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Cancer Research

एकल-फंसे डीएनए इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं में प्रतिकृति तनाव की मात्रा

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64920
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Oncology, Department of Medicine, Siteman Cancer Center, Washington University School of Medicine

Summary

यहां, हम कोशिकाओं में एकल-फंसे डीएनए के स्तर को निर्धारित करने के लिए एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस-आधारित विधि का वर्णन करते हैं। इस कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का उपयोग प्रतिकृति तनाव की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जो कई डिम्बग्रंथि के कैंसर में एक आम विशेषता है। इसके अतिरिक्त, यह परख एक स्वचालित विश्लेषण पाइपलाइन के साथ संगत है, जो इसकी दक्षता को और बढ़ाती है।

Abstract

प्रतिकृति तनाव कई डिम्बग्रंथि के कैंसर की पहचान है। प्रतिकृति तनाव कई स्रोतों से उभर सकता है, जिसमें डबल-स्ट्रैंड ब्रेक, प्रतिलेखन-प्रतिकृति संघर्ष, या प्रवर्धित ऑन्कोजीन शामिल हैं, जिसके परिणामस्वरूप अनिवार्य रूप से एकल-फंसे हुए डीएनए (एसएसडीएनए) की पीढ़ी होती है। इसलिए, एसएसडीएनए की मात्रा, विभिन्न सेल प्रकारों में और विभिन्न डीएनए-हानिकारक स्थितियों या उपचारों के तहत प्रतिकृति तनाव के स्तर का आकलन करने का अवसर प्रस्तुत करती है। उभरते सबूत यह भी बताते हैं कि एसएसडीएनए डीएनए की मरम्मत को लक्षित करने वाली कीमोथेरेपी दवाओं की प्रतिक्रियाओं का एक भविष्यवक्ता हो सकता है। यहां, हम एसएसडीएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विस्तृत इम्यूनोफ्लोरेसेंस-आधारित पद्धति का वर्णन करते हैं। इस पद्धति में जीनोम को थाइमिडीन एनालॉग के साथ लेबल करना शामिल है, इसके बाद गैर-विकृत परिस्थितियों में क्रोमैटिन में एनालॉग का एंटीबॉडी-आधारित पता लगाना शामिल है। एसएसडीएनए के हिस्सों को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत फॉसी के रूप में देखा जा सकता है। फॉसी की संख्या और तीव्रता सीधे नाभिक में मौजूद एसएसडीएनए के स्तर के साथ सह-संबंधित है। हम एसएसडीएनए सिग्नल को मापने के लिए एक स्वचालित पाइपलाइन का भी वर्णन करते हैं। विधि तेजी से और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। इसके अलावा, इस पद्धति की सादगी इसे दवा और आनुवंशिक स्क्रीन जैसे उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए उत्तरदायी बनाती है।

Introduction

जीनोमिक डीएनए अक्सर विभिन्न अंतर्जात और बहिर्जात स्रोतों से कई हमलों के संपर्कमें आता है। अंतर्जात क्षति की आवृत्ति सीधे चयापचय उपोत्पादों के स्तर से संबंधित है, जैसे कि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां या एल्डिहाइड, जो डिम्बग्रंथि के कैंसर सहित कई कैंसरप्रकारों में आंतरिक रूप से अधिक हैं। यह जरूरी है कि डीएनए क्षति को कुशलतापूर्वक हल किया जाए; अन्यथा, यह जीनोटॉक्सिक घावों को बढ़ावा दे सकता है और, परिणामस्वरूप, म्यूटेनेसिस। जीनोटॉक्सिक घावों की मरम्मत करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता त्रुटि-मुक्त डीएनए मरम्मत मार्गों की कार्यक्षमता और डीएनए क्षति के जवाब में सेल चक्र प्रगति के कुशल विनियमन पर निर्भर है। विशेष रूप से, कई डिम्बग्रंथि के कैंसर पी 53 में कार्यात्मक रूप से निष्क्रिय उत्परिवर्तन को सहन करते हैं और इस प्रकार, एक दोषपूर्ण जी 1 / एस चेकपॉइंट होता है, जिससे कोशिकाओं को अप्रकाशित जीनोमिक घावोंकी उपस्थिति के बावजूद डीएनए प्रतिकृति शुरू करने के लिए प्रेरित किया जाता है। डिम्बग्रंथि के कैंसर में डीएनए क्षति की डिग्री इस अवलोकन से और बढ़ जाती है कि उच्च श्रेणी के सीरस डिम्बग्रंथि कार्सिनोमा (एचजीएसओसी) के 50% से अधिक में बीआरसीए 1- और बीआरसीए 2-मध्यस्थता वाले समरूप पुनर्संयोजन, त्रुटि-मुक्त डीएनए मरम्मत मार्ग में दोष होते हैं, और लगभग 20% में जीन सीसीएनई 1 में प्रवर्धन होता है, जो समय से पहले जी 1 कोशिकाओं को एस-चरण6 में धकेल देता है . साथ में अंतर्जात डीएनए क्षति की उच्च आवृत्ति, दोषपूर्ण चौकियों, और खराब मरम्मत मार्गों ने डिम्बग्रंथि के कैंसर में जीनोमिक घावों के संचय को तेजी से बढ़ाया है। ये घाव डीएनए प्रतिकृति और प्रतिलेखन जैसी महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं की प्रगति के लिए बाधाओं के रूप में काम कर सकते हैं। जैसा कि नीचे चर्चा की गई है, इस तरह की बाधाएं कोशिकाओं में एकल-फंसे डीएनए (एसएसडीएनए) की पीढ़ी को उत्प्रेरित करती हैं।

डीएनए का डबल हेलिक्स जीनोम को कई म्यूटाजेनिक प्रक्रियाओं से बचाने के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे कि सहज डीप्यूरिनेशन और डिपिरिमिडिनेशन, साइटोसिन डिमिनेस की गतिविधि, और ऑक्सीडेटिव डीएनए क्षति 1,7। इसके विपरीत, एसएसडीएनए इन उत्परिवर्तन घटनाओं के लिए अत्यधिक संवेदनशील है। कोशिकाओं में कई प्रक्रियाओं के परिणामस्वरूप एसएसडीएनए (चित्रा 1) की पीढ़ी हो सकती है। इनमें निम्नलिखित शामिल हैं:

(i) डीएनए प्रतिकृति मशीनरी का ठप होना: इससे डीएनए हेलिकेस और पोलीमरेज़ का एक संयोजन होता है, जिससे एसएसडीएनए 8,9 के खंड छूट जाते हैं।

(ii) प्रतिलेखन मशीनरी का रुकना: आरएनए पोलीमरेज़ के लगातार रुकने से तीन-फंसे हुए हाइब्रिड डीएनए/आरएनए संरचनाओं का निर्माण होता है जिन्हें आर-लूप कहा जाता है। आर-लूप गठन विस्थापित, गैर-स्थानांतरित डीएनए को एकल स्ट्रैंड10 के रूप में उजागर करता है।

(iii) डीएनए एंड-रिसेक्शन: होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत की शुरुआत के लिए एक समरूप अनुक्रम11 की खोज को उत्प्रेरित करने के लिए 3'एसएसडीएनए की पीढ़ी की आवश्यकता होती है।

(iv) डी-लूप: समरूप पुनर्संयोजन के दौरान स्ट्रैंड आक्रमण के परिणामस्वरूप गैर-टेम्पलेट पूरक स्ट्रैंड का विस्थापन हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप एसएसडीएनए12 हो सकता है।

(v) प्रतिकृति-युग्मित अंतराल: डीएनए प्रतिकृति के दौरान, लैगिंग स्ट्रैंड संश्लेषण एक असंतुलित तरीके से होता है, जिससे ओकाजाकी टुकड़े पहले उत्पन्न होते हैं और फिर लिगेट होते हैं। ओकाजाकी टुकड़ों को संसाधित करने में देरी या दोष के परिणामस्वरूप एसएसडीएनए का गठन भी हो सकता है। अंत में, यदि एक प्रमुख स्ट्रैंड पर प्रतिकृति कांटा एक रुकने वाले घाव, डीएनए पोलीमरेज़ और प्राइमाज़ का सामना करता है, तो PRIMPOL संश्लेषण को डाउनस्ट्रीम में पुन: प्राप्त कर सकता है, जिससेएसएसडीएनए अंतर 13,14 पीछे रह जाता है।

जाहिर है, इनमें से अधिकांश घटनाएं या तो तब होती हैं जब डीएनए प्रतिकृति मशीनरी जीनोमिक घावों का सामना करती है या प्रतिकृति-युग्मित मरम्मत के दौरान, यह सुझाव देती है कि उच्च डीएनए क्षति से एसएसडीएनए के स्तर में वृद्धि होती है। चूंकि इनमें से कई घटनाएं प्रतिकृति से जुड़ी हैं, एसएसडीएनए के गठन को कोशिकाओं15,16 में "प्रतिकृति तनाव" का मार्कर माना जाता है।

यहां, हम एक परख का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग कोशिकाओं में एसएसडीएनए को मज़बूती से निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण की सादगी, प्रजनन क्षमता और लागत लाभ कोशिकाओं में प्रतिकृति-तनाव प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए उपयोग किए जाने योग्य बनाते हैं। उभरते अध्ययनों से पता चला है कि एसएसडीएनए का स्तर कीमोथेरेपी के लिए प्रतिक्रियाओं का एक भविष्यवक्ता भी हो सकता है, जैसे कि पीएआरपी 1/2 एंजाइम, एटीआर, और वी 1 किनेज 17,18,19,20,21 के अवरोधक। इन अवरोधकों को कई एचजीएसओसी22 के उपचार आहार में पीछा किया जा रहा है। इसलिए, यह परख डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं में कीमोथेरेपी प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी करने के लिए एक उपयोगी उपकरण भी हो सकता है।

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Protocol

नोट: डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइन, OVCAR3, का उपयोग इन चरणों में किया गया था, लेकिन यह प्रोटोकॉल व्यापक रूप से कई अन्य सेल लाइनों पर लागू होता है, जिसमें गैर-डिम्बग्रंथि स्रोतों से प्राप्त भी शामिल हैं। प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्र 2 में दिखाया गया है।

1. कोशिकाओं को चढ़ाना

  1. पॉली-एल-लाइसिन लेपित कवरलिप बनाएं।
    1. पॉली-एल-लाइसिन समाधान के साथ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में ऑटोक्लेव 12 मिमी व्यास के कवरलिप जोड़ें, और 15 मिनट के लिए एक रॉकर पर रखें।
    2. ऊतक संवर्धन हुड में घोल को एस्पिरेट करें। बाँझ पानी जोड़कर कवरलिप्स को धोएं, और कवरलिप्स युक्त ट्यूब को 5 मिनट के लिए रॉकर पर वापस रखें। इस वॉश स्टेप को तीन बार दोहराएं।
    3. लेपित कवरलिप्स को बाँझ पकवान पर फैलाएं, और किसी भी शेष पानी को एस्पिरेट करें। कवरलिप्स को 1 घंटे के लिए ऊतक संस्कृति हुड में सूखने दें या जब तक पानी की बूंदें न रहें। एक बार सूखने के बाद, डिश को पैराफिल्म के साथ सील करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. 24-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में एक पॉली-एल-लाइसिन-लेपित कवरस्लिप रखें। पूर्व-निष्कर्षण चरण के दौरान कवरलिप्स से कोशिकाओं की अलगाव को रोकने के लिए पॉली-लाइसिन कवरलिप्स का उपयोग महत्वपूर्ण है।
  3. ट्रिप्सिनाइज ओवीसीएआर 3 कोशिकाएं एक बार जब वे 70% -80% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती हैं।
    1. 10 सेमी कल्चर डिश को ट्रिप्सिनाइज करने के लिए जो 70% -80% कॉन्फ्लुएंट है, प्लेट से माध्यम को एस्पिरेट करें, और पीबीएस के 5-7 एमएल के साथ धोएं।
    2. पीबीएस को एस्पिरेट करें, 0.25% ट्रिप्सिन का 1 एमएल जोड़ें, और डिश को 8-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें, या जब तक कि कोशिकाएं प्लेट के नीचे से न उठ जाएं।
    3. 5-10 एमएल माध्यम के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और एक शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ें।
    4. मानक प्रक्रियाओं का उपयोग करके हेमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से गिनें।
  4. 25,000 कोशिकाओं / एमएल का कमजोर पड़ना बनाएं, और 24-वेल प्लेटों के कुओं में रखे पॉली-एल-लाइसिन कवरलिप्स पर 1 एमएल कोशिकाओं को जोड़ें। किसी भी अन्य सेल लाइन के लिए, एक संख्या निर्धारित करें जैसे कि तीन आबादी दोगुनी होने के बाद कोशिकाएं लगभग 70% -80% कॉन्फ्लुएंट हों।
  5. मानक परिस्थितियों में संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को विकसित करें।

2. आईडीयू के साथ स्पंदन कोशिकाएं

  1. कोशिकाओं को कवरलिप्स पर ठीक से फैलाने के लिए, एक आबादी दोगुनी होना पर्याप्त है। एक जनसंख्या दोगुनी होने के बाद, कोशिकाओं को 10 μM 5-iodo-2'-deoxyuridine (IDU) के साथ पल्स करें (IDU को पुनर्गठित करने के तरीके पर सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: हमने ब्रोमोड्यूक्स्यूरिडाइन (बीआरडीयू), 5-क्लोरो-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन (सीआईडीयू), और आईडीयू सहित विभिन्न थाइमिडाइन एनालॉग्स की कोशिश की है। तीन एनालॉग्स में से, आईडीयू सबसे अच्छा सिग्नल-टू-शोर अनुपात देता है। तीन अलग-अलग एनालॉगों के साथ स्पंदित कोशिकाओं की तुलनात्मक छवियां चित्रा 3 में दिखाई गई हैं। हम दो नकारात्मक नियंत्रणों के उपयोग की सलाह देते हैं: (i) कोई आईडीयू स्पंदित नमूना नहीं, और (ii) कोई प्राथमिक एंटीबॉडी नियंत्रण नहीं। यदि किसी दिए गए उपचार के कारण एसएसडीएनए के गठन का आकलन करने की आवश्यकता होती है, तो हम आईडीयू दोगुना होने के पहले दौर के बाद दवा को जोड़ने की सलाह देते हैं।
  2. दो आबादी दोगुनी होने के लिए आईडीयू के साथ स्पंदन के बाद, इमेजिंग के लिए कोशिकाओं की कटाई करें।
    1. माध्यम को 5 मिनट के लिए बर्फ पर बर्फ-ठंडा 0.5% PBSTx (PBS + 0.5% Triton X-100) से बदलें। यह पूर्व-निष्कर्षण चरण साइटोप्लाज्मिक और गैर-क्रोमैटिन-बाध्य प्रोटीन को जारी करने में मदद करता है, जिससे क्रोमैटिन-बाध्य प्रोटीन बरकरार रहते हैं। पूर्व-निष्कर्षण के दौरान कुछ सेल लाइनें आसानी से छील सकती हैं। ऐसे परिदृश्य में कोई 0.5% सीएसके बफर (10 एमएम पाइप (पीएच 6.8), 100 एमएम एनएसीएल, 300 एमएम सुक्रोज, 3 एमएम एमजीसीएल2, 1 एमएम ईजीटीए और 0.5% ट्राइटन एक्स -100) का उपयोग कर सकता है।

3. निर्धारण

  1. एस्पिरेट पीबीएसटीएक्स, और कमरे के तापमान पर 3% पीएफए (सामग्री की तालिका) के साथ 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, इसके बाद 1 एक्स पीबीएस के साथ तीन से चार धोएं। निश्चित कोशिकाओं को अगले चरणों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
    सावधानी: पीएफए अत्यधिक विषाक्त और कार्सिनोजेनिक है। त्वचा, आंखों और श्लेष्म झिल्ली के संपर्क से बचें। पीएफए के साथ सभी चरणों को एक फ्यूम हुड में निष्पादित करें, और सामग्री को ठीक से निपटाएं।

4. परमेबिलाइजेशन और ब्लॉकिंग

  1. निर्धारण के बाद, 5 मिनट के लिए बर्फ पर 0.5% पीबीएसटीएक्स का उपयोग करके कोशिकाओं को स्थिर करें। पूरे कवरस्लिप को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा का उपयोग करें (आमतौर पर 500 μL और 1 mL के बीच)।
  2. कमरे के तापमान पर 0.2% पीबीएसटी (1एक्स पीबीएस + 0.2% ट्वीन -20) के साथ कोशिकाओं को तीन से चार बार धोएं। प्रत्येक कुएं को धोने के लिए पीबीएसटी का एक एमएल पर्याप्त है। बिना किसी ऊष्मायन के बैक टू बैक वॉश करें।
  3. पीबीएसटी को एस्पिरेट करें, और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 1x PBS (ब्लॉकिंग बफर) में बनाए गए 5% बीएसए (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके नमूने को ब्लॉक करें।

5. आईडीयू एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेनिंग

  1. इम्यूनोस्टेनिंग के लिए, एक ह्यूमिडिफायर चैंबर (फ्लैट-बॉटम टपरवेयर पर गीला पेपर तौलिया) तैयार करें। पैराफिल्म के साथ 24-वेल प्लेट के ढक्कन को कवर करें, ह्यूमिडिफायर चैंबर में रखें, और प्लेट के ढक्कन पर कवरलिप बिछाएं।
  2. चरण 4.2 से ब्लॉकिंग बफर में 1:200 को पतला करके एंटी-बीआरडीयू प्राथमिक माउस एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) तैयार करें।
  3. कवरलिप्स के शीर्ष पर 60 μL IDU एंटीबॉडी कमजोर पड़ने जोड़ें। कवरलिप्स को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    1. वैकल्पिक रूप से, कम एंटीबॉडी समाधान का उपयोग करें यदि कवरलिप्स को पैराफिल्म पर 1:200 एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की बूंद (20-25 μL) पर फ़्लिप किया जाता है। यह इनक्यूबेशन के दौरान समाधान के सूखने की संभावना को भी कम करता है।
  4. 1 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी को एस्पिरेट करें। कवरलिप्स को 24-वेल प्लेट पर वापस लाएं, और उन्हें 0.2% पीबीएसटी के साथ चार बार धोएं।
  5. द्वितीयक एंटीबॉडी के लिए, चरण 5.1 में वर्णित उसी ह्यूमिडिफायर कक्ष का उपयोग करें। ब्लॉकिंग बफर (1: 200) में एंटी-माउस संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) को पतला करें। कवरलिप्स में 60 μL द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ें, और 1 घंटे के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  6. द्वितीयक एंटीबॉडी को एस्पिरेट करें। कवरलिप्स को 24-वेल प्लेट पर वापस लाएं, और 0.2% पीबीएसटी के साथ चार बार धोएं।
  7. माइक्रोस्कोप स्लाइड्स को लेबल करें, और डीएपीआई माउंटिंग माध्यम (सामग्री की तालिका) के साथ स्लाइड पर कवरलिप्स माउंट करें। 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में स्लाइड स्टोर करें। 24 घंटे इनक्यूबेशन की सिफारिश की जाती है यदि बढ़ते माध्यम को ठीक करने या कठोर करने की आवश्यकता होती है।
    नोट: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर छवि बनाने से पहले स्लाइड्स को 4 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत किया जा सकता है। एक प्रतिनिधि छवि चित्रा 4 में दिखाया गया है।

6. आईडीयू फॉसी का स्वचालित परिमाणीकरण

नोट: इस परख की शक्ति त्वरित और कुशल परिमाणीकरण के लिए विश्लेषण को स्वचालित करने की क्षमता में निहित है। हम यहां एक स्वचालित विश्लेषण पाइपलाइन प्रस्तुत करते हैं जिसका उपयोग किसी दिए गए छवि क्षेत्र में आईडीयू फॉसी को मापने के लिए किया जा सकता है। यह महत्वपूर्ण है कि किसी दिए गए प्रयोग के भीतर सभी छवियों को एक ही एक्सपोज़र सेटिंग्स के साथ लिया जाता है; अन्यथा, परिमाणीकरण विश्वसनीय नहीं होगा। एक गैर-दाग वाले नियंत्रण को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल करना भी मूल्यवान हो सकता है, कम से कम पहली बार यह प्रयोग चलाया गया है (चित्रा 5)। नीचे दिया गया प्रोटोकॉल एनआईएस जनरल एनालिसिस सॉफ्टवेयर के लिए विशिष्ट है, लेकिन समान सिद्धांतों को अन्य वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर के साथ भी लागू किया जा सकता है।

  1. दृश्य टैब में, विश्लेषण नियंत्रण पर जाएँ | विश्लेषण एक्सप्लोरर. यह विश्लेषण एक्सप्लोरर नामक एक नई साइड विंडो खोलता है। नया बनाएं पर क्लिक करें | सामान्य विश्लेषण 3. यह विश्लेषण एक्सप्लोरर फ़्लोचार्ट निर्माण सॉफ्टवेयर खोलता है।
  2. स्रोत टैब पर जाएँ, और चैनल कमांड को बाएं मेनू से कार्य क्षेत्र में खींचें। DAPI और IDU फॉसी के लिए दो चैनल स्वचालित रूप से बाइनरी बॉक्स के रूप में पॉप अप होंगे (चित्र 5 में लाल रूपरेखा वाले बक्से के रूप में दिखाया गया है)।
  3. प्रीप्रोसेसिंग टैब पर जाएं, और स्थानीय कंट्रास्ट कमांड को बाएं मेनू से कार्य क्षेत्र में खींचें। स्थानीय कंट्रास्ट को आईडीयू फॉसी चैनल से कनेक्ट करें। विभाजन टैब से, थ्रेशोल्ड कमांड (प्रत्येक चैनल के लिए एक) खींचें।
  4. प्रत्येक चैनल को थ्रेशोल्ड कमांड से कनेक्ट करें। किसी छवि की सीमा पर किसी भी नाभिक को खत्म करने के लिए, बाइनरी प्रोसेसिंग टैब पर जाएं, टचिंग बॉर्डर्स कमांड खींचें, और डीएपीआई सीमा से कनेक्ट करें।
  5. मापन टैब में एग्रीगेट चिल्ड्रन कमांड का उपयोग करके दो चैनलों से डेटा मर्ज करें। DAPI चैनल को माता-पिता (A) और फॉसी चैनल को चाइल्ड (B) के रूप में परिभाषित करें। एग्रीगेट चिल्ड्रन कमांड में ड्रॉपडाउन मेनू में, उस विकल्प का चयन करें जो बच्चा माता-पिता के अंदर है। यह कदम प्रति नाभिक (माता-पिता) फॉसी (बच्चे) की संख्या को गिनने में मदद करता है।
    1. डेटा को सारणीबद्ध स्वरूप में निर्यात करने के लिए, डेटा प्रबंधन टैब में स्तंभ संशोधित करें आदेश पर क्लिक करें. संशोधित कॉलम कमांड से ड्रॉपडाउन मेनू में, DAPI-ID का चयन करें (यह किसी दिए गए छवि के भीतर प्रत्येक नाभिक को एक अद्वितीय संख्या असाइन करने में मदद करता है) और आईडीयू गिनती (यह प्रत्येक नाभिक में आईडीयू फॉसी की संख्या प्रदान करता है)। CSV स्वरूप में डेटा निर्यात करने के लिए, संदर्भ टैब में तालिका से CSV आदेश का उपयोग करें। GA3 को अब वर्णनात्मक शीर्षक के साथ सहेजा जा सकता है।
  6. विश्लेषण के लिए, सॉफ़्टवेयर में एक छवि खोलें।
    1. चरण 6.1 में किए गए विश्लेषण एक्सप्लोरर टैब को खोलें, और नए बनाए गए GA3 की स्थिति जानें। GA3 फ़ाइल पर डबल-क्लिक करें, जो GA3 विज़ार्ड नामक एक नई विंडो खोलता है जहाँ कोई DAPI और IDU चैनलों के लिए सीमा सेट कर सकता है।
    2. प्रत्येक चैनल के लिए न्यूनतम और अधिकतम सीमा सेट करने के लिए विंडो में स्लाइडर का उपयोग करें और इसलिए, सिग्नल को परिभाषित करें। एक अच्छा थ्रेशोल्डिंग मूल्य वह है जहां प्रत्येक नाभिक और आईडीयू फोकस के लिए सीमाएं स्पष्ट रूप से परिभाषित की जाती हैं। एक बार थ्रेशोल्ड मानों से संतुष्ट होने के बाद, किसी दिए गए प्रयोग में सभी फ़ाइलों का विश्लेषण करने के लिए इन संख्याओं को बनाए रखें।
    3. आईडीयू फॉसी/प्रति न्यूक्लियस की गिनती प्राप्त करने के लिए रन बटन पर क्लिक करें।
      नोट: सॉफ्टवेयर प्रति नाभिक फॉसी की एक तालिका उत्पन्न करता है, जिसके बाद किसी भी ग्राफिंग उद्देश्यों के लिए उपयोग किया जा सकता है (चित्रा 5)।

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Representative Results

अनुपचारित कोशिकाओं और कोशिकाओं से प्राप्त नाभिक से आईडीयू फॉसी की प्रतिनिधि छवियों और 24 घंटे के लिए 0.5 एमएम हाइड्रॉक्सीयूरिया के साथ इलाज की गई कोशिकाओं को चित्रा 4 में दिखाया गया है। दोनों नाभिक DAPI चैनल में दाग और पहचाने जाने योग्य हैं। इन छवियों के विश्लेषण में प्रत्येक नाभिक में फॉसी की संख्या को निर्धारित करना शामिल है। फॉसी की संख्या प्रतिकृति तनाव की डिग्री के समानुपाती है।

Figure 1
चित्रा 1: एसएसडीएनए पीढ़ी के तंत्र। विभिन्न तंत्रों को दिखाने के लिए योजनाबद्ध जिसके द्वारा सेल में एसएसडीएनए उत्पन्न किया जा सकता है। इसमें (ए) प्रतिकृति मशीनरी का ठहराव, (बी) प्रतिलेखन मशीनरी का ठहराव, जिसके परिणामस्वरूप आर-लूप, (सी) डीएनए एंड रिसेक्शन, (डी) डी-लूप का गठन, या (ई) प्रतिकृति-युग्मित अंतराल शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: आईडीयू लेबलिंग योजनाबद्ध। कोशिकाओं को दो जनसंख्या दोगुनी करने के लिए आईडीयू के साथ स्पंदित किया जाता है। यदि किसी दवा उपचार की आवश्यकता है, तो इसे आईडीयू की उपस्थिति में पहली आबादी दोगुनी होने के बाद प्रशासित किया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: आईडीयू, बीआरडीयू, या सीएलडीयू के साथ स्पंदन के बाद प्राप्त फॉसी सिग्नल की तुलना। तीन अलग-अलग थाइमिडीन एनालॉग के साथ स्पंदित कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां। DAPI, GFP (एलेक्सा -488-लेबल आईडीयू फॉसी का प्रतिनिधित्व करते हुए), और विलय किए गए चैनल दिखाए जाते हैं। स्केल पट्टी: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: प्रतिकृति तनाव के कारण OVCAR3 कोशिकाओं में आईडीयू फॉसी में वृद्धि हुई। (A) प्रतिनिधि IU और DAPI-दाग वाले नाभिक चित्र और (B) 24 घंटे के लिए 0.5 mM हाइड्रॉक्सीयूरिया के साथ इलाज की गई कोशिकाओं < का परिमाणीकरण। स्केल पट्टी: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिनिधि स्वचालित विश्लेषण जीए 3 पाइपलाइन। जीए 3 स्वचालित विश्लेषण डीएपीआई (नारंगी में दिखाया गया) और आईडीयू फॉसी (पीले रंग में दिखाया गया) के आधार पर नाभिक को थ्रेशोल्ड करने के लिए एक पाइपलाइन उत्पन्न करके पूरा किया जा सकता है। इन दो थ्रेसहोल्ड को एकत्र करने से प्रति नाभिक आईडीयू फॉसी की संख्या आबाद होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

जैसा कि प्रोटोकॉल में उल्लेख किया गया था, यह सुनिश्चित करने के लिए कुछ प्रयोगात्मक नियंत्रणों को शामिल करना मूल्यवान है कि परख काम कर रही है। इनमें कोई आईडीयू उपचारित नमूना और साथ ही कोई प्राथमिक एंटीबॉडी उपचारित नमूना शामिल है। दोनों नकारात्मक नियंत्रणों को उन कोशिकाओं का उत्पादन करना चाहिए जो DAPI द्वारा दागदार हैं लेकिन इसमें कोई आईडीयू संकेत नहीं है।

प्रयोगात्मक स्थितियों और सेल लाइनों के आधार पर, सर्वोत्तम फ्लोरोसेंट सिग्नल प्राप्त करने के लिए विभिन्न एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकती है। बहुत अधिक संकेत के परिणामस्वरूप व्यक्तिगत फॉसी को मापने में असमर्थता हो सकती है, जबकि बहुत कम संकेत का मतलब यह हो सकता है कि नमूनों के बीच प्रयोगात्मक अंतर की पहचान नहीं की जा सकती है। पूर्व-निष्कर्षण और परमेबिलाइजेशन समय को समायोजित करने से भी मदद मिल सकती है यदि बहुत अधिक पृष्ठभूमि संकेत है, जो अप्राप्य न्यूक्लियोप्लाज्मिक सामग्री से उत्पन्न हो सकता है।

चूंकि इस प्रोटोकॉल के लिए दो जनसंख्या दोहरीकरण पर आईडीयू निगमन की आवश्यकता होती है, इसलिए प्रत्येक सेल लाइन के दोहरीकरण समय का हिसाब रखना महत्वपूर्ण है। दो सेल लाइनों की तुलना करते समय जिनके पास अलग-अलग दोहरीकरण समय होता है, प्रत्येक सेल लाइन के दोहरीकरण समय के लिए आईडीयू स्पंदन की लंबाई को समायोजित करना अनिवार्य है। हालांकि, यह भिन्नता के कुछ स्तर को पेश कर सकता है। इस प्रकार, समान दोहरीकरण समय के साथ सेल लाइनों की तुलना करते समय इस परख का अनुप्रयोग सबसे प्रभावी होता है। यदि दोहरीकरण समय ज्ञात नहीं है, तो इसके लिए पूर्व प्रयोगात्मक अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।

इसके अतिरिक्त, यह परख एसएसडीएनए की मात्रा को कम कर सकती है जो किसी भी समय सेल में मौजूद होती है। एसएसडीएनए केवल फॉसी के रूप में पहचाना जा सकता है जब विपरीत स्ट्रैंड को आईडीयू के साथ लेबल किया गया है। इस प्रकार, यदि एसएसडीएनए के विपरीत स्ट्रैंड को लेबल नहीं किया गया है, तो इसका पता नहीं लगाया जाएगा। उदाहरण के लिए, यदि माता-पिता के गैर-लेबल डीएनए में घाव होते हैं जो अंतराल को जन्म देते हैं, तो उन घावों का पता नहीं लगाया जाएगा (चित्रा 2)। अधिक संवेदनशील विश्लेषण के लिए, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रतिकृति प्रोटीन ए (आरपीए) के लिए कोशिकाओं की जांच करना होगा। आरपीए एक डीएनए बाइंडिंग प्रोटीन है जो अधिमानतः एसएसडीएनए को द्वितीयक संरचनाओं को बनाने से रोकने और न्यूक्लियस गतिविधि23,24 से बचाने के लिए कोट करता है। प्रतिकृति-युग्मित क्षति के दौरान, आरपीए को सेरीन 33 पर फॉस्फोराइलेटेड किया जाता है, और इसलिए, पीआरपीए एस 33 को प्रतिकृति तनाव के लिए मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। अत्यधिक क्षति की स्थितियों के तहत, पीआरपीए एस 33 को डीएनए-पीके25 द्वारा एस 4 /एस 8 पर फॉस्फोराइलेट किया जाता है। इसलिए, क्रोमैटिन से बंधे आरपीए के विभिन्न रूपों की जांच करके, कोई कोशिकाओं में विभिन्न प्रतिकृति तनाव प्रतिक्रियाओं का आकलन कर सकता है। इन दो पूरक दृष्टिकोणों (आईडीयू फॉसी और आरपीए धुंधला) को अलग-अलग पद्धतियों का उपयोग करके एसएसडीएनए के स्तर को मान्य करने के लिए समानांतर में किया जा सकता है।

यह परख किसी दिए गए सेल प्रकार में एसएसडीएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक आसान-से-पालन, अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और कुशल विधि प्रदान करती है। इसे विभिन्न दवा उपचार, विभिन्न सेल प्रकार और कई विश्लेषण उपकरणों के आवेदन की अनुमति देने के लिए समायोजित किया जा सकता है। यह एनआईएस विश्लेषण सॉफ्टवेयर सहित विभिन्न स्वचालित परिमाणीकरण विधियों के लिए उत्तरदायी है। एसएसडीएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए अन्य तकनीकों के विपरीत, जैसे कि कॉमेट-आधारित परख, आईडीयू फॉसी परख उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए अधिक व्यवहार्य है।

इस परख का उपयोग कई अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है। एसएसडीएनए की बढ़ती उपस्थिति का उपयोग प्रतिकृति तनाव के मार्कर के रूप में और विभिन्न डिम्बग्रंथि के कैंसर में कीमोथेरेपी प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, ऑन्कोजीन का प्रवर्धन जो प्रतिकृति या सेल चक्र विनियमन को बाधित करने के लिए जाना जाता है, घावों के संचय का कारण बन सकता है जिसके परिणामस्वरूप एसएसडीएनए में वृद्धि होती है। इसलिए, इस परख का उपयोग एसएसडीएनए के संचय पर ऑन्कोजीन के प्रवर्धन के प्रभाव की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है।

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Disclosures

कोई नहीं।

Acknowledgments

पीवी को बार्न्स-यहूदी अस्पताल के लिए फाउंडेशन के माध्यम से एल्विन जे साइटमैन कैंसर सेंटर द्वारा उद्घाटन पेडल द कॉज ग्रांट, डिम्बग्रंथि के कैंसर अनुसंधान के लिए मार्शा रिवकिन सेंटर से पायलट रिसर्च ग्रांट, मैरी के ऐश फाउंडेशन और वी-फाउंडेशन से कैंसर रिसर्च ग्रांट द्वारा समर्थित किया गया है। एनआर वाशिंगटन विश्वविद्यालय, सेंट लुइस को एनआईएच सेल और आणविक जीवविज्ञान प्रशिक्षण टी 32 अनुदान द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3% Paraformaldehyde (PFA) Fisher Scientific NC0179595 10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage
Storage: Store in -20 °C
5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) Sigma Aldrich I7125-5G MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia
Storage: Stored in -20 °C
Anti-BrdU antibody BD Biosciences 347580 Storage: Store in 4 °C
Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody Thermo Scientific A32766 Light sensitive - keep in dark
Storage: Store in 4 °C
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A7906-100G Made by adding specific mass to volume of PBS
Storage: Store in 4 °C
Circular Cover Glass  Electron Microscopy Sciences 72230-01
NIS GA3 Software  Nikon  77010604
OVCAR3 ATCC HTB-161 Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep
Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C
Poly-L-Lysine solution Sigma Aldrich P4832-50ML Storage: Store in 4 °C
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI Thermo Scientific P36962 Storage: Store in 4 °C
Trypsin-EDTA, 0.25% Genesee Scientific 25-510 Storage: Store in 4 °C
Water, sterile-filtered Sigma Aldrich W3500-6X500ML Storage: Store in 4 °C

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 192
एकल-फंसे डीएनए इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं में प्रतिकृति तनाव की मात्रा
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Ramakrishnan, N., Haseljic, E.,… More

Ramakrishnan, N., Haseljic, E., Verma, P. Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (192), e64920, doi:10.3791/64920 (2023).

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