Summary
Aqui, descrevemos um método baseado em imunofluorescência para quantificar os níveis de DNA de fita simples nas células. Este método eficiente e reprodutível pode ser utilizado para examinar o estresse de replicação, uma característica comum em vários tipos de câncer de ovário. Além disso, este ensaio é compatível com um pipeline de análise automatizado, o que aumenta ainda mais a sua eficiência.
Abstract
O estresse de replicação é uma característica de vários cânceres de ovário. O estresse de replicação pode emergir de várias fontes, incluindo quebras de fita dupla, conflitos de transcrição-replicação ou oncogenes amplificados, resultando inevitavelmente na geração de DNA de fita simples (ssDNA). A quantificação do ssDNA, portanto, apresenta uma oportunidade para avaliar o nível de estresse de replicação em diferentes tipos de células e sob várias condições ou tratamentos prejudiciais ao DNA. Evidências emergentes também sugerem que o ssDNA pode ser um preditor de respostas a drogas quimioterápicas que visam o reparo do DNA. Aqui, descrevemos uma metodologia detalhada baseada em imunofluorescência para quantificar o ssDNA. Esta metodologia envolve a marcação do genoma com um análogo da timidina, seguido pela detecção baseada em anticorpos do análogo na cromatina em condições não desnaturantes. Alongamentos de ssDNA podem ser visualizados como focos sob um microscópio de fluorescência. O número e a intensidade dos focos co-relacionam-se diretamente com o nível de ssDNA presente no núcleo. Também descrevemos um pipeline automatizado para quantificar o sinal de ssDNA. O método é rápido e reprodutível. Além disso, a simplicidade dessa metodologia a torna passível de aplicações de alto rendimento, como telas genéticas e de medicamentos.
Introduction
O DNA genômico é frequentemente exposto a múltiplos ataques de várias fontes endógenas e exógenas1. A frequência de dano endógeno correlaciona-se diretamente com os níveis de subprodutos metabólicos, como espécies reativas de oxigênio ou aldeídos, que são intrinsecamente maiores em vários tipos de câncer, incluindo o câncer de ovário 2,3. É imperativo que os danos ao ADN sejam eficazmente resolvidos; caso contrário, pode promover lesões genotóxicas e, consequentemente, mutagênese. A capacidade das células de reparar lesões genotóxicas depende da funcionalidade das vias de reparo do DNA livres de erros e da regulação eficiente da progressão do ciclo celular em resposta a danos no DNA. Notavelmente, muitos cânceres de ovário apresentam mutações funcionalmente inativadoras na p53 e, portanto, têm um ponto de verificação G1/S defeituoso, levando as células a iniciar a replicação do DNA, apesar da presença de lesões genômicas não reparadas 4,5. O grau de dano ao DNA em cânceres de ovário é ainda agravado pela observação de que mais de 50% do carcinoma seroso de ovário de alto grau (HGSOC) tem defeitos na recombinação homóloga mediada por BRCA1 e BRCA2, a via de reparo de DNA livre de erros, e cerca de 20% têm amplificação no gene CCNE1, que prematuramente empurra as células G1 para a fase S6 . Juntas, a alta frequência de danos endógenos ao DNA, pontos de verificação defeituosos e vias de reparo com defeito aumentam exponencialmente o acúmulo de lesões genômicas em cânceres de ovário. Essas lesões podem servir como impedimentos para a progressão de processos celulares críticos, como replicação e transcrição do DNA. Como discutido abaixo, tais impedimentos catalisam a geração de DNA de fita simples (ssDNA) nas células.
A dupla hélice do DNA é fundamental para proteger o genoma de múltiplos processos mutagênicos, como a depurinação espontânea e a despirimidinação, a atividade das citosinas desaminadas e o dano oxidativo ao DNA 1,7. Em contraste, o ssDNA é altamente vulnerável a esses eventos mutacionais. Múltiplos processos nas células podem resultar na geração de ssDNA (Figura 1). Estes incluem o seguinte:
(i) Estagnação da máquina de replicação do DNA: Isso leva a um desacoplamento da helicase de DNA e da polimerase, deixando trechos de ssDNA 8,9.
(ii) Estagnação da maquinaria de transcrição: A estagnação persistente da RNA polimerase leva à geração de estruturas híbridas de DNA/RNA de três fitas chamadas R-loops. A formação da alça R expõe o DNA deslocado e não transcrito como uma única fita10.
(iii) Ressecção final de DNA: O início do reparo dirigido por homologia requer a geração de um ssDNA 3' para catalisar a busca de uma sequência homóloga11.
(iv) D-loop: A invasão da fita durante a recombinação homóloga pode resultar no deslocamento da fita complementar não molde, resultando em ssDNA12.
(v) Lacunas acopladas à replicação: Durante a replicação do DNA, a síntese de fitas atrasadas acontece de forma descontínua, em que os fragmentos de Okazaki são primeiro gerados e depois ligados. Um atraso ou defeito no processamento dos fragmentos de Okazaki também pode resultar na formação de ssDNA. Finalmente, se o garfo de replicação em uma fita principal encontrar uma lesão estagnada, DNA polimerase e primase, o PRIMPOL pode refazer a síntese a jusante, deixando uma lacuna de ssDNA atrásde 13,14.
Evidentemente, a maioria desses eventos acontece quando a maquinaria de replicação do DNA enfrenta lesões genômicas ou durante o reparo acoplado à replicação, sugerindo que maiores danos ao DNA levam ao aumento dos níveis de ssDNA. Como muitos desses eventos estão associados à replicação, a formação de ssDNA é considerada o marcador de "estresse de replicação" nas células15,16.
Aqui, descrevemos um ensaio que pode ser usado para quantificar de forma confiável o ssDNA nas células. A simplicidade, a reprodutibilidade e os benefícios de custo dessa abordagem a tornam passível de ser usada para avaliar a resposta de replicação e estresse nas células. Estudos emergentes têm revelado que o nível de ssDNA também pode ser um preditor de respostas à quimioterapia, como inibidores das enzimas PARP1/2, ATR e Wee1 quinase 17,18,19,20,21. Esses inibidores estão sendo perseguidos no regime de tratamento de vários HGSOCs22. Portanto, este ensaio também pode ser uma ferramenta útil para prever respostas quimioterápicas em células de câncer de ovário.
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Protocol
NOTA: A linhagem celular de câncer de ovário, OVCAR3, foi usada nessas etapas, mas este protocolo é amplamente aplicável a várias outras linhagens celulares, incluindo aquelas derivadas de fontes não ovarianas. Um esquema do protocolo é mostrado na Figura 2.
1. Planear as células
- Faça tampas revestidas com poli-L-lisina.
- Adicione as coberturas autoclavadas de 12 mm de diâmetro a um tubo cônico de 50 mL com solução de poli-L-lisina e coloque em um balancim por 15 min.
- Aspirar a solução em um capuz de cultura de tecidos. Lave as tampas adicionando água estéril e coloque o tubo que contém as tampas de volta no balancim por 5 minutos. Repita esta etapa de lavagem três vezes.
- Espalhe as tampas revestidas em um prato estéril e aspirar qualquer água restante. Deixe as tampas secarem no exaustor de cultura de tecidos por 1 h ou até que não restem gotículas de água. Uma vez seco, sele o prato com parafilme e coloque a 4 °C.
- Coloque uma tampa revestida de poli-L-lisina em cada poço de uma placa de 24 poços. O uso de coberturas de polilisina é fundamental para evitar o descolamento das células das coberturas durante a etapa de pré-extração.
- Tripsiniza as células OVCAR3 uma vez que atinjam 70%-80% de confluência.
- Para tripsinizar um prato de cultura de 10 cm que seja 70%-80% confluente, aspirar o meio da placa e lavar com 5-7 mL de PBS.
- Aspirar o PBS, adicionar 1 mL de tripsina a 0,25% e colocar o prato em uma incubadora de 37 °C por 8-10 min, ou até que as células se levantem do fundo da placa.
- Colete as células com 5-10 mL de meio e adicione a um tubo cônico.
- Conte as células manualmente com um hemocitômetro usando procedimentos padrão.
- Faça uma diluição de 25.000 células/mL e adicione 1 mL das células em coberturas de poli-L-lisina colocadas nos poços de placas de 24 poços. Para qualquer outra linhagem celular, determine um número tal que as células sejam cerca de 70% a 80% confluentes após três duplicações populacionais.
- Cultivar as células no meio de cultura em condições padrão.
2. Células pulsantes com IdU
- Para que as células se espalhem adequadamente nas coberturas, uma duplicação populacional é suficiente. Após a duplicação de uma população, pulsar as células com 10 μM 5-iodo-2'-desoxiuridina (IdU) (ver Tabela de Materiais sobre como reconstituir a IdU) para as duas duplicações populacionais subsequentes.
NOTA: Tentamos diferentes análogos da timidina, incluindo bromodeoxiuridina (BrdU), 5-cloro-2′-desoxiuridina (CIdU) e IdU. Entre os três análogos, o IdU fornece a melhor relação sinal-ruído. Imagens comparativas de células pulsadas com os três análogos diferentes são mostradas na Figura 3. Recomendamos o uso de dois controles negativos: (i) uma amostra sem pulsação de IdU e (ii) um controle sem anticorpos primários. Se a formação de ssDNA precisar ser avaliada devido a um determinado tratamento, recomendamos a adição do medicamento após a primeira rodada de duplicação da IdU. - Depois de pulsar com IdU para duas duplicações populacionais, colha as células para geração de imagens.
- Substitua o meio por PBSTx gelado a 0,5% (PBS + 0,5% Triton X-100) no gelo por 5 min. Esta etapa de pré-extração ajuda a liberar proteínas citoplasmáticas e não ligadas à cromatina, deixando intactas as proteínas ligadas à cromatina. Certas linhagens celulares podem facilmente descascar durante a pré-extração. Nesse cenário, pode-se usar tampão CSK de 0,5% (PIPES de 10 mM (pH 6,8), NaCl de 100 mM, sacarose de 300 mM, MgCl2 de 3 mM, EGTA de 1 mM e Triton X-100 de 0,5%).
3. Fixação
- Aspirar PBSTx e incubar por 15 min com PFA a 3% (Tabela de Materiais) à temperatura ambiente, seguido de três a quatro lavagens com PBS 1x. As células fixas podem ser mantidas a 4 °C até novos passos.
CUIDADO: O PFA é altamente tóxico e cancerígeno. Evite o contato com a pele, olhos e membranas mucosas. Execute todas as etapas com PFA em um exaustor e descarte os materiais corretamente.
4. Permeabilização e bloqueio
- Após a fixação, permeabilizar as células usando PBSTx a 0,5% sobre gelo por 5 min. Use volume suficiente para cobrir toda a tampa (normalmente entre 500 μL e 1 mL).
- Lave as células três a quatro vezes com PBST a 0,2% (1X PBS + 0,2% Tween-20) à temperatura ambiente. Um mL de PBST é suficiente para lavar cada poço. Realize as lavagens de costas para trás sem incubações.
- Aspirar o PBST e bloquear as amostras utilizando 5% de BSA (Table of Materials) confeccionado em 1x PBS (tampão de bloqueio) por 30 min à temperatura ambiente.
5. Imunocoloração com o anticorpo IdU
- Para imunocoloração, prepare uma câmara umidificada (papel toalha molhada em um Tupperware de fundo plano). Cubra a tampa da placa de 24 poços com parafilme, coloque na câmara umidificada e coloque as tampas na tampa da placa.
- Prepare o anticorpo primário anti-BrdU do rato (Tabela de Materiais) diluindo-o 1:200 no tampão de bloqueio da etapa 4.2.O anticorpo anti-BrdU demonstrou anteriormente detectar IdU.
- Adicionar 60 μL de diluição de anticorpos IdU na parte superior das coberturas. Incubar as folhas de cobertura durante 1 h a 37 °C.
- Alternativamente, use menos solução de anticorpos se as coberturas forem viradas em uma gota (20-25 μL) de diluição de anticorpos 1:200 pipetada em parafilme. Isso também diminui a probabilidade de a solução secar durante a incubação.
- Após a incubação de 1 h, aspirar o anticorpo primário. Devolva as tampas de volta a uma placa de 24 poços e lave-as quatro vezes com 0,2% de PBST.
- Para o anticorpo secundário, utilizar a mesma câmara humidificada descrita no passo 5.1. Anticorpo secundário conjugado anti-rato diluído (Tabela de Materiais) no tampão de bloqueio (1:200). Adicione 60 μL de anticorpo secundário às coberturas e incube à temperatura ambiente no escuro durante 1 h.Este anticorpo secundário é sensível à luz.
- Aspirar o anticorpo secundário. Devolva as tampas de volta à placa de 24 poços e lave quatro vezes com 0,2% de PBST.
- Rotule as lâminas do microscópio e monte as folhas de cobertura nas lâminas com o meio de montagem DAPI (Tabela de Materiais). Armazenar lâminas no escuro à temperatura ambiente por 24 h. A incubação de 24 horas é recomendada se o meio de montagem precisar ser curado ou endurecido.
NOTA: As lâminas podem então ser armazenadas a 4 °C antes de serem fotografadas num microscópio de fluorescência. Uma imagem representativa é mostrada na Figura 4.
6. Quantificação automatizada de focos de IdU
NOTA: O poder deste ensaio reside na capacidade de automatizar a análise para quantificação rápida e eficiente. Apresentamos aqui um pipeline de análise automatizado que pode ser usado para quantificar focos de IdU em um determinado campo de imagem. É importante que todas as imagens dentro de um determinado experimento sejam tiradas com as mesmas configurações de exposição; caso contrário, a quantificação não será confiável. Também pode ser valioso incluir um controle não corado como um controle negativo, pelo menos pela primeira vez que esse experimento é executado (Figura 5). O protocolo abaixo é específico para o NIS General Analysis Software, mas os mesmos princípios também podem ser aplicados com outros softwares comerciais.
- Na guia Exibir , vá para Controles de Análise | Gerenciador de Análises. Isso abre uma nova janela lateral chamada Analysis Explorer. Clique em Criar Novo | Análise Geral 3. Isso abre o software de criação de fluxograma Analysis Explorer.
- Vá para a guia Fontes e arraste o comando Canais do menu esquerdo para a área de trabalho. Os dois canais para os focos DAPI e IdU aparecerão automaticamente como caixas binárias (mostradas na Figura 5 como caixas com contornos vermelhos).
- Vá para a guia Pré-processamento e arraste o comando Contraste Local do menu esquerdo para a área de trabalho. Conecte o Contraste Local com o canal de focos de IdU. Na guia Segmentação , arraste o comando Limite (um para cada canal).
- Conecte cada canal a um comando Limite . Para eliminar quaisquer núcleos na borda de uma imagem, vá para a guia Processamento binário , arraste o comando Tocando bordas e conecte-se ao limite DAPI.
- Mescle os dados dos dois canais usando o comando Agregar Filhos na guia Medição . Defina o canal DAPI como Pai (A) e o canal de focos como Filho (B). No menu suspenso do comando Agregar Filhos , selecione a opção filho está dentro do pai. Esta etapa ajuda a contar o número de focos (filho) por núcleo (pai).
- Para exportar os dados em um formato tabular, clique no comando Modificar Colunas na guia Gerenciamento de Dados . No menu suspenso do comando Modificar colunas , selecione DAPI-ID (isso ajuda a atribuir um número exclusivo a cada núcleo dentro de uma determinada imagem) e Contagem de IdU (isso fornece o número de focos de IdU em cada núcleo). Para exportar os dados em um formato CSV, use o comando Tabela para CSV na guia Referência . O GA3 agora pode ser salvo com um título descritivo.
- Para a análise, abra uma imagem no software.
- Abra a guia Analysis Explorer como foi feito na etapa 6.1 e localize o GA3 recém-criado. Clique duas vezes no arquivo GA3, que abre uma nova janela chamada Assistente GA3 , onde se pode definir o limite para os canais DAPI e IdU.
- Use o controle deslizante na janela para definir o limite mínimo e máximo para cada canal e, portanto, definir o sinal. Um bom valor de limiar é onde os limites para cada núcleo e foco IdU são claramente definidos. Uma vez satisfeito com os valores limite, retenha esses números para analisar todos os arquivos em um determinado experimento.
- Clique no botão Executar para obter a contagem de focos de IdU/por núcleo.
NOTA: O software gera uma tabela de focos por núcleo, que pode ser usada posteriormente para qualquer finalidade gráfica (Figura 5).
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Representative Results
Imagens representativas e a quantificação de focos de IdU dos núcleos derivados das células não tratadas e células tratadas com hidroxiureia 0,5 mM por 24 h são mostradas na Figura 4. Ambos os núcleos são corados e identificáveis no canal DAPI. A análise dessas imagens consiste em quantificar o número de focos em cada núcleo. O número de focos é proporcional ao grau de estresse de replicação.
Figura 1: Mecanismos de geração de ssDNA. Esquema para mostrar diferentes mecanismos pelos quais o ssDNA pode ser gerado na célula. Isso inclui (A) paralisação da máquina de replicação, (B) paralisação da máquina de transcrição, resultando em loops R, (C) ressecção final de DNA, (D) a formação de loops D ou (E) lacunas acopladas à replicação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esquema de rotulagem de IdU. As células são pulsadas com IdU para duas duplicações populacionais. Se for necessário algum tratamento medicamentoso, ele deve ser administrado após a primeira duplicação da população na presença de IdU. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comparação do sinal de focos obtido após pulsação com IdU, BrdU ou CldU. Imagens representativas de células pulsadas com três análogos de timidina diferentes. O DAPI, GFP (representando os focos IdU rotulados como Alexa-488) e os canais mesclados são mostrados. Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Aumento dos focos de IdU em células OVCAR3 causado por estresse de replicação . (A) Imagens representativas de núcleos corados com IdU e DAPI e (B) quantificação das células tratadas com hidroxiureia 0,5 mM por 24 h. **** p < 0,0001 (teste de Mann-Whitney). Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise automatizada representativa do pipeline GA3. A análise automatizada GA3 pode ser realizada gerando um pipeline para limiar os núcleos com base em DAPI (mostrado em laranja) e focos IdU (mostrado em amarelo). A agregação desses dois limiares preenche o número de focos de IdU por núcleo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Como foi mencionado no protocolo, é valioso incluir alguns controles experimentais para garantir que o ensaio esteja funcionando. Estes incluem uma amostra sem tratamento com IdU, bem como uma amostra sem tratamento com anticorpos primários. Ambos os controles negativos devem produzir células que são coradas por DAPI, mas não contêm sinal de IdU.
Com base nas condições experimentais e linhagens celulares utilizadas, diferentes diluições de anticorpos podem ser necessárias para obter o melhor sinal fluorescente. Muito sinal pode resultar em uma incapacidade de quantificar focos individuais, enquanto muito pouco sinal pode significar que diferenças experimentais entre as amostras não podem ser identificadas. Ajustar os tempos de pré-extração e permeabilização também pode ajudar se houver muito sinal de fundo, que pode surgir de conteúdo nucleoplasmático não extraído.
Como esse protocolo requer a incorporação de IdU em duas duplicações populacionais, é importante levar em conta o tempo de duplicação de cada linhagem celular. Ao comparar duas linhagens celulares que têm tempos de duplicação diferentes, é imperativo ajustar o comprimento da pulsação IdU ao tempo de duplicação de cada linhagem celular. No entanto, isso pode introduzir algum nível de variação. Assim, a aplicação deste ensaio é mais eficaz quando se compara linhagens celulares com tempos de duplicação semelhantes. Se os tempos de duplicação não forem conhecidos, isso pode exigir otimização experimental prévia.
Além disso, este ensaio pode subestimar a quantidade de ssDNA que está presente na célula a qualquer momento. O ssDNA só é identificável como focos quando a fita oposta foi marcada com IdU. Assim, se a fita oposta ao ssDNA não tiver sido marcada, ela não será detectada. Por exemplo, se o DNA parental não marcado tiver lesões que dão origem a lacunas, essas lesões não serão detectadas (Figura 2). Para uma análise mais sensível, uma abordagem alternativa seria sondar as células para a proteína de replicação A (RPA). A RPA é uma proteína ligadora de DNA que revestia preferencialmente o ssDNA para evitar que ele forme estruturas secundárias e proteja da atividade da nuclease23,24. Durante o dano acoplado à replicação, o RPA é fosforilado na serina 33 e, portanto, o pRPA S33 pode ser usado como um marcador para a tensão de replicação. Sob condições de danos excessivos, o pRPA S33 é fosforilado em S4/S8 pelo DNA-PK25. Assim, sondando diferentes formas de RPA ligadas à cromatina, pode-se avaliar várias respostas de estresse de replicação nas células. Essas duas abordagens complementares (focos de IdU e coloração RPA) podem ser realizadas em paralelo para validar os níveis de ssDNA usando metodologias distintas.
Este ensaio fornece um método fácil de seguir, altamente reprodutível e eficiente para quantificar o ssDNA em um determinado tipo de célula. Ele pode ser ajustado para permitir a aplicação de diferentes tratamentos medicamentosos, vários tipos de células e várias ferramentas de análise. É passível de vários métodos automatizados de quantificação, incluindo o software de análise NIS. Ao contrário de outras técnicas para quantificar o ssDNA, como o ensaio baseado em COMET, o ensaio de focos IdU é mais viável para aplicações de alto rendimento.
Este ensaio pode ser usado para uma infinidade de aplicações. Um aumento da presença de ssDNA pode ser usado como um marcador de estresse de replicação e para prever respostas quimioterápicas em vários tipos de câncer de ovário. Além disso, a amplificação de oncogenes que são conhecidos por interromper a replicação ou a regulação do ciclo celular pode causar o acúmulo de lesões que resultam em aumento do ssDNA. Este ensaio, portanto, também poderia ser usado para examinar o efeito que a amplificação de oncogenes tem sobre o acúmulo de ssDNA.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
O PV é apoiado pela Bolsa Inaugural Pedal the Cause do Alvin J. Siteman Cancer Center através da Fundação para o Hospital Barnes-Judaico, Bolsa de Pesquisa Piloto do Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research, Cancer Research Grant da Mary Kay Ash Foundation e V-Foundation. A NR é apoiada pela bolsa T32 de treinamento em Biologia Molecular e Celular do NIH para a Universidade de Washington, St. Louis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | NC0179595 | 10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C |
| 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) | Sigma Aldrich | I7125-5G | MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C |
| Anti-BrdU antibody | BD Biosciences | 347580 | Storage: Store in 4 °C |
| Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody | Thermo Scientific | A32766 | Light sensitive - keep in dark Storage: Store in 4 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G | Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C |
| Circular Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| NIS GA3 Software | Nikon | 77010604 | |
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma Aldrich | P4832-50ML | Storage: Store in 4 °C |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Thermo Scientific | P36962 | Storage: Store in 4 °C |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Genesee Scientific | 25-510 | Storage: Store in 4 °C |
| Water, sterile-filtered | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | Storage: Store in 4 °C |
References
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