Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) ist ein Open-Source-ImageJ-Plugin für die 3D-Calcium-Imaging-Analyse, das die Bewegung auf der z-Achse untersucht und den Maximalwert jedes Z-Stapels identifiziert, um die Intensität einer Zelle zum entsprechenden Zeitpunkt darzustellen. Es kann Neuronen trennen, die sich in lateraler (x / y) Richtung, aber auf verschiedenen Z-Ebenen überlappen.
Abstract
Die Forschung in den Neurowissenschaften hat sich dahingehend entwickelt, dass komplexe Bildgebungs- und Berechnungswerkzeuge verwendet werden, um umfassende Informationen aus Datensätzen zu extrahieren. Die Kalziumbildgebung ist eine weit verbreitete Technik, die eine ausgeklügelte Software erfordert, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, aber viele Labore haben Schwierigkeiten, Berechnungsmethoden anzuwenden, wenn sie Protokolle aktualisieren, um modernen Standards zu entsprechen. Schwierigkeiten entstehen durch mangelnde Programmierkenntnisse und Paywalls für Software. Darüber hinaus zeigen die interessierenden Zellen während der Kalziumbildgebung Bewegungen in alle Richtungen. Es wurden viele Ansätze entwickelt, um die Bewegung in lateraler (x/y) Richtung zu korrigieren.
In diesem Artikel wird ein Workflow beschrieben, bei dem ein neues ImageJ-Plugin, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), verwendet wird, um Bewegungen auf der z-Achse in der 3D-Calcium-Bildgebung zu untersuchen. Diese Software identifiziert den maximalen Fluoreszenzwert aus allen Z-Positionen, in denen ein Neuron erscheint, und verwendet ihn, um die Intensität des Neurons an der entsprechenden T-Position darzustellen. Daher kann dieses Werkzeug Neuronen trennen, die sich in lateraler (x/y) Richtung überlappen, aber auf unterschiedlichen z-Ebenen erscheinen. Als ImageJ-Plugin ist TACI ein benutzerfreundliches Open-Source-Berechnungswerkzeug für die 3D-Kalzium-Bildgebungsanalyse. Wir validierten diesen Workflow mit thermosensitiven Neuronen von Fliegenlarven, die Bewegungen in alle Richtungen während der Temperaturschwankung zeigten, und einem 3D-Kalzium-Bildgebungsdatensatz, der aus dem Fliegengehirn aufgenommen wurde.
Introduction
Der intrazelluläre Calciumspiegel ist ein präziser Marker für die neuronale Erregbarkeit. Die Calcium-Bildgebung misst die Veränderungen des intrazellulären Calciums, um die neuronale Aktivität zu verstehen1. Studien in den Neurowissenschaften haben diese Methode aufgrund der Entwicklung von Techniken zur Messung der intrazellulären Kalziumkonzentration, einschließlich genetisch kodierter Kalziumindikatoren (GECIs), wie GCaMP2,3, die durch genetische Ansätze nichtinvasiv in bestimmten Gruppen von Neuronen exprimiert werden können, zunehmend verwendet. Die geringeren Kosten für Laser und Mikroskopkomponenten haben auch den Einsatz von Calcium-Bildgebungerhöht 4. Wichtig ist, dass die Kalzium-Bildgebung es ermöglicht, sowohl einzelne Neuronen als auch große Neuronenpopulationen gleichzeitig in frei beweglichen Tieren aufzuzeichnen und zu untersuchen5.
Nichtsdestotrotz ist die Analyse von Kalzium-Bildgebungsdaten eine Herausforderung, da (1) die Fluoreszenzänderungen einzelner Zellen im Laufe der Zeit verfolgt werden, (2) das Fluoreszenzsignal intermittierend verschwindet oder mit neuronalen Reaktionen wieder auftaucht und (3) sich die Neuronen in alle Richtungen bewegen können, insbesondere in und aus einer Fokusebene oder auf mehreren Ebenen 4, 6. Preise Die manuelle Analyse ist zeitaufwändig und wird mit zunehmender Länge der Aufzeichnungen und der Anzahl der Neuronen unpraktisch. Es wurden verschiedene Softwareprogramme entwickelt, um den Prozess der Analyse der Kalziumbildgebung zu beschleunigen. Bisher wurde Software in einem begrenzten experimentellen Kontext entwickelt, was es für andere Labore schwierig machte, sie zu übernehmen. Jüngste Bemühungen, moderne Standards für die gemeinsame Nutzung von Software zu erfüllen, haben zur Entwicklung mehrerer Tools geführt, die Kalzium-Bildgebungsdaten über verschiedene Gruppen hinweg konsistent analysieren können 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Die meisten dieser Tools erfordern jedoch Programmierkenntnisse und/oder sind auf kommerzielle Software angewiesen. Mangelnde Programmierkenntnisse und Software-Paywalls halten Forscher davon ab, diese Methoden anzuwenden. Darüber hinaus konzentrieren sich viele dieser Werkzeuge auf die Korrektur der x/y-Bewegung, obwohl auch die Bewegung auf der z-Achse explizit diagnostiziert und korrigiert werden muss6. Es besteht ein Bedarf an einem Berechnungswerkzeug zur Analyse der 3D-Kalziumbildgebung, das sich auf Neuronen konzentriert, die eine Z-Drift aufweisen und auf mehreren Z-Ebenen auftreten. Idealerweise sollte dieses Tool Open-Source-Software verwenden und keine Programmierkenntnisse erfordern, damit andere Labore es problemlos übernehmen können.
Hier haben wir ein neues ImageJ-Plugin, TACI, entwickelt, um 3D-Kalzium-Bildgebungsdaten zu analysieren. Zunächst benennt die Software die 3D-Kalzium-Bildgebungsdaten bei Bedarf um und organisiert sie nach Z-Positionen. Die interessierenden Zellen werden in jeder z-Position verfolgt, und ihre Fluoreszenzintensitäten werden mit TrackMate oder anderen Berechnungswerkzeugen extrahiert. TACI wird dann angewendet, um die Bewegung auf der z-Achse zu untersuchen. Es identifiziert den Maximalwert eines Z-Stapels und verwendet ihn, um die Intensität einer Zelle zum entsprechenden Zeitpunkt darzustellen. Dieser Workflow eignet sich für die Analyse der 3D-Kalziumbildgebung mit Bewegung in alle Richtungen und/oder mit Neuronen, die sich in lateraler (x/y) Richtung überlappen, aber in verschiedenen Z-Positionen auftreten. Um diesen Workflow zu validieren, wurden 3D-Kalzium-Bildgebungsdatensätze von thermosensitiven Neuronen der Fliegenlarven und Pilzneuronen im Gehirn verwendet. Bemerkenswert ist, dass TACI ein Open-Source-ImageJ-Plugin ist und keine Programmierkenntnisse erfordert.
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Protocol
1. Kalzium-Bildgebung
- Vorbereitung der Fliegenlarven
HINWEIS: Fliegen und Larven werden bei 25 °C unter einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 h:12 h gehalten.- Betäuben Sie die Fliegen mit CO2. Sortieren Sie 20-45 Männchen und 20-45 Weibchen in jedes Fliegenfläschchen und geben Sie ihnen mindestens 24 bis 48 Stunden Zeit, um sich von der CO2 -Exposition zu erholen.
HINWEIS: Die Exposition der Fliegen gegenüber CO2 sollte so kurz wie möglich anhalten. - Um das Alter der Larven zu synchronisieren, klopfen Sie die Fliegen in neue Fläschchen mit Hefegranulat und lassen Sie sie 4-8 Stunden Eier legen. Entfernen Sie die Fliegen, indem Sie sie in neue Fläschchen drehen.
- Sammeln Sie die Larven nach 72 h mit 10 ml 20%iger Saccharoselösung.
- Betäuben Sie die Fliegen mit CO2. Sortieren Sie 20-45 Männchen und 20-45 Weibchen in jedes Fliegenfläschchen und geben Sie ihnen mindestens 24 bis 48 Stunden Zeit, um sich von der CO2 -Exposition zu erholen.
- Aufbau des Mikroskops und der Temperaturregelung
- Führen Sie die Bildgebung an einem konfokalen Mikroskop (siehe Materialtabelle) und einem Piezotisch der Z-Achse mit einem Tischeinsatz mit den folgenden Einstellungen durch: Laser, Argon; Scan-Modus, Rahmen; Bildgröße: 512 x 512; Geschwindigkeit, Maximum; Kanäle/Bittiefe, 1/8 Bit; Zoom, 1,5; Z-Stapel, Slice = 15, Keep = Slice; Fokusgeräte und Strategie, Definitiver Fokus; Fokus, Definitiver Fokus auf.
- Befestigen Sie ein Peltier-Kühlmodul an einem Kühlkörper mit der Wärmeübertragungsmasse, um einen thermoelektrischen Kühler zu bauen. Der Peltier wird von einem 2 A Netzteil gespeist.
- Schließen Sie eine Thermoelement-Mikrosonde an ein Datenerfassungsgerät an, um die Temperatur aufzuzeichnen.
- Calcium-Bildgebung
- Spülen Sie die Larven 3x in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aus.
- Pipettieren Sie 75 μl 1x PBS in die Mitte eines Objektträgers.
- Legen Sie ein oder zwei Larven in 1x PBS und platzieren Sie die Thermoelement-Mikrosonde in der Nähe der Larven.
HINWEIS: Der Abstand zwischen den Larven und der Mikrosonde sollte ~5 mm betragen. Die Larven können sich bewegen, wenn die Mikrosonde zu nahe an ihnen positioniert ist. Eine große Entfernung kann zu ungenauen Temperaturmessungen führen. - Decken Sie die Larven und die Thermoelement-Mikrosonde mit einem Glasdeckglas ab. Versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack.
- Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch, finden Sie den Fokus mit einem 25-fachen Objektiv und platzieren Sie den thermoelektrischen Kühler auf dem Objektträger.
HINWEIS: Das Peltier wird direkt auf den Objektträger gelegt, wo die Larven die Temperaturreize abgeben sollen. - Konzentrieren Sie sich in konfokaler Software auf die interessierenden fluoreszierenden Zellen. Passen Sie die Laserleistung an, um eine Übersättigung zu vermeiden. Legen Sie die erste und letzte Slice-Position in der Z-Stack-Einstellung fest.
HINWEIS: Verwenden Sie vor der Aufnahme die niedrigstmögliche Laserleistung, um ein Ausbleichen zu vermeiden. - Starten Sie gleichzeitig den Z-Stack-Scan und die Temperaturaufzeichnung.
- Steuern Sie das Netzteil, das den Peltier mit Strom versorgt, um die Oberflächentemperatur des Peltiers zu ändern. Schalten Sie das Netzteil ein, um die Temperatur zu senken, und schalten Sie es aus, um die Temperatur zu erhöhen.
- Stoppen Sie das Scannen des Z-Stapels und die Temperaturaufzeichnung.
2. Analyse der 3D-Calcium-Imaging-Daten
- Exportieren Sie die Calcium-Bildgebungsdaten in TIFF-Dateien und speichern Sie sie in einem Ordner mit demselben Namen wie der Basisname der darin enthaltenen TIFF-Dateien.
HINWEIS: Der Dateiname darf keine Kommas enthalten.- Verwenden Sie die folgenden Parameter, um die Calcium-Bildgebungsdaten aus ZEN (schwarze Ausgabe) zu exportieren: Dateityp, TIFF; Komprimierung, LZW; Kanäle, 2; Z-Position, alle; Zeit, alles; Phase, 1; Region, voll.
- Installation
- Laden Sie TACI-Calcium_Imaging.jar von Github (https://github.com/niflylab/TACI_CalciumImagingPlugin/releases) herunter.
- Installieren Sie das Plugin in FIDSCHI, indem Sie in der Menüleiste auf Plugins klicken und dann im Dropdown-Menü auf Installieren klicken (Plugins | Installieren). Starten Sie dann FIDSCHI neu.
HINWEIS: Verwenden Sie KEINE Plugins | Installieren Sie das Plugin. - Führen Sie das Plugin aus, indem Sie auf Plugins klicken und dann TACI-Calcium Imaging auswählen (Plugins | TACI-Calcium-Bildgebung).
- Verwenden Sie die Funktion RENAME , um die TIFF-Dateinamen in die gewünschte Struktur zu konvertieren.
HINWEIS: Das Tool verwendet filename_h#t#z#c#.tif als Standardstruktur (h# und c# sind optional; #: eine positive ganze Zahl). Wenn die Bilddateinamen nicht in der Standardstruktur enthalten sind, muss die RENAME-Funktion ausgeführt werden.- Wählen Sie den Ordner aus, in dem die TIFF-Bilder umbenannt werden sollen, indem Sie auf Ordner durchsuchen klicken.
- Geben Sie die Parameterinformationen ein. Es werden fünf Parameter aufgelistet, darunter Dateiname, Phase, Maximale T-Position, Maximale Z-Position und Kanal. Jeder Parameter hat drei Werte: Vorhergehender Text, Parameterwert und Reihenfolge.
HINWEIS: Bei den Informationen wird zwischen Groß- und Kleinschreibung unterschieden. Wenn die Bilddateinamen eine Phrase vor einem Parameter enthalten, geben Sie die Phrase als vorangehenden Text des entsprechenden Parameters ein. Wenn die Bilddateinamen nach allen Parametern eine Phrase enthalten, geben Sie die Phrase als Beitragstext ein.- Stellen Sie sicher, dass Sie Dateiname, Maximale T-Position und Maximale Z-Position eingeben und dass die Parameterwerte für Maximale T-Position und Maximale Z-Position alle Ziffern enthalten.
- Warten Sie, bis der Dateiname automatisch mit dem Ordnernamen gefüllt wird.
- Wenn die TIFF-Dateinamen die Phase und den Kanal nicht enthalten, lassen Sie den entsprechenden Parameterwert leer, und wählen Sie Na in der Reihenfolge aus.
- Klicken Sie auf Umbenennen , um einen Ordner mit demselben Namen und derselben _r zu erstellen. Beachten Sie, dass die TIFF-Dateinamen im Ordner so umstrukturiert wurden, dass sie mit der ORGANIS-Funktion kompatibel sind.
HINWEIS: _r wurde zu den Dateinamen der TIFF-Bilder hinzugefügt.
- Verwenden Sie die ORGANISIEREN-Funktion , um die TIFF-Bilder von derselben Z-Position in einem Ordner zu speichern.
HINWEIS: Der Ordnername muss den gleichen Namen wie der Basisname der darin enthaltenen TIFF-Dateien haben und darf KEINE Kommas enthalten.- Wählen Sie den Ordner aus, in dem die TIFF-Bilder organisiert werden sollen, indem Sie auf Ordner durchsuchen klicken.
- Wenn die Parameter-CSV-Datei (param.csv) vorhanden ist, warten Sie, bis die Parameterwerte automatisch ausgefüllt wurden.
Hinweis: Die Datei param.csv hat ein erforderliches Format. Die Parameter, einschließlich Dateiname, Phase, position_t, position_z, Kanal und is_gray, müssen in Zeile 1 von links nach rechts ab Spalte A ausgefüllt werden. - Wenn die Parameter-CSV-Datei (param.csv) nicht vorhanden ist, geben Sie die Parameterwerte manuell ein. Stellen Sie sicher, dass die Parameterwerte von Phase und Kanal Buchstaben enthalten, während die Parameterwerte von T-Position und Z-Position die größten Zahlen der t- und z-Positionen sein sollten. Wenn die Bilddateinamen die Phase oder den Kanal nicht enthalten, geben Sie Na ein.
- Erstellen Sie bei Bedarf Graustufen-TIFF-Bilder. Lassen Sie das Kontrollkästchen Sind Bilder grau? deaktiviert, um die Bilder in Graustufen zu stufen.
- Klicken Sie auf Organisieren , um einen Ordner mit demselben Namen und derselben _gray_stacks zu erstellen und Ordner mit demselben Namen und _# (#: z-Positionen) im Ordner zu generieren. Beachten Sie, dass die TIFF-Dateien nach Z-Positionen in entsprechende Ordner sortiert sind und dass eine Datei mit dem Namen param.csv generiert wird, in der die Parameter und ihre Werte zu finden sind.
- Verwenden Sie TrackMate in FIDSCHI, um die Fluoreszenzintensitäten der interessierenden Zellen aus jeder Z-Position zu extrahieren.
HINWEIS: Dieser Schritt kann auch mit anderer Bildbearbeitungssoftware durchgeführt werden.- Öffnen Sie die TIFF-Bilder in einem Ordner mit Z-Position von FIJI.
- Führen Sie TrackMate aus, indem Sie auf Plugins | Sendungsverfolgung | TrackMate und passen Sie bei Bedarf die folgenden Parameter an.
- Verwenden Sie DoG- oder LoG-Detektoren.
- Ändern Sie den Blobdurchmesser, den Schwellenwert und den Medianfilter. Stellen Sie den Blobdurchmesser so ein, dass er dem Durchmesser der Zellen ähnelt. Wenn die Zellen oval sind, passen Sie den Blobdurchmesser so an, dass er der Nebenachse ähnelt.
HINWEIS: Durch Erhöhen des Schwellenwerts wird vermieden, dass Hintergrundgeräusche als Signale aufgenommen werden, ohne die Signalintensität zu beeinträchtigen (Ergänzende Abbildung 1). Bei einer Erhöhung des Schwellenwerts können jedoch echte Signale übersehen werden (Ergänzende Abbildung 1). Wenn die Signale stark sind, verwenden Sie den Medianfilter , um das Salz- und Pfefferrauschen zu verringern. - Stellen Sie die Filter so ein, dass einige, wenn nicht sogar alle irrelevanten Signale entfernt werden. Die Filter X und Y sind räumliche Filter. Verwenden Sie die Filter X und Y , um die irrelevanten Signale zu entfernen, die von den realen Signalen entfernt sind.
HINWEIS: Wenn Filter auf ein Bild gesetzt sind, ist es wichtig, alle anderen Bilder zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die echten Signale nicht entfernt werden. - Legen Sie den maximalen Verbindungsabstand, den maximalen Abstand zum Schließen des Spalts und den maximalen Rahmenabstand zum Schließen des Spalts fest. Stellen Sie den maximalen Verbindungsabstand und den maximalen Abstand zum Schließen des Spalts auf das 3-fache bis 5-fache des Blob-Durchmessers ein, insbesondere wenn sich die Proben im Laufe der Zeit erheblich bewegen, um die Anzahl der Spuren zu verringern. Legen Sie den maximalen Frame-Abstand zum Schließen des Spalts auf die Anzahl der Bilder im Stapel fest.
- Exportieren Sie die Fluoreszenzintensitäten der interessierenden Regionen (ROIs) in eine CSV-Datei. Wenn eine alte TrackMate-Version verwendet wird, wählen Sie im Fenster Aktion auswählen die Option Alle Spots-Statistiken exportieren. Wenn die TrackMate-Version 7.6.1 oder höher ist, wählen Sie die Spots im Fenster Anzeigeoptionen. Exportieren oder speichern Sie die interaktiven Dateien in CSV-Dateien.
HINWEIS: Beide Dateien sind mit dem Bildfenster interaktiv. Wenn Sie einen ROI hervorheben, wird der entsprechende ROI im Bildfenster angezeigt. Diese Dateien enthalten die mittleren Intensitäten (MEAN_INTENSITY oder MEAN_INTENSITY_CH1) der interessierenden Zellen zu entsprechenden Zeitpunkten (POSITION_T). Dieselben TRACK_IDs sollten zu unterschiedlichen Zeitpunkten die gleichen ROIs darstellen. Dies ist jedoch nicht immer der Fall und muss bei Bedarf möglicherweise manuell korrigiert werden. Wenn TrackMate die ROIs zu bestimmten Zeitpunkten nicht erkennt, werden diese Zeitpunkte nicht angezeigt.
- Extrahieren Sie die Hintergrundfluoreszenzintensität und erstellen Sie die Background_list.csv Datei.
HINWEIS: In dieser Studie wurde die Hintergrundintensität für jede z-Position unter Verwendung des Durchschnittswerts von drei bis fünf benachbarten Blobs gleicher Größe geschätzt, die keine Fluoreszenzsignale enthielten und zu unterschiedlichen Zeitpunkten stammten.- Die Background_list.csv Datei hat ein erforderliches Format: Jede Spalte enthält die Informationen eines Neurons, beginnend mit Neuron 0. Geben Sie die Neuronennummern, z. B. Neuron 0, in Zeile 1 ein. Geben Sie dann die Hintergrundintensität für jede analysierte Z-Position an - wenn fünf Z-Positionen für Neuron 0 analysiert werden, geben Sie fünf Hintergrundintensitätswerte unter Neuron 0 ein.
HINWEIS: Die Background_list.csv-Datei ist für die TACI EXTRACT-Funktion erforderlich. Wenn der Hintergrund vernachlässigbar ist, muss der Background_list.csv mit der Hintergrundintensität von Null jedes Neurons angegeben werden.
- Die Background_list.csv Datei hat ein erforderliches Format: Jede Spalte enthält die Informationen eines Neurons, beginnend mit Neuron 0. Geben Sie die Neuronennummern, z. B. Neuron 0, in Zeile 1 ein. Geben Sie dann die Hintergrundintensität für jede analysierte Z-Position an - wenn fünf Z-Positionen für Neuron 0 analysiert werden, geben Sie fünf Hintergrundintensitätswerte unter Neuron 0 ein.
- Verwenden Sie die EXTRACT-Funktion , um die maximalen Fluoreszenzintensitäten an jeder t-Position zu ermitteln und ΔF/F0 wie in Gleichung (1) gezeigt zu berechnen.
Bewertungen (1)- Erstellen Sie einen Ordner und benennen Sie ihn mit der Neuronennummer, beginnend mit Neuron 0. Speichern Sie die CSV-Dateien mit den Fluoreszenzinformationen des entsprechenden Neurons im Ordner. Jede CSV-Datei enthält die Informationen einer Z-Position, sodass die Anzahl der CSV-Dateien der Anzahl der analysierten Z-Positionen entspricht. Benennen Sie die CSV-Dateien als Mean_Intensity#.csv (# steht für die Z-Position), und jede CSV-Datei enthält mindestens zwei Spalten: POSITION_T und MEAN_INTENSITY oder MEAN_INTENSITY_CH1.
HINWEIS: Erstellen Sie einen Ordner für jede Zelle von Interesse. - Speichern Sie die Background_list.csv Datei und Ordner, die in Schritt 2.7.1 erstellt wurden, in einem Ordner. Wählen Sie diesen Ordner aus, indem Sie auf Dateien durchsuchen klicken.
HINWEIS: Die Anzahl der Hintergrundwerte in der Background_list.csv-Datei muss mit der Anzahl der Mean_Intensity#.csv-Dateien für jedes Neuron übereinstimmen. - Die Hintergrunddatei wird automatisch ausgefüllt. Füllen Sie die größte Anzahl von t-Positionen für die Anzahl der T-Positionen aus.
- Klicken Sie auf Extrahieren , um einen Ergebnisordner zu erstellen, der die CSV-Dateien und Diagramme für jedes Neuron enthält. Die CSV-Dateien enthalten Informationen über die maximale Fluoreszenzintensität und ΔF/F0 an jeder t-Position. Die Diagramme sind Liniendiagramme von ΔF/F0 über t-Positionen.
ANMERKUNG: In dieser Studie wurde ΔF/F0 mit Gleichung (1) berechnet. Der erste Wert jeder z-Position wurde als F0 verwendet. Wenn dieses F0 nicht geeignet ist20, stellt das Plugin Dateien mit Rohdaten für jedes Neuron im python_files Ordner bereit.
- Erstellen Sie einen Ordner und benennen Sie ihn mit der Neuronennummer, beginnend mit Neuron 0. Speichern Sie die CSV-Dateien mit den Fluoreszenzinformationen des entsprechenden Neurons im Ordner. Jede CSV-Datei enthält die Informationen einer Z-Position, sodass die Anzahl der CSV-Dateien der Anzahl der analysierten Z-Positionen entspricht. Benennen Sie die CSV-Dateien als Mean_Intensity#.csv (# steht für die Z-Position), und jede CSV-Datei enthält mindestens zwei Spalten: POSITION_T und MEAN_INTENSITY oder MEAN_INTENSITY_CH1.
- Verwenden Sie die MERGE-Funktion, um die ΔF/F 0 jedes Neurons zu mitteln, das REM zu berechnen und den Durchschnitt ΔF/F0 über t-Positionen aufzuzeichnen.
- Wählen Sie den von der EXTRACT-Funktion erstellten Ergebnisordner aus, indem Sie auf Dateien durchsuchen klicken.
- Füllen Sie die Anzahl der T-Positionen mit der größten Anzahl von T-Positionen aus.
- Klicken Sie auf Zusammenführen , um einen merged_data Ordner zu erstellen, der eine merged_data.csv Datei und ein Average_dF_F0.png Diagramm enthält. Die CSV-Datei enthält die Informationen über den Mittelwert und SEM ΔF/F0 an jeder t-Position. Das Diagramm ist ein Liniendiagramm des durchschnittlichen ΔF/F0 über t-Positionen.
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Representative Results
Arbeitsablauf der 3D-Calcium-Imaging-Analyse
In dieser Studie entwickelten wir ein neues ImageJ-Plugin, TACI, und beschrieben einen Workflow zur Verfolgung der Z-Drift und zur Analyse der 3D-Kalzium-Bildgebung, die die Reaktionen einzelner Zellen in mehreren Z-Positionen lokalisiert (Abbildung 1). Dieses Tool verfügt über vier Funktionen: UMBENENNEN, ORGANISIEREN, EXTRAHIEREN und ZUSAMMENFÜHREN. Erstens, wenn die Bildnamen nicht mit der ORGANIZE-Funktion kompatibel sind, kann die RENAME-Funktion die Bildnamen in die erforderliche Struktur konvertieren. Anschließend ordnet die ORGANIS-Funktion Graustufen (falls erforderlich) und organisiert die 3D-TIFF-Daten für die Kalziumbildgebung nach Z-Positionen. Bilder aus der gleichen Z-Position werden in einem Ordner gespeichert. Als nächstes können verschiedene bildgebende Analysewerkzeuge verwendet werden, um die ROIs zu erkennen und zu verfolgen und ihre Fluoreszenzintensitäten im Laufe der Zeit für jede Z-Position zu extrahieren. Ein ImageJ-Plugin, TrackMate, wurde verwendet, um diesen Schritt durchzuführen. TrackMate ist ein Open-Source-ImageJ-Plugin zum Aufspüren einzelner Partikel21. Es wurde häufig verwendet, um Partikel in verschiedenen biologischen Studien mit Lebendzell-Bildgebung zu verfolgen, einschließlich der Kalzium-Bildgebung 11,21,22,23. TrackMate verfolgt automatisch Zellen in lateraler (x/y) Richtung, erkennt ROIs und extrahiert Signale aus einem Live-Imaging-Datensatz 4,12. Für jede interessierende Zelle sortiert die EXTRACT-Funktion die Fluoreszenzintensitäten aller z-Positionen nach t-Positionen, identifiziert die Maximalwerte jeder t-Position, subtrahiert den Hintergrund und berechnet und zeichnet ΔF/F0. Schließlich berechnet und zeichnet die MERGE-Funktion den Durchschnitt von ΔF/F0 mehrerer Zellen.
Kalziumreaktionen von Fliegenlarven kühlen Neuronen auf Temperaturänderungen
Wir validierten diese Methode anhand der Kalziumänderungen als Reaktion auf Temperaturschwankungen in kühlen Neuronen der Fliegenlarven. Ein genetisch kodierter Calciumindikator, GCaMP6m 24, wurde in kühlen Neuronen der Larven durch Ir21a-Gal425 exprimiert. Bei einer Temperatur von etwa 27 °C wiesen die Neuronen einen niedrigen intrazellulären Kalziumspiegel auf (Abbildung 2A und Abbildung 3). Wenn die Temperatur auf etwa 10 °C gesenkt und dort gehalten wurde, stiegen die intrazellulären Calciumspiegel schnell an und wurden aufrechterhalten (Abbildung 2B und Abbildung 3). Der Kalziumspiegel sank schnell, wenn die Temperatur erhöht wurde (Abbildung 3).
Analyse eines 3D-Kalzium-Imaging-Datensatzes für das Fliegengehirn
Wir validierten diese Methode auch anhand eines 3D-Kalzium-Imaging-Datensatzes des Fliegenhirns11. Die abgebildeten transgenen Fliegen (VT50339-Gal4; UAS-GCaMP6f) exprimierte GCaMP6f im Pilzkörper im Gehirn11. Daten von 45 z-Positionen (in Abständen von 1,5 μm) wurden bei 50 Hz für 225 s (250 Zeitpunkte) gesammelt, und die erste Hälfte des Datensatzes (125 Zeitpunkte) wurde analysiert. Als die Aufzeichnung begann, wiesen sieben Neuronen eine deutliche Fluoreszenz auf, von denen vier analysiert wurden (Abbildung 4A). Die Intensitäten in diesen Neuronen nahmen mit der Zeit ab (Abbildung 4B). Wenn Octanol aufgetragen wurde (Abbildung 4C), hellten sich mehrere Neuronen auf. Es wurde festgestellt, dass die Fluoreszenz von 10 Neuronen zum Zeitpunkt 92 gleichzeitig zunimmt (Abbildung 4D), was darauf hindeutet, dass diese Pilzneuronen auf Octanolgeruch reagieren. Obwohl Octanol 5 s lang angewendet wurde, wurde eine hohe Fluoreszenz in diesen Neuronen nur zu einem Zeitpunkt (0,9 s) beobachtet und fiel dann schnell ab, was darauf hindeutet, dass die Reaktion phasisch und vorübergehend ist.
Trennung von überlappenden Zellen
Abbildung 5A zeigt ein maximales Projektionsbild von drei Neuronen. Die weiße Pfeilspitze zeigt auf zwei Neuronen, die sich in der x/y-Ebene überlappten, aber in der Orthoansicht getrennt waren (blaue und orangefarbene Pfeilspitzen in Abbildung 5B), was darauf hindeutet, dass diese Neuronen in unterschiedlichen Z-Positionen auftraten; Die orangefarbene Zelle hatte das stärkste Signal auf z7 (Abbildung 5C), während die blaue Zelle das stärkste Signal auf z10 hatte (Abbildung 5D). Das Tool unterschied diese beiden Zellen und zeigte die verzögerte, aber starke Aktivierung der orangefarbenen Zelle (Abbildung 5E).
Abbildung 1: Workflow mit TACI zur Analyse der 3D-Calcium-Bildgebung. TACI hat vier Funktionen: UMBENENNEN, ORGANISIEREN, EXTRAHIEREN und ZUSAMMENFÜHREN. Wenn die TIFF-Namen nicht mit der ORGANIS-Funktion kompatibel sind, kann die RENAME-Funktion die Bildnamen in die erforderliche Struktur konvertieren. Anschließend ordnet die ORGANIS-Funktion Graustufen (falls erforderlich) und organisiert die 3D-TIFF-Daten für die Kalziumbildgebung nach Z-Positionen. Bilder aus der gleichen Z-Position werden in einem Ordner gespeichert. Als nächstes können verschiedene bildgebende Analysewerkzeuge verwendet werden, um die ROIs zu erkennen und zu verfolgen und ihre Fluoreszenzintensitäten in jeder Z-Position zu extrahieren. Für jede interessierende Zelle sortiert die EXTRACT-Funktion die Fluoreszenzintensitäten nach den entsprechenden Zeitpunkten, identifiziert die Maximalwerte jeder t-Position, subtrahiert den Hintergrund und berechnet und zeichnet ΔF/F0. Schließlich berechnet und zeichnet die MERGE-Funktion den Durchschnitt von ΔF/F0 mehrerer Zellen. Abkürzungen: TACI = TrackMate Analysis of Calcium Imaging; ROIs = Regionen von Interesse; ΔF/F0 = Verhältnis der Änderung der Fluoreszenz zur anfänglichen Fluoreszenzintensität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Calcium-Bildgebung von kühlen Zellen der Fliegenlarven im inaktiven und aktiven Zustand . (A) Die Zellen sind im inaktiven Zustand kaum sichtbar. (B) Die Zellen sind im aktiven Zustand stark fluoreszierend. Unterschiedliche Farbpfeilspitzen zeigen unterschiedliche Zellen an. Der Genotyp ist Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. Z5-13: Bilder an Z-Positionen von 5 bis 13. In B wird die durch die weißen Pfeilspitzen gekennzeichnete Zelle auf z5 bis z8 angezeigt; Die durch orangefarbene und blaue Pfeilspitzen gekennzeichneten Felder sind auf Z8 bis Z13 dargestellt. Maßstabsleiste = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Quantifizierung der Fluoreszenz als Änderung der Fluoreszenzintensität (F) im Vergleich zur Anfangsintensität (F0). Der Genotyp ist Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. n = 7 Zellen von drei Tieren. Spuren = Mittelwert ± REM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Analyse eines 3D-Kalzium-Imaging-Datensatzes des Fliegenhirns. (A) Das maximale Projektionsbild zum Zeitpunkt 1 (t1). Die Zahlen 0-3 geben die vier analysierten Neuronen an. (B) Fluoreszenzänderungen der Neuronen 0-3 in A während der Zeitpunkte 0 bis 125. (C) Das maximale Projektionsbild zum Zeitpunkt 92 (t92). Die Zahlen 0-9 geben die 10 analysierten Neuronen an. (D) Fluoreszenzänderungen der Neuronen 0-9 in C während der Zeitpunkte 0 bis 125. Es wurden entweder 5 s Luft oder 5 s Octanol aufgetragen, wie grau dargestellt. Maßstabsbalken = 10.000 Einheiten Rohfluoreszenzintensität. Abkürzung: OCT = Octanol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Trennung von überlappenden Zellen basierend auf dem Maximalwert. (A) Zwei Neuronen überlappen sich (weiße Pfeilspitze) in einem maximalen Projektionsbild (m). Der Genotyp ist Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. (B) Diese Neuronen sind in der Ortho-Ansicht getrennt (blaue und orangefarbene Pfeilspitzen). (C,D) Die orangefarbene Zelle erscheint auf z7 (C), während die blaue Zelle auf z10 (D) erscheint. Maßstabsleiste = 10 μm. (E) Die Fluoreszenzänderungen der orangefarbenen und blauen Zellen werden mit den Maximalwerten der einzelnen Z-Positionen quantifiziert. Abkürzung: ΔF/F0 = Verhältnis der Fluoreszenzänderung zur anfänglichen Fluoreszenzintensität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Zwei Neuronen mit schwachen Kalziumsignalen werden mit DoG- und LoG-Detektoren an unterschiedlichen Schwellenwerten analysiert. (A-C) Das erste Neuron (Ir21a-Gal80 26/UAS-GCaMP6;Ir93a-Gal427) wird mittels DoG und LoG bei unterschiedlichen Schwellenwerten analysiert. (A) Der Schwellenwert wird auf 0,1 festgelegt. Sowohl DoG als auch LoG erkennen alle 36 Zeitpunkte. (B) Der Schwellenwert wird auf 0,3 festgesetzt. Von den 36 Zeitpunkten erkennt DoG 36 und LoG 35. (C) Der Schwellenwert wird auf 1,0 festgesetzt. Von den 36 Zeitpunkten erkennt DoG 34 und LoG 15. (D-F) Das zweite Neuron (UAS-GCaMP6;Ir68a-Gal428) wird mittels DoG und LoG bei unterschiedlichen Schwellenwerten analysiert. (D) Der Schwellenwert wird auf 0,1 festgesetzt. DoG erkennt alle 36 Zeitpunkte und LoG erkennt 34. (E) Der Schwellenwert wird auf 0,3 festgesetzt. Von den 36 Zeitpunkten erkennt DoG 33 und LoG 18. (F) Der Schwellenwert wird auf 1,0 festgelegt. Von den 36 Zeitpunkten erkennt DoG 14 und LoG nur einen. Beachten Sie, dass die Erhöhung des Schwellenwerts keinen Einfluss auf die Intensitätsanzeige hat, wenn ein ROI erkannt wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Der Maximalwert ist ein guter Vertreter der Intensität einer Zelle. (A) Es werden Z-Stacks mit unterschiedlichen Z-Abständen simuliert. (B) Es werden Z-Stapel mit unterschiedlichen Z-Positionen simuliert. (C) Z-Stapel werden aus simulierten Zellen mit unterschiedlichen Intensitäten erzeugt. Abkürzungen: max = der Maximalwert eines Z-Stacks; ground_truth = das Produkt aus dem Volumen der simulierten Zelle und ihrer Füllintensität. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Vergleich zwischen TACI- und 3D-ROI-Methoden. (A) Fluoreszenzänderungen in zwei Zellen, die durch Orange und Blau gekennzeichnet sind, werden mit TACI und einer benutzerdefinierten Software, die in IGOR Pro geschrieben ist, quantifiziert. Der Genotyptyp ist R11F02-Gal429; UAS-GCaMP6m. (B) Fluoreszenzänderungen in zwei Zellen, die durch Orange und Blau gekennzeichnet sind, werden mit TACI und IMARIS quantifiziert. Der Genotyptyp ist Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. Abkürzung: ΔF/F0 = Verhältnis der Fluoreszenzänderung zur anfänglichen Fluoreszenzintensität. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
In dieser Studie wurde ein neues ImageJ-Plugin, TACI, entwickelt und ein Workflow zur Analyse der 3D-Kalziumbildgebung beschrieben. Viele derzeit verfügbare Werkzeuge konzentrieren sich auf die Korrektur der x/y-Bewegung, obwohl auch die Bewegung auf der z-Achse explizit diagnostiziert oder korrigiert werden muss6. Während der Bildaufnahme in einem lebenden Organismus ist eine Bewegung auf der z-Achse unvermeidlich, selbst wenn der Organismus immobilisiert ist, und einige Reize, wie z. B. Temperaturänderungen, verursachen oft eine signifikante Z-Drift. Durch die Erhöhung der Z-Stapel können die interessierenden Zellen während des gesamten Bildgebungsprozesses aufgezeichnet werden. Es ist jedoch nicht trivial, die Bewegung auf der Z-Achse zu analysieren, insbesondere wenn einzelne Zellen in mehreren Z-Positionen erscheinen. Wenn eine solche Bewegung ignoriert wird, werden die Forscher nicht die genauen Kalziumreaktionen dieser Zellen erhalten. TACI korrigiert die Z-Drift, indem es die Fluoreszenzsignale aus jeder Z-Position extrahiert. Ein kritischer Schritt von TACI besteht darin, den Maximalwert zu jedem Zeitpunkt zu sortieren und ihn zur Darstellung der Intensität einer Zelle zu verwenden. Daher ist es wichtig, alle Z-Positionen der interessierenden Zellen während des Bildgebungsprozesses einzubeziehen. Zusätzlich empfehlen wir, eine Zelle in fünf oder mehr Z-Positionen erscheinen zu lassen, damit die Z-Abstände und Z-Positionen den Maximalwert nicht beeinflussen (Ergänzende Abbildung 2A,B). Darüber hinaus ermöglicht TACI die Trennung von Zellen, die sich in lateraler (x/y) Richtung überlappen, aber in unterschiedlichen z-Positionen auftreten.
Die Z-Drift kann auch korrigiert werden, indem Fluoreszenzintensitäten aus 3D-ROIs 8,11,29 extrahiert werden. Wir verglichen TACI mit zwei 3D-ROI-Methoden. Zuerst erstellten Klein et al. eine benutzerdefinierte Software, die in IGOR Pro geschrieben wurde und die hellsten 100 Pixel in jedem 3D-ROI verwendet, um das Rohsignal29 zu erzeugen. Diese Methode und TACI führten zu ähnlichen Ergebnissen (ergänzende Abbildung 3A). Zweitens haben wir IMARIS (Version 9.8.2), eine kommerzielle Software, angewendet, um die 3D-ROIs zu modellieren und ihre mittleren Intensitäten zu extrahieren. Obwohl die Ergebnisse von TACI und IMARIS ähnliche Trends zeigten, waren die Faltungsänderungen unterschiedlich (ergänzende Abbildung 3B). Diese Diskrepanz kann auf Algorithmen zurückzuführen sein. Bemerkenswert ist, dass der von TACI extrahierte Maximalwert proportional zur Ground-Truth-Intensität ist (ergänzende Abbildung 2C).
Obwohl dieser Workflow halbautomatisch ist und immer noch manuelle Anstrengungen von Forschern erfordert, bietet er einen rechnerischen Ansatz für die 3D-Kalzium-Bildgebungsanalyse. Wichtig ist, dass dieser Workflow auf ImageJ basiert und keine kommerzielle Software oder Programmierkenntnisse erfordert. Die Einschränkungen und möglichen Lösungen für diesen Workflow sind wie folgt. Erstens akzeptiert TACI nur TIFF-Dateien und eine bestimmte Dateinamenstruktur: filename_h#t#z#c#.tif (h# und c# sind optional). Andere Dateiformate, die mit ImageJ kompatibel sind, können jedoch von ImageJ problemlos in TIFF-Dateien konvertiert werden. Darüber hinaus verfügt das Plugin über eine RENAME-Funktion , die die Bildnamen in die erforderliche Struktur umwandelt, so dass sie mit Kalzium-Bildgebungsdaten kompatibel ist, die von verschiedenen Systemen erhalten wurden.
Zweitens ist das Plugin für Kalzium-Bildgebungsdaten mit konstantem Hintergrund konzipiert. Das Subtrahieren der entsprechenden Hintergrundinformationen von den ROI-Intensitäten zu jedem Zeitpunkt ist eine Möglichkeit, schwankende Hintergründe zu korrigieren. Das Tool liefert ROI-Intensitäten zu jedem Zeitpunkt im Ordner python_files. Die Hintergrundintensitäten können durch (1) die mittleren Intensitäten der Bilder oder (2) die mittleren Intensitäten der ROIs ohne aktive Zellen dargestellt werden. ImageJ bietet Methoden, um die mittleren Intensitäten der Bilder zu erhalten (indem Sie auf Bild | Stapeln | Measure Stack) und die mittleren Intensitäten zufälliger ROIs (durch Klicken auf Analysieren | Werkzeuge | ROI-Manager | Multi Measure). Wenn während der Kalzium-Bildgebung ein Photobleaching auftritt, wird die Bleichkorrekturfunktion (durch Klicken auf Bild | Anpassen | Bleach Correction) kann vor TrackMate ausgeführt werden.
Schließlich muss die Zellregistrierung über Z-Positionen hinweg in diesen Workflow einbezogen werden, wenn TACI verwendet wird, um eine große Anzahl von Neuronen gleichzeitig zu analysieren. Dementsprechend muss eine zusätzliche Funktion entwickelt werden, die die Informationen über Fluoreszenzintensitäten in der von der MERGE-Funktion benötigten Datenstruktur organisiert.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Ein Zeiss LSM 880 im Fralin Imaging Center wurde verwendet, um die Kalzium-Bildgebungsdaten zu sammeln. Wir danken Dr. Michelle L. Olsen und Yuhang Pan für ihre Unterstützung bei der IMARIS-Software. Wir danken Dr. Lenwood S. Heath für konstruktive Kommentare zum Manuskript und Steven Giavasis für Kommentare zur GitHub README-Datei. Diese Arbeit wurde von NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) und NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) an L.N. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
References
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