Summary
Her beskriver vi en immunfluorescensbasert metode for å kvantifisere nivåene av enkeltstrenget DNA i celler. Denne effektive og reproduserbare metoden kan brukes til å undersøke replikasjonsstress, et vanlig trekk ved flere eggstokkreft. I tillegg er denne analysen kompatibel med en automatisert analysepipeline, noe som øker effektiviteten ytterligere.
Abstract
Replikasjonsstress er et kjennetegn på flere eggstokkreft. Replikasjonsstress kan dukke opp fra flere kilder, inkludert dobbeltstrengbrudd, transkripsjon-replikasjonskonflikter eller forsterkede onkogener, noe som uunngåelig resulterer i generering av enkeltstrenget DNA (ssDNA). Kvantifisering av ssDNA gir derfor en mulighet til å vurdere nivået av replikasjonsstress i forskjellige celletyper og under forskjellige DNA-skadelige forhold eller behandlinger. Nye bevis tyder også på at ssDNA kan være en prediktor for respons på kjemoterapeutiske legemidler som retter seg mot DNA-reparasjon. Her beskriver vi en detaljert immunfluorescensbasert metodikk for å kvantifisere ssDNA. Denne metoden innebærer merking av genomet med en tymidinanalog, etterfulgt av antistoffbasert deteksjon av analogen ved kromatin under ikke-denaturerende forhold. Strekninger av ssDNA kan visualiseres som foci under et fluorescensmikroskop. Antallet og intensiteten av foci er direkte relatert til nivået av ssDNA tilstede i kjernen. Vi beskriver også en automatisert pipeline for å kvantifisere ssDNA-signalet. Metoden er rask og reproduserbar. Videre gjør enkelheten i denne metoden den mottagelig for applikasjoner med høy gjennomstrømning som narkotika og genetiske skjermer.
Introduction
Genomisk DNA blir ofte utsatt for flere angrep fra ulike endogene og eksogene kilder1. Frekvensen av endogen skade korrelerer direkte med nivåene av metabolske biprodukter, som reaktive oksygenarter eller aldehyder, som er iboende høyere i flere krefttyper, inkludert eggstokkreft 2,3. Det er viktig at DNA-skade løses effektivt; Ellers kan det fremme genotoksiske lesjoner og følgelig mutagenese. Cellens evne til å reparere genotoksiske lesjoner er avhengig av funksjonaliteten til feilfrie DNA-reparasjonsveier og effektiv regulering av cellesyklusprogresjon som respons på DNA-skade. Spesielt har mange eggstokkreft funksjonelt inaktiverende mutasjoner i p53 og har dermed et defekt G1 / S-kontrollpunkt, noe som fører til at cellene starter DNA-replikasjon til tross for tilstedeværelsen av ureparerte genomiske lesjoner 4,5. Graden av DNA-skade i eggstokkreft forsterkes ytterligere av observasjonen at mer enn 50% av høyverdig serøs ovariekarsinom (HGSOC) har defekter i BRCA1- og BRCA2-mediert homolog rekombinasjon, den feilfrie DNA-reparasjonsveien, og rundt 20% har amplifisering i genet CCNE1, som for tidlig skyver G1-celler inn i S-fase6 . Sammen øker den høye frekvensen av endogen DNA-skade, defekte sjekkpunkter og feilfungerende reparasjonsveier eksponentielt akkumuleringen av genomiske lesjoner i eggstokkreft. Disse lesjonene kan tjene som hindringer for utviklingen av kritiske cellulære prosesser som DNA-replikasjon og transkripsjon. Som diskutert nedenfor, katalyserer slike hindringer genereringen av enkeltstrenget DNA (ssDNA) i celler.
Den doble helixen av DNA er kritisk for å beskytte genomet fra flere mutagene prosesser, for eksempel spontan depurinering og depyrimidinering, aktiviteten til cytosindeaminaser og oksidativ DNA-skade 1,7. I motsetning til dette er ssDNA svært sårbart for disse mutasjonshendelsene. Flere prosesser i celler kan resultere i generering av ssDNA (figur 1). Disse inkluderer følgende:
(i) Stopping av DNA-replikasjonsmaskineriet: Dette fører til en frakobling av DNA-helikasen og polymerasen, og etterlater strekninger av ssDNA 8,9.
(ii) Stopping av transkripsjonsmaskineriet: Vedvarende stalling av RNA-polymerase fører til generering av trestrengede hybrid DNA / RNA-strukturer kalt R-sløyfer. R-sløyfeformasjon eksponerer det forskjøvede, ikke-transkriberte DNA som en enkelt streng10.
(iii) DNA-endereseksjon: Initiering av homologirettet reparasjon krever generering av et 3' ssDNA for å katalysere søket etter en homolog sekvens11.
(iv) D-sløyfe: Strandinvasjon under homolog rekombinasjon kan resultere i forskyvning av den ikke-malkomplementære strengen, noe som resulterer i ssDNA12.
(v) Replikasjonskoblede hull: Under DNA-replikasjon skjer forsinket strengsyntese på en diskontinuerlig måte, hvorved Okazaki-fragmenter først genereres og deretter ligeres. En forsinkelse eller defekt i behandlingen av Okazaki-fragmentene kan også resultere i ssDNA-dannelse. Til slutt, hvis replikasjonsgaffelen på en ledende streng møter en stalling lesjon, DNA-polymerase og primase, kan PRIMPOL reprime syntesen nedstrøms, og etterlate et ssDNA-gap bak13,14.
Det er åpenbart at de fleste av disse hendelsene enten skjer når DNA-replikasjonsmaskineriet står overfor genomiske lesjoner eller under replikasjonskoblet reparasjon, noe som tyder på at høyere DNA-skade fører til økte nivåer av ssDNA. Siden mange av disse hendelsene er replikasjonsassosierte, betraktes dannelsen av ssDNA som markøren for "replikasjonsstress" i cellene15,16.
Her beskriver vi en analyse som kan brukes til å kvantifisere ssDNA i celler på en pålitelig måte. Enkelheten, reproduserbarheten og kostnadsfordelene ved denne tilnærmingen gjør den egnet til å brukes til å vurdere replikasjonsstressresponsen i celler. Nye studier har vist at nivået av ssDNA også kan være en prediktor for respons på kjemoterapi, for eksempel hemmere av PARP1/2-enzymer, ATR og Wee1-kinase 17,18,19,20,21. Disse hemmerne forfølges i behandlingsregimet til flere HGSOCs22. Derfor kan denne analysen også være et nyttig verktøy for å forutsi kjemoterapeutiske responser i eggstokkreftceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Eggstokkreftcellelinjen, OVCAR3, ble brukt i disse trinnene, men denne protokollen er i stor grad anvendelig for flere andre cellelinjer, inkludert de som er avledet fra ikke-eggstokkkilder. Et skjema over protokollen er vist i figur 2.
1. Plettering av cellene
- Lag poly-L-lysinbelagte deksler.
- Legg autoklaverte deksler på 12 mm diameter til et 50 ml konisk rør med poly-L-lysinløsning, og sett på en vippe i 15 minutter.
- Aspirer løsningen i en vevskulturhette. Vask dekslene ved å tilsette sterilt vann, og legg røret som inneholder dekslene tilbake på vippen i 5 min. Gjenta dette vasketrinnet tre ganger.
- Spred de belagte dekslene på en steril tallerken, og aspirer eventuelt gjenværende vann. La lokkene tørke i vevskulturhetten i 1 time eller til det ikke er vanndråper igjen. Når det er tørt, forsegl fatet med parafilm og sett ved 4 °C.
- Plasser en poly-L-lysinbelagt dekselslip i hver brønn på en 24-brønnsplate. Bruken av polylysindeksel er kritisk for å forhindre løsrivelse av cellene fra dekselene under pre-ekstraksjonstrinnet.
- Trypsinize OVCAR3 celler når de når 70% -80% sammenløp.
- For å trypsinisere en 10 cm dyrken tallerken som er 70% -80% sammenflytende, aspirer mediet fra platen, og vask med 5-7 ml PBS.
- Aspirer PBS, tilsett 1 ml 0,25% trypsin, og legg fatet i en 37 ° C inkubator i 8-10 minutter, eller til cellene løfter seg fra bunnen av platen.
- Samle cellene med 5-10 ml medium, og legg til et konisk rør.
- Telle cellene manuelt med et hemocytometer ved hjelp av standardprosedyrer.
- Lag en fortynning på 25.000 celler / ml, og tilsett 1 ml av cellene på poly-L-lysindeksel plassert i brønnene på 24-brønnplater. For en hvilken som helst annen cellelinje, bestem et tall slik at cellene er omtrent 70% -80% sammenflytende etter tre populasjonsdoblinger.
- Voks cellene i kulturmediet under standardbetingelser.
2. Pulserende celler med IdU
- For at cellene skal spre seg ordentlig på dekslene, er en populasjonsdobling nok. Etter en populasjonsdobling pulserer cellene med 10 μM 5-jod-2'-deoksyuridin (IdU) (se materialtabell om hvordan IdU rekonstitueres) for de to påfølgende populasjonsdoblingene.
MERK: Vi har prøvd forskjellige tymidinanaloger, inkludert bromodeoksyuridin (BrdU), 5-klor-2'-deoksyuridin (CIdU) og IdU. Blant de tre analogene gir IdU det beste signal-støy-forholdet. Sammenlignende bilder av celler pulserende med de tre forskjellige analogene er vist i figur 3. Vi anbefaler bruk av to negative kontroller: (i) en ingen IdU pulserende prøve, og (ii) en ingen primær antistoffkontroll. Dersom dannelsen av ssDNA må vurderes på grunn av en gitt behandling, anbefaler vi å tilsette medikamentet etter første runde med IdU-dobling. - Etter å ha pulsert med IdU i to populasjonsdoblinger, høst cellene for avbildning.
- Bytt ut mediet med iskald 0,5% PBSTx (PBS + 0,5% Triton X-100) på is i 5 min. Dette preekstraksjonstrinnet bidrar til å frigjøre cytoplasmatiske og ikke-kromatinbundne proteiner, slik at kromatinbundne proteiner forblir intakte. Visse cellelinjer kan lett skrelle av under pre-ekstraksjon. I et slikt scenario kan man bruke 0,5% CSK buffer (10 mM RØR (pH 6,8), 100 mM NaCl, 300 mM sukrose, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA og 0,5% Triton X-100).
3. Fiksering
- Aspirer PBSTx, og rug i 15 minutter med 3% PFA (Table of Materials) ved romtemperatur, etterfulgt av tre til fire vasker med 1x PBS. De faste cellene kan holdes ved 4 °C inntil ytterligere trinn.
FORSIKTIG: PFA er svært giftig og kreftfremkallende. Unngå kontakt med hud, øyne og slimhinner. Utfør alle trinnene med PFA i en avtrekkshette, og kast materialene på riktig måte.
4. Permeabilisering og blokkering
- Etter fiksering, permeabiliser cellene med 0,5% PBSTx på is i 5 minutter. Bruk nok volum til å dekke hele dekselet (vanligvis mellom 500 μL og 1 ml).
- Vask cellene tre til fire ganger med 0,2% PBST (1X PBS + 0,2% mellom-20) ved romtemperatur. En ml PBST er nok til å vaske hver brønn. Utfør vaskene rygg mot rygg uten inkubasjoner.
- Aspirer PBST, og blokker prøvene ved hjelp av 5% BSA (materialfortegnelse) laget i 1x PBS (blokkeringsbuffer) i 30 minutter ved romtemperatur.
5. Immunfarging med IdU-antistoffet
- For immunfarging, lag et fuktet kammer (vått papirhåndkle på en flatbunnet Tupperware). Dekk lokket på 24-brønnplaten med parafilm, plasser i det fuktede kammeret og legg ned dekslene på platelokket.
- Klargjør anti-BrdU primært museantistoff (materialfortegnelse) ved å fortynne det 1:200 i blokkeringsbufferen fra trinn 4.2.Anti-BrdU-antistoffet har tidligere vist seg å påvise IdU.
- Tilsett 60 μL IdU antistofffortynning på toppen av dekslene. Inkuber dekslene i 1 time ved 37 °C.
- Alternativt kan du bruke mindre antistoffløsning hvis dekslene vippes på en dråpe (20-25 μL) på 1:200 antistofffortynning pipettert på parafilm. Dette reduserer også sannsynligheten for at løsningen tørker ut under inkubasjonen.
- Etter 1 h inkubasjon, aspirer det primære antistoffet. Sett dekslene tilbake på en 24-brønns plate, og vask dem fire ganger med 0,2 % PBST.
- For det sekundære antistoffet, bruk det samme fuktede kammeret som beskrevet i trinn 5.1. Fortynnet anti-mus konjugert sekundært antistoff (Table of Materials) i blokkeringsbufferen (1:200). Tilsett 60 μL sekundært antistoff mot dekslene, og inkuber ved romtemperatur i mørket i 1 time.Dette sekundære antistoffet er lysfølsomt.
- Aspirer det sekundære antistoffet. Sett dekslene tilbake på 24-brønnsplaten, og vask fire ganger med 0,2 % PBST.
- Merk lysbilder med mikroskop, og monter dekslene på lysbildene med DAPI-monteringsmedium (materialfortegnelse). Oppbevar lysbilder i mørket ved romtemperatur i 24 timer. 24-timers inkubasjonen anbefales hvis monteringsmediet må herdes eller herdes.
MERK: Lysbildene kan deretter lagres i 4 ° C før de blir avbildet på et fluorescensmikroskop. Et representativt bilde er vist i figur 4.
6. Automatisert kvantifisering av IdU-foci
MERK: Kraften i denne analysen ligger i evnen til å automatisere analysen for rask og effektiv kvantifisering. Vi presenterer her en automatisert analysepipeline som kan brukes til å kvantifisere IdU-foci i et gitt bildefelt. Det er viktig at alle bildene i et gitt eksperiment tas med de samme eksponeringsinnstillingene. Ellers vil kvantifiseringen ikke være pålitelig. Det kan også være verdifullt å inkludere en ikke-farget kontroll som en negativ kontroll, i hvert fall for første gang dette eksperimentet kjøres (figur 5). Protokollen nedenfor er spesifikk for NIS General Analysis Software, men de samme prinsippene kan også brukes med annen kommersiell programvare.
- I Vis-fanen går du til Analysekontroller | Analyse Explorer. Dette åpner et nytt sidevindu kalt Analysis Explorer. Klikk på Opprett ny | Generell analyse 3. Dette åpner programvaren for oppretting av flytskjema i Analysis Explorer.
- Gå til kategorien Kilder , og dra kommandoen Kanaler fra menyen til venstre til arbeidsområdet. De to kanalene for DAPI og IdU foci vil automatisk dukke opp som binære bokser (vist i figur 5 som bokser med røde konturer).
- Gå til kategorien Forhåndsbehandling , og dra kommandoen Lokal kontrast fra menyen til venstre til arbeidsområdet. Koble den lokale kontrasten med IdU-focikanalen. Fra kategorien Segmentering drar du kommandoen Terskelverdi (én for hver kanal).
- Koble hver kanal til en terskelkommando . Hvis du vil eliminere kjerner på kantlinjen til et bilde, går du til kategorien Binær behandling , drar kommandoen Berøring av grenser og kobler til DAPI-terskelen.
- Slå sammen dataene fra de to kanalene ved hjelp av kommandoen Aggregerte barn i kategorien Måling . Definer DAPI-kanalen som Overordnet (A) og fokuskanalen som Underordnet (B). I rullegardinmenyen i kommandoen Aggregerte barn velger du alternativet barnet er inne i foreldrene. Dette trinnet bidrar til å telle antall foci (barn) per kjerne (foreldre).
- For å eksportere dataene i tabellformat, klikk på kommandoen Endre kolonner i kategorien Databehandling . I rullegardinmenyen fra kommandoen Endre kolonner velger du DAPI-ID (dette bidrar til å tilordne et unikt tall til hver kjerne i et gitt bilde) og IdU-telling (dette gir antall IdU-foci i hver kjerne). Hvis du vil eksportere dataene i et CSV-format, bruker du kommandoen Tabell til CSV i kategorien Referanse . GA3 kan nå lagres med en beskrivende tittel.
- For analysen, åpne et bilde i programvaren.
- Åpne kategorien Analysis Explorer som ble gjort i trinn 6.1, og finn den nyopprettede GA3. Dobbeltklikk på GA3-filen, som åpner et nytt vindu kalt GA3 Wizard hvor man kan sette terskelen for DAPI og IdU-kanalene.
- Bruk glidebryteren i vinduet til å angi minimums- og maksimumsterskelen for hver kanal, og definer dermed signalet. En god terskelverdi er der grensene for hver kjerne og IdU-fokus er klart definert. Når du er fornøyd med terskelverdier, beholder du disse tallene for å analysere alle filene i et gitt eksperiment.
- Klikk på Kjør-knappen for å få antall IdU-foci/per kjerne.
MERK: Programvaren genererer en tabell med foci per kjerne, som deretter kan brukes til alle grafiske formål (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative bilder og kvantifisering av IdU-foci fra kjernene avledet fra ubehandlede celler og celler behandlet med 0,5 mM hydroksyurea i 24 timer er vist i figur 4. Begge kjernene er farget og identifiserbare i DAPI-kanalen. Analysen av disse bildene består i å kvantifisere antall foci i hver kjerne. Antall foci er proporsjonal med graden av replikasjonsspenning.
Figur 1: Mekanismer for ssDNA-generering. Skjematisk for å vise forskjellige mekanismer som ssDNA kan genereres i cellen. Dette inkluderer (A) stans av replikasjonsmaskineriet, (B) stans av transkripsjonsmaskineriet, noe som resulterer i R-sløyfer, (C) DNA-endereseksjon, (D) dannelse av D-sløyfer, eller (E) replikasjonskoblede hull. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk merking av IdU. Celler pulseres med IdU for to populasjonsdoblinger. Hvis noen medikamentell behandling er nødvendig, bør den administreres etter den første populasjonen dobling i nærvær av IdU. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sammenligning av foci-signalet oppnådd etter pulserende med IdU, BrdU eller CldU. Representative bilder av celler pulserende med tre forskjellige tymidinanaloger. DAPI, GFP (som representerer Alexa-488-merket IdU-foci) og sammenslåtte kanaler vises. Skala bar: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Økt IdU-foci i OVCAR3-celler forårsaket av replikasjonsstress . (A) Representative IdU- og DAPI-fargede kjernebilder og (B) kvantifisering av cellene behandlet med 0,5 mM hydroksyurea i 24 timer. **** p < 0,0001 (Mann-Whitney-test). Skala bar: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representativ automatisert analyse GA3-pipeline. GA3 automatisert analyse kan oppnås ved å generere en rørledning for å terskelere kjernene basert på DAPI (vist i oransje) og IdU-foci (vist i gult). Aggregering av disse to tersklene fyller antall IdU-foci per kjerne. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som nevnt i protokollen, er det verdifullt å inkludere noen eksperimentelle kontroller for å sikre at analysen fungerer. Disse inkluderer en ingen IdU-behandlet prøve, så vel som en primær antistoffbehandlet prøve. Begge negative kontrollene skal gi celler som er farget av DAPI, men inneholder ikke noe IdU-signal.
Basert på eksperimentelle forhold og cellelinjer som brukes, kan det være nødvendig med forskjellige antistofffortynninger for å oppnå det beste fluorescerende signalet. For mye signal kan føre til manglende evne til å kvantifisere individuelle foci, mens for lite signal kan bety at eksperimentelle forskjeller mellom prøvene ikke kan identifiseres. Justering av pre-ekstraksjon og permeabiliseringstider kan også hjelpe hvis det er for mye bakgrunnssignal, som kan oppstå fra ikke-ekstrahert nukleoplasmatisk innhold.
Siden denne protokollen krever IdU-inkorporering over to populasjonsdoblinger, er det viktig å ta hensyn til hver cellelinjes doblingstid. Når man sammenligner to cellelinjer som har forskjellige doblingstider, er det viktig å justere lengden på IdU-pulserende til hver cellelinjes doblingstid. Dette kan imidlertid introdusere en viss grad av variasjon. Dermed er anvendelsen av denne analysen mest effektiv når man sammenligner cellelinjer med lignende doblingstider. Hvis doblingstidene ikke er kjent, kan dette kreve forutgående eksperimentell optimalisering.
I tillegg kan denne analysen undervurdere mengden ssDNA som er tilstede i cellen til enhver tid. ssDNA er bare identifiserbart som foci når den motsatte strengen er merket med IdU. Dermed, hvis strengen motsatt av ssDNA ikke er merket, vil den ikke bli oppdaget. For eksempel, hvis foreldrenes ikke-merkede DNA har lesjoner som gir opphav til hull, vil disse lesjonene ikke bli oppdaget (figur 2). For en mer sensitiv analyse vil en alternativ tilnærming være å undersøke cellene for replikasjonsprotein A (RPA). RPA er et DNA-bindende protein som fortrinnsvis belegger ssDNA for å forhindre at det danner sekundære strukturer og beskytter mot nukleaseaktivitet23,24. Under replikasjonskoblet skade fosforyleres RPA ved serin 33, og pRPA S33 kan derfor brukes som markør for replikasjonsspenning. Under forhold med overdreven skade fosforyleres pRPA S33 ytterligere på S4/S8 av DNA-PK25. Ved å undersøke ulike former for RPA bundet til kromatinet, kan man derfor vurdere ulike replikasjonsstressresponser i celler. Disse to komplementære tilnærmingene (IdU-foci og RPA-farging) kan utføres parallelt for å validere nivåene av ssDNA ved hjelp av forskjellige metoder.
Denne analysen gir en lett-å-følge, svært reproduserbar og effektiv metode for å kvantifisere ssDNA i en gitt celletype. Det kan justeres for å tillate anvendelse av ulike medikamentelle behandlinger, ulike celletyper og flere analyseverktøy. Det er mottagelig for ulike automatiserte kvantifiseringsmetoder, inkludert NIS-analyseprogramvaren. I motsetning til andre teknikker for å kvantifisere ssDNA, for eksempel den COMET-baserte analysen, er IdU-foci-analysen mer gjennomførbar for applikasjoner med høy gjennomstrømning.
Denne analysen kan brukes til en rekke applikasjoner. En økt tilstedeværelse av ssDNA kan brukes som en markør for replikasjonsstress og for å forutsi kjemoterapiresponser i forskjellige eggstokkreftformer. Videre kan amplifisering av onkogener som er kjent for å forstyrre replikasjon eller cellesyklusregulering føre til akkumulering av lesjoner som resulterer i økt ssDNA. Denne analysen kan derfor også brukes til å undersøke effekten som amplifiseringen av onkogener har på akkumuleringen av ssDNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
PV støttes av Inaugural Pedal the Cause Grant av Alvin J. Siteman Cancer Center gjennom The Foundation for Barnes-Jewish Hospital, Pilot Research Grant fra Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research, Cancer Research Grant fra Mary Kay Ash Foundation og V-Foundation. NR støttes av NIH Cell and Molecular Biology training T32 stipend til Washington University, St. Louis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | NC0179595 | 10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C |
| 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) | Sigma Aldrich | I7125-5G | MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C |
| Anti-BrdU antibody | BD Biosciences | 347580 | Storage: Store in 4 °C |
| Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody | Thermo Scientific | A32766 | Light sensitive - keep in dark Storage: Store in 4 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G | Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C |
| Circular Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| NIS GA3 Software | Nikon | 77010604 | |
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma Aldrich | P4832-50ML | Storage: Store in 4 °C |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Thermo Scientific | P36962 | Storage: Store in 4 °C |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Genesee Scientific | 25-510 | Storage: Store in 4 °C |
| Water, sterile-filtered | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | Storage: Store in 4 °C |
References
- Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
- Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D'Andrea, A. D. Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamental vulnerability of ovarian cancer. Cancer Discovery. 5 (11), 1137-1154 (2015).
- Gee, M. E., Faraahi, Z., McCormick, A., Edmondson, R. J. DNA damage repair in ovarian cancer: Unlocking the heterogeneity. Journal of Ovarian Research. 11, 50 (2018).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nature communications. 8, 1093 (2017).
- Kroeger, P. T., Drapkin, R. Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).
- Patch, A. -M., et al. Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer. Nature. 521 (7553), 489-494 (2015).
- Alexandrov, L. B., et al. The repertoire of mutational signatures in human cancer. Nature. 578 (7793), 94-101 (2020).
- Byun, T. S., Pacek, M., Yee, M. -C., Walter, J. C., Cimprich, K. A. Functional uncoupling of MCM helicase and DNA polymerase activities activates the ATR-dependent checkpoint. Genes & Development. 19 (9), 1040-1052 (2005).
- Toledo, L. I., et al. ATR prohibits replication catastrophe by preventing global exhaustion of RPA. Cell. 155 (5), 1088-1103 (2013).
- Brickner, J. R., Garzon, J. L., Cimprich, K. A. Walking a tightrope: The complex balancing act of R-loops in genome stability. Molecular Cell. 82 (12), 2267-2297 (2022).
- Cejka, P., Symington, L. S. DNA end resection: Mechanism and control. Annual Review of Genetics. 55, 285-307 (2021).
- Kowalczykowski, S. C. An overview of the molecular mechanisms of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (11), 016410 (2015).
- Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A.
- Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: An essential regulator of genome integrity. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (8), 616-627 (2008).
- Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Xu, H., et al. CCNE1 copy number is a biomarker for response to combination WEE1-ATR inhibition in ovarian and endometrial cancer models. Cell Reports. Medicine. 2 (9), 100394 (2021).
- Konstantinopoulos, P. A., et al. A Replication stress biomarker is associated with response to gemcitabine versus combined gemcitabine and ATR inhibitor therapy in ovarian cancer. Nature Communications. 12, 5574 (2021).
- Buisson, R., Boisvert, J. L., Benes, C. H., Zou, L. Distinct but concerted roles of ATR, DNA-PK, and Chk1 in countering replication stress during S phase. Molecular Cell. 59 (6), 1011-1024 (2015).
- Belan, O., et al. POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells. Molecular Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).
- da Costa, A. A. B. A., et al. Targeting replication stress in cancer therapy. Nature Reviews. Drug Discovery. 22 (1), 38-58 (2023).
- Chen, R., Wold, M. S. Replication protein A: Single-stranded DNA's first responder: Dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair. BioEssays. 36 (12), 1156-1161 (2014).
- Bhat, K. P., Cortez, D. RPA and RAD51: Fork reversal, fork protection, and genome stability. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (6), 446-453 (2018).
- Maréchal, A., Zou, L. RPA-coated single-stranded DNA as a platform for post-translational modifications in the DNA damage response. Cell Research. 25 (1), 9-23 (2015).
