Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Enmolekylär avbildning av lateral rörlighet och jonkanalaktivitet i lipidlager med hjälp av total intern reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopi

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64970
Automatic Translation
1, 1
1Biophysics Department, Institute of Biomaterials and Biomolecular Systems, University of Stuttgart

Summary

Detta protokoll beskriver hur man använder TIRF-mikroskopi för att spåra enskilda jonkanaler och bestämma deras aktivitet i lipidmembran som stöds, vilket definierar samspelet mellan lateral membranrörelse och kanalfunktion. Den beskriver hur man förbereder membranen, registrerar data och analyserar resultaten.

Abstract

Högupplösta avbildningstekniker har visat att många jonkanaler inte är statiska utan föremål för mycket dynamiska processer, inklusive den övergående föreningen av porbildande och hjälpunderenheter, lateral diffusion och klustring med andra proteiner. Förhållandet mellan lateral diffusion och funktion är dock dåligt förstått. För att närma sig detta problem beskriver vi hur lateral rörlighet och aktivitet hos enskilda kanaler i stödda lipidmembran kan övervakas och korreleras med hjälp av total intern reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopi. Membran tillverkas på ett ultratunt hydrogelsubstrat med hjälp av droppgränssnitt dubbelskikt (DIB) teknik. Jämfört med andra typer av modellmembran har dessa membran fördelen att de är mekaniskt robusta och lämpliga för mycket känsliga analystekniker. Detta protokoll mäter Ca 2+ jonflöde genom enstaka kanaler genom att observera fluorescensemissionen av ett Ca2+-känsligt färgämne i närheten av membranet. Till skillnad från klassiska enkelmolekylära spårningsmetoder krävs inga fluorescerande fusionsproteiner eller etiketter som kan störa lateral rörelse och funktion i membranet. Möjliga förändringar i jonflöde i samband med konformationsförändringar av proteinet beror endast på proteinets laterala rörelse i membranet. Representativa resultat visas med användning av mitokondriell proteintranslokationskanal TOM-CC och bakteriekanalen OmpF. I motsats till OmpF är grinden av TOM-CC mycket känslig för molekylär inneslutning och typen av lateral diffusion. Därför är stödda dubbellager med droppgränssnitt ett kraftfullt verktyg för att karakterisera länken mellan lateral diffusion och jonkanalernas funktion.

Introduction

Detta protokoll syftar till att beskriva hur man studerar korrelationen mellan membranmobilitet och jonkanalpermeabilitet hos membran i polymerstödda droppgränssnitt dubbelskikt (DIB) membran 1,2,3.

Den nuvarande tekniken kompletterar en imponerande uppsättning avancerade optiska och ytanalytiska verktyg, såsom enkelpartikelspårning 4,5, fluorescenskorrelationsspektroskopi 6,7 och höghastighetsatomkraftmikroskopi 8,9,10. Dessa ger värdefulla insikter i den dynamiska sammansättningen och strukturen hos membran som påverkar membranbaserade reaktioner11,12,13. Medan rörelsen och lateral diffusion av proteiner beror på den lokala densiteten hos proteiner i membranet, kan enskilda proteinmolekyler också fångas i lipidflottar14 och genom protein-proteininteraktioner15,16. Beroende på proteindomänerna som sticker ut från membranet till den extracellulära miljön eller cytosolen kan proteinmobiliteten variera från mycket mobil till helt orörlig. På grund av membranets komplexitet och dess perifera strukturer är det emellertid ofta svårt att dechiffrera samspelet mellan den laterala rörlighetens natur och proteinfunktionen17.

DIB-membran har visat sig vara en effektiv plattform för biofysiska enmolekylära analyser av membranproteiner 18,19,20,21,22. De bildas genom lipid självmontering genom kontakt av vattenhaltiga droppar med hydrogelstödda substrat i en lipid / oljefas. I likhet med de vanliga stödda lipidbiskikten (SLB)1,23,24,25 tillåter DIB lokal inställning av den laterala rörligheten genom tillfällig eller permanent bindning av proteiner till polymermatrisen när de funktionaliseras med lämpliga ligander 17. Den senare kan fungera som ett modellsystem för biokemiska processer i cellmembran med en heterogen proteinfördelning10.

Den experimentella metoden som beskrivs här bygger på fluorescensen hos Ca 2+-känsliga färgämnen för att mätaCa2+-jonflödet genom enskilda kanaler i närheten av membranet 2,22 med hjälp av TIRF-mikroskopi. Detta optiska tillvägagångssätt begränsar belysningen av provet till ett avstånd nära membranet, vilket på grund av de fysikaliska egenskaperna hos det flyktiga excitationsljuset leder till en signifikant minskning av fluorescensbakgrunden. Det senare är en förutsättning om hög rumslig och tidsmässig upplösning krävs för detektion av enskilda molekyler. Till skillnad från klassiska elektrofysiologiska metoder26,27 krävs inga membranspänningar för att studera jonflöde genom enskilda kanaler. Vidare kräver metoden inte märkning med fluorescerande färgämnen eller molekyler som kan störa kanalernas laterala rörelse i membranet.

Metoden är särskilt användbar för att studera proteinkanaler inbäddade i membranet på enmolekylnivå utan att använda klassisk elektrofysiologi. Med hjälp av mitokondriell proteinledande kanal TOM-CC från Neurospora crassa28,29,30 och OmpF, som stödjer diffusionen av små hydrofila molekyler över det yttre membranet hos Escherichia coli17,31, illustrerar vi hur membranmobiliteter och kanalaktiviteter hos de två proteinerna kan studeras och korreleras. Vi föreslår att detta tillvägagångssätt, även om det är optimerat för TOM-CC och OmpF, lätt kan tillämpas på andra proteinkanaler.

Protocol

1. Proteinproduktion

OBS: I detta avsnitt beskrivs förfarandet för att isolera OmpF från Escherichia coli BE BL21(DE3) omp631,32, som saknar LamB och OmpC, och TOM-kärnkomplexet från Neurospora crassa (figur 1)28,29. Det senare kräver mitokondrier isolerade från en N. crassa-stam 28 innehållande en 6xHis-märkt form av TOM-underenheten Tom22 (figur 1A), som kan isoleras enligt beskrivningen28. Följande protokoll ger vanligtvis 1-2 mg N. crassa TOM-CC och 10 mg E. coli OmpF. Om mängden ska justeras är det viktigt att förhållandet mellan protein och tvättmedel bibehålls exakt. Om inget annat anges ska alla steg utföras vid 4 °C.

  1. Isolering av TOM-kärnkomplexet
    1. Solubilisera renade N. crassa mitokondrier (2 g protein) erhållna genom differentiell sedimentering från ca 1,5 kg (våtvikt) hyfer, enligt Bausewein et al.30, vid en proteinkoncentration av 10 mg/ml i 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 1% (w/v) DDM, 20% (v/v) glycerol, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol och 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) i 30 min vid 4 °C.
      VARNING: PMSF är giftigt. Använd lämplig personlig skyddsutrustning.
    2. Överför de solubiliserade mitokondrierna till ultracentrifugrör och separera de icke-lösliga membranen från lösliga membranproteiner genom ultracentrifugering vid 130 000 x g i 40 minuter vid 4 °C och filtrering med filterpapper av standardkvalitet.
    3. Balansera en färdigförpackad Ni-NTA-kolonn (volym 5 ml) med cirka 5 kolonnvolymer (CV) buffert A1 (tabell 1) med hjälp av ett automatiserat proteinreningssystem. Kör Ni-NTA-kolonnen med en konstant flödeshastighet på 1 ml/min under alla steg. Använd en kolonn med lägre volym (1 ml) om proteinerna har isolerats från mindre än 2 g mitokondrier.
    4. Fyll det lösliga proteinprovet på Ni-NTA-kolonnen med en flödeshastighet på 1 ml/min.
    5. Tvätta Ni-NTA-kolonnen med 5 CV buffert A1 (tabell 1) för att avlägsna obundna proteiner.
    6. Eluera His-märkt TOM-CC med 30% buffert A2 (tabell 1; 300 mM imidazol) och samla proteintoppen som den visas i 280 nm-kromatogrammet (figur 1B).
    7. För ytterligare rening av TOM-CC, balansera den färdigförpackade anjonbytarkolonnen (1 ml) med 5 CV vardera av buffert B1, B2 och B1 (tabell 1) med hjälp av det automatiserade proteinreningssystemet. Kör anjonbytarkolonnen med en konstant flödeshastighet på 1 ml/min under alla steg.
    8. Fyll på TOM-CC-toppfraktionen (steg 1.1.6) på anjonbytarkolonnen (flödeshastighet 1 ml/min).
    9. Avlägsna de obundna proteinerna genom att tvätta kolonnen med 5 CV buffert B1 (tabell 1) och en linjär saltgradient på 0–20 % buffert B2 (tabell 1).
    10. Eluera TOM-CC med en linjär saltgradient på 20%-35% buffert B2 och samla proteintoppfraktionen som den visas i 280 nm-kromatogrammet (figur 1C).
    11. Bedöm provets renhet med SDS-PAGE (figur 1D) och bestäm proteinkoncentrationen med hjälp av en kommersiellt tillgänglig proteinanalys, enligt tillverkarens protokoll (se materialtabell).
    12. Frys proteinproverna i flytande kväve och förvara dem vid -80 °C tills de används vidare.
      VARNING: Flytande kväve ska hanteras i väl ventilerade utrymmen. Använd lämplig personlig skyddsutrustning.
       
  2. Isolering av OmpF
    1. Återvinn E. coli-stammen BE BL21 (DE3) omp6, som saknar LamB och OmpC32, från ett fryst glycerollager under sterila förhållanden och stryk på en Luria-Bertani (LB) agarplatta (tabell 2). För att göra detta sprider du provet jämnt över hela plattan.
    2. Låt provet dra in i agarn i 5 minuter innan plattan vänds upp och ned med locket stängt och inkuberas över natten vid 37 °C.
    3. Välj en enda E. coli-koloni , inokulera 7,5 ml LB-medium (tabell 2) med denna enda koloni med en steril tandpetare och låt växa över natten (14 timmar) med omrörning (170 rpm) vid 37 ° C.
    4. Överför 2 x 1 ml E. coli-celler med sterila pipetter till 2 x 500 ml LB-medium (tabell 2) och låt växa över natten (~ 14 timmar) vid 37 ° C med omrörning (~ 170 rpm) i en shaker.
    5. Skörda cellerna genom centrifugering vid 5 000 x g i 20 minuter vid 4 °C, frys pelleten i flytande kväve och förvara vid -80 °C tills den används igen.
      OBS: Cellpelletens våtvikt är typiskt 5 g per 1 liter kultur. Vid denna tidpunkt kan protokollet pausas.
    6. Tina och suspendera cellerna (2 g) i 20 ml lysbuffert C1 (tabell 2) och passera suspensionen tre gånger vid 1 000 psi genom ett förkylt (4 °C) högtryckscellstörningssystem med en maximal provvolym på 35 ml enligt tillverkarens anvisningar.
      VARNING: Användning av en fransk press kan leda till allvarliga skador. Överskrid aldrig tryckgränsen för den använda cellen. Använd lämplig personlig skyddsutrustning.
    7. Ta bort obrutna celler från lysatet genom centrifugering vid 4 000 x g i 15 minuter och samla upp supernatanten.
    8. Samla upp membranen genom ultracentrifugering vid 100 000 x g i 1 timme.
    9. Återsuspendera membranpelleten i 10 ml buffert C2 (tabell 2) och blanda med en lika stor volym SDS-buffert C3 (tabell 2) med en kullagerglashomogenisator.
      VARNING: β-merkaptoetanol i buffert C3 är giftigt. Följ alla relevanta säkerhetsföreskrifter.
    10. Inkubera suspensionen i vattenbad vid 50 °C i 30 minuter.
    11. Centrifugera provet vid 100 000 x g vid 20 °C i 1 timme.
    12. Återsuspendera membranpelleten i 10 ml SDS-buffert C4 (tabell 2) med en kullagerglashomogenisator och inkubera suspensionen i vattenbad vid 37 °C i 30 minuter.
      OBS: Om pelleten inte kan resuspenderas, tillsätt mer SDS-buffert C4 upp till en volym på 20 ml.
    13. Centrifugera provet vid 100 000 x g vid 20 °C i 30 minuter och samla upp supernatanten.
    14. Blanda supernatanten med oktylpolyoxietylen (oktyl POE) till en slutlig tvättmedelskoncentration på 0,5 % (vikt/volym) och dialysera provet två gånger mot buffert C5 (tabell 2) vid 4 °C i 24 timmar. För detta ändamål, använd dialysslangar med en avstängning på 20 kDa, enligt tillverkarens instruktioner, och placera provet i dialysslangen eller enheten.
      OBS: Avskärningen av dialysslangen måste justeras om proteiner med andra molekylmassor dialyseras.
    15. Bedöm provets renhet med SDS-PAGE och bestäm proteinkoncentrationen med hjälp av en kommersiellt tillgänglig proteinanalys, enligt tillverkarens protokoll (Table of Materials).
      OBS: Prover uppvärmda till 95 °C visar monomera OmpF. Prover som inte värmts upp visar OmpF i trimerform (figur 1F).
    16. Stötfrys dialyserat OmpF i alikvoter i flytande kväve och förvara vid -20 °C tills vidare användning.
      VARNING: Flytande kväve ska hanteras i väl ventilerade utrymmen. Använd lämplig personlig skyddsutrustning.

2. Optisk enkanalsinspelning av jonkanaler i DIB-membran

OBS: Detta avsnitt beskriver proceduren för beredning av DIB-membran i mikrofabricerade polymetylmetakrylatkammare( PMMA) 2 för att övervaka lateral proteinrörelse och jonflöde genom enstaka jonkanaler17. Måtten och de exakta ritningarna för tillverkning av kammaren finns i Lepthin et al.2. Figur 2 ger en översikt över monteringen av PMMA-kammaren2 och bildandet av DIB-membranen. Om inget annat anges utförs alla steg vid rumstemperatur (RT). Figur 3 visar en schematisk representation av ett DIB-membran och hurCa2+ flöde genom ett enkanaligt protein används för att övervaka både rörelse i membranet och kanalens öppna-slutna tillstånd.

  1. Beredning av lipider
    1. Avlägsna lipidstamlösningen innehållande 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (25 mg/ml DPhPC) upplöst i kloroform från frysen vid -20 °C och värm till RT. För detta ändamål är det i allmänhet tillräckligt att värma upp provet långsamt för hand i några minuter.
      VARNING: Kloroform är giftigt. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och utför alla procedurer som involverar kloroform under en dragskåp.
    2. Överför 380 μl DPhPC-stamlösning (25 mg/ml DPhPC) till en injektionsflaska av glas. Undvik pipetter med gummitätningar. Använd istället mikroliter glassprutor med rostfria kolvar.
    3. Efter hantering av lipidstamlösningen, täck över lipidstamlösningen med AR- ellerN2-gas för att förhindra lipidoxidation. Använd lägsta möjliga gasflöde för att undvika avdunstning av det organiska lösningsmedlet i vilket lipiderna är upplösta eller stänk av lösningsmedelssprayerna från injektionsflaskan. Se till att locken på glasflaskorna som innehåller lipider med organiskt lösningsmedel är belagda med polytetrafluoreten (PTFE) på insidan.
    4. Torka lipidprovet (steg 2.1.2) under en ström avN2 och avlägsna det återstående organiska lösningsmedlet från lipidprovet över natten under vakuum (2,0 mbar) med en oljefri vakuumpump.
    5. Lös upp lipidfilmen i hexadekan/silikonoljelösning genom att tillsätta lika stora volymer hexadekan och silikonolja (500 μL vardera) med en mikroliter glasspruta till en slutlig lipidkoncentration på 9,5 mg/ml.
      OBS: Lipidlösningen är stabil vid RT i flera veckor.
  2. Framställning av agaroshydrogel
    1. Bered ca 1 ml lågsmältande agaroslösning (0,75 % [vikt/volym]) i dubbelavjoniserat vatten och värm till 85 °C i ett värmeblock i 20 minuter för användning för centrifugering av glastäckglas.
      OBS: Agaroslösningen kan förvaras vid RT i flera veckor och kan värmas upp flera gånger.
    2. Bered 2,5 % (vikt/volym) agaroslösning med låg smältning i 0,66 M CaCl 2 och 8,8 mM HEPES (pH7,2 ) och värm till 85 °C i ett värmeblock i 20 minuter. Se till att agarosen är väl smält.
      OBS: Agaroslösningen kan förvaras i flera veckor vid rumstemperatur och kan värmas upp flera gånger, precis som agarosen (steg 2.2.1) som används för spinnbeläggning.
  3. Polymetylmetakrylat (PMMA) kammarmontering och lipidmonolagerbildning vid hydrogelen hexadekan / silikonoljegränssnittet
    1. Placera några glastäcken (40 mm x 24 mm x 0,13 mm) i en täckhållare i rostfritt stål och rengör dem i en glasbägare i 10 minuter med aceton i en ultraljudsrengörare. Använd precis tillräckligt med aceton för att sänka ner täckglasen och täck bägaren löst med en glasplatta för att skapa ett trycklöst, slutet system som minimerar utsläpp av ångor under rengöringsprocessen.
      VARNING: Aceton är ett mycket brandfarligt lösningsmedel med låg flampunkt. Ång-/luftblandningar är explosiva. Använd ultraljudsrengöraren i ett väl ventilerat område. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och följ officiella säkerhetsåtgärder (t.ex. inga öppna lågor och inga gnistor).
    2. Skölj glastäcket med dubbelavjoniserat vatten och torka dem under en ström avN2.
      OBS: Täckglas som rengörs på detta sätt kan lagras i flera veckor.
    3. Rengör och hydrofilisera ett täckglas ytterligare i en plasmarenare med syre (0,5 mbar) i 5 minuter.
      OBS: Utför detta steg omedelbart före centrifugering med agaroslösning, eftersom den hydrofila effekten av plasmarengöring avtar med tiden.
    4. Montera ett plasmabehandlat täckglas på en spinnlacker (figur 2, steg 1).
    5. Belägg täckglaset med en submikrometertjock film av agaros genom att långsamt tillsätta 140 μL uppvärmd 0,75 % (vikt/volym) lågsmältande agaros (steg 2.2.1) vid 3 000 varv/min i 30 sekunder med en 200 μl pipett (figur 2, steg 1).
      OBS: Agarosfilmens tjocklek kan bestämmas genom atomkraftmikroskopi (AFM), enligt beskrivningen17.
    6. Fäst omedelbart det spinbelagda täckglaset med det tunna lagret av agaroshydrogelen på undersidan av PMMA-kammaren2. Se till att agaroshydrogelen pekar uppåt (figur 2, steg 2).
    7. Fäst täckglasets kanter på PMMA-mikrobearbetad enhet med transparent tejp.
    8. Placera PMMA-enheten på en värmeplatta uppvärmd till 35 °C (figur 2, steg 3).
    9. Häll försiktigt 200 μl 2,5% agaroslösning (steg 2.2.2) i kammarens inlopp med en pipett (figur 2, steg 3), utan att skapa luftbubblor så att den tunna hydrogelen som appliceras med spinnbeläggning kan balansera med bufferten av 2,5% agaroslösningen och förbli hydratiserad. Se till att 2,5 % agaroslösning sprids runt den spinbelagda agaroshydrogelen men inte över den (figur 3A), vilket kan undvikas genom att försiktigt trycka PMMA-kammaren på värmeplattan.
    10. Täck omedelbart PMMA-kammarens brunnar (figur 2, steg 4) med totalt 60 μl lipid/oljelösning (steg 2.1.5) för att initiera bildning av lipidmonolager vid gränssnittet mellan agaros och olja och för att undvika uttorkning av den spinbelagda agarosen i PMMA-kammarens brunnar. Förvara enheten på en värmeplatta vid 35 °C i cirka 2 timmar.
      OBS: De cirkulära brunnarna i PMMA-kammaren har en diameter på 0,5 mm och ett djup på 1,8 mm, enligt tidigare publicerat arbete2.
  4. Beredning av lipidbelagda vattenhaltiga droppar i hexadekan/silikonoljelösning
    1. Placera 20 μl lipidhexadekan/silikonoljelösning (steg 2.1.5) i var och en av flera mikrofabricerade brunnar i en droppinkubationskammare (figur 2, steg 4). Lämpliga behållare för lipidhexadekan/silikonoljelösningen är små urtag på 40 mm x 30 mm x 3,5 mm i en tunn PMMA-platta2.
    2. Bered en mikrokapillär glasnål med en spetsöppningsdiameter på 20 μm med hjälp av en vertikal eller horisontell mikropipettdragare (t.ex. används för att tillverka patchpipetter eller vassa glaselektroder). Uppskatta öppningsdiametern på mikrokapillärglasnålen under ett binokulärt stereomikroskop vid låg förstoring, i ett zoomområde mellan 7,5x och 35x.
      OBS: Inställningarna för förvärmningsläget innan glaskapillären dras, uppvärmningsläget för dragning och dragkraften bör bestämmas experimentellt i förväg, enligt tillverkarens specifikationer för draganordningen och typen av kapillär.
    3. Fyll den mikrokapillära glasnålen med 5 μL vatteninsprutningslösning innehållande 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl och 30 nM TOM kärnkomplex, alternativt 20 nM OmpF med en mikrokapillärpipettspets. Använd endast dubbeldestillerat vatten som tidigare behandlats med ett kelaterande harts som binder multivalenta metalljoner (Ca2+) för att bereda den vattenhaltiga injektionslösningen.
    4. Montera den mikrokapillära glasnålen med den vattenhaltiga injektionslösningen på en piezodriven nanoinjektor.
    5. Injicera 100–200 nL vattenhaltiga droppar (figur 2, steg 4) innehållande 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl och 30 nM TOM-kärnkomplex (steg 1.1.12), eller alternativt 20 nM OmpF (steg 1.2.16) i brunnarna i droppinkubationskammaren fylld med lipidhexadekan/silikonoljelösning (se 2.1.5) med användning av nanoinjektorn. Se till att dropparna inte vidrör varandra genom att placera dem flera millimeter (>10 mm) från varandra i brunnarna. Annars, om lipidmonolager ännu inte har bildats vid olje-buffertgränssnittet, kommer de att smälta samman till större droppar.
      OBS: Om inga klasskapillärer och inga nanoinjektorer finns tillgängliga kan dropparna alternativt framställas manuellt med enkanaliga mikroliterpipetter för volymer mellan 0,1 μL och 0,5 μL, enligt beskrivningen2. I det här fallet är dock droppvolymerna inte lika exakta.
    6. Tillåt bildandet av ett lipidmonolager vid gränssnittet mellan dropp och olja i ca 2 timmar genom att PMMA och droppinkubationskamrarna (figur 2, steg 4) hålls på en värmeplatta uppvärmd till 35 °C.
  5. Beredning och avbildning av enstaka jonkanaler i DIB-membran
    1. Överför enskilda vattenhaltiga droppar manuellt från droppinkubationskammarens brunnar under ett stereomikroskop till brunnarna i PMMA-kammaren (figur 2, steg 5) med en enkanals mikroliterpipett med en engångsspets av polypropen på 10 μL. Låt dropparna sjunka ner på lipidmonolagren som bildas vid hydrogel-oljegränssnittet i ca 5 minuter för att bilda ett lipiddubbelskikt (figur 3) mellan dropparna och agaroshydrogelen.
    2. Montera PMMA-kammaren med DIB-membran på provhållaren i ett inverterat ljusmikroskop och bedöm membranbildningen med hjälp av ett 10x Hoffman-moduleringskontrastmål (figur 2, steg 6). DIB-membranbildning indikeras av en klar vit ring vid gränssnittet mellan droppen och hydrogelen (figur 4A). DIB-membran som har brutits visar inte denna ring (figur 4B).
      OBS: Alternativt kan DIB-membranen visualiseras vid 10x förstoring genom faskontrast eller differentialinterferenskontrastmikroskopi (DIC).
    3. Om DIB-membran har bildats, montera PMMA-kammaren på provhållaren i ett TIRF-mikroskop (figur 2, steg 7) utrustad med en konventionell ljuskälla för epifluorescensbelysning, en 488 nm laser (Pmax = 100 mW) och en bakgrundsbelyst elektronmultiplicerande CCD-kamera (512 x 512 pixlar; >95% QE) för att uppnå en pixelstorlek på ~ 0,16 μm.
    4. Fokusera kanten på ett DIB-membran med ett 10x förstoringsmål under epifluorescensbelysning med en högintensiv ljuskälla med hjälp av en GFP-filteruppsättning.
    5. Finfokusera samma kant på DIB-membranet vid hög förstoring med ett 100x / N.A. 1,49 apokromatolja TIRF-mål, återigen under epifluorescensbelysning, med den högintensiva ljuskällan med hjälp av en GFP-filtersats som gör det möjligt att visualisera svag bakgrundsfluorescens av det fluorescerande färgämnet Fluo-8 i droppen (figur 4C).
    6. Ändra filterinställningen från GFP till fyrbands TIRF-filteruppsättningen.
    7. Slå på 488 nm-lasern och ställ in laserns intensitet på objektivlinsen till ett värde mellan 8 mW och 10 mW.
      OBS: Eftersom det ofta inte finns någon kvantitativ information om laserintensiteten vid objektivlinsen, bör laserintensitetsinställningarna kalibreras i förväg i separata mätningar vid linsen, med en optisk lasereffektmätare utrustad med en fotodiodsensor, enligt tillverkarens specifikationer.
      VARNING: För att säkerställa säker drift av lasern måste operatören vara medveten om de möjliga farorna med laserstrålning och bestämmelserna om förebyggande av olyckor.
    8. För att visualisera enskilda jonkanaler, justera TIRF-vinkeln och EMCCD-kameraförstärkningen (t.ex. EM-förstärkningsmultiplikatorinställning: 285) så att öppna jonkanaler i DIB-membranet visas som fluorescerande fläckar med hög kontrast på en mörk bakgrund (figur 4D-G), och signal-till-bakgrundsförhållandet, när det inspekteras visuellt, når ett maximum. Se till att fläckarna, motsvarande Ca2+-flöde genom enstaka jonkanaler, förblir i fokus och har en rund form, med hög intensitet i mitten och gradvis avtagande mot periferin. Membran utan kanaler visar endast bakgrundsfluorescens (figur 4C).
    9. Innan du registrerar enskilda kanalers rörelse och öppna-slutna aktivitet över tid, kontrollera att fluorescerande fläckar är i fokus, för att säkerställa att jonkanalerna har rekonstituerats till DIB-membranen och rör sig i sidled i membranplanet. Om så inte är fallet kan det indikera att en fluorescerande molekyl doppar in och ut ur det flyktiga fältet som genereras av lasern nära membranet.
    10. Spela in en serie membranbilder som möjliggör korrekt spårning av positionen och övervakning av det öppna-slutna tillståndet för de enskilda jonkanalerna. För att bestämma typen av lateral rörlighet (t.ex. fri rörelse kontra transient förankring [för referens, se16]) och tillståndet för kanalaktivitet (t.ex. öppen eller stängd), förvärva tillräckligt långa (t.ex. 30 s till 1 min) och väl samplade banor (t.ex. bildhastighet på 48 s-1).
      OBS: Observationen av kanaliserad, begränsad eller humlediffusion16 kräver att samplingsfrekvensen är tillräckligt snabb för att mäta obegränsad diffusion inom begränsade gränser. Se dessutom till att dataprovtagningstiden är tillräckligt lång för att mäta övergången från obegränsad till begränsad diffusion (för detaljer, se Jacobson et al.16).
  6. Bild- och databehandling
    OBS: Bildbehandlingspaket med öppen källkod33 eller självskrivna rutiner17 baserade på kommersiella programvarupaket kan användas för att analysera den spatiotemporala dynamiken hos enskilda jonkanaler i DIB. För att kunna korrelera lateral membranrörlighet med jonflödet genom de enskilda kanalerna bör inga filteralgoritmer tillämpas.
    1. Korrigera bildtidsserier för blekning genom att tillämpa standardprocedurer34 med hjälp av självskrivna rutiner, genom att anpassa den genomsnittliga bildintensiteten Equation 1 för hela bilden till Equation 2, där t är ramindex (tid) och akär anpassningsparametrarna. Korrigera sedan tidsserien enligt Equation 3, där I(t) är intensiteten. Alternativt, för inledande dataanalyser, utför bakgrundskorrigeringar med hjälp av programvara med öppen källkod med implementerade rullande bollalgoritmer33 och en rullande bollradie, beroende på kamerans spot- och pixelstorlek (t.ex. 50 pixlar).
    2. Bestäm de rumsliga positionerna och amplituderna för en fluorescenspunkt inom ett definierat område av intresse (ROI) (t.ex. 30 x 30 pixlar) genom att anpassa I(t) vid en given tidpunkt t till en tvådimensionell gaussisk funktion med plan lutning som tar hänsyn till Equation 4möjliga lokala belysningsgradienter enligt . Här är x = (x, y) ROI med fluorescensintensitetsinformationen, A och σ är Gaussians amplitud och bredder, pk är parametrar som karakteriserar bakgrundsintensiteten för ROI och μ = (x 0, y 0) definierar Gaussians position. Jonflödet genom en enskild kanal ges av parametern A. Kanalens bana ges av x och möjliggör bestämning av kanalens laterala rörlighet. Alternativt är det möjligt att bestämma positionerna och intensiteterna för enskilda platser med hjälp av plattformar med öppen källkod33 och plug-ins enligt beskrivningen35,36. Uppskatta positionsnoggrannheten37 efter omvandling av EMCCD-kamerans avläsning till fotonnummer38.
    3. Plotta fluorescensamplituden A mot tiden och motsvarande bana x för att bestämma en möjlig korrelation mellan kanaldiffusiviteten och jonflödet genom kanalen. Utför detta med vilken grafikprogramvara som helst. Vid fri lateral kanalrörelse bestämmer du den laterala diffusionskoefficienten D genom linjär regression av tidsfördröjningen τ och beräknar den genomsnittliga kvadratförskjutningen av fläckarna från x enligt Equation 5.
      OBS: Typiska diffusionskoefficienter17 för TOM-CC och OmpF som rör sig fritt i DIB-membran varierar mellan 0,5 och 1,5 μm2 s-1. Molekyler vars diffusionskonstant är mindre än 0,01 mm2·s-1 definieras som immobiliserade17.

Representative Results

Elektrodfri optisk enkanalsinspelning i realtid avslöjar samspelet mellan lateral proteinrörelse och funktionen hos enskilda jonkanaler i DIB-membran. Rekonstituering av det mitokondriella TOM-kärnkomplexet (figur 1A) till ett DIB-membran (figur 4D) illustrerar en stark tidsmässig korrelation mellan lateral rörlighet och jonpermeabilitet (figur 5A). TOM-CC-grinden verkar vara känslig för läget för lateral rörelse17. Rörliga kanaler visar Ca2+ flöde genom sina porer och höga fluorescenspunktintensiteter. Fångade, icke-rörliga molekyler visar låga och medelstora fluorescensintensiteter. För den allmänna proteinimportporen i mitokondrierna TOM-CC avslöjade denna enda molekylmetod en stark tidsmässig korrelation mellan lateral rörlighet och jonpermeabilitet, vilket tyder på att TOM-CC-kanalen har mekanokänsliga egenskaper17. Ett lateralt stopp av fritt rörliga TOM-CC-molekyler åtföljs av en partiell eller fullständig stängning av TOM-CC-kanalen. Avbildning av DIB-membran med OmpF (figur 1E och figur 4F), som är nästan helt inbäddade i membranet, visar inga stop-and-go-effekter (figur 5B). Slumpmässiga stopp av OmpF är inte förknippade med en förändring i intensitet och därmed med stängningen av dess porer. Baserat på fluorescenssignalerna38 kan positionsnoggrannheten för de enskilda kanalerna uppskattas i intervallet mellan 5 och 10 nm. Det bör dock noteras att denna noggrannhet inte kan uppnås om kanalerna vacklar något på grund av mobil förankring med agaroshydrogelen, som visas till exempel för TOM-CC-molekylerna i ett mellanliggande tillstånd med en rotmedelförskjutning på 120 nm (figur 5A).

Figure 1
Figur 1: Isolering av TOM-CC. a) Cryo EM-struktur av N. crassa TOM-CC30,39. Mitokondrier från en N. crassa-stam innehållande en Tom22 med en 6xHe-tagg solubiliserades i DDM och utsattes för Ni-NTA-affinitetskromatografi (B) och anjonbyteskromatografi (C). (D) SDS-PAGE för isolerad TOM-CC. (E) Kristallstruktur (PDB, 1OPF) och (F) SDS-PAGE av renad E. coli OmpF. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Flödesschema för PMMA-kammarmontering. Steg 1: Ett glastäckglas är spin-belagt med en agaroshydrogel. Steg 2: Det spinbelagda täckglaset monteras i en skräddarsydd PMMA-mikroskopikammare. Steg 3: Ytterligare agaros med låg smälthalt tillsätts i PMMA-kammarens inloppsport på en 35 °C värmeplatta. Steg 4: Lipidmonolager bildas runt vattenhaltiga droppar vid ett buffert-/oljegränssnitt (vänster) och på agaroshydrogel/oljegränssnittet (höger). Steg 5: Individuella vattenhaltiga droppar pipetteras in i brunnarna i PMMA-kammaren för att bilda ett lipiddubbelskikt vid kontakt med de två lipidmonolagren. Steg 6: Bildandet av DIB-membranen valideras med Hofmann-moduleringskontrastmikroskopi. Steg 7: Bilder av utvalda områden av DIB-membranen med införda jonkanaler erhålls genom TIRF-mikroskopi. Grön: 0,75% agaros; gul: 2,5% agaros innehållandeCa2+ joner; magenta: lipid / oljefas; mörkblå: vattenhaltig droppbuffert innehållande Ca2+-känsligt färgämne och protein. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Experimentell uppställning . (A) Schematisk representation av ett DIB-membran i en PMMA-brunn. Dubbelskiktet vilar på en ultratunn 0,75% agarosfilm för att möjliggöra TIRF-avbildning av Ca2+-flöde genom en jonkanal över tid med användning av ettCa2+-känsligt fluorescensfärgämne (Fluo-8) i trans. (B) Ca2+-flödet styrs uteslutande av det osmotiska trycket från cis till trans. Detta möjliggör både bestämning av positionen i membranet och kanalens öppna-slutna tillstånd . Kanalen som visas här är den proteinledande kanalen TOM-CC av N. crassa mitokondrier30. (C) Bana för en enda TOM-CC-kanal. Grön: rörlig kanal; Gul: Kanal som inte rör sig. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Avbildning av TOM-CC och OmpF i DIB-membran. (A) DIB-membran avbildat med Hoffmanns moduleringskontrastmikroskopi som visar dubbelskiktets kontaktyta mellan hydrogelen och droppen. (B) Brutet DIB-membran avbildat enligt (A). Pil, kant av PMMA-kammaren. (C) DIB-membran avbildat med TIRF-mikroskopi utan proteinkanaler. (D) DIB-membran med rekonstituerad TOM-CC, avbildad med TIRF-mikroskopi. De vita fyrkanterna markerar fläckar med hög (SH), mellanliggande (SI) och låg (SL) intensitet. (E) Anpassning av fluorescensintensitetsprofilen för de tre punkterna markerade i (A) till tvådimensionella Gaussfunktioner avslöjar positionen för enskilda TOM-CC och Ca2+ -flödet genom kanalen. F) DIB-membran med rekonstituerat OmpF. (G) Gaussisk passning av den fluorescerande punkt som är markerad i (F). I motsats till det tvåporiga β-fats proteinkomplexet TOM-CC avslöjar OmpF med tre porer β fat endast ett permeabilitetstillstånd. Pixelstorlek, 0,16 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Kanalaktivitet korrelerar med lateral rörlighet för TOM-CC. (A) Den fluorescerande amplitudspåret (överst) och motsvarande bana (botten) för TOM-CC indikerar att den öppna-slutna kanalaktiviteten för TOM-CC korrelerar med komplexets laterala membranrörlighet. Banan visar tre permeabilitetstillstånd. Grön: helt öppet tillstånd; gul: mellanliggande permeabilitetstillstånd; röd: stängt kanaltillstånd; röd stjärna: TOM-CC i mellanläge vinglar runt sin medelposition med cirka ±60 nm. Positionsnoggrannheten37 baserad på fluorescenssignalerna i helt öppna och mellanliggande tillstånd varierar mellan 5 nm och 10 nm. (B) Fluorescerande amplitudspår (överst) och motsvarande bana (botten) för OmpF. OmpF avslöjar bara en intensitetsnivå, oavsett om den är i rörelse eller fångad. Bansegmenten som motsvarar tidsperioderna för fångade molekyler är markerade i grått. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Buffert  Reagenskoncentrationer Volym
A1* 20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1 % (vikt/volym) n-dodecyl-β-D-maltosid (DDM), 10 % (v/v) glycerol, 300 mM NaCl och 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) 100 ml
A2* 20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1% (w/v) DDM, 10% (v/v) glycerol, 1 M Imidazol och 1 mM PMSF 100 ml
B1* 20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (w/v) DDM, 2% (v/v) dimetylsulfoxid (DMSO) 100 ml
B2* 20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (w/v) DDM, 1 M KCl, 2% (v/v) dimetylsulfoxid (DMSO) 100 ml
* Gasa och passera genom ett 0,22 μm filter före användning.

Tabell 1: Buffertlösningar för TOM-CC-isolering.

Buffert  Reagenskoncentrationer Volym
LB* 1% (w/v) trypton, 1% (w/v) NaCl och 0,5% (w/v) jästextrakt 1100 ml
C1 2 mM MgCl2 och ~750 enheter DNAse och 50 mM Tris-HCl pH 7,5 20 ml
C2 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 50 ml
C3 4% (w/v) natriumdodecylsulfat (SDS), 2 mM β-merkaptoetanol och 50 mM Tris-HCl pH 7,5 50 ml
C4 2% (w/v) SDS, 500 mM NaCl och 50 mM Tris-HCl pH 7,5 50 ml
C5 0,5% (w/v) oktylpolyoxietylen (oktyl POE), 1 mM EDTA och 20 mM Tris pH 8,5 1000 ml
* Sterilisera före användning.

Tabell 2: Buffertlösningar för OmpF-isolering.

Discussion

Protokollet som presenteras här ger en introduktion till användningen av DIB-membran för att studera samspelet mellan lateral jonkanalrörelse och kanalfunktion med hjälp av enmolekylär TIRF-mikroskopi. För att få bästa möjliga data är beredningen av stabila DIB-membran med så många välseparerade kanaler som möjligt avgörande för att erhålla tidsserier av enskilda partiklar, som kan analyseras på ett tillfredsställande sätt.

Kritiska parametrar som ska optimeras inkluderar valet av lipid, lipidkoncentrationen i oljefasen och protein- och tvättmedelskoncentrationerna i vattenhaltiga droppar. De lipider som används är ovanliga eftersom de inte visar någon tydlig fasövergång vid låga temperaturer. DPhPC är en vanlig lipid för att producera stabila membransystem40. I princip kan vilken lipid som helst som bibehåller sin vätskemiljö vid låga temperaturer vara lämplig för denna applikation. Dessutom bör lipiden inte vara känslig för oxidation. Tvättmedelskoncentrationen i dropparna bör vara så låg som möjligt för att undvika membranbrott. Stabila membran och goda proteininblandningshastigheter uppnås i allmänhet med tvättmedelskoncentrationer under den kritiska micellkoncentrationen (cmc), förutsatt att membranproteinet inte fälls ut.

Om DIB-membranen inte tål specifika tvättmedel21,41, eller om proteinerna inte integreras från låg tvättmedelslösning i DIB-membranen, kan proteinkanalerna först rekonstitueras till små unilamellär lipidvesiklar (SUV), som sedan smälts samman med DIB-membranen från droppsidan, vilket framgångsrikt har visats för E. coli MscL 42 . Ibland bildas inte DIB-membran eftersom lipidkoncentrationen i oljefasen är för låg. För att förhindra att DIB-membran spricker bör man också vara medveten om att det osmotiska trycket mellan hydrogelen och droppen måste balanseras exakt utan att påverka Ca2+-flödet från cis till trans för mycket. Optimerad agarostjocklek och maskstorlek verkar vara avgörande för att observera diffusionen av membranproteiner. Eventuell torkning av agarosskiktet bör undvikas. Tjockleken kan bestämmas med hjälp av atomkraftmikroskopi17. Genom att variera agaroskoncentrationen, volymen och rotationshastigheten under spinnbeläggning kan hydrogelens maskstorlek och tjocklek optimeras. Observera dock att hydrogelskiktets tjocklek påverkar bildkontrasten. För att fånga membranproteiner i DIB kan agaroshydrogelen ersättas med specialsyntetiserad, icke-tvärbunden, Ni-NTA-modifierad, lågsmältande agaros för att fånga dem via en His-tag17. En alltför hög fluorescensbakgrund orsakas ofta av bristning av DIB-membranen. Detta är särskilt ett problem med flerbrunnskammare, eftersom det Ca2+-känsliga färgämnet diffunderar in i hydrogelen. I detta fall bör intilliggande brunnar undvikas. Fluorescensblekning av det Ca2+-känsliga färgämnet ovanför membranet bör inte vara en signifikant begränsande faktor, eftersom den utbyts av oexciterade färgämnen i huvuddelen av droppen (figur 3A) utanför TIRF-evanescentfältet. Lokaliseringsprecisionen för proteinet ges av noggrannheten att passa fläckarna och pixelstorleken.

Svaga fluorescenssignaler kan orsakas av lågt Ca2+-flöde genom kanalen. Möjliga orsaker inkluderar: (i) felaktiga TIRF-inställningar (t.ex. laserintensitet), (ii) det osmotiska Ca 2+ trycket över membranet, eller (iii) kanalernas inneboende Ca2+-permeabilitet är för låg. För att klara det första problemet måste laserintensitet, TIRF-vinkel och kameraförstärkning optimeras. De två senare problemen kan övervinnas genom applicering av en elektrisk potential över membranet 2,43. Tillämpningen av externa spänningar kan dock snedvrida resultatet, eftersom elektriska effekter kan påverka kanalöppningen av ligandstyrda eller mekanokänsliga jonkanaler som faktiskt inte är spänningsstyrda. Exempel på sådana kanaler är mitokondriella proteintranslokasen TOM-CC27 och dess kanalbildande underenhet Tom40 26,44,45,46. Slutligen bör det noteras att det är svårt att införa membranproteiner i DIB-membran i en specifik orientering för att uppnå önskad funktionalitet, och kvantitativa studier är sällsynta47,48. I vissa fall är orienteringen av de integrerade proteinerna slumpmässig. Detta är ett allvarligt problem för att studera membranproteiner, eftersom vissa membranproteiner aktiveras på endast ena sidan av membranet.

TIRF-mikroskopi är en kraftfull metod för att hantera enmolekylära händelser i plana stödda membran49. Exempel inkluderar montering och vikningsvägsbelysning av kanalproteiner såsom α-hemolysin50, perfringolysin O 51 och OmpG52. Dessa studier inkluderade FRET som en ytterligare teknik. Dessutom har aktivering av den mekanokänsliga jonkanalen MscL tidigare studerats genom mekanisk stimulering av stödda DIB-bilager42 med hjälp av strömmätningar. Baserat på detta arbete kan framtida studier kombinera plattformen som beskrivs här med FRET-experiment med en molekyl för att adressera mekanokänsliga kanaler på enmolekylnivå på ett optiskt sätt17. Injektion av buffert i droppen, sträckning av det inre DIB-monolagret eller riktad bindning av enskilda kanaler till den underliggande hydrogelen kan användas för att ytterligare studera inte bara den fysiska mekanismen för mekaniskt aktiverade kanaler, som svarar på membranspänning och / eller krökning som visas för MscL och MscS, tvåpordomänen K + -kanaler, TREK-1, TREK-2, och TRAAK, och PIEZO (för granskning, se53), men också lokal bindning till det cellulära cytoskelettet, som visas för den beröringskänsliga jonkanalen NOMPC54,55.

Disclosures

Vi deklarerar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi tackar Beate Nitschke för hennes hjälp med proteinberedning och Robin Ghosh, Michael Schweikert (Stuttgart) och Maximilan Ulbrich (Freiburg) för insiktsfulla diskussioner. Detta arbete stöddes av Stuttgart Research Center Systems Biology (SRCSB) och ett bidrag från Baden Württemberg Foundation (BiofMO-6 till SN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850356C
100x Oil objective Apochromat N.A. 1.49 Nikon MRD01991 TIRF microscope 
10x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.25  Nikon Microscope to assess DIB membrane formation  
10x objective N.A. 0.25 Nikon MRL00102 TIRF microscope 
40x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.55 Nikon Microscope to assess DIB membrane formation  
488 nm laser, 100 mW   Visitron TIRF microscope 
Adhesive tape
Äkta pure   Cytiva Protein purification system
Bradford assay kit, Pierce Thermo Fisher  23236
CaCl2 Roth 5239.2
Chelax 100 resin Biorad 143-2832
Chloroform  Sigma-Aldrich MC1024452500
Dialysis cassettes Slide-A-Lyzer 20 k MWCO Thermo Fisher  87735
DIB chamber  Custom made PMMA chamber for DIB membranes
Digital power meter and energy console Thorlabs PM100D Laser power meter 
Dimethyl sulfoxide Roth  4720.1
Double distilled H2O
Eclipse TS 100 Hoffmann modulation contrast microscope  Nikon Microscope to assess DIB membrane formation  
EDTA Roth 8042.2
EMCCD camera iXon Ultra 897 Andor TIRF microscope 
Ethanol Sigma-Aldrich 32205-M
Fixed angle rotor Ti70 Beckman Coulter
Fluo-8, CalciFluorTM Santa Cruz Biotechnology SC-362561 Ca2+-sensitive dye
French press cell disruption homogenizer Igneus Igneus 40000 psi
GFP filter AHF Filter seeting used for excitation of DIB-membranes by epifluorescence with white light source 
Glass capillaries World Precision Instruments 4878
Glass coverslips 40 mm x 24 mm x 0.13 mm Roth 1870.2
Glycerol Roth 3783.2
Hamilton syringe 10 mL Roth X033.1
Hamilton syringe 100 mL Roth X049.1
Hamilton syringe 500 mL Roth EY49.1
Heating block  Eppendorf Thermomixer comfort
Heating plate Minitube  HT200
Hepes Roth  9205.3
Hexadcane Sigma-Aldrich 296317
His Trap HP 1 mL Cytiva 29051021 Ni-NTA column
Imidazole Sigma-Aldrich 1.04716.1000
KCl Honeywell 10314243
KLM spin coater  Schaefer Tec SCV-10
List medical L/M-3P-A vertical pipette puller Artisan Technology Group 57761-1
Low melting point agarose Sigma-Aldrich  A9414
M8 Stereomicroscope Wild Stereomicrosope 
Matlab  MathWorks R2022a
Methanol Sigma-Aldrich 34860
MicroFil pipette tips World Precision Instruments MF34G-5
N2 gas
NaCl Roth 3957.1
Nanoliter 2010 injector  World Precision Instruments Nanoliter 2010 
n-dodecyl-b-D-maltoside Glycon Biochemicals D97002-C
Ni-NTA agarose, non-crosslinked Cube Biotech 124115393 Custom made
NIS-Elements AR software Nikon MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930 Imaging software
n-octyl-polyoxyethylene Sigma-Aldrich 40530
O2 gas
Phenylmethylsulfonyl fluoride Roth  6367.3
Photodiode sensor  Si, 400 - 1100 nm, 500 mW Thorlabs S130C Sensor for laser power meter 
Plasma cleaner Diener Electronics Zepto
Preparative ultracentrifuge Optima Beckman Coulter
Quad-band TIRF-filter 446/523/600/677 HC AHF Filter setting used for excitation of DIB-membranes with 488 nm laser 
Resource Q 1 mL Cytiva 17117701 Anion exchange column
Silicon oil AR 20 Sigma-Aldrich 10836
Sodium dodecyl sulfate Roth 2326.2
Super LoLux camera JVC Stereomicrosope 
Thermoshaker Gerhardt THL 500/1
Ti-E Fluorescence microscope   Nikon MEA53100
Tris-HCl Sigma-Aldrich 9090.3
Tryptone Roth 8952.2
Ultrasonic bath  Bandelin Sonorex RK 100
Vaccum pump Vacuubrand MD 4C NT
White light source for epifluorescence illumination (100 W) Nikon MBF72655 TIRF microscope 
Yeast extract Roth 2363.2
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  2. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  3. Thompson, J. R., Heron, A. J., Santoso, Y., Wallace, M. I. Enhanced stability and fluidity in droplet on hydrogel bilayers for measuring membrane protein diffusion. Nano Letters. 7 (12), 3875-3878 (2007).
  4. Kusumi, A., et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34 (1), 351-378 (2005).
  5. Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysical Journal. 60 (4), 910-921 (1991).
  6. Kusumi, A., Shirai, Y. M., Koyama-Honda, I., Suzuki, K. G. N., Fujiwara, T. K. Hierarchical organization of the plasma membrane: Investigations by single-molecule tracking vs. fluorescence correlation spectroscopy. FEBS Letters. 584 (9), 1814-1823 (2010).
  7. Betaneli, V., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy to examine protein-lipid interactions in membranes. Methods in Molecular Biology. 974, 253-278 (2013).
  8. Ando, T., et al. A high-speed atomic force microscope for studying biological macromolecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (22), 12468-12472 (2001).
  9. Casuso, I., et al. Characterization of the motion of membrane proteins using high-speed atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (8), 525-529 (2012).
  10. Karner, A., et al. Tuning membrane protein mobility by confinement into nanodomains. Nature Nanotechnology. 12 (3), 260-266 (2017).
  11. Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118 (6), 1099-1102 (2005).
  12. Schink, K. O., Tan, K. -W., Stenmark, H. Phosphoinositides in control of membrane dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 143-171 (2016).
  13. Schafer, D. A. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).
  14. Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10005-10010 (2008).
  15. Engelman, D. M. Membranes are more mosaic than fluid. Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).
  16. Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The lateral organization and mobility of plasma membrane components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
  17. Wang, S., et al. Spatiotemporal stop-and-go dynamics of the mitochondrial TOM core complex correlates with channel activity. Communications Biology. 5 (1), 471 (2022).
  18. Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochemical and Biophysical Research Communications. 265 (2), 595-599 (1999).
  19. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  20. Heron, A. J., Thompson, J. R., Mason, A. E., Wallace, M. I. Direct detection of membrane channels from gels using water-in-oil droplet bilayers. Journal of the American Chemical Society. 129 (51), 16042-16047 (2007).
  21. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  22. Huang, S., Romero-Ruiz, M., Castell, O. K., Bayley, H., Wallace, M. I. High-throughput optical sensing of nucleic acids in a nanopore array. Nature Nanotechnology. 10 (11), 986-991 (2015).
  23. Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271 (5245), 43-48 (1996).
  24. Kiessling, V., Yang, S. -T., Tamm, L. K. Supported lipid bilayers as models for studying membrane domains. Current Topics in Membranes. 75, 1-23 (2015).
  25. Murray, D. H., Tamm, L. K., Kiessling, V. Supported double membranes. Journal of Structural Biology. 168 (1), 183-189 (2009).
  26. Hill, K., et al. Tom40 forms the hydrophilic channel of the mitochondrial import pore for preproteins. Nature. 395 (6701), 516-521 (1998).
  27. Poynor, M., Eckert, R., Nussberger, S. Dynamics of the preprotein translocation channel of the outer membrane of mitochondria. Biophysical Journal. 95 (3), 1511-1522 (2008).
  28. Künkele, K. P., et al. The preprotein translocation channel of the outer membrane of mitochondria. Cell. 93 (6), 1009-1019 (1998).
  29. Ahting, U., et al. The TOM core complex: the general protein import pore of the outer membrane of mitochondria. The Journal of Cell Biology. 147 (5), 959-968 (1999).
  30. Bausewein, T., et al. Cryo-EM structure of the TOM core complex from Neurospora crassa. Cell. 170 (4), 693-700 (2017).
  31. Cowan, S. W., et al. Crystal structures explain functional properties of two E. coli porins. Nature. 358 (6389), 727-733 (1992).
  32. Bieligmeyer, M., et al. Reconstitution of the membrane protein OmpF into biomimetic block copolymer-phospholipid hybrid membranes. Beilstein Journal of Nanotechnology. 7, 881-892 (2016).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Vicente, N. B., Zamboni, J. E. D., Adur, J. F., Paravani, E. V., Casco, V. H. Photobleaching correction in fluorescence microscopy images. Journal of Physics: Conference Series. 90 (1), 012068 (2007).
  35. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  36. Ershov, D., et al. TrackMate 7: integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
  37. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  38. Hirsch, M., Wareham, R. J., Martin-Fernandez, M. L., Hobson, M. P., Rolfe, D. J. A stochastic model for electron multiplication charge-coupled devices - From theory to practice. PLoS One. 8 (1), 53671 (2013).
  39. Bausewein, T., Naveed, H., Liang, J., Nussberger, S. The structure of the TOM core complex in the mitochondrial outer membrane. Biological Chemistry. 401 (6-7), 687-697 (2020).
  40. Lindsey, H., Petersen, N. O., Chan, S. I. Physicochemical characterization of 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in model membrane systems. Biochimica et Biophysica Acta. 555 (1), 147-167 (1979).
  41. Manafirad, A. Single ion-channel analysis in droplet interface bilayer. Methods in Molecular Biology. 2186, 187-195 (2021).
  42. Rosholm, K. R., et al. Activation of the mechanosensitive ion channel MscL by mechanical stimulation of supported Droplet-Hydrogel bilayers. Scientific Reports. 7 (1), 45180 (2017).
  43. Wang, Y., et al. Electrode-free nanopore sensing by DiffusiOptoPhysiology. Science Advances. 5 (9), (2019).
  44. Ahting, U., et al. the pore-forming component of the protein-conducting TOM channel in the outer membrane of mitochondria. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1151-1160 (2001).
  45. Romero-Ruiz, M., Mahendran, K. R., Eckert, R., Winterhalter, M., Nussberger, S. Interactions of mitochondrial presequence peptides with the mitochondrial outer membrane preprotein translocase TOM. Biophysical Journal. 99 (3), 774-781 (2010).
  46. Kuszak, A. J., et al. Evidence of distinct channel conformations and substrate binding affinities for the mitochondrial outer membrane protein translocase pore Tom40. The Journal of Biological Chemistry. 290 (43), 26204-26217 (2015).
  47. Yanagisawa, M., Iwamoto, M., Kato, A., Yoshikawa, K., Oiki, S. Oriented reconstitution of a membrane protein in a giant unilamellar vesicle: Experimental verification with the potassium channel KcsA. Journal of the American Chemical Society. 133 (30), 11774-11779 (2011).
  48. Goers, R., et al. Optimized reconstitution of membrane proteins into synthetic membranes. Communications Chemistry. 1, 35 (2018).
  49. Castell, O. K., Dijkman, P. M., Wiseman, D. N., Goddard, A. D. Single molecule fluorescence for membrane proteins. Methods. 147, 221-228 (2018).
  50. Thompson, J. R., Cronin, B., Bayley, H., Wallace, M. I. Rapid assembly of a multimeric membrane protein pore. Biophysical Journal. 101 (11), 2679-2683 (2011).
  51. Senior, M. J. T., et al. Single-molecule tracking of perfringolysin O assembly and membrane insertion uncoupling. The FEBS Journal. , (2022).
  52. Weatherill, E. E., et al. Fast slow folding of an outer membrane porin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (20), 2121487119 (2022).
  53. Kefauver, J. M., Ward, A. B., Patapoutian, A. Discoveries in structure and physiology of mechanically activated ion channels. Nature. 587 (7835), 567-576 (2020).
  54. Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
  55. Wang, Y., et al. The push-to-open mechanism of the tethered mechanosensitive ion channel NompC. eLife. 10, 58388 (2021).

Tags

Biokemi nummer 192
Enmolekylär avbildning av lateral rörlighet och jonkanalaktivitet i lipidlager med hjälp av total intern reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, S., Nussberger, S.… More

Wang, S., Nussberger, S. Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. J. Vis. Exp. (192), e64970, doi:10.3791/64970 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter