-loops in genome stability. Molecular Cell. 82 (12), 2267-2297 (2022).
- Cejka, P., Symington, L. S. DNA end resection: Mechanism and control. Annual Review of Genetics. 55, 285-307 (2021).
- Kowalczykowski, S. C. An overview of the molecular mechanisms of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (11), 016410 (2015).
- Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. PRIMPOL ready, set, reprime. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).
- Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: An essential regulator of genome integrity. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (8), 616-627 (2008).
- Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Xu, H., et al. CCNE1 copy number is a biomarker for response to combination WEE1-ATR inhibition in ovarian and endometrial cancer models. Cell Reports. Medicine. 2 (9), 100394 (2021).
- Konstantinopoulos, P. A., et al. A Replication stress biomarker is associated with response to gemcitabine versus combined gemcitabine and ATR inhibitor therapy in ovarian cancer. Nature Communications. 12, 5574 (2021).
- Buisson, R., Boisvert, J. L., Benes, C. H., Zou, L. Distinct but concerted roles of ATR, DNA-PK, and Chk1 in countering replication stress during S phase. Molecular Cell. 59 (6), 1011-1024 (2015).
- Belan, O., et al. POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells. Molecular Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).
- da Costa, A. A. B. A., et al. Targeting replication stress in cancer therapy. Nature Reviews. Drug Discovery. 22 (1), 38-58 (2023).
- Chen, R., Wold, M. S. Replication protein A: Single-stranded DNA's first responder: Dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair. BioEssays. 36 (12), 1156-1161 (2014).
- Bhat, K. P., Cortez, D. RPA and RAD51: Fork reversal, fork protection, and genome stability. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (6), 446-453 (2018).
- Maréchal, A., Zou, L. RPA-coated single-stranded DNA as a platform for post-translational modifications in the DNA damage response. Cell Research. 25 (1), 9-23 (2015).
