Summary
여기에서는 세포에서 단일 가닥 DNA의 수준을 정량화하는 면역형광 기반 방법을 설명합니다. 이 효율적이고 재현 가능한 방법은 여러 난소암에서 흔히 볼 수 있는 특징인 복제 스트레스를 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 이 분석은 자동화된 분석 파이프라인과 호환되어 효율성을 더욱 높입니다.
Abstract
복제 스트레스는 여러 난소암의 특징입니다. 복제 스트레스는 이중 가닥 절단, 전사-복제 충돌 또는 증폭된 종양 유전자를 포함한 여러 소스에서 나타날 수 있으며, 필연적으로 단일 가닥 DNA(ssDNA)의 생성을 초래합니다. 따라서 ssDNA를 정량화하면 다양한 세포 유형과 다양한 DNA 손상 조건 또는 치료에서 복제 스트레스 수준을 평가할 수 있습니다. 새로운 증거는 또한 ssDNA가 DNA 복구를 표적으로 하는 화학요법 약물에 대한 반응의 예측 인자일 수 있음을 시사합니다. 여기에서는 ssDNA를 정량화하기 위한 상세한 면역형광 기반 방법론을 설명합니다. 이 방법론은 티미딘 유사체로 게놈을 표지한 다음 비변성 조건에서 염색질에서 유사체의 항체 기반 검출을 포함합니다. ssDNA의 스트레치는 형광 현미경으로 초점으로 시각화할 수 있습니다. 병소의 수와 강도는 핵에 존재하는 ssDNA의 수준과 직접 관련이 있습니다. 또한 ssDNA 신호를 정량화하기 위한 자동화된 파이프라인에 대해서도 설명합니다. 이 방법은 빠르고 재현 가능합니다. 또한 이 방법론의 단순성으로 인해 약물 및 유전자 스크리닝과 같은 고처리량 응용 분야에 적합합니다.
Introduction
게놈 DNA는 다양한 내인성 및 외인성 출처의 여러 공격에 자주 노출된다1. 내인성 손상의 빈도는 난소암을 포함한 여러 암 유형에서 본질적으로 더 높은 활성산소종 또는 알데히드와 같은 대사 부산물의 수준과 직접적인 상관관계가 있다 2,3. DNA 손상을 효율적으로 해결하는 것이 필수적입니다. 그렇지 않으면 유전 독성 병변을 조장하여 결과적으로 돌연변이 유발을 일으킬 수 있습니다. 유전독성 병변을 복구하는 세포의 능력은 오류 없는 DNA 복구 경로의 기능과 DNA 손상에 대한 반응으로 세포 주기 진행의 효율적인 조절에 달려 있습니다. 특히, 많은 난소암은 p53에 기능적으로 비활성화 돌연변이를 가지고 있으며, 따라서 결함이 있는 G1/S 체크포인트를 가지고 있어 복구되지 않은 게놈 병변이 있음에도 불구하고 세포가 DNA 복제를 시작하도록 유도합니다 4,5. 난소암의 DNA 손상 정도는 고급 장액성 난소암(HGSOC)의 50% 이상이 BRCA1 및 BRCA2 매개 상동 재조합, 오류 없는 DNA 복구 경로에 결함이 있고 약 20%가 유전자 CCNE1에서 증폭되어 G1 세포를 S상6으로 조기에 밀어 넣는다는 관찰에 의해 더욱 복잡해집니다 . 높은 빈도의 내인성 DNA 손상, 결함 있는 체크포인트 및 오작동하는 복구 경로가 함께 난소암에서 게놈 병변의 축적을 기하급수적으로 향상시킵니다. 이러한 병변은 DNA 복제 및 전사와 같은 중요한 세포 과정의 진행에 장애가 될 수 있습니다. 아래에서 논의되는 바와 같이, 이러한 장애는 세포에서 단일 가닥 DNA(ssDNA)의 생성을 촉매합니다.
DNA의 이중 나선은 자발적인 정화 및 탈피리미딘, 시토신 데아미나제의 활성, 산화적 DNA 손상과 같은 여러 돌연변이 유발 과정으로부터 게놈을 보호하는 데 중요합니다 1,7. 대조적으로, ssDNA는 이러한 돌연변이 사건에 매우 취약합니다. 세포의 여러 과정으로 인해 ssDNA가 생성될 수 있습니다(그림 1). 여기에는 다음이 포함됩니다.
(i) DNA 복제 기계의 정지: 이것은 DNA 헬리카제와 중합효소의 분리로 이어져 ssDNA 8,9의 스트레칭을 남깁니다.
(ii) 전사 기계의 실속: RNA 중합효소의 지속적인 실속은 R-루프라고 하는 3가닥 하이브리드 DNA/RNA 구조의 생성으로 이어집니다. R-루프 형성은 변위되고 전사되지 않은 DNA를 단일 가닥10으로 노출시킵니다.
(iii) DNA 말단 절제술: 상동성 지향 복구의 개시는 상동 서열11에 대한 탐색을 촉매하기 위해 3' ssDNA의 생성을 필요로 한다.
(iv) D-루프: 상동성 재조합 동안 가닥 침범은 비주형 상보적 가닥의 변위를 초래하여 ssDNA12를 초래할 수 있습니다.
(v) 복제 결합 갭: DNA 복제 중에 지연 가닥 합성이 불연속적인 방식으로 발생하여 오카자키 조각이 먼저 생성된 다음 결찰됩니다. 오카자키 단편 처리의 지연 또는 결함도 ssDNA 형성을 초래할 수 있습니다. 마지막으로, 선행 가닥의 복제 포크가 실속 병변, DNA 중합효소 및 프리마제를 만나면 PRIMPOL은 합성 다운스트림을 리프라이밍하여13,14 뒤에 ssDNA 갭을 남길 수 있습니다.
분명히, 이러한 사건의 대부분은 DNA 복제 기계가 게놈 병변에 직면하거나 복제 결합 복구 중에 발생하며, 이는 DNA 손상이 높을수록 ssDNA 수치가 증가함을 시사합니다. 이러한 사건의 많은 부분이 복제와 관련되어 있기 때문에 ssDNA의 형성은 세포15,16에서 "복제 스트레스"의 마커로 간주됩니다.
여기에서는 세포에서 ssDNA를 안정적으로 정량화하는 데 사용할 수 있는 분석법을 설명합니다. 이 접근법의 단순성, 재현성 및 비용 이점으로 인해 세포의 복제 스트레스 반응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 신흥 연구는 ssDNA의 수준이 또한 PARP1/2 효소의 억제제, ATR, 및 Wee1 키나제 17,18,19,20,21과 같은 화학요법에 대한 반응의 예측인자일 수 있다는 것을 밝혀냈다. 이들 억제제는 여러 HGSOCs2의 치료 요법에서 추구되고 있다. 따라서, 이 분석은 또한 난소암 세포에서 화학요법 반응을 예측하는 유용한 도구가 될 수 있다.
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Protocol
참고: 난소암 세포주인 OVCAR3이 이 단계에서 사용되었지만 이 프로토콜은 비난소 공급원에서 파생된 세포주를 포함하여 여러 다른 세포주에 광범위하게 적용할 수 있습니다. 프로토콜의 개략도는 그림 2에 나와 있습니다.
1. 셀 도금
- 폴리-L-라이신 코팅 커버슬립을 만듭니다.
- 폴리-L-라이신 용액이 담긴 12mL 원뿔형 튜브에 오토클레이브 50mm 직경 커버슬립을 추가하고 로커에 15분 동안 놓습니다.
- 조직 배양 후드에서 용액을 흡인합니다. 멸균수를 추가하여 커버슬립을 세척하고 커버슬립이 들어 있는 튜브를 로커에 5분 동안 다시 놓습니다. 이 세척 단계를 세 번 반복하십시오.
- 코팅된 커버슬립을 멸균 접시에 펼치고 남아 있는 물을 흡인합니다. 커버슬립을 조직 배양 후드에서 1시간 동안 또는 물방울이 남지 않을 때까지 건조시킵니다. 건조되면 접시를 파라필름으로 밀봉하고 4°C에 둡니다.
- 하나의 폴리-L-라이신 코팅 커버슬립을 24웰 플레이트의 각 웰에 놓습니다. 폴리 라이신 커버슬립의 사용은 사전 추출 단계 동안 커버슬립에서 세포가 분리되는 것을 방지하는 데 중요합니다.
- OVCAR3 세포가 70%-80% 밀도에 도달하면 트립신화합니다.
- 70%-80% 합류성인 10cm 배양 접시를 트립신화하려면 플레이트에서 배지를 흡인하고 5-7mL의 PBS로 세척합니다.
- PBS를 흡인하고 0.25% 트립신 1mL를 첨가한 후 접시를 37°C 인큐베이터에 8-10분 동안 또는 세포가 플레이트 바닥에서 들어 올려질 때까지 놓습니다.
- 5-10 mL의 배지로 세포를 모으고 원추형 튜브에 첨가하십시오.
- 표준 절차를 사용하여 혈구계로 수동으로 세포를 계산합니다.
- 25,000 cells/mL로 희석하고 24웰 플레이트의 웰에 놓인 폴리-L-라이신 커버슬립에 세포 1mL를 추가합니다. 다른 세포주의 경우, 세 번의 집단 배가 후 세포가 약 70%-80% 합류하도록 숫자를 결정합니다.
- 표준 조건하의 배양 배지에서 세포를 성장시킨다.
2. IdU로 세포 펄스
- 세포가 커버 슬립에 제대로 퍼지기 위해서는 한 개체군을 두 배로 늘리면 충분합니다. 한 집단 배가 후, 두 개의 후속 집단 배가에 대해 10μM 5-요오도-2'-데옥시유리딘(IdU)(IdU를 재구성하는 방법에 대한 재료 표 참조)으로 세포를 펄스합니다.
참고: 우리는 브로모데옥시유리딘(BrdU), 5-클로로-2′-데옥시유리딘(CIdU) 및 IdU를 포함한 다양한 티미딘 유사체를 시도했습니다. 세 가지 아날로그 중에서 IdU는 최고의 신호 대 잡음비를 제공합니다. 세 가지 다른 유사체로 펄싱된 세포의 비교 이미지가 그림 3에 나와 있습니다. 두 가지 음성 대조군을 사용하는 것이 좋습니다: (i) IdU 펄스 샘플이 없고 (ii) 1차 항체 대조군이 없습니다. 주어진 치료로 인해 ssDNA의 형성을 평가해야 하는 경우 IdU 배가의 첫 번째 라운드 후에 약물을 추가하는 것이 좋습니다. - 두 개의 집단 배가를 위해 IdU로 펄싱한 후 이미징을 위해 세포를 수확합니다.
- 매체를 얼음 위에서 얼음처럼 차가운 0.5% PBSTx(PBS + 0.5% Triton X-100)로 5분 동안 교체합니다. 이 사전 추출 단계는 세포질 및 염색질 결합되지 않은 단백질을 방출하여 염색질 결합 단백질을 그대로 유지하는 데 도움이 됩니다. 특정 세포주는 사전 추출 중에 쉽게 벗겨질 수 있습니다. 이러한 시나리오에서 0.5% CSK 완충액(10mM PIPES(pH 6.8), 100mM NaCl, 300mM 수크로스, 3mMMgCl2, 1mM EGTA 및 0.5% 트리톤 X-100)을 사용할 수 있습니다.
3. 고정
- PBSTx를 흡인하고, 실온에서 3% PFA(Table of Materials)로 15분 동안 인큐베이션한 다음, 1x PBS로 3 내지 4회 세척한다. 고정된 셀은 추가 단계까지 4°C에서 유지될 수 있다.
주의: PFA는 독성이 강하고 발암성이 있습니다. 피부, 눈, 점막과의 접촉을 피하십시오. 흄 후드에서 PFA로 모든 단계를 수행하고 재료를 적절하게 폐기하십시오.
4. 투과화 및 차단
- 고정 후, 얼음 위에서 0.5% PBSTx를 사용하여 5분 동안 세포를 투과화시킨다. 전체 커버슬립을 덮을 수 있는 충분한 양을 사용합니다(일반적으로 500μL에서 1mL 사이).
- 실온에서 0.2% PBST(1X PBS + 0.2% Tween-20)로 세포를 3 내지 4회 세척한다. PBST 1mL는 각 웰을 세척하기에 충분합니다. 배양 없이 연속적으로 세척을 수행합니다.
- PBST를 흡인하고, 실온에서 30분 동안 1x PBS(blocking buffer)로 만든 5% BSA(Table of Materials)를 사용하여 시료를 차단한다.
5. IdU 항체를 이용한 면역염색
- 면역 염색을 위해 가습 챔버 (평평한 바닥 타파웨어에 젖은 종이 타월)를 준비하십시오. 24웰 플레이트의 뚜껑을 파라필름으로 덮고 가습실에 넣고 플레이트 뚜껑에 커버슬립을 놓습니다.
- 4.2 단계의 차단 완충액에 1:200으로 희석하여 항-BrdU 1차 마우스 항체(재료 표)를 준비합니다.항-BrdU 항체는 이전에 IdU를 검출하는 것으로 나타났습니다.
- 커버슬립 상단에 IdU 항체 희석액 60μL를 추가합니다. 커버슬립을 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 또는 커버슬립을 파라필름에 피펫으로 피펫팅한 1:200 항체 희석액 한 방울(20-25μL)로 뒤집는 경우 항체 용액을 덜 사용하십시오. 이것은 또한 배양 중에 용액이 건조 될 가능성을 감소시킵니다.
- 1시간 배양 후, 1차 항체를 흡인한다. 커버슬립을 다시 24웰 플레이트로 되돌리고 0.2% PBST로 4회 세척합니다.
- 2차 항체의 경우, 단계 5.1에 기술된 것과 동일한 가습 챔버를 사용한다. 항-마우스 접합 2차 항체(Table of Materials)를 블로킹 완충액(1:200)에 희석한다. coverslips에 이차 항체의 60 μL를 추가하고, 1 h.This 이차 항체를 위해 어둠에 있는 실내 온도에 인큐베이션합니다 빛에 과민합니다.
- 2차 항체를 흡인합니다. 커버슬립을 다시 24웰 플레이트로 되돌리고 0.2% PBST로 4회 세척합니다.
- 현미경 슬라이드에 라벨을 붙이고 DAPI 장착 매체(재료 표)를 사용하여 슬라이드에 커버슬립을 장착합니다. 슬라이드를 실온의 어두운 곳에서 24시간 동안 보관하십시오. 장착 매체를 경화 또는 경화해야 하는 경우 24시간 배양하는 것이 좋습니다.
참고: 그런 다음 형광 현미경으로 이미지화하기 전에 슬라이드를 4°C에 보관할 수 있습니다. 대표 이미지는 그림 4에 나와 있습니다.
6. IdU 병소의 자동 정량화
참고: 이 분석의 힘은 빠르고 효율적인 정량화를 위해 분석을 자동화하는 능력에 있습니다. 여기에서는 주어진 이미지 필드에서 IdU 초점을 정량화하는 데 사용할 수 있는 자동화된 분석 파이프라인을 제시합니다. 주어진 실험 내의 모든 이미지를 동일한 노출 설정으로 촬영하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 정량화를 신뢰할 수 없습니다. 염색되지 않은 대조군을 음성 대조군으로 포함하는 것도 가치가 있을 수 있으며, 적어도 이 실험이 처음으로 실행될 때에는 가치가 있을 수 있습니다(그림 5). 아래 프로토콜은 NIS 일반 분석 소프트웨어에만 해당되지만 다른 상용 소프트웨어에도 동일한 원칙을 적용할 수 있습니다.
- 보기( View ) 탭에서 분석 제어(Analysis Controls) | 분석 탐색기. 그러면 해석 결과 탐색기라는 새 측면 창이 열립니다. Create New(새로 만들기) | 일반 분석 3. 그러면 해석 결과 순서도 작성 소프트웨어가 열립니다.
- 소스 탭으로 이동하여 왼쪽 메뉴에서 채널 명령을 작업 영역으로 끕니다. DAPI 및 IdU 초점에 대한 두 채널은 자동으로 이진 상자로 팝업됩니다(그림 5에서 빨간색 윤곽선이 있는 상자로 표시됨).
- Preprocessing 탭으로 이동하여 왼쪽 메뉴에서 Local Contrast 명령을 작업 영역으로 끕니다. 로컬 대비를 IdU 초점 채널과 연결합니다. 세그멘테이션 탭에서 임계값 명령(각 채널에 하나씩)을 끕니다.
- 각 채널을 임계값 명령에 연결합니다. 이미지 테두리에 있는 핵을 제거하려면 이진 처리 탭으로 이동하여 접는 테두 리 명령을 끌어 DAPI 임계값에 연결합니다.
- 측정 탭의 Aggregate Children 명령을 사용하여 두 채널의 데이터를 병합합니다. DAPI 채널을 상위(A)로 정의하고 초점 채널을 하위(B)로 정의합니다. Aggregate Children 명령의 드롭다운 메뉴에서 child is inside the parent 옵션을 선택합니다. 이 단계는 핵 (부모) 당 초점 (자식)의 수를 계산하는 데 도움이됩니다.
- 데이터를 테이블 형식으로 내보내려면 데이터 관리 탭에서 열 수정 명령을 클릭합니다. Modify Columns 명령의 드롭다운 메뉴에서 DAPI-ID(지정된 이미지 내의 각 핵에 고유 번호를 할당하는 데 도움이 됨) 및 IdU 수(각 핵의 IdU 초점 수 제공)를 선택합니다. 데이터를 CSV 형식으로 내보내려면 참조 탭에서 CSV로 표 명령을 사용합니다. 이제 GA3를 설명이 포함된 제목으로 저장할 수 있습니다.
- 분석을 위해 소프트웨어에서 이미지를 엽니다.
- 6.1단계에서와 같이 분석 탐색기 탭을 열고 새로 만든 GA3을 찾습니다. GA3 파일을 두 번 클릭하면 DAPI 및 IdU 채널에 대한 임계값을 설정할 수 있는 GA3 마법사 라는 새 창이 열립니다.
- 창의 슬라이더를 사용하여 각 채널에 대한 최소 및 최대 임계값을 설정하고 신호를 정의합니다. 좋은 임계값은 각 핵 및 IdU 초점의 경계가 명확하게 정의되는 위치입니다. 임계값이 충족되면 지정된 실험의 모든 파일을 분석하기 위해 이 숫자를 유지합니다.
- 실행 버튼을 클릭하여 IdU 초점/핵당 개수를 얻습니다.
참고: 이 소프트웨어는 핵당 초점 표를 생성하며, 이후 모든 그래프 작성 목적으로 사용할 수 있습니다(그림 5).
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Representative Results
24시간 동안 0.5 mM 하이드록시우레아로 처리된 미처리 세포 및 세포로부터 유래된 핵으로부터의 IdU 초점의 대표 이미지 및 정량화가 도 4에 제시되어 있다. 두 핵 모두 염색되어 DAPI 채널에서 식별 가능합니다. 이 이미지의 분석은 각 핵의 초점 수를 정량화하는 것으로 구성됩니다. 초점의 수는 복제 스트레스의 정도에 비례합니다.
그림 1: ssDNA 생성 메커니즘. 세포에서 ssDNA가 생성될 수 있는 다양한 메커니즘을 보여주는 개략도. 여기에는 (A) 복제 기계의 스톨, (B) 전사 머신의 스톨링, R-루프, (C) DNA 말단 절제술, (D) D-루프 형성 또는 (E) 복제 결합 갭이 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: IdU 라벨링 회로도. 세포는 두 개의 집단 배가를 위해 IdU로 펄스됩니다. 약물 치료가 필요한 경우 IdU가 있는 상태에서 첫 번째 인구가 두 배로 증가한 후에 투여해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: IdU, BrdU 또는 CldU로 펄싱한 후 얻은 초점 신호 비교. 3개의 상이한 티미딘 유사체로 펄스된 세포의 대표 이미지. DAPI, GFP(Alexa-488 표지 IdU 초점을 나타냄) 및 병합된 채널이 표시됩니다. 스케일 바: 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 복제 스트레스로 인한 OVCAR3 세포에서 IdU 병소 증가 . (A) 대표적인 IdU 및 DAPI-염색된 핵 이미지 및 (B) 24시간 동안 0.5 mM 하이드록시우레아로 처리된 세포의 정량화. **** p < 0.0001 (Mann-Whitney test). 스케일 바: 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 대표적인 자동 분석 GA3 파이프라인. GA3 자동 분석은 DAPI(주황색으로 표시) 및 IdU 초점(노란색으로 표시)을 기반으로 핵을 임계값으로 설정하는 파이프라인을 생성하여 수행할 수 있습니다. 이 두 임계값을 집계하면 핵당 IdU 초점의 수가 채워집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
프로토콜에서 언급했듯이 분석이 작동하는지 확인하기 위해 몇 가지 실험 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다. 여기에는 IdU 처리되지 않은 샘플과 1차 항체 처리되지 않은 샘플이 포함됩니다. 두 음성 대조군 모두 DAPI에 의해 염색되었지만 IdU 신호를 포함하지 않는 세포를 생성해야 합니다.
사용된 실험 조건 및 세포주에 따라 최상의 형광 신호를 얻기 위해 다양한 항체 희석이 필요할 수 있습니다. 신호가 너무 많으면 개별 초점을 정량화할 수 없는 반면, 신호가 너무 적으면 샘플 간의 실험적 차이를 식별할 수 없습니다. 추출 전 및 투과화 시간을 조정하면 추출되지 않은 핵질 내용물에서 발생할 수 있는 배경 신호가 너무 많은 경우에도 도움이 될 수 있습니다.
이 프로토콜은 두 개의 개체군 배가에 걸쳐 IdU 통합이 필요하기 때문에 각 세포주의 배가 시간을 고려하는 것이 중요합니다. 배가 시간이 다른 두 세포주를 비교할 때 각 세포주의 배가 시간에 맞춰 IdU 펄스의 길이를 조정하는 것이 필수적입니다. 그러나 이로 인해 어느 정도의 변형이 발생할 수 있습니다. 따라서, 이 분석법의 적용은 유사한 배가 시간을 갖는 세포주를 비교할 때 가장 효과적이다. 배가 시간을 알 수 없는 경우 사전 실험 최적화가 필요할 수 있습니다.
또한, 이 분석은 주어진 시간에 세포에 존재하는 ssDNA의 양을 과소평가할 수 있습니다. ssDNA는 반대쪽 가닥이 IdU로 표지된 경우에만 병소로 식별할 수 있습니다. 따라서 ssDNA와 반대되는 가닥이 표지되지 않은 경우 검출되지 않습니다. 예를 들어, 표지되지 않은 부모의 DNA에 틈을 일으키는 병변이 있는 경우 해당 병변은 감지되지 않습니다(그림 2). 보다 민감한 분석을 위해 대체 접근법은 복제 단백질 A(RPA)에 대해 세포를 조사하는 것입니다. RPA는 ssDNA가 2차 구조를 형성하는 것을 방지하고 뉴클레아제 활성으로부터 보호하기 위해 우선적으로 코팅하는 DNA 결합 단백질입니다23,24. 복제 결합 손상 동안, RPA는 세린 33에서 인산화되고, 따라서 pRPA S33은 복제 스트레스에 대한 마커로서 사용될 수 있다. 과도한 손상 조건에서 pRPA S33은 DNA-PK25에 의해 S4/S8에서 추가로 인산화됩니다. 따라서 염색질에 결합된 다양한 형태의 RPA를 조사하여 세포의 다양한 복제 스트레스 반응을 평가할 수 있습니다. 이 두 가지 상호보완적인 접근법(IdU foci 및 RPA 염색)은 별개의 방법론을 사용하여 ssDNA 수준을 검증하기 위해 병렬로 수행할 수 있습니다.
이 분석은 주어진 세포 유형에서 ssDNA를 정량화하기 위해 따라하기 쉽고 재현성이 높으며 효율적인 방법을 제공합니다. 다양한 약물 치료, 다양한 세포 유형 및 여러 분석 도구를 적용할 수 있도록 조정할 수 있습니다. NIS 분석 소프트웨어를 포함한 다양한 자동 정량 분석법이 가능합니다. COMET 기반 분석과 같이 ssDNA를 정량화하는 다른 기법과 달리 IdU foci 분석은 고처리량 응용 분야에 더 적합합니다.
이 분석은 다양한 응용 분야에 사용할 수 있습니다. ssDNA의 증가된 존재는 복제 스트레스의 마커로 사용되며 다양한 난소암에서 화학요법 반응을 예측하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 복제 또는 세포주기 조절을 방해하는 것으로 알려진 종양 유전자의 증폭은 병변의 축적을 유발하여 ssDNA를 증가시킬 수 있습니다. 따라서 이 분석은 종양유전자의 증폭이 ssDNA의 축적에 미치는 영향을 조사하는 데에도 사용될 수 있습니다.
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Disclosures
없음.
Acknowledgments
PV는 The Foundation for Barnes-Jewish Hospital을 통한 Alvin J. Siteman Cancer Center의 Inaugural Pedal the Cause Grant, Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research의 파일럿 연구 보조금, Mary Kay Ash Foundation 및 V-Foundation의 암 연구 보조금의 지원을 받습니다. NR은 세인트루이스 워싱턴 대학교에 대한 NIH 세포 및 분자 생물학 교육 T32 보조금의 지원을 받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | NC0179595 | 10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C |
| 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) | Sigma Aldrich | I7125-5G | MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C |
| Anti-BrdU antibody | BD Biosciences | 347580 | Storage: Store in 4 °C |
| Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody | Thermo Scientific | A32766 | Light sensitive - keep in dark Storage: Store in 4 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G | Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C |
| Circular Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| NIS GA3 Software | Nikon | 77010604 | |
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma Aldrich | P4832-50ML | Storage: Store in 4 °C |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Thermo Scientific | P36962 | Storage: Store in 4 °C |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Genesee Scientific | 25-510 | Storage: Store in 4 °C |
| Water, sterile-filtered | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | Storage: Store in 4 °C |
References
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