Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) est un plugin ImageJ open-source pour l’analyse 3D de l’imagerie calcique qui examine le mouvement sur l’axe z et identifie la valeur maximale de chaque pile z pour représenter l’intensité d’une cellule au point de temps correspondant. Il peut séparer les neurones qui se chevauchent dans la direction latérale (x / y) mais sur des plans z différents.
Abstract
La recherche en neurosciences a évolué pour utiliser des outils complexes d’imagerie et de calcul pour extraire des informations complètes à partir d’ensembles de données. L’imagerie calcique est une technique largement utilisée qui nécessite un logiciel sophistiqué pour obtenir des résultats fiables, mais de nombreux laboratoires ont du mal à adopter des méthodes de calcul lors de la mise à jour des protocoles pour répondre aux normes modernes. Des difficultés surviennent en raison d’un manque de connaissances en programmation et de paywalls pour les logiciels. De plus, les cellules d’intérêt affichent des mouvements dans toutes les directions pendant l’imagerie calcique. De nombreuses approches ont été développées pour corriger le mouvement dans la direction latérale (x/y).
Ce document décrit un flux de travail utilisant un nouveau plug-in ImageJ, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), pour examiner le mouvement sur l’axe z en imagerie calcique 3D. Ce logiciel identifie la valeur de fluorescence maximale de toutes les positions z dans lesquelles un neurone apparaît et l’utilise pour représenter l’intensité du neurone à la position t correspondante. Par conséquent, cet outil peut séparer les neurones qui se chevauchent dans la direction latérale (x / y) mais apparaissent sur des plans z distincts. En tant que plugin ImageJ, TACI est un outil de calcul convivial et open-source pour l’analyse d’imagerie calcique 3D. Nous avons validé ce flux de travail en utilisant des neurones thermosensibles aux larves de mouches qui affichaient des mouvements dans toutes les directions pendant la fluctuation de température et un ensemble de données d’imagerie calcique 3D acquises à partir du cerveau de la mouche.
Introduction
Le taux de calcium intracellulaire est un marqueur précis de l’excitabilité neuronale. L’imagerie calcique mesure les changements dans le calcium intracellulaire pour comprendre l’activité neuronale1. Les études en neurosciences ont de plus en plus utilisé cette méthode en raison du développement de techniques de mesure de la concentration intracellulaire de calcium, y compris des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECI), tels que GCaMP2,3, qui peuvent être exprimés de manière non invasive dans des ensembles spécifiques de neurones par des approches génétiques. La baisse des coûts des lasers et des composants de microscope a également augmenté l’utilisation de l’imagerie calcique4. Il est important de noter que l’imagerie calcique permet d’enregistrer et d’étudier simultanément des neurones uniques ainsi que de grandes populations de neurones chez des animaux en mouvement libre5.
Néanmoins, l’analyse des données d’imagerie calcique est difficile car (1) elle implique de suivre les changements de fluorescence des cellules individuelles au fil du temps, (2) le signal de fluorescence disparaît ou réapparaît par intermittence avec les réponses neuronales, et (3) les neurones peuvent se déplacer dans toutes les directions, en particulier dans et hors d’un plan focal ou apparaissant sur plusieurs plans4, 6. L’analyse manuelle prend beaucoup de temps et devient impraticable à mesure que la longueur des enregistrements et le nombre de neurones augmentent. Divers logiciels ont été développés pour accélérer le processus d’analyse de l’imagerie calcique. Auparavant, le logiciel était conçu dans un contexte expérimental limité, ce qui rendait difficile son adoption par d’autres laboratoires. Les efforts récents pour répondre aux normes modernes de partage de logiciels ont conduit au développement de plusieurs outils capables d’analyser de manière cohérente les données d’imagerie calcique dans différents groupes 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Cependant, la plupart de ces outils nécessitent des connaissances en programmation et / ou dépendent de logiciels commerciaux. Un manque de connaissances en programmation et de logiciels payants dissuade les chercheurs d’adopter ces méthodes. De plus, beaucoup de ces outils se concentrent sur la correction du mouvement x/y, bien que le mouvement sur l’axe z doive également être explicitement diagnostiqué et corrigé6. Il existe un besoin d’un outil informatique pour analyser l’imagerie calcique 3D qui se concentre sur les neurones présentant une dérive z et apparaissant sur plusieurs plans z. Idéalement, cet outil devrait utiliser un logiciel open source et ne pas nécessiter de connaissances en programmation pour permettre à d’autres laboratoires de l’adopter facilement.
Ici, nous avons développé un nouveau plugin ImageJ, TACI, pour analyser les données d’imagerie calcique 3D. Tout d’abord, le logiciel renomme, si nécessaire, et organise les données d’imagerie calcique 3D par positions z. Les cellules d’intérêt sont suivies dans chaque position z, et leurs intensités de fluorescence sont extraites par TrackMate ou d’autres outils de calcul. TACI est ensuite appliqué pour examiner le mouvement sur l’axe z. Il identifie la valeur maximale d’une pile z et l’utilise pour représenter l’intensité d’une cellule au point de temps correspondant. Ce flux de travail est adapté à l’analyse de l’imagerie calcique 3D avec un mouvement dans toutes les directions et / ou avec des neurones se chevauchant dans la direction latérale (x / y) mais apparaissant dans différentes positions z. Pour valider ce flux de travail, des ensembles de données d’imagerie calcique 3D provenant de neurones thermosensibles aux larves de mouches et de neurones champignons dans le cerveau ont été utilisés. Il est à noter que TACI est un plugin ImageJ open-source et ne nécessite aucune connaissance en programmation.
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Protocol
1. Imagerie calcique
- Préparation des larves de mouches
NOTE: Les mouches et les larves sont maintenues à 25 ° C sous un cycle lumière:obscurité de 12 h:12 h.- Anesthésiez les mouches avec du CO2. Trier 20 à 45 mâles et 20 à 45 femelles dans chaque flacon de mouches et leur donner au moins 24 h à 48 h pour se remettre de l’exposition au CO2 .
REMARQUE : L’exposition des mouches au CO2 devrait durer le moins longtemps possible. - Pour synchroniser l’âge des larves, tapotez les mouches dans de nouveaux flacons contenant des granules de levure et laissez-leur pondre 4 à 8 heures pour pondre des œufs. Retirez les mouches en les retournant dans de nouveaux flacons.
- Prélever les larves à 72 h en utilisant 10 mL de solution de saccharose à 20 % p/v.
- Anesthésiez les mouches avec du CO2. Trier 20 à 45 mâles et 20 à 45 femelles dans chaque flacon de mouches et leur donner au moins 24 h à 48 h pour se remettre de l’exposition au CO2 .
- Configuration du microscope et du contrôle de la température
- Effectuer l’imagerie sur un microscope confocal (voir le tableau des matériaux) et un étage piézoélectrique de l’axe z avec un insert de scène en utilisant les paramètres suivants: laser, argon; mode de balayage, cadre; taille de l’image, 512 x 512; vitesse, maximum; canaux/profondeur de bits, 1/8 bit; zoom, 1,5; pile z, tranche = 15, conserver = tranche; dispositifs de mise au point et stratégie, mise au point définie; mise au point, Accent mis sur.
- Fixez un module de refroidissement Peltier à un dissipateur thermique par le composé de transfert de chaleur pour construire un refroidisseur thermoélectrique. Le Peltier est alimenté par une alimentation 2 A.
- Fixez une microsonde thermocouple à un dispositif d’acquisition de données pour enregistrer la température.
- Imagerie calcique
- Rincer les larves 3x dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Pipeter 75 μL de 1x PBS sur le centre d’une lame de verre.
- Mettez une ou deux larves dans 1x PBS et placez la microsonde thermocouple près des larves.
REMARQUE: La distance entre les larves et la microsonde doit être de ~5 mm. Les larves peuvent se déplacer si la microsonde est positionnée trop près d’elles. Une grande distance pourrait entraîner des lectures de température inexactes. - Couvrir les larves et la microsonde thermocouple avec une lamelle de verre couvercle. Scellez le couvercle avec du vernis à ongles.
- Placez la lame sur la platine du microscope, trouvez la mise au point à l’aide d’un objectif 25x et placez le refroidisseur thermoélectrique sur la lame.
REMARQUE: Le Peltier est placé directement sur la lame où les larves doivent délivrer les stimuli de température. - Dans les logiciels confocaux, concentrez-vous sur les cellules fluorescentes d’intérêt. Ajustez la puissance du laser pour éviter la sursaturation. Définissez les positions de la première et de la dernière tranche dans le paramètre z-stack.
REMARQUE: Utilisez la puissance laser la plus faible possible avant d’enregistrer pour éviter le photoblanchiment. - Démarrez le balayage z-stack et l’enregistrement de la température en même temps.
- Contrôlez l’alimentation qui alimente le Peltier pour modifier la température de surface du Peltier. Allumez le bloc d’alimentation pour diminuer la température et éteignez-le pour augmenter la température.
- Arrêtez le balayage z-stack et l’enregistrement de la température.
2. Analyse des données d’imagerie calcique 3D
- Exportez les données d’imagerie calcique vers des fichiers TIFF et enregistrez-les dans un dossier portant le même nom que le nom de base des fichiers TIFF qu’ils contiennent.
Remarque : Le nom de fichier ne doit pas contenir de virgules.- Utilisez les paramètres suivants pour exporter les données d’imagerie calcique de ZEN (édition noire) : type de fichier, TIFF ; compression, LZW ; canaux, 2 ; Position Z, toutes; le temps, tous; phase, 1; région, pleine.
- Installation
- Téléchargez TACI-Calcium_Imaging.jar depuis Github (https://github.com/niflylab/TACI_CalciumImagingPlugin/releases).
- Installez le plugin dans FIJI en cliquant sur Plugins dans la barre de menus, puis en cliquant sur Installer dans le menu déroulant (Plugins | Installer). Ensuite, redémarrez FIJI.
REMARQUE: N’utilisez PAS de plugins | Installez le plugin. - Exécutez le plugin en cliquant sur Plugins , puis en choisissant TACI-Calcium Imaging (Plugins | TACI-Imagerie calcique).
- Utilisez la fonction RENAME pour convertir les noms de fichiers TIFF en la structure requise.
Remarque : L’outil utilise filename_h#t#z#c#.tif comme structure par défaut (h# et c# sont facultatifs ; # : entier positif). Si les noms de fichiers image ne figurent pas dans la structure par défaut, la fonction RENAME doit être exécutée.- Choisissez le dossier dans lequel les images TIFF doivent être renommées en cliquant sur Parcourir les dossiers.
- Renseignez les informations sur les paramètres. Cinq paramètres sont répertoriés, notamment Filename, Phase, Max T-Position, Max Z-Position et Channel. Chaque paramètre possède trois valeurs : Texte précédent, Valeur du paramètre et Ordre.
Remarque : Les informations sont sensibles à la casse. Si les noms de fichiers image contiennent une phrase avant un paramètre, renseignez l’expression en tant que texte précédent du paramètre correspondant. Si les noms de fichiers image contiennent une phrase après tous les paramètres, renseignez-la en tant que texte de publication.- Assurez-vous d’entrer Filename, Max T-Position et Max Z-Position et que les valeurs de paramètre pour Max T-Position et Max Z-Position incluent tous les chiffres.
- Attendez que le nom de fichier soit automatiquement rempli à l’aide du nom du dossier.
- Si les noms de fichiers TIFF n’incluent pas la phase et le canal, laissez la valeur de paramètre correspondante vide et choisissez Na dans l’ordre.
- Cliquez sur Renommer pour créer un dossier portant le même nom et le même _r. Notez que dans le dossier, les noms de fichiers TIFF ont été restructurés pour être compatibles avec la fonction ORGANIZE .
Remarque : _r a été ajouté aux noms de fichiers des images TIFF.
- Utilisez la fonction ORGANIZE pour enregistrer les images TIFF de la même position z dans un dossier.
Remarque : Le nom du dossier doit avoir le même nom que le nom de base des fichiers TIFF à l’intérieur et ne doit pas avoir de virgule.- Choisissez le dossier dans lequel les images TIFF doivent être organisées en cliquant sur Parcourir les dossiers.
- Si le fichier CSV de paramètre (param.csv) existe, attendez que les valeurs des paramètres soient remplies automatiquement.
Remarque : Le fichier param.csv a un format requis. Les paramètres, y compris le nom de fichier, la phase, position_t, position_z, le canal et is_gray, doivent être remplis à la ligne 1 de gauche à droite à partir de la colonne A. Les valeurs correspondantes pour chaque paramètre doivent être remplies à la ligne 2. - Si le fichier CSV de paramètre (param.csv) n’existe pas, renseignez manuellement les valeurs des paramètres. Assurez-vous que les valeurs de paramètre de Phase et Canal incluent des lettres, tandis que les valeurs de paramètre de Position T et Position Z doivent être les plus grands nombres des positions t et z. Si les noms des fichiers image n’incluent pas la phase ou le canal, entrez Na.
- Créez des images TIFF en niveaux de gris si nécessaire. Laissez la case Les images sont-elles grises ? décochée pour mettre les images en niveaux de gris.
- Cliquez sur Organiser pour créer un dossier portant le même nom et le même _gray_stacks et pour générer des dossiers portant le même nom et _# (#: z-positions) dans le dossier. Notez que les fichiers TIFF sont triés dans les dossiers correspondants par z-positions et qu’un fichier nommé param.csv est généré, dans lequel les paramètres et leurs valeurs peuvent être trouvés.
- Utilisez TrackMate dans FIJI pour extraire les intensités de fluorescence des cellules d’intérêt de chaque position z.
Remarque : Cette étape peut également être accomplie par d’autres logiciels d’imagerie.- Ouvrez les images TIFF dans un dossier z-position de FIJI.
- Exécutez TrackMate en cliquant sur Plugins | Suivi | TrackMate et ajustez les paramètres suivants si nécessaire.
- Utilisez des détecteurs DoG ou LoG.
- Modifiez le diamètre de l’objet blob, le seuil et le filtre médian. Ajustez le diamètre de l’objet blob pour qu’il soit similaire au diamètre des cellules. Si les cellules sont ovales, ajustez le diamètre de l’objet blob pour qu’il soit similaire à l’axe mineur.
REMARQUE : L’augmentation du seuil permet d’éviter que le bruit de fond ne soit capté sous forme de signaux sans affecter l’intensité du signal (Figure supplémentaire 1). Cependant, une augmentation du seuil peut manquer les signaux réels (figure supplémentaire 1). Si les signaux sont forts, utilisez le filtre médian pour diminuer le bruit poivre et sel. - Réglez les filtres pour supprimer certains, sinon tous, des signaux non pertinents. Les filtres X et Y sont des filtres spatiaux. Utilisez les filtres X et Y pour supprimer les signaux non pertinents qui sont éloignés des signaux réels.
REMARQUE: Lorsque des filtres sont définis sur une image, il est crucial de vérifier toutes les autres images pour s’assurer que les signaux réels ne sont pas supprimés. - Définissez la distance maximale de liaison, la distance maximale de fermeture d’espace et l’écart d’image maximal de fermeture d’espace. Définissez la distance maximale de liaison et la distance maximale de fermeture de l’espace sur 3x-5x le diamètre de l’objet blob, en particulier lorsque les échantillons se déplacent de manière significative au fil du temps, afin de réduire le nombre de pistes. Définissez l’écart maximal d’images de fermeture de l’espace sur le nombre d’images dans la pile.
- Exportez les intensités de fluorescence des régions d’intérêt (ROI) vers un fichier CSV. Si une ancienne version de TrackMate est utilisée, choisissez Exporter toutes les statistiques de spots dans la fenêtre Sélectionner une action . Si la version de TrackMate est 7.6.1 ou supérieure, choisissez les Spots dans la fenêtre Options d’affichage . Exportez ou enregistrez en tant que fichiers interactifs dans des fichiers CSV.
REMARQUE: Les deux fichiers sont interactifs avec la fenêtre d’image; la mise en surbrillance d’un ROI affiche le ROI correspondant dans la fenêtre d’image. Ces fichiers comprennent les intensités moyennes (MEAN_INTENSITY ou MEAN_INTENSITY_CH1) des cellules d’intérêt aux points temporels correspondants (POSITION_T). Les mêmes TRACK_IDs doivent représenter les mêmes retours sur investissement à différents moments. Cependant, cela n’est pas toujours vrai et peut devoir être corrigé manuellement, si nécessaire. Si TrackMate ne reconnaît pas les retours sur investissement à certains moments, ces points temporels ne sont pas affichés.
- Extrayez l’intensité de fluorescence de fond et créez le fichier Background_list.csv.
REMARQUE: Dans cette étude, l’intensité de fond pour chaque position z a été estimée en utilisant la valeur moyenne de trois à cinq blobs voisins de même taille qui ne contenaient pas de signaux de fluorescence et provenaient de points temporels différents.- Le fichier Background_list.csv a un format requis: chaque colonne contient les informations d’un neurone, à partir de Neuron 0. Renseignez les nombres de neurones, tels que Neurone 0, dans la ligne 1. Ensuite, fournissez l’intensité de fond pour chaque position z analysée - si cinq positions z sont analysées pour le neurone 0, remplissez cinq valeurs d’intensité de fond en dessous du neurone 0.
Remarque : Le fichier Background_list.csv est requis pour la fonction TACI EXTRACT . Si le fond est négligeable, le Background_list.csv avec l’intensité de fond nulle de chaque neurone doit être fourni.
- Le fichier Background_list.csv a un format requis: chaque colonne contient les informations d’un neurone, à partir de Neuron 0. Renseignez les nombres de neurones, tels que Neurone 0, dans la ligne 1. Ensuite, fournissez l’intensité de fond pour chaque position z analysée - si cinq positions z sont analysées pour le neurone 0, remplissez cinq valeurs d’intensité de fond en dessous du neurone 0.
- Utilisez la fonction EXTRACT pour identifier les intensités de fluorescence maximales à chaque position t et calculer ΔF/F0 comme indiqué dans l’équation (1).
(1)- Créez un dossier et nommez-le en utilisant le numéro de neurone, en commençant par Neuron 0. Enregistrez les fichiers CSV contenant les informations de fluorescence du neurone correspondant dans le dossier. Chaque fichier CSV contient les informations d’une position z, de sorte que le nombre de fichiers CSV est égal au nombre de positions z analysées. Nommez les fichiers CSV comme Mean_Intensity#.csv (# représente la position z) et chaque fichier CSV comprend au moins deux colonnes : POSITION_T et MEAN_INTENSITY ou MEAN_INTENSITY_CH1.
Remarque : Créez un dossier pour chaque cellule d’intérêt. - Enregistrez le fichier et les dossiers Background_list.csv créés à l’étape 2.7.1 dans un dossier. Choisissez ce dossier en cliquant sur Parcourir les fichiers.
REMARQUE: Le nombre de valeurs d’arrière-plan dans le fichier Background_list.csv doit correspondre au nombre de fichiers Mean_Intensity#.csv pour chaque neurone. - Le fichier d’arrière-plan est automatiquement rempli. Remplissez le plus grand nombre de positions t pour le nombre de positions t.
- Cliquez sur Extraire pour créer un dossier de résultats, y compris les fichiers CSV et les tracés pour chaque neurone. Les fichiers CSV contiennent des informations sur l’intensité de fluorescence maximale et ΔF/F0 à chaque position t. Les tracés sont des graphiques linéaires de ΔF/F0 sur t-positions.
NOTE: Dans cette étude, ΔF / F0 a été calculé à l’aide de l’équation (1). La première valeur de chaque position z a été utilisée comme F0. Si ce F0 n’est pas approprié20, le plugin fournit des fichiers comprenant des données brutes pour chaque neurone dans le dossier python_files.
- Créez un dossier et nommez-le en utilisant le numéro de neurone, en commençant par Neuron 0. Enregistrez les fichiers CSV contenant les informations de fluorescence du neurone correspondant dans le dossier. Chaque fichier CSV contient les informations d’une position z, de sorte que le nombre de fichiers CSV est égal au nombre de positions z analysées. Nommez les fichiers CSV comme Mean_Intensity#.csv (# représente la position z) et chaque fichier CSV comprend au moins deux colonnes : POSITION_T et MEAN_INTENSITY ou MEAN_INTENSITY_CH1.
- Utilisez la fonction MERGE pour faire la moyenne du ΔF/F 0 de chaque neurone, calculer le MEB et tracer la moyenne ΔF/F0 sur les positions t.
- Choisissez le dossier de résultats créé par la fonction EXTRACT en cliquant sur Parcourir les fichiers.
- Remplissez le nombre de positions T avec le plus grand nombre de positions t.
- Cliquez sur Fusionner pour créer un dossier merged_data, y compris un fichier merged_data.csv et un tracé Average_dF_F0.png. Le fichier CSV comprend les informations sur la moyenne et SEM ΔF/F0 à chaque position t. Le graphique est un graphique linéaire de la moyenne ΔF/F0 sur t-positions.
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Representative Results
Flux de travail d’analyse d’imagerie calcique 3D
Dans cette étude, nous avons développé un nouveau plugin ImageJ, TACI, et décrit un flux de travail pour suivre la dérive z et analyser l’imagerie calcique 3D qui identifie les réponses des cellules individuelles apparaissant dans plusieurs positions z (Figure 1). Cet outil a quatre fonctions : RENOMMER, ORGANISER, EXTRAIRE et FUSIONNER. Tout d’abord, si les noms d’image ne sont pas compatibles avec la fonction ORGANIZE, la fonction RENAME peut convertir les noms d’image à la structure requise. Ensuite, la fonction ORGANIZE répartit les niveaux de gris (si nécessaire) et organise les données TIFF d’imagerie calcique 3D par positions z. Les images de la même position z sont enregistrées dans un dossier. Ensuite, différents outils d’analyse d’imagerie peuvent être utilisés pour détecter et suivre les retours sur investissement et extraire leurs intensités de fluorescence au fil du temps pour chaque position z. Un plugin ImageJ, TrackMate, a été utilisé pour accomplir cette étape. TrackMate est un plugin open-source ImageJ pour le suivi des particules simples21. Il a été largement utilisé pour suivre les particules dans diverses études biologiques impliquant l’imagerie de cellules vivantes, y compris l’imagerie calcique 11,21,22,23. TrackMate, de manière automatisée, suit les cellules dans la direction latérale (x / y), détecte les ROI et extrait les signaux d’un ensemble de données d’imagerie en direct 4,12. Pour chaque cellule d’intérêt, la fonction EXTRACT trie les intensités de fluorescence de toutes les positions z par positions t, identifie les valeurs maximales de chaque position t, soustrait le fond et calcule et trace ΔF/F0. Enfin, la fonction MERGE calcule et trace la moyenne de ΔF/F0 de plusieurs cellules.
Réponses calciques des neurones froids des larves de mouches aux changements de température
Nous avons validé cette méthode en utilisant les changements de calcium en réponse aux fluctuations de température dans les neurones froids des larves de mouches. Un indicateur de calcium génétiquement codé, GCaMP6m 24, a été exprimé dans les neurones froids larvaires par Ir21a-Gal425. Lorsqu’ils étaient exposés à environ 27 °C, les neurones présentaient de faibles taux de calcium intracellulaire (Figure 2A et Figure 3). Lorsque la température a été abaissée à environ 10 °C et maintenue là, les niveaux de calcium intracellulaire ont rapidement augmenté et se sont maintenus (Figure 2B et Figure 3). Les niveaux de calcium ont rapidement chuté lorsque la température a augmenté (Figure 3).
Analyse d’un ensemble de données d’imagerie calcique 3D du cerveau d’une mouche
Nous avons également validé cette méthode à l’aide d’un ensemble de données d’imagerie calcique 3Dcerveau de mouche 11. Les mouches transgéniques imagées (VT50339-Gal4; UAS-GCaMP6f) exprimé GCaMP6f dans le corps du champignon dans le cerveau11. Les données de 45 positions z (espacées de 1,5 μm) ont été recueillies à 50 Hz pendant 225 s (250 points temporels), et la première moitié de l’ensemble de données (125 points temporels) a été analysée. Lorsque l’enregistrement a commencé, sept neurones avaient une fluorescence évidente, et quatre d’entre eux ont été analysés (Figure 4A). Les intensités de ces neurones ont diminué avec le temps (Figure 4B). Lorsque l’octanol a été appliqué (Figure 4C), plusieurs neurones se sont éclaircis. La fluorescence de 10 neurones s’est avérée augmenter simultanément au point temporel 92 (Figure 4D), ce qui suggère que ces neurones champignons répondent à l’odeur d’octanol. Bien que l’octanol ait été appliqué pendant 5 s, une fluorescence élevée dans ces neurones a été observée en un seul point temporel (0,9 s), puis a rapidement chuté, suggérant que la réponse est phasique et transitoire.
Séparation des cellules qui se chevauchent
La figure 5A présente une image de projection maximale de trois neurones. La pointe de flèche blanche pointe vers deux neurones qui se chevauchaient dans le plan x/y mais étaient séparés dans la vue ortho (pointes de flèches bleues et oranges sur la figure 5B), indiquant que ces neurones apparaissaient dans des positions z différentes; la cellule orange avait le signal le plus fort sur z7 (Figure 5C), tandis que la cellule bleue avait le signal le plus fort sur z10 (Figure 5D). L’outil a distingué ces deux cellules et a révélé l’activation retardée mais forte de la cellule orange (Figure 5E).
Figure 1 : Flux de travail utilisant TACI pour analyser l’imagerie calcique 3D. TACI a quatre fonctions : RENOMMER, ORGANISER, EXTRAIRE et FUSIONNER. Tout d’abord, si les noms TIFF ne sont pas compatibles avec la fonction ORGANIZE, la fonction RENAME peut convertir les noms d’image en la structure requise. Ensuite, la fonction ORGANIZE répartit les niveaux de gris (si nécessaire) et organise les données TIFF d’imagerie calcique 3D par positions z. Les images de la même position z sont enregistrées dans un dossier. Ensuite, différents outils d’analyse d’imagerie peuvent être utilisés pour détecter et suivre les retours sur investissement et extraire leurs intensités de fluorescence dans chaque position z. Pour chaque cellule d’intérêt, la fonction EXTRACT trie les intensités de fluorescence par les points temporels correspondants, identifie les valeurs maximales de chaque position t, soustrait l’arrière-plan, et calcule et trace ΔF/F0. Enfin, la fonction MERGE calcule et trace la moyenne de ΔF/F0 de plusieurs cellules. Abréviations : TACI = TrackMate Analysis of Calcium Imaging; ROI = régions d’intérêt; ΔF/F0 = rapport entre la variation de la fluorescence et l’intensité initiale de la fluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Imagerie calcique des cellules froides de larves de mouches à l’état inactif et actif. (A) Les cellules sont à peine visibles à l’état inactif. (B) Les cellules sont fortement fluorescentes à l’état actif. Les pointes de flèches de différentes couleurs indiquent différentes cellules. Le génotype est Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. Z5-13 : images aux positions Z de 5 à 13. En B, la cellule indiquée par les pointes de flèches blanches est représentée sur z5 à z8; Les cellules indiquées par des pointes de flèches orange et bleues sont indiquées sur Z8 à Z13. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Quantification de la fluorescence comme changement de l’intensité de fluorescence (F) par rapport à l’intensité initiale (F0). Le génotype est Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. n = 7 cellules de trois animaux. Traces = moyenne ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse d’un ensemble de données d’imagerie calcique 3D du cerveau d’une mouche. (A) L’image de projection maximale au point temporel 1 (t1). Les nombres 0-3 indiquent les quatre neurones analysés. (B) Changements de fluorescence des neurones 0-3 dans A pendant les points temporels 0 à 125. (C) L’image de projection maximale au point temporel 92 (t92). Les nombres 0-9 indiquent les 10 neurones analysés. (D) Changements de fluorescence des neurones 0-9 en C pendant les points de temps 0 à 125. 5 s d’air ou 5 s d’octanol ont été appliqués, comme indiqué en gris. Barre d’échelle = 10 000 unités d’intensité de fluorescence brute. Abréviation : OCT = octanol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Séparation des cellules qui se chevauchent en fonction de la valeur maximale. (A) Deux neurones se chevauchent (pointe de flèche blanche) dans une image de projection maximale (m). Le génotype est Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. (B) Ces neurones sont séparés dans la vue ortho (pointes de flèches bleues et oranges). (C, D) La cellule orange apparaît sur z7 (C), tandis que la cellule bleue apparaît sur z10 (D). Barre d’échelle = 10 μm. (E) Les changements de fluorescence des cellules orange et bleue sont quantifiés à l’aide des valeurs maximales des positions z individuelles. Abréviation : ΔF/F0 = rapport entre la variation de la fluorescence et l’intensité initiale de la fluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1: Deux neurones avec des signaux calciques faibles sont analysés à l’aide de détecteurs DoG et LoG à des seuils différents. (A-C) Le premier neurone (Ir21a-Gal80 26/UAS-GCaMP6;Ir93a-Gal427) est analysé par DoG et LoG à différents seuils. (A) Le seuil est fixé à 0,1. DoG et LoG détectent les 36 points temporels. (B) Le seuil est fixé à 0,3. Parmi les 36 points temporels, DoG en détecte 36 et LoG en détecte 35. (C) Le seuil est fixé à 1,0. Parmi les 36 points temporels, DoG en détecte 34 et LoG en détecte 15. (D-F) Le deuxième neurone (UAS-GCaMP6;Ir68a-Gal428) est analysé par DoG et LoG à différents seuils. (D) Le seuil est fixé à 0,1. DoG détecte les 36 points temporels et LoG en détecte 34. (E) Le seuil est fixé à 0,3. Parmi les 36 points temporels, DoG en détecte 33 et LoG en détecte 18. (F) Le seuil est fixé à 1,0. Parmi les 36 points temporels, DoG en détecte 14 et LoG n’en détecte qu’un. Il est à noter que l’augmentation du seuil n’affecte pas sa lecture d’intensité si un retour sur investissement est reconnu. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : La valeur maximale est une bonne représentation de l’intensité d’une cellule. (A) Des piles Z avec différentes distances z sont simulées. (B) Des piles Z avec différentes positions z sont simulées. (C) Les piles Z sont créées à partir de cellules simulées avec différentes intensités. Abréviations : max = la valeur maximale d’une pile z ; ground_truth = le produit du volume de la cellule simulée et de son intensité remplie. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 3 : Comparaison entre les méthodes TACI et 3D-ROI. (A) Les changements de fluorescence dans deux cellules indiquées par l’orange et le bleu sont quantifiés à l’aide de TACI et d’un logiciel personnalisé écrit en IGOR Pro. Le génotype est R11F02-Gal429; UAS-GCaMP6m. (B) Les changements de fluorescence dans deux cellules indiquées par l’orange et le bleu sont quantifiés à l’aide de TACI et IMARIS. Le génotype est Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. Abréviation : ΔF/F0 = rapport entre la variation de la fluorescence et l’intensité initiale de la fluorescence. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Cette étude a développé un nouveau plugin ImageJ, TACI, et décrit un flux de travail analysant l’imagerie calcique 3D. De nombreux outils actuellement disponibles se concentrent sur la correction du mouvement x/y, bien que le mouvement sur l’axe z doive également être explicitement diagnostiqué ou corrigé6. Lors de l’acquisition d’images dans un organisme vivant, le mouvement sur l’axe z est inévitable même lorsque l’organisme est immobilisé, et certains stimuli, tels que le changement de température, provoquent souvent une dérive z importante. L’augmentation de la hauteur des piles z permettra d’enregistrer les cellules d’intérêt pendant tout le processus d’imagerie; Cependant, il n’est pas trivial d’analyser le mouvement sur l’axe Z, en particulier lorsque des cellules individuelles apparaissent dans plusieurs positions Z. Si un tel mouvement est ignoré, les chercheurs n’obtiendront pas les réponses précises en calcium de ces cellules. TACI corrige la dérive z en extrayant les signaux de fluorescence de chaque position z. Une étape critique de TACI consiste à trier la valeur maximale à chaque point temporel et à l’utiliser pour représenter l’intensité d’une cellule. Par conséquent, il est essentiel d’inclure toutes les positions z des cellules d’intérêt pendant le processus d’imagerie. De plus, nous recommandons d’autoriser une cellule à apparaître dans cinq positions z ou plus afin que les distances z et les positions z n’affectent pas la valeur maximale (Figure supplémentaire 2A,B). De plus, TACI permet la séparation des cellules qui se chevauchent dans la direction latérale (x/y) mais apparaissent dans des positions z différentes.
La dérive Z peut également être corrigée en extrayant les intensités de fluorescence des ROI 3D 8,11,29. Nous avons comparé TACI à deux méthodes 3D-ROI. Tout d’abord, Klein et al. ont créé un logiciel personnalisé écrit en IGOR Pro qui utilise les 100 pixels les plus lumineux de chaque retour sur investissement 3D pour générer le signal brut29. Cette méthode et TACI ont produit des résultats similaires (figure supplémentaire 3A). Deuxièmement, nous avons appliqué IMARIS (version 9.8.2), un logiciel commercial, pour modéliser les ROI 3D et extraire leurs intensités moyennes. Bien que les résultats de TACI et d’IMARIS aient montré des tendances similaires, les changements de plis étaient différents (figure supplémentaire 3B). Cet écart peut être dû à des algorithmes. Il convient de noter que la valeur maximale extraite par TACI est proportionnelle à l’intensité de la réalité terrain (figure supplémentaire 2C).
Bien que ce flux de travail soit semi-automatique et nécessite encore des efforts manuels de la part des chercheurs, il fournit une approche informatique pour l’analyse d’imagerie calcique 3D. Il est important de noter que ce flux de travail est basé sur ImageJ et ne nécessite pas de logiciels commerciaux ou de connaissances en programmation. Les limites et les solutions potentielles pour ce flux de travail sont les suivantes. Tout d’abord, TACI n’accepte que les fichiers TIFF et une structure de nom de fichier spécifique : filename_h#t#z#c#.tif (h# et c# sont facultatifs). Cependant, d’autres formats de fichiers compatibles avec ImageJ peuvent être facilement convertis en fichiers TIFF par ImageJ. De plus, le plugin dispose d’une fonction RENAME qui convertit les noms d’image à la structure requise afin qu’elle soit compatible avec les données d’imagerie calcique obtenues à partir de différents systèmes.
Deuxièmement, le plugin est conçu pour les données d’imagerie calcique avec des arrière-plans constants. Soustraire les informations de base correspondantes des intensités de retour sur investissement à chaque point temporel est un moyen de corriger les arrière-plans fluctuants. L’outil fournit des intensités de retour sur investissement à chaque point temporel du dossier python_files. Les intensités d’arrière-plan pourraient être représentées par (1) les intensités moyennes des images ou (2) les intensités moyennes des ROI sans cellules actives. ImageJ fournit des méthodes pour obtenir les intensités moyennes des images (en cliquant sur Image | Pile | Mesurer la pile) et les intensités moyennes des ROI aléatoires (en cliquant sur Analyser | Outils | Gestionnaire de retour sur investissement | Multi-mesures). Si le photoblanchiment se produit pendant l’imagerie calcique, la fonction Correction de l’eau de Javel (en cliquant sur Image | Ajuster | Bleach Correction) peut être exécuté avant TrackMate.
Enfin, l’enregistrement cellulaire à travers les positions z doit être inclus dans ce flux de travail si vous utilisez TACI pour analyser un grand nombre de neurones simultanément. Par conséquent, une fonction supplémentaire doit être développée pour organiser l’information sur les intensités de fluorescence dans la structure de données requise par la fonction MERGE .
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Un Zeiss LSM 880 dans le Fralin Imaging Center a été utilisé pour collecter les données d’imagerie calcique. Nous remercions le Dr Michelle L Olsen et Yuhang Pan pour leur aide avec le logiciel IMARIS. Nous remercions le Dr Lenwood S. Heath pour ses commentaires constructifs sur le manuscrit et Steven Giavasis pour ses commentaires sur le fichier GitHub README. Ce travail a été soutenu par NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) et NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) à L.N. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
References
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