Summary
במאמר זה אנו מתארים שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה לכימות רמות הדנ"א החד-גדילי בתאים. שיטה יעילה וניתנת לשחזור זו יכולה לשמש לבחינת לחץ שכפול, תכונה נפוצה במספר סוגי סרטן השחלות. בנוסף, בדיקה זו תואמת צינור ניתוח אוטומטי, אשר מגביר עוד יותר את יעילותו.
Abstract
לחץ שכפול הוא סימן ההיכר של מספר סוגי סרטן השחלות. לחץ שכפול יכול לנבוע ממקורות מרובים, כולל הפסקות דו-גדיליות, התנגשויות שעתוק-שכפול או אונקוגנים מוגברים, וכתוצאה מכך באופן בלתי נמנע יצירת DNA חד-גדילי (ssDNA). כימות ssDNA, אם כן, מהווה הזדמנות להעריך את רמת לחץ השכפול בסוגי תאים שונים ובתנאים או טיפולים שונים הפוגעים בדנ"א. ראיות חדשות מצביעות גם על כך ש- ssDNA יכול להיות מנבא של תגובות לתרופות כימותרפיות המכוונות לתיקון DNA. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה מפורטת המבוססת על אימונופלואורסנציה לכימות ssDNA. מתודולוגיה זו כוללת תיוג הגנום עם אנלוגי תימידין, ואחריו זיהוי מבוסס נוגדנים של האנלוגי בכרומטין בתנאים שאינם דנטורציה. ניתן לדמיין מתיחות של ssDNA כמוקדים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מספר המוקדים ועוצמתם קשורים ישירות לרמת ssDNA הקיימת בגרעין. אנו גם מתארים צינור אוטומטי לכימות אות ssDNA. השיטה מהירה וניתנת לשחזור. יתר על כן, הפשטות של מתודולוגיה זו הופכת אותה למקובלת על יישומים בעלי תפוקה גבוהה כגון תרופות ובדיקות גנטיות.
Introduction
דנ"א גנומי חשוף לעתים קרובות להתקפות מרובות ממקורות אנדוגניים ואקסוגניים שונים1. תדירות הנזק האנדוגני נמצאת בקורלציה ישירה עם רמות תוצרי לוואי מטבוליים, כגון מיני חמצן תגובתי או אלדהידים, שהם גבוהים יותר באופן מהותי בסוגי סרטן מרובים, כולל סרטן השחלות 2,3. הכרחי שנזק לדנ"א ייפתר ביעילות; אחרת, זה יכול לטפח נגעים genotoxic, וכתוצאה מכך, מוטגנזה. יכולתם של תאים לתקן נגעים גנוטוקסיים תלויה בפונקציונליות של מסלולי תיקון דנ"א נטולי שגיאות ובוויסות יעיל של התקדמות מחזור התא בתגובה לנזק לדנ"א. יש לציין כי סרטני שחלות רבים נושאים מוטציות לא פעילות תפקודית ב-p53, ולכן יש להם מחסום G1/S פגום, מה שמוביל את התאים ליזום שכפול DNA למרות נוכחותם של נגעים גנומיים לא מתוקנים 4,5. מידת הנזק לדנ"א בסרטן השחלות מורכבת עוד יותר על ידי התצפית כי ליותר מ -50% מקרצינומת השחלות הסרוסיות בדרגה גבוהה (HGSOC) יש פגמים ברקומבינציה הומולוגית בתיווך BRCA1 ו- BRCA2, מסלול תיקון ה- DNA ללא שגיאות, וכ -20% יש הגברה בגן CCNE1, אשר דוחף בטרם עת תאי G1 לשלב S6 . יחד, התדירות הגבוהה של נזק אנדוגני לדנ"א, נקודות ביקורת פגומות ומסלולי תיקון לא תקינים מגבירים באופן אקספוננציאלי את הצטברות הנגעים הגנומיים בסרטן השחלות. נגעים אלה יכולים לשמש מכשולים להתקדמות של תהליכים תאיים קריטיים כגון שכפול DNA ושעתוק . כפי שיפורט להלן, מכשולים כאלה מזרזים את יצירת הדנ"א החד-גדילי (ssDNA) בתאים.
הסליל הכפול של הדנ"א הוא קריטי להגנה על הגנום מפני תהליכים מוטגניים מרובים, כגון דפורינציה ודפירימידינציה ספונטנית, פעילות של ציטוזין דיאמינאזות, ונזק חמצונילדנ"א 1,7. לעומת זאת, ssDNA פגיע מאוד לאירועים מוטציוניים אלה. תהליכים מרובים בתאים יכולים לגרום ליצירת ssDNA (איור 1). אלה כוללים את הדברים הבאים:
(i) עיכוב של מנגנון שכפול הדנ"א: זה מוביל לניתוק של מנחת המסוקים והפולימראז של הדנ"א, ומשאיר רצועות של ssDNA 8,9.
(ii) עיכוב של מנגנון השעתוק: עיכוב מתמשך של RNA פולימראז מוביל ליצירת מבני DNA/RNA היברידיים תלת-גדיליים הנקראים לולאות R. היווצרות לולאת R חושפת את הדנ"א העקור, שאינו משועתק, כגדיל יחיד10.
(iii) כריתת קצה דנ"א: התחלת תיקון מכוון הומולוגיה דורשת יצירה של ssDNA 3' כדי לזרז את החיפוש אחר רצף הומולוגי11.
(iv) D-loop: פלישת גדיל במהלך רקומבינציה הומולוגית עלולה לגרום לתזוזה של הגדיל המשלים שאינו תבנית, וכתוצאה מכך ssDNA12.
(v) פערים מצומדים לשכפול: במהלך שכפול הדנ"א, סינתזת גדילים מפגרים מתרחשת באופן לא רציף, שבו מקטעי אוקזקי נוצרים תחילה ולאחר מכן קשירה. עיכוב או פגם בעיבוד מקטעי אוקזקי יכול גם לגרום להיווצרות ssDNA. לבסוף, אם מזלג השכפול על גדיל מוביל נתקל בנגע משתהה, DNA פולימראז ופרימאז, PRIMPOL יכול להוביל מחדש את הסינתזה במורד הזרם, ולהשאיר פער ssDNA מאחורי13,14.
ככל הנראה, רוב האירועים האלה מתרחשים כאשר מנגנון שכפול הדנ"א מתמודד עם נגעים גנומיים או במהלך תיקון מצומד שכפול, דבר המצביע על כך שנזק גבוה יותר לדנ"א מוביל לרמות גבוהות יותר של ssDNA. מכיוון שרבים מאירועים אלה קשורים לשכפול, היווצרות ssDNA נחשבת לסמן של "לחץ שכפול" בתאים15,16.
כאן, אנו מתארים בדיקה שניתן להשתמש בה כדי לכמת באופן אמין ssDNA בתאים. הפשטות, יכולת השחזור ויתרונות העלות של גישה זו הופכים אותה למקובלת לשימוש להערכת תגובת השכפול-עקה בתאים. מחקרים חדשים גילו כי רמת ssDNA יכולה גם לנבא תגובות לכימותרפיה, כגון מעכבי אנזימי PARP1/2, ATR וקינאז Wee1 17,18,19,20,21. מעכבים אלה נרדפים במשטר הטיפול של מספר HGSOCs22. לכן, בדיקה זו יכולה להיות גם כלי שימושי לחיזוי תגובות כימותרפיות בתאי סרטן השחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: קו תאי סרטן השחלות, OVCAR3, שימש בשלבים אלה, אך פרוטוקול זה חל באופן נרחב על קווי תאים רבים אחרים, כולל אלה שמקורם במקורות שאינם שחלתיים. סכמה של הפרוטוקול מוצגת באיור 2.
1. ציפוי התאים
- הכינו כיסויים מצופים פולי-L-ליזין.
- הוסיפו כיסויים בקוטר 12 מ"מ לצינור חרוטי בנפח 50 מ"ל עם תמיסת פולי-L-ליזין, והניחו על נדנדה למשך 15 דקות.
- שאפו את הפתרון בתרבית רקמות. שטפו את הכיסויים על ידי הוספת מים סטריליים, והניחו את הצינור המכיל את הכיסויים בחזרה על הנדנדה למשך 5 דקות. חזור על שלב השטיפה שלוש פעמים.
- מורחים את הכיסויים המצופים על כלי סטרילי, ושואבים את שאריות המים. הניחו לכיסויים להתייבש במכסה המנוע של תרבית הרקמה למשך שעה או עד שלא יישארו טיפות מים. לאחר ייבוש, לאטום את הכלי עם parafilm, ומניחים ב 4 °C.
- מניחים מכסה אחד מצופה פולי-L-ליזין בכל באר של צלחת בת 24 בארות. השימוש בכיסויי פוליליזין הוא קריטי למניעת ניתוק התאים מהכיסויים בשלב שלפני השאיבה.
- טריפסיניזציה של תאי OVCAR3 ברגע שהם מגיעים למפגש של 70%-80%.
- כדי לטריפסין צלחת תרבית בקוטר 10 ס"מ שהיא 70%-80% מתמזגת, שאפו את המדיום מהצלחת ושטפו עם 5-7 מ"ל PBS.
- שואפים את PBS, מוסיפים 1 מ"ל של 0.25% טריפסין, ומניחים את המנה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 8-10 דקות, או עד שהתאים מתרוממים מתחתית הצלחת.
- לאסוף את התאים עם 5-10 מ"ל של בינוני, ולהוסיף צינור חרוט.
- ספור את התאים באופן ידני עם hemocytometer באמצעות הליכים סטנדרטיים.
- בצע דילול של 25,000 תאים / מ"ל, והוסף 1 מ"ל של התאים על כיסויי פולי-L-ליזין שהונחו בבארות של לוחות 24 בארות. עבור כל קו תאים אחר, קבע מספר כך שהתאים יהיו בערך 70%-80% נפגשים לאחר שלוש הכפלות אוכלוסייה.
- לגדל את התאים במדיום התרבית בתנאים סטנדרטיים.
2. תאים פועמים עם IdU
- כדי שהתאים יתפשטו כראוי על גבי הכיסויים, די בהכפלת אוכלוסייה אחת. לאחר הכפלת אוכלוסייה אחת, יש לפעום את התאים עם 10 מיקרומטר 5-יודו-2'-דאוקסיורידין (IdU) (ראו טבלת חומרים כיצד ליצור מחדש את IdU) עבור שתי הכפלות האוכלוסייה הבאות.
הערה: ניסינו אנלוגים שונים של תימידין, כולל bromodeoxyuridine (BrdU), 5-chloro-2′-deoxyuridine (CIdU) ו- IdU. בין שלושת האנלוגים, IdU נותן את יחס האות לרעש הטוב ביותר. תמונות השוואתיות של תאים שפועמים עם שלושת האנלוגים השונים מוצגות באיור 3. אנו ממליצים להשתמש בשתי בקרות שליליות: (i) דגימה ללא פעימות IdU, ו-(ii) בקרה ללא נוגדנים ראשוניים. אם יש צורך להעריך את היווצרות ssDNA עקב טיפול נתון, אנו ממליצים להוסיף את התרופה לאחר הסבב הראשון של הכפלת IdU. - לאחר פעימה עם IdU עבור שתי הכפלות אוכלוסייה, לקצור את התאים להדמיה.
- החליפו את המדיום ב-0.5% PBSTx קר כקרח (PBS + 0.5% Triton X-100) על קרח למשך 5 דקות. שלב טרום מיצוי זה מסייע לשחרר חלבונים ציטופלזמיים ושאינם קשורים לכרומטין, ומשאיר חלבונים הקשורים לכרומטין. קווי תאים מסוימים יכולים להתקלף בקלות במהלך טרום החילוץ. בתרחיש כזה ניתן להשתמש במאגר CSK 0.5% (10 mM PIPES (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 mM סוכרוז, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA ו- 0.5% Triton X-100).
3. קיבעון
- יש לשאוף PBSTx, ולדגור במשך 15 דקות עם 3% PFA (טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שלוש עד ארבע שטיפות עם PBS אחד. התאים הקבועים יכולים להישמר ב 4 ° C עד צעדים נוספים.
אזהרה: PFA רעיל מאוד ומסרטן. יש להימנע ממגע עם העור, העיניים והריריות. בצעו את כל השלבים עם PFA במכסה אדים, והשליכו את החומרים כראוי.
4. חדירה וחסימה
- לאחר הקיבוע, יש לחדור לתאים באמצעות 0.5% PBSTx על קרח למשך 5 דקות. השתמש בנפח מספיק כדי לכסות את כל הכיסוי (בדרך כלל בין 500 μL ל 1 מ"ל).
- שטפו את התאים שלוש עד ארבע פעמים עם 0.2% PBST (1X PBS + 0.2% Tween-20) בטמפרטורת החדר. מ"ל אחד של PBST מספיק לשטיפת כל באר. בצעו את השטיפות גב אל גב ללא דגירה.
- שאפו את ה-PBST, וחסמו את הדגימות באמצעות 5% BSA (טבלת חומרים) המיוצרת ב-1x PBS (חיץ חוסם) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
5. Immunostaining עם נוגדן IdU
- עבור immunostaining, להכין תא לח (מגבת נייר רטובה על Tupperware שטוח תחתית). מכסים את מכסה הצלחת בת 24 הבארות בפרפילם, מניחים בתא הלח ומניחים את הכיסויים על מכסה הצלחת.
- הכן את נוגדן העכבר הראשי נגד BrdU (טבלה של חומרים) על ידי דילול אותו 1:200 במאגר החוסם משלב 4.2.הנוגדן נגד BrdU הוכח בעבר לזהות IdU.
- הוסף 60 μL של דילול נוגדנים IdU בחלק העליון של הכיסויים. יש לדגור על הכיסויים למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C.
- לחילופין, יש להשתמש בתמיסת נוגדנים פחותה אם הופכים את הכיסויים על טיפה (20-25 מיקרוליטר) של דילול נוגדנים בקנ"מ 1:200 המודבק על פרפילם. זה גם מקטין את הסבירות של הפתרון להתייבש במהלך הדגירה.
- לאחר הדגירה של 1 שעות, שואפים את הנוגדן העיקרי. החזירו את הכיסויים לצלחת בת 24 בארות, ושטפו אותם ארבע פעמים עם 0.2% PBST.
- עבור הנוגדן המשני, השתמש באותו חדר לחות המתואר בשלב 5.1. לדלל נוגדן משני מצומד נגד עכבר (טבלה של חומרים) במאגר החוסם (1:200). יש להוסיף 60 μL של נוגדן משני לכיסויים, ולדגור בטמפרטורת החדר בחושך למשך שעה אחת.נוגדן משני זה רגיש לאור.
- לשאוף את הנוגדן המשני. החזירו את הכיסויים לצלחת בת 24 הקידוחים, ושטפו ארבע פעמים עם 0.2% PBST.
- תייגו שקופיות במיקרוסקופ והרכיבו את הכיסויים על השקופיות עם אמצעי הרכבה DAPI (Table of Materials). אחסנו מגלשות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. הדגירה של 24 שעות מומלצת אם יש צורך לרפא או להתקשות את מדיום ההרכבה.
הערה: לאחר מכן ניתן לאחסן את השקופיות בטמפרטורה של 4°C לפני שהן מצולמות במיקרוסקופ פלואורסצנטי. תמונה מייצגת מוצגת באיור 4.
6. כימות אוטומטי של מוקדי IdU
הערה: כוחו של מבחן זה טמון ביכולת להפוך את הניתוח לאוטומטי לכימות מהיר ויעיל. אנו מציגים כאן צינור ניתוח אוטומטי שניתן להשתמש בו כדי לכמת מוקדי IdU בשדה תמונה נתון. חשוב שכל התמונות בניסוי נתון יצולמו עם אותן הגדרות חשיפה; אחרת, הכימות לא יהיה אמין. ייתכן גם שיהיה חשוב לכלול בקרה לא מוכתמת כבקרה שלילית, לפחות בפעם הראשונה שהניסוי הזה מנוהל (איור 5). הפרוטוקול להלן ספציפי עבור NIS General Analysis Software, אך ניתן ליישם את אותם עקרונות גם עם תוכנות מסחריות אחרות.
- בכרטיסיה תצוגה , עבור אל פקדי ניתוח | סייר ניתוחים. פעולה זו פותחת חלון צדדי חדש בשם Analysis Explorer. לחץ על צור חדש | ניתוח כללי 3. פעולה זו פותחת את התוכנה ליצירת תרשימי זרימה של Analysis Explorer.
- עברו אל הכרטיסייה ' מקורות ' וגררו את הפקודה 'ערוצים ' מהתפריט השמאלי לאזור העבודה. שני הערוצים עבור מוקדי DAPI ו- IdU יופיעו באופן אוטומטי כתיבות בינאריות (מוצגות באיור 5 כתיבות עם קווי מתאר אדומים).
- עבור אל הכרטיסייה Preprocessing וגרור את הפקודה Local Contrast מהתפריט השמאלי לאזור העבודה. חבר את הניגודיות המקומית לערוץ המוקדים של IdU. בכרטיסיה Segmentation , גרור את הפקודה Threshold (אחת לכל ערוץ).
- חבר כל ערוץ לפקודת סף . כדי לחסל גרעינים בגבול תמונה, עבור אל הכרטיסיה עיבוד בינארי , גרור את הפקודה נוגע בגבולות והתחבר לסף DAPI.
- מזג את הנתונים משני הערוצים באמצעות הפקודה צבירת צאצאים בכרטיסיה מדידה . הגדר את ערוץ DAPI כהורה (A) ואת ערוץ המוקדים כצאצא (B). בתפריט הנפתח בפקודה צבירת ילדים , בחר באפשרות בן נמצא בתוך ההורה. שלב זה מסייע לספור את מספר המוקדים (ילד) לכל גרעין (הורה).
- כדי לייצא את הנתונים בתבנית טבלאית, לחץ על הפקודה שינוי עמודות בכרטיסייה ניהול נתונים . בתפריט הנפתח מהפקודה שינוי עמודות , בחר DAPI-ID (פעולה זו מסייעת להקצות מספר ייחודי לכל גרעין בתמונה נתונה) וספירת IdU (פעולה זו מספקת את מספר מוקדי IdU בכל גרעין). כדי לייצא את הנתונים בתבנית CSV, השתמש בפקודה Table To CSV בכרטיסיה Reference . כעת ניתן לשמור את GA3 עם כותרת תיאורית.
- לצורך הניתוח, פתח תמונה בתוכנה.
- פתח את הכרטיסיה Analysis Explorer כפי שנעשה בשלב 6.1 ואתר את GA3 החדש שנוצר. לחץ פעמיים על קובץ GA3, אשר פותח חלון חדש בשם GA3 אשף שבו ניתן להגדיר את הסף עבור DAPI וערוצי IdU.
- השתמש במחוון בחלון כדי להגדיר את הסף המינימלי והמקסימלי עבור כל ערוץ, ומכאן, להגדיר את האות. ערך סף טוב הוא המקום שבו הגבולות עבור כל גרעין ומיקוד IdU מוגדרים בבירור. לאחר שתסתפק בערכי סף, שמור מספרים אלה לניתוח כל הקבצים בניסוי נתון.
- לחץ על כפתור הפעלה כדי לקבל את ספירת מוקדי IdU / לכל גרעין.
הערה: התוכנה יוצרת טבלה של מוקדים לכל גרעין, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם לכל מטרה גרפית (איור 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תמונות מייצגות וכימות של מוקדי IdU מהגרעינים שמקורם בתאים לא מטופלים ובתאים שטופלו בהידרוקסיוראה של 0.5 מילימטר במשך 24 שעות מוצגים באיור 4. שני הגרעינים מוכתמים וניתנים לזיהוי בערוץ DAPI. ניתוח תמונות אלה מורכב מכימות מספר המוקדים בכל גרעין. מספר המוקדים פרופורציונלי למידת לחץ השכפול.
איור 1: מנגנונים של יצירת ssDNA. סכמטי כדי להראות מנגנונים שונים שבאמצעותם ssDNA יכול להיווצר בתא. זה כולל (A) עיכוב של מכונות השכפול, (B) עיכוב של מכונות השעתוק, וכתוצאה מכך לולאות R, (C) כריתה של קצה DNA, (D) היווצרות של לולאות D, או (E) רווחים מצומדים לשכפול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סכמת תיוג IdU. התאים פועמים עם IdU עבור שתי הכפלות אוכלוסייה. אם יש צורך בטיפול תרופתי כלשהו, הוא צריך להינתן לאחר הכפלת האוכלוסייה הראשונה בנוכחות IDU. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השוואה של אות המוקד המתקבל לאחר פעימה עם IdU, BrdU או CldU. תמונות מייצגות של תאים פועמים עם שלושה אנלוגים שונים thymidine. DAPI, GFP (מייצג מוקדי IdU עם תווית Alexa-488) וערוצים ממוזגים מוצגים. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מוקדי IdU מוגברים בתאי OVCAR3 שנגרמו על-ידי עקה של שכפול . (A) תמונות נציג של גרעיני IdU וגרעינים מוכתמים ב-DAPI ו-(B) כימות התאים שטופלו בהידרוקסיוראה של 0.5 מילימטר במשך 24 שעות. **** p < 0.0001 (מבחן מאן-ויטני). סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: צנרת GA3 לניתוח אוטומטי מייצג. ניתוח אוטומטי GA3 יכול להתבצע על ידי יצירת צינור לסף הגרעינים המבוסס על DAPI (מוצג בכתום) ומוקדי IdU (מוצג בצהוב). צבירת שני ערכי סף אלה מאכלסת את מספר מוקדי IdU לכל גרעין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כפי שהוזכר בפרוטוקול, חשוב לכלול כמה בקרות ניסיוניות כדי להבטיח שהבדיקה עובדת. אלה כוללים דגימה ללא טיפול ב- IdU וכן דגימה ללא נוגדנים ראשוניים. שתי הבקרות השליליות אמורות להניב תאים המוכתמים על-ידי DAPI אך אינם מכילים אות IdU.
בהתבסס על תנאי הניסוי וקווי התאים שבהם נעשה שימוש, ייתכן שיהיה צורך בדילולי נוגדנים שונים כדי לקבל את האות הפלואורסצנטי הטוב ביותר. אות רב מדי עלול לגרום לחוסר יכולת לכמת מוקדים בודדים, בעוד שאות מועט מדי עשוי לגרום לכך שלא ניתן לזהות הבדלים ניסיוניים בין הדגימות. התאמת זמני טרום החילוץ והחדירה עשויה לעזור גם אם יש יותר מדי אות רקע, אשר יכול לנבוע תוכן נוקלאופלזמי שלא חולץ.
מכיוון שפרוטוקול זה דורש שילוב IdU על פני שתי הכפלות אוכלוסייה, חשוב לקחת בחשבון את זמן ההכפלה של כל קו תאים. כאשר משווים בין שני קווי תאים בעלי זמני הכפלה שונים, הכרחי להתאים את אורך פעימת ה- IdU לזמן ההכפלה של כל קו תא. עם זאת, זה יכול להציג רמה מסוימת של וריאציה. לפיכך, היישום של בדיקה זו הוא היעיל ביותר בעת השוואת שורות תאים עם זמני הכפלה דומים. אם זמני ההכפלה אינם ידועים, הדבר עשוי לדרוש אופטימיזציה ניסיונית מוקדמת.
בנוסף, בדיקה זו עשויה להמעיט בכמות ssDNA שנמצא בתא בכל זמן נתון. ssDNA ניתן לזיהוי כמוקדים רק כאשר הגדיל הנגדי מסומן עם IdU. לכן, אם הגדיל הנגדי ל- ssDNA לא תויג, הוא לא יזוהה. לדוגמה, אם לדנ"א ההורי שאינו מסומן יש נגעים שיוצרים רווחים, הנגעים האלה לא יזוהו (איור 2). עבור ניתוח רגיש יותר, גישה חלופית תהיה לחקור את התאים עבור חלבון שכפול A (RPA). RPA הוא חלבון קושר DNA המצפה באופן מועדף ssDNA כדי למנוע ממנו ליצור מבנים משניים ולהגן מפני פעילות נוקלאז23,24. במהלך נזק מצומד לשכפול, RPA עובר זרחן בסרין 33, ולכן pRPA S33 יכול לשמש כסמן ללחץ שכפול. בתנאים של נזק מוגזם, pRPA S33 עובר זרחן נוסף על S4/S8 על ידי DNA-PK25. לפיכך, על ידי חקירת צורות שונות של RPA הקשורות לכרומטין, ניתן להעריך תגובות שונות של עקה שכפול בתאים. שתי גישות משלימות אלה (מוקדי IdU וצביעת RPA) יכולות להתבצע במקביל כדי לאמת את רמות ssDNA באמצעות מתודולוגיות שונות.
בדיקה זו מספקת שיטה קלה למעקב, ניתנת לשחזור ויעילה לכימות ssDNA בסוג תא נתון. ניתן להתאים אותו כדי לאפשר יישום של טיפולים תרופתיים שונים, סוגי תאים שונים וכלי ניתוח מרובים. היא מקובלת על שיטות כימות אוטומטיות שונות, כולל תוכנת האנליזה של ש"ח. שלא כמו טכניקות אחרות לכימות ssDNA, כגון מבחן מבוסס COMET, בדיקת מוקדי IdU אפשרית יותר עבור יישומים בעלי תפוקה גבוהה.
בדיקה זו יכולה לשמש עבור מספר רב של יישומים. נוכחות מוגברת של ssDNA יכולה לשמש כסמן של לחץ שכפול ולחיזוי תגובות כימותרפיות בסוגי סרטן שחלות שונים. יתר על כן, הגברה של אונקוגנים הידועים כמשבשים את השכפול או את ויסות מחזור התא עלולה לגרום להצטברות נגעים המביאים לעלייה ב- ssDNA. בדיקה זו, אם כן, יכולה לשמש גם כדי לבחון את ההשפעה שיש להגברה של אונקוגנים על הצטברות ssDNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא.
Acknowledgments
PV נתמכת על ידי מענק Pedal the Cause של מרכז הסרטן ע"ש אלווין ג'יי סייטמן באמצעות הקרן לבית החולים היהודי בארנס, מענק מחקר פיילוט ממרכז מרשה ריבקין לחקר סרטן השחלות, מענק לחקר הסרטן מקרן Mary Kay Ash וקרן V. NR נתמך על ידי מענק T32 להכשרת תאים וביולוגיה מולקולרית של NIH לאוניברסיטת וושינגטון, סנט לואיס.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | NC0179595 | 10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C |
| 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) | Sigma Aldrich | I7125-5G | MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C |
| Anti-BrdU antibody | BD Biosciences | 347580 | Storage: Store in 4 °C |
| Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody | Thermo Scientific | A32766 | Light sensitive - keep in dark Storage: Store in 4 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G | Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C |
| Circular Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| NIS GA3 Software | Nikon | 77010604 | |
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma Aldrich | P4832-50ML | Storage: Store in 4 °C |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Thermo Scientific | P36962 | Storage: Store in 4 °C |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Genesee Scientific | 25-510 | Storage: Store in 4 °C |
| Water, sterile-filtered | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | Storage: Store in 4 °C |
References
- Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
- Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D'Andrea, A. D. Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamental vulnerability of ovarian cancer. Cancer Discovery. 5 (11), 1137-1154 (2015).
- Gee, M. E., Faraahi, Z., McCormick, A., Edmondson, R. J. DNA damage repair in ovarian cancer: Unlocking the heterogeneity. Journal of Ovarian Research. 11, 50 (2018).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nature communications. 8, 1093 (2017).
- Kroeger, P. T., Drapkin, R. Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).
- Patch, A. -M., et al. Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer. Nature. 521 (7553), 489-494 (2015).
- Alexandrov, L. B., et al. The repertoire of mutational signatures in human cancer. Nature. 578 (7793), 94-101 (2020).
- Byun, T. S., Pacek, M., Yee, M. -C., Walter, J. C., Cimprich, K. A. Functional uncoupling of MCM helicase and DNA polymerase activities activates the ATR-dependent checkpoint. Genes & Development. 19 (9), 1040-1052 (2005).
- Toledo, L. I., et al. ATR prohibits replication catastrophe by preventing global exhaustion of RPA. Cell. 155 (5), 1088-1103 (2013).
- Brickner, J. R., Garzon, J. L., Cimprich, K. A. Walking a tightrope: The complex balancing act of R-loops in genome stability. Molecular Cell. 82 (12), 2267-2297 (2022).
- Cejka, P., Symington, L. S. DNA end resection: Mechanism and control. Annual Review of Genetics. 55, 285-307 (2021).
- Kowalczykowski, S. C. An overview of the molecular mechanisms of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (11), 016410 (2015).
- Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A.
- Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: An essential regulator of genome integrity. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (8), 616-627 (2008).
- Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Xu, H., et al. CCNE1 copy number is a biomarker for response to combination WEE1-ATR inhibition in ovarian and endometrial cancer models. Cell Reports. Medicine. 2 (9), 100394 (2021).
- Konstantinopoulos, P. A., et al. A Replication stress biomarker is associated with response to gemcitabine versus combined gemcitabine and ATR inhibitor therapy in ovarian cancer. Nature Communications. 12, 5574 (2021).
- Buisson, R., Boisvert, J. L., Benes, C. H., Zou, L. Distinct but concerted roles of ATR, DNA-PK, and Chk1 in countering replication stress during S phase. Molecular Cell. 59 (6), 1011-1024 (2015).
- Belan, O., et al. POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells. Molecular Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).
- da Costa, A. A. B. A., et al. Targeting replication stress in cancer therapy. Nature Reviews. Drug Discovery. 22 (1), 38-58 (2023).
- Chen, R., Wold, M. S. Replication protein A: Single-stranded DNA's first responder: Dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair. BioEssays. 36 (12), 1156-1161 (2014).
- Bhat, K. P., Cortez, D. RPA and RAD51: Fork reversal, fork protection, and genome stability. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (6), 446-453 (2018).
- Maréchal, A., Zou, L. RPA-coated single-stranded DNA as a platform for post-translational modifications in the DNA damage response. Cell Research. 25 (1), 9-23 (2015).
