Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) är ett ImageJ-plugin med öppen källkod för 3D-kalciumavbildningsanalys som undersöker rörelse på z-axeln och identifierar det maximala värdet för varje z-stack för att representera en cells intensitet vid motsvarande tidpunkt. Det kan separera neuroner som överlappar i lateral (x / y) riktning men på olika z-plan.
Abstract
Forskning inom neurovetenskap har utvecklats till att använda komplexa bild- och beräkningsverktyg för att extrahera omfattande information från datamängder. Kalciumavbildning är en allmänt använd teknik som kräver sofistikerad programvara för att få tillförlitliga resultat, men många laboratorier kämpar för att anta beräkningsmetoder när de uppdaterar protokoll för att uppfylla moderna standarder. Svårigheter uppstår på grund av brist på programmeringskunskap och betalväggar för programvara. Dessutom visar celler av intresse rörelser i alla riktningar under kalciumavbildning. Många metoder har utvecklats för att korrigera rörelsen i lateral (x/y) riktning.
Detta dokument beskriver ett arbetsflöde som använder ett nytt ImageJ-plugin, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), för att undersöka rörelse på z-axeln i 3D-kalciumavbildning. Denna programvara identifierar det maximala fluorescensvärdet från alla z-positioner som en neuron visas i och använder den för att representera neuronens intensitet vid motsvarande t-position. Därför kan detta verktyg separera neuroner som överlappar i lateral (x / y) riktning men visas på distinkta z-plan. Som ett ImageJ-plugin är TACI ett användarvänligt beräkningsverktyg med öppen källkod för 3D-kalciumavbildningsanalys. Vi validerade detta arbetsflöde med hjälp av fluglarvens värmekänsliga neuroner som visade rörelser i alla riktningar under temperaturfluktuationer och en 3D-kalciumbilddataset förvärvad från flughjärnan.
Introduction
Nivån av intracellulärt kalcium är en exakt markör för neuronal excitabilitet. Kalciumavbildning mäter förändringarna i intracellulärt kalcium för att förstå neuronal aktivitet1. Studier inom neurovetenskap har alltmer använt denna metod på grund av utvecklingen av tekniker för mätning av intracellulär kalciumkoncentration, inklusive genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECI), såsom GCaMP2,3, som kan uttryckas icke-invasivt i specifika uppsättningar neuroner genom genetiska metoder. De lägre kostnaderna för lasrar och mikroskopkomponenter har också ökat användningen av kalciumavbildning4. Viktigt är att kalciumavbildning möjliggör inspelning och studier av enskilda neuroner såväl som stora neuronpopulationer samtidigt i fritt rörliga djur5.
Ändå är analysen av kalciumavbildningsdata utmanande eftersom (1) det handlar om att spåra förändringarna i fluorescens hos enskilda celler över tiden, (2) fluorescenssignalen försvinner intermittent eller återkommer med neuronala svar, och (3) neuronerna kan röra sig i alla riktningar, särskilt in och ut ur ett fokalplan eller visas på flera plan4, 6. Manuell analys är tidskrävande och blir opraktisk när längden på inspelningar och antalet neuroner ökar. Olika program har utvecklats för att påskynda processen att analysera kalciumavbildning. Tidigare utformades programvara i ett begränsat experimentellt sammanhang, vilket gjorde det svårt för andra laboratorier att anta det. Nya ansträngningar för att uppfylla moderna standarder för programvarudelning har lett till utvecklingen av flera verktyg som konsekvent kan analysera kalciumavbildningsdata över olika grupper 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . De flesta av dessa verktyg kräver dock programmeringskunskap och / eller är beroende av kommersiell programvara. Brist på programmeringskunskap och mjukvaruväggar avskräcker forskare från att anta dessa metoder. Dessutom fokuserar många av dessa verktyg på att korrigera x/y-rörelsen, även om rörelse på z-axeln också måste diagnostiseras och korrigerasexplicit 6. Det finns ett behov av ett beräkningsverktyg för att analysera 3D-kalciumavbildning som fokuserar på neuroner som uppvisar z-drift och uppträder på flera z-plan. Helst bör detta verktyg använda programvara med öppen källkod och inte kräva programmeringskunskap för att andra laboratorier lätt ska kunna anta det.
Här utvecklade vi ett nytt ImageJ-plugin, TACI, för att analysera 3D-kalciumbilddata. Först byter programvaran namn, om det behövs, och organiserar 3D-kalciumbildningsdata efter z-positioner. Cellerna av intresse spåras i varje z-position, och deras fluorescensintensiteter extraheras av TrackMate eller andra beräkningsverktyg. TACI används sedan för att undersöka rörelsen på z-axeln. Den identifierar det maximala värdet för en z-stack och använder den för att representera en cells intensitet vid motsvarande tidpunkt. Detta arbetsflöde är lämpligt för att analysera 3D-kalciumavbildning med rörelse i alla riktningar och / eller med neuroner som överlappar i lateral (x / y) riktning men visas i olika z-positioner. För att validera detta arbetsflöde användes 3D-kalciumavbildningsdataset från fluglarvers värmekänsliga neuroner och svampneuroner i hjärnan. Observera att TACI är ett ImageJ-plugin med öppen källkod och kräver ingen programmeringskunskap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kalciumavbildning
- Fly larver förberedelse
OBS: Flugor och larver hålls vid 25 °C under en 12 h:12 h ljus:mörk cykel.- Bedöva flugorna med CO2. Sortera 20-45 hanar och 20-45 honor i varje flugflaska och ge dem minst 24 till 48 timmar för att återhämta sig från CO2-exponeringen .
OBS: Flugexponering för CO2 bör pågå under kortast möjliga tid. - För att synkronisera larvernas ålder, knacka över flugorna i nya flaskor som innehåller jästgranulat och låt dem 4-8 timmar lägga ägg. Ta bort flugorna genom att vända dem i nya flaskor.
- Samla larverna vid 72 timmar med 10 ml 20% w/v sackaroslösning.
- Bedöva flugorna med CO2. Sortera 20-45 hanar och 20-45 honor i varje flugflaska och ge dem minst 24 till 48 timmar för att återhämta sig från CO2-exponeringen .
- Inställning av mikroskop och temperaturkontroll
- Utför avbildningen på ett konfokalmikroskop (se materialtabellen) och ett zi-axelpiezosteg med en sceninsats med följande inställningar: laser, Argon; skanningsläge, ram; ramstorlek, 512 x 512; hastighet, maximalt; kanaler/bitdjup, 1/8 bit; zoom, 1,5; z-stack, skiva = 15, behåll = segment; fokusenheter och strategi, Bestämd fokus; fokus, Definitivt fokus på.
- Fäst en Peltier-kylmodul på en kylfläns med värmeöverföringsföreningen för att bygga en termoelektrisk kylare. Peltier drivs av en 2 A strömförsörjning.
- Fäst en termoelementmikrosond på en datainsamlingsenhet för att registrera temperaturen.
- Kalciumavbildning
- Skölj larverna 3x i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Pipettera 75 μL 1x PBS på mitten av en glasskiva.
- Sätt en eller två larver i 1x PBS och placera termoelementmikrosonden nära larverna.
OBS: Avståndet mellan larverna och mikrosonden bör vara ~ 5 mm. Larverna kan röra sig om mikrosonden är placerad för nära dem. Ett stort avstånd kan resultera i felaktiga temperaturavläsningar. - Täck larverna och termoelementmikrosonden med ett glasskydd. Försegla täckglaset med nagellack.
- Placera bilden på mikroskopsteget, hitta fokus med ett 25x mål och placera den termoelektriska kylaren på bilden.
OBS: Peltier placeras direkt på bilden där larverna ska leverera temperaturstimuli. - I konfokal programvara, fokusera på de fluorescerande cellerna av intresse. Justera lasereffekten för att undvika övermättnad. Ange den första och sista segmentpositionen i z-stack-inställningen.
OBS: Använd lägsta möjliga lasereffekt före inspelning för att förhindra fotoblekning. - Starta z-stack-skanningen och temperaturregistreringen samtidigt.
- Kontrollera strömförsörjningen som driver Peltier för att ändra Peltiers yttemperatur. Slå på strömförsörjningen för att sänka temperaturen och stäng av den för att öka temperaturen.
- Stoppa z-stack-skanningen och temperaturregistreringen.
2. Analys av 3D-kalciumavbildningsdata
- Exportera kalciumavbildningsdata till TIFF-filer och spara dem i en mapp med samma namn som basnamnet på TIFF-filerna inuti.
Filnamnet får inte innehålla kommatecken.- Använd följande parametrar för att exportera kalciumavbildningsdata från ZEN (svart utgåva): filtyp, TIFF; komprimering, LZW; kanaler, 2; Z-position, alla; tid, allt; fas, 1; region, full.
- Installation
- Ladda ner TACI-Calcium_Imaging.jar från Github (https://github.com/niflylab/TACI_CalciumImagingPlugin/releases).
- Installera plugin i FIJI genom att klicka på Plugins i menyraden och sedan klicka på Installera i rullgardinsmenyn (Plugins | Installera). Starta sedan om FIJI.
OBS: Använd INTE Plugins | Installera plugin. - Kör plugin genom att klicka på Plugins och sedan välja TACI-Calcium Imaging (Plugins | TACI-kalciumavbildning).
- Använd funktionen RENAME för att konvertera TIFF-filnamnen till önskad struktur.
Verktyget använder filename_h#t#z#c#.tif som standardstruktur (h# och c# är valfria; #: ett positivt heltal). Om bildfilnamnen inte finns i standardstrukturen måste funktionen RENAME köras.- Välj den mapp där TIFF-bilderna behöver byta namn genom att klicka på Bläddra i mappar.
- Fyll i parameterinformationen. Fem parametrar visas, inklusive Filnamn, Fas, Max T-position, Max Z-Position och Kanal. Varje parameter har tre värden: Föregående text, Parametervärde och Ordning.
Informationen är skiftlägeskänslig. Om bildfilnamnen innehåller en fras före en parameter fyller du i frasen som föregående text för motsvarande parameter. Om bildfilnamnen innehåller en fras efter alla parametrar fyller du i frasen som inläggstext.- Var noga med att ange Filnamn, Max T-position och Max Z-Position och att parametervärdena för Max T-Position och Max Z-Position inkluderar alla siffror.
- Vänta tills filnamnet fylls i automatiskt med mappnamnet .
- Om TIFF-filnamnen inte innehåller fas och kanal lämnar du motsvarande parametervärde tomt och väljer Na i ordning.
- Klicka på Byt namn om du vill skapa en mapp med samma namn och _r. Observera att TIFF-filnamnen i mappen har omstrukturerats för att vara kompatibla med funktionen ORGANISERA .
_r har lagts till i filnamnen på TIFF-bilderna.
- Använd funktionen ORGANIZE för att spara TIFF-bilder från samma z-position i en mapp.
Mappnamnet måste ha samma namn som basnamnet på TIFF-filerna inuti och får INTE ha kommatecken.- Välj den mapp där TIFF-bilderna behöver ordnas genom att klicka på Bläddra i mappar.
- Om parametern CSV-fil (param.csv) finns väntar du tills parametervärdena fylls i automatiskt.
Filen param.csv har ett format som krävs. Parametrarna, inklusive filnamn, fas, position_t, position_z, kanal och is_gray, måste fyllas i på rad 1 från vänster till höger med början från kolumn A. Motsvarande värden för varje parameter måste fyllas i på rad 2. - Om parametern CSV-fil (param.csv) inte finns fyller du i parametervärdena manuellt. Se till att parametervärdena för fas och kanal innehåller bokstäver, medan parametervärdena för T-position och Z-position ska vara det största antalet t- och z-positioner. Om bildfilnamnen inte innehåller fasen eller kanalen anger du Na.
- Skapa TIFF-bilder i gråskala när det behövs. Lämna rutan Är bilderna grå? avmarkerad om du vill gråskala bilderna.
- Klicka på Ordna om du vill skapa en mapp med samma namn och _gray_stacks och generera mappar med samma namn och _# (#: z-positioner) i mappen. Observera att TIFF-filerna sorteras i motsvarande mappar efter z-positioner och att en fil med namnet param.csv genereras, där parametrarna och deras värden kan hittas.
- Använd TrackMate i FIJI för att extrahera fluorescensintensiteten hos cellerna av intresse från varje z-position.
OBS: Detta steg kan också utföras med annan bildhanteringsprogramvara.- Öppna TIFF-bilderna i en z-positionsmapp från FIJI.
- Kör TrackMate genom att klicka på Plugins | Spåra Paket | TrackMate, och justera följande parametrar om det behövs.
- Använd DoG- eller LoG-detektorer.
- Ändra blobdiameter, tröskelvärde och medianfilter. Justera blobdiametern så att den liknar cellernas diameter. Om cellerna är ovala justerar du blobdiametern så att den liknar delaxeln.
Att höja tröskeln hjälper till att undvika att bakgrundsbrus fångas upp som signaler utan att påverka signalintensiteterna (kompletterande figur 1). En höjning av tröskelvärdet kan dock missa sanna signaler (kompletterande figur 1). Om signalerna är starka, använd medianfiltret för att minska salt- och pepparbruset. - Ställ in filtren för att ta bort några, om inte alla, irrelevanta signaler. Filter X och Y är rumsliga filter. Använd filter X och Y för att ta bort irrelevanta signaler som är avlägsna från de verkliga signalerna.
OBS: När filter ställs in på en bild är det viktigt att kontrollera alla andra bilder för att säkerställa att de verkliga signalerna inte tas bort. - Ställ in länkande maxavstånd, gapstängande maxavstånd och gapstängande max ramgap. Ange det maximala länkavståndet och det maximala avståndet för mellanrumsstängning till 3x–5x blobdiametern, särskilt när samplingarna flyttas betydligt över tid, för att minska antalet spår. Ställ in det gapstängande maximala ramgapet till antalet bilder i stapeln.
- Exportera fluorescensintensiteten för de intressanta regionerna (ROI) till en CSV-fil. Om en gammal TrackMate-version används väljer du Exportera all spotstatistik i fönstret Välj en åtgärd. Om TrackMate-versionen är 7.6.1 eller högre, välj Fläckar i fönstret Visningsalternativ. Exportera eller spara som interaktiva filer till CSV-filer.
Båda filerna är interaktiva med bildfönstret; Om du markerar en avkastning på investeringen visas motsvarande avkastning i bildfönstret. Dessa filer inkluderar medelintensiteterna (MEAN_INTENSITY eller MEAN_INTENSITY_CH1) för cellerna av intresse vid motsvarande tidpunkter (POSITION_T). Samma TRACK_IDs bör representera samma avkastning på investeringen vid olika tidpunkter. Detta är dock inte alltid sant och kan behöva korrigeras manuellt vid behov. Om TrackMate inte känner igen ROI:erna vid vissa tidpunkter, visas inte dessa tidpunkter.
- Extrahera bakgrundsfluorescensintensiteten och skapa Background_list.csv filen.
OBS: I denna studie uppskattades bakgrundsintensiteten för varje z-position med hjälp av medelvärdet av tre till fem närliggande blobbar av samma storlek som inte innehöll fluorescenssignaler och var från olika tidpunkter.- Den Background_list.csv filen har ett obligatoriskt format: varje kolumn innehåller informationen om en neuron, från och med Neuron 0. Fyll i neuronnumren, till exempel Neuron 0, på rad 1. Ange sedan bakgrundsintensiteten för varje analyserad z-position - om fem z-positioner analyseras för Neuron 0, fyll i fem bakgrundsintensitetsvärden under Neuron 0.
OBS: Filen Background_list.csv krävs för funktionen TACI EXTRACT . Om bakgrunden är försumbar måste Background_list.csv med nollbakgrundsintensiteten för varje neuron tillhandahållas.
- Den Background_list.csv filen har ett obligatoriskt format: varje kolumn innehåller informationen om en neuron, från och med Neuron 0. Fyll i neuronnumren, till exempel Neuron 0, på rad 1. Ange sedan bakgrundsintensiteten för varje analyserad z-position - om fem z-positioner analyseras för Neuron 0, fyll i fem bakgrundsintensitetsvärden under Neuron 0.
- Använd funktionen EXTRAKT för att identifiera den maximala fluorescensintensiteten vid varje t-position och beräkna ΔF/F0 enligt ekvation 1.
(1)- Skapa en mapp och namnge den med hjälp av neuronnumret, med början från Neuron 0. Spara CSV-filerna som innehåller fluorescensinformationen för motsvarande neuron i mappen. Varje CSV-fil innehåller informationen om en z-position, så antalet CSV-filer är lika med antalet analyserade z-positioner. Namnge CSV-filerna som Mean_Intensity#.csv (# representerar z-positionen) och varje CSV-fil innehåller minst två kolumner: POSITION_T och MEAN_INTENSITY eller MEAN_INTENSITY_CH1.
Skapa en mapp för varje cell av intresse. - Spara Background_list.csv filen och mapparna som skapades i steg 2.7.1 i en mapp. Välj den här mappen genom att klicka på Bläddra bland filer.
Antalet bakgrundsvärden i Background_list.csv-filen måste matcha antalet Mean_Intensity#.csv-filer för varje neuron. - Bakgrundsfilen fylls i automatiskt. Fyll i det största antalet t-positioner för antalet T-positioner.
- Klicka på Extrahera för att skapa en resultatmapp, inklusive CSV-filer och diagram för varje neuron. CSV-filerna innehåller information om maximal fluorescensintensitet och ΔF / F0 vid varje t-position. Diagrammen är linjediagram över ΔF/F0 över t-positioner.
OBS: I denna studie beräknades ΔF/F0 med hjälp av ekvation (1). Det första värdet för varje z-position användes som F0. Om denna F0 inte är lämplig20, tillhandahåller plugin filer inklusive rådata för varje neuron i mappen python_files.
- Skapa en mapp och namnge den med hjälp av neuronnumret, med början från Neuron 0. Spara CSV-filerna som innehåller fluorescensinformationen för motsvarande neuron i mappen. Varje CSV-fil innehåller informationen om en z-position, så antalet CSV-filer är lika med antalet analyserade z-positioner. Namnge CSV-filerna som Mean_Intensity#.csv (# representerar z-positionen) och varje CSV-fil innehåller minst två kolumner: POSITION_T och MEAN_INTENSITY eller MEAN_INTENSITY_CH1.
- Använd MERGE-funktionen för att medelvärdet av varje neurons ΔF / F 0, beräkna SEM och plotta medelvärdet ΔF / F0 över t-positioner.
- Välj resultatmappen som skapats av EXTRACT-funktionen genom att klicka på Bläddra bland filer.
- Fyll i antalet T-positioner med det största antalet t-positioner.
- Klicka på Sammanfoga om du vill skapa en merged_data mapp, inklusive en merged_data.csv fil och ett Average_dF_F0.png diagram. CSV-filen innehåller information om genomsnittet och SEM ΔF / F0 vid varje t-position. Diagrammet är ett linjediagram över medelvärdet ΔF/F0 över t-positioner.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbetsflöde för 3D-kalciumavbildningsanalys
I denna studie utvecklade vi ett nytt ImageJ-plugin, TACI, och beskrev ett arbetsflöde för att spåra z-drift och analysera 3D-kalciumavbildning som identifierar svaren hos enskilda celler som förekommer i flera z-positioner (figur 1). Detta verktyg har fyra funktioner: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT och MERGE. För det första, om bildnamnen inte är kompatibla med funktionen ORGANISERA, kan funktionen RENAME konvertera bildnamnen till önskad struktur. Sedan fungerar ORGANIZE gråskalor (om det behövs) och organiserar 3D-kalciumavbildnings-TIFF-data efter z-positioner. Bilder från samma z-position sparas i en mapp. Därefter kan olika bildanalysverktyg användas för att upptäcka och spåra avkastningen och extrahera deras fluorescensintensiteter över tid för varje z-position. Ett ImageJ-plugin, TrackMate, användes för att utföra detta steg. TrackMate är ett ImageJ-plugin med öppen källkod för att spåra enstaka partiklar21. Det har använts i stor utsträckning för att spåra partiklar i olika biologiska studier som involverar levande cellavbildning, inklusive kalciumavbildning 11,21,22,23. TrackMate, på ett automatiserat sätt, spårar celler i lateral (x / y) riktning, upptäcker ROI och extraherar signaler från en live-imaging dataset 4,12. För varje cell av intresse sorterar EXTRACT-funktionen fluorescensintensiteterna från alla z-positioner med t-positioner, identifierar maximivärdena för varje t-position, subtraherar bakgrunden och beräknar och plottar ΔF / F0. Slutligen beräknar och plottar MERGE-funktionen medelvärdet av ΔF / F0 för flera celler.
Kalciumsvar från fluglarver kyla neuroner till temperaturförändringar
Vi validerade denna metod med hjälp av kalciumförändringar som svar på temperaturfluktuationer i fluglarvens kalla neuroner. En genetiskt kodad kalciumindikator, GCaMP6m 24, uttrycktes i larvala svala neuroner av Ir21a-Gal425. Vid exponering för cirka 27 °C hade neuronerna låga intracellulära kalciumnivåer (figur 2A och figur 3). När temperaturen sänktes till cirka 10 °C och hölls där, ökade de intracellulära kalciumnivåerna snabbt och bibehölls (figur 2B och figur 3). Kalciumnivåerna sjönk snabbt när temperaturen höjdes (figur 3).
Analysera en flughjärna 3D-kalciumbilddataset
Vi validerade också denna metod med hjälp av en flughjärna 3D-kalciumavbildningsdataset11. De avbildade transgena flugorna (VT50339-Gal4; UAS-GCaMP6f) uttryckte GCaMP6f i svampkroppen i hjärnan11. Data från 45 z-positioner (fördelade med 1,5 μm intervall) samlades in vid 50 Hz för 225 s (250 tidpunkter) och den första halvan av datasetet (125 tidpunkter) analyserades. När inspelningen började hade sju neuroner uppenbar fluorescens, och fyra av dem analyserades (figur 4A). Intensiteterna i dessa neuroner minskade med tiden (figur 4B). När oktanol applicerades (figur 4C) ljusnade flera neuroner. Fluorescensen hos 10 neuroner visade sig öka samtidigt vid tidpunkt 92 (Figur 4D), vilket tyder på att dessa svampneuroner svarar på oktanollukt. Även om oktanol applicerades i 5 s observerades hög fluorescens i dessa neuroner endast vid en tidpunkt (0,9 s) och sjönk sedan snabbt, vilket tyder på att svaret är fasiskt och övergående.
Separation av överlappande celler
Figur 5A presenterar en maximal projektionsbild av tre neuroner. Den vita pilspetsen pekar på två neuroner som överlappade i x/y-planet men var separata i ortovyn (blå och orange pilspetsar i figur 5B), vilket indikerar att dessa neuroner uppträdde i olika z-positioner; den orange cellen hade den starkaste signalen på z7 (figur 5C), medan den blå cellen hade den starkaste signalen på z10 (figur 5D). Verktyget skilde dessa två celler och avslöjade den fördröjda men starka aktiveringen av den orange cellen (figur 5E).
Figur 1: Arbetsflöde med TACI för att analysera 3D-kalciumavbildning. TACI har fyra funktioner: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT och MERGE. För det första, om TIFF-namnen inte är kompatibla med funktionen ORGANISERA , kan funktionen RENAME konvertera bildnamnen till önskad struktur. Sedan fungerar ORGANIZE gråskalor (om det behövs) och organiserar 3D-kalciumavbildnings-TIFF-data efter z-positioner. Bilder från samma z-position sparas i en mapp. Därefter kan olika bildanalysverktyg användas för att upptäcka och spåra avkastningen och extrahera deras fluorescensintensiteter i varje z-position. För varje cell av intresse sorterar EXTRACT-funktionen fluorescensintensiteterna med motsvarande tidpunkter, identifierar maximivärdena för varje t-position, subtraherar bakgrunden och beräknar och plottar ΔF / F0. Slutligen beräknar och plottar MERGE-funktionen medelvärdet av ΔF / F0 för flera celler. Förkortningar: TACI = TrackMate-analys av kalciumavbildning; ROI = regioner av intresse; ΔF/F0 = förhållandet mellan förändring i fluorescens och initial fluorescensintensitet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kalciumavbildning av fluglarver kyla celler i inaktiva och aktiva tillstånd. (A) Cellerna är knappt synliga i inaktivt tillstånd. (B) Cellerna är starkt fluorescerande i aktivt tillstånd. Olika färg pilspetsar indikerar olika celler. Genotypen är Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. Z5-13: Bilder vid z-positioner från 5 till 13. I B visas cellen som indikeras av de vita pilspetsarna på z5 till z8; Cellerna som indikeras med orange och blå pilspetsar visas på Z8 till Z13. Skalstång = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Kvantifiering av fluorescens som förändringen i fluorescensintensiteten (F) jämfört med den ursprungliga intensiteten (F0). Genotypen är Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. n = 7 celler från tre djur. Spår = medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Analysera en flughjärna 3D-kalciumavbildningsdataset. (A) Den maximala projektionsbilden vid tidpunkt 1 (t1). Siffrorna 0-3 anger de fyra analyserade neuronerna. (B) Fluorescensförändringar av neuroner 0-3 i A under tidpunkterna 0 till 125. (C) Den maximala projektionsbilden vid tidpunkten punkt 92 (t92). Siffrorna 0-9 anger de 10 analyserade neuronerna. (D) Fluorescensförändringar av neuroner 0-9 i C under tidpunkterna 0 till 125. Antingen 5 s luft eller 5 s oktanol applicerades, som visas i grått. Skalstapel = 10 000 enheter rå fluorescensintensitet. Förkortning: OCT = oktanol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Separation av överlappande celler baserat på det maximala värdet. (A) Två neuroner överlappar varandra (vit pilspets) i en maximal projektionsbild (m). Genotypen är Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. (B) Dessa neuroner är separata i ortovyn (blå och orange pilspetsar). (C,D) Den orange cellen visas på z7 (C), medan den blå cellen visas på z10 (D). Skalstång = 10 μm. (E) Fluorescensförändringarna hos de orange och blå cellerna kvantifieras med hjälp av maximivärdena från enskilda z-positioner. Förkortning: ΔF/F0 = förhållandet mellan förändring av fluorescens och initial fluorescensintensitet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Två neuroner med svaga kalciumsignaler analyseras med hjälp av DoG- och LoG-detektorer vid olika tröskelvärden. (A–C) Den första neuronen (Ir21a-Gal80 26/UAS-GCaMP6;Ir93a-Gal427) analyseras av DoG och LoG vid olika tröskelvärden. A) Tröskelvärdet är satt till 0,1. Både DoG och LoG upptäcker alla 36 tidpunkter. (B) Tröskelvärdet är satt till 0,3. Bland de 36 tidpunkterna upptäcker DoG 36 och LoG upptäcker 35. (C) Tröskelvärdet är satt till 1,0. Bland de 36 tidpunkterna upptäcker DoG 34 och LoG upptäcker 15. (D-F) Den andra neuronen (UAS-GCaMP6;Ir68a-Gal428) analyseras av DoG och LoG vid olika tröskelvärden. d) Tröskelvärdet är satt till 0,1. DoG upptäcker alla 36 tidpunkter och LoG upptäcker 34. E) Tröskelvärdet är satt till 0,3. Bland de 36 tidpunkterna upptäcker DoG 33 och LoG upptäcker 18. (F) Tröskelvärdet är satt till 1,0. Bland de 36 tidpunkterna upptäcker DoG 14 och LoG upptäcker bara en. Observera att en ökning av tröskeln inte påverkar dess intensitetsavläsning om en avkastning erkänns. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Det maximala värdet är en bra representant för en cells intensitet. (A) Z-stackar med olika z-avstånd simuleras. (B) Z-staplar med olika z-positioner simuleras. (C) Z-staplar skapas från simulerade celler med olika intensitet. Förkortningar: max = det maximala värdet för en z-stack; ground_truth = produkten av den simulerade cellens volym och dess fyllda intensitet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Jämförelse mellan TACI- och 3D-ROI-metoder. (A) Fluorescensförändringar i två celler som indikeras med orange och blått kvantifieras med hjälp av TACI och en anpassad programvara skriven i IGOR Pro. Genotyptypen är R11F02-Gal429; UAS-GCaMP6m. b) Fluorescensförändringar i två celler markerade med orange och blått kvantifieras med hjälp av TACI och IMARIS. Genotyptypen är Ir21a-Gal4; UAS-GCaMP6m. Förkortning: ΔF/F0 = förhållandet mellan förändring av fluorescens och initial fluorescensintensitet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie utvecklade ett nytt ImageJ-plugin, TACI, och beskrev ett arbetsflöde som analyserade 3D-kalciumavbildning. Många för närvarande tillgängliga verktyg fokuserar på att korrigera x / y-rörelsen, även om rörelse på z-axeln också måste diagnostiseras eller korrigerasexplicit 6. Under bildförvärv i en levande organism är rörelse på z-axeln oundviklig även när organismen är immobiliserad, och vissa stimuli, såsom temperaturförändring, orsakar ofta signifikant z-drift. Att öka höjden på z-stackarna gör det möjligt att spela in cellerna av intresse under hela bildprocessen; Det är emellertid inte trivialt att analysera rörelse på z-axeln, särskilt när enskilda celler visas i flera z-positioner. Om sådan rörelse ignoreras kommer forskare inte att få de exakta kalciumsvaren hos dessa celler. TACI korrigerar z-driften genom att extrahera fluorescenssignalerna från varje z-position. Ett kritiskt steg i TACI är att sortera det maximala värdet vid varje tidpunkt och använda det för att representera en cells intensitet. Därför är det viktigt att inkludera alla z-positioner för cellerna av intresse under avbildningsprocessen. Dessutom rekommenderar vi att du tillåter att en cell visas i fem eller fler z-positioner så att z-avstånden och z-positionerna inte påverkar maximivärdet (kompletterande figur 2A,B). Dessutom möjliggör TACI separation av celler som överlappar varandra i lateral (x/y) riktning men förekommer i olika z-positioner.
Z-drift kan också korrigeras genom att extrahera fluorescensintensiteter från 3D ROI 8,11,29. Vi jämförde TACI med två 3D-ROI-metoder. Först skapade Klein et al. en anpassad programvara skriven i IGOR Pro som använder de ljusaste 100 pixlarna i varje 3D-ROI för att generera råsignalen29. Denna metod och Taci gav liknande resultat (kompletterande figur 3A). För det andra använde vi IMARIS (version 9.8.2), en kommersiell programvara, för att modellera 3D-avkastningen och extrahera deras genomsnittliga intensiteter. Även om resultaten från Taci och IMARIS uppvisade liknande trender, var veckförändringarna olika (kompletterande figur 3B). Denna skillnad kan bero på algoritmer. Observera att det högsta värde som extraheras av TACI är proportionellt mot grundsanningsintensiteten (kompletterande figur 2C).
Även om detta arbetsflöde är halvautomatiskt och fortfarande kräver manuella ansträngningar från forskare, ger det en beräkningsmetod för 3D-kalciumbildningsanalys. Det är viktigt att detta arbetsflöde är baserat på ImageJ och inte kräver kommersiell programvara eller programmeringskunskap. Begränsningarna och potentiella lösningar för det här arbetsflödet är följande. För det första accepterar TACI endast TIFF-filer och en specifik filnamnsstruktur: filename_h#t#z#c#.tif (h# och c# är valfria). Andra filformat som är kompatibla med ImageJ kan dock enkelt konverteras till TIFF-filer av ImageJ. Dessutom har plugin en RENAME-funktion som konverterar bildnamnen till önskad struktur så att den är kompatibel med kalciumbilddata som erhållits från olika system.
För det andra är plugin utformat för kalciumbilddata med konstant bakgrund. Att subtrahera motsvarande bakgrundsinformation från ROI-intensiteterna vid varje tidpunkt är ett sätt att korrigera fluktuerande bakgrunder. Verktyget ger ROI-intensiteter vid varje tidpunkt i mappen python_files. Bakgrundsintensiteterna kan representeras av (1) bildernas medelintensiteter eller (2) medelintensiteten för avkastningen utan aktiva celler. ImageJ tillhandahåller metoder för att erhålla bildernas medelintensitet (genom att klicka på Bild | Stack | Mätstack) och medelintensiteten för slumpmässiga ROI (genom att klicka på Analysera | Verktyg | ROI-chef | Flera åtgärder). Om fotoblekning sker under kalciumavbildning, blekkorrigeringsfunktionen (genom att klicka på Bild | Justera | Bleach Correction) kan köras före TrackMate.
Slutligen måste cellregistrering över z-positioner inkluderas i detta arbetsflöde om man använder TACI för att analysera ett stort antal neuroner samtidigt. Följaktligen måste en ytterligare funktion utvecklas som organiserar informationen om fluorescensintensiteter i datastrukturen som krävs av MERGE-funktionen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
En Zeiss LSM 880 i Fralin Imaging Center användes för att samla in kalciumavbildningsdata. Vi tackar Dr. Michelle L Olsen och Yuhang Pan för deras hjälp med IMARIS-programvaran. Vi tackar Dr. Lenwood S. Heath för konstruktiva kommentarer om manuskriptet och Steven Giavasis för kommentarer om GitHub README-filen. Detta arbete stöddes av NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) och NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) till L.N. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förberedelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
References
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y., et al. jGCaMP8 fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
- Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., Zlatic, M. Calcium imaging analysis - How far have we come. F1000Research. 10, 258 (2021).
- Oh, J., Lee, C., Kaang, B. K. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 23 (4), 237-249 (2019).
- Stringer, C., Pachitariu, M. Computational processing of neural recordings from calcium imaging data. Current Opinion in Neurobiology. 55, 22-31 (2019).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Nguyen, J. P., Linder, A. N., Plummer, G. S., Shaevitz, J. W., Leifer, A. M. Automatically tracking neurons in a moving and deforming brain. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005517 (2017).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. EMC2: A versatile algorithm for robust tracking of calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. bioRxiv. , (2021).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Scientific Reports. 10, 7153 (2020).
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Eglen, S. J., et al. Toward standard practices for sharing computer code and programs in neuroscience. Nature Neuroscience. 20 (6), 770-773 (2017).
- Pachitariu, M., et al. Suite2p: Beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , (2017).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. Tracking calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. PLoS Computational Biology. 17 (10), 1009432 (2021).
- Kolar, K., Dondorp, D., Zwiggelaar, J. C., Høyer, J., Chatzigeorgiou, M. Mesmerize is a dynamically adaptable user-friendly analysis platform for 2D and 3D calcium imaging data. Nature Communications. 12, 6569 (2021).
- Moein, M., et al. CaSiAn: A Calcium Signaling Analyzer tool. Bioinformatics. 34 (17), 3052-3054 (2018).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Neugornet, A., O'Donovan, B., Ortinski, P. I. Comparative effects of event detection methods on the analysis and interpretation of Ca(2+) imaging data. Frontiers in Neuroscience. 15, 620869 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Fazeli, E., et al. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Research. 9, 1279 (2020).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ni, L., et al. The ionotropic receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Omelchenko, A. A., et al. Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae. Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nature Communications. 9 (1), 4252 (2018).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis. Science Advances. 7 (35), (2021).
- Klein, M., et al. Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).
