Implante de arranjo de eletrocorticografia mole subdural (ECoG) e registro cortical de longa duração em miniporcos

Summary

Aqui, apresentamos um método para avaliação de desempenho e segurança a longo prazo de arranjos de eletrodos subdurais moles em um modelo minipig, descrevendo método cirúrgico e ferramentas, ressonância magnética pós-operatória, eletrofisiologia do córtex auditivo, propriedades eletroquímicas do implante e imunoquímica post-mortem.

Abstract

Deficiências neurológicas e doenças podem ser diagnosticadas ou tratadas usando arranjos de eletrocorticografia (ECoG). Na epilepsia resistente a medicamentos, estes ajudam a delinear a região epiléptica para ressecação. Em aplicações de longo prazo, como interfaces cérebro-computador, esses eletrodos epicorticais são usados para registrar a intenção de movimento do cérebro, para controlar os membros robóticos de pacientes paralisados. No entanto, as grades de eletrodos rígidos atuais não respondem à necessidade de gravações cerebrais de alta resolução e biointegração de longo prazo. Recentemente, arranjos de eletrodos conformáveis têm sido propostos para alcançar estabilidade de implante a longo prazo com alto desempenho. No entanto, estudos pré-clínicos para essas novas tecnologias de implantes são necessários para validar sua funcionalidade a longo prazo e perfil de segurança para sua tradução para pacientes humanos. Nesse contexto, modelos suínos são rotineiramente empregados no desenvolvimento de dispositivos médicos devido ao seu grande tamanho de órgãos e fácil manuseio animal. No entanto, poucas aplicações cerebrais são descritas na literatura, principalmente devido a limitações cirúrgicas e integração do sistema de implante em um animal vivo.

Aqui, relatamos o método para implantação a longo prazo (6 meses) e avaliação de matrizes ECoG moles no modelo minipig. O estudo apresenta primeiramente o sistema de implante, consistindo de um arranjo de eletrodos microfabricados macios integrado a uma porta transdérmica polimérica compatível com ressonância magnética (RM) que abriga conectores de instrumentação para registros eletrofisiológicos. Em seguida, o estudo descreve o procedimento cirúrgico, desde o implante subdural até a recuperação do animal. Focalizamos o córtex auditivo como um exemplo de área-alvo onde os potenciais evocados são induzidos por estimulação acústica. Finalmente, descrevemos uma sequência de aquisição de dados que inclui RM de todo o cérebro, caracterização eletroquímica do implante, eletrofisiologia intraoperatória e de movimento livre e coloração imunohistoquímica dos cérebros extraídos.

Este modelo pode ser usado para investigar a segurança e a função de um novo design de próteses corticais; estudo pré-clínico obrigatório para prever a tradução para pacientes humanos.

Introduction

Deficiências neurológicas e doenças podem ser diagnosticadas ou tratadas usando arranjos de eletrocorticografia (ECoG). Essas grades de eletrodos são implantadas na superfície do cérebro e permitem o registro ou estimulação do córtex humano¹. No caso da epilepsia resistente, por exemplo, ajudam a delinear a região epiléptica para ressecção². Em aplicações de longo prazo, como interfaces cérebro-computador, esses eletrodos epicorticais são usados para registrar a intenção de movimento do cérebro, para controlar os membros robóticos de pacientes paralisados³. No entanto, as grades de eletrodos de corrente são feitas de blocos metálicos rígidos embutidos em substratos poliméricos rígidos e não respondem à necessidade de registros cerebrais de alta resolução e biointegração subdural de longo prazo (>30 dias). Em vez disso, eles criam reações teciduais locais que levam ao encapsulamento fibrótico do dispositivo implantado, levando a um pior desempenho ao longo do tempo. Recentemente, arranjos de eletrodos flexíveis ou esticáveis utilizando substratos poliméricos finos fabricados por técnicas de microfabricação têm sido propostos para alcançar alto desempenho em implantes de longa duração, limitando a reação tecidual ^4,5. No entanto, estudos pré-clínicos para essas novas tecnologias de implantes são necessários para validar sua funcionalidade e perfil de segurança a longo prazo, de modo que a tradução para pacientes humanos possa ser imaginada. Nesse contexto, modelos de miniporco e porco são rotineiramente empregados no desenvolvimento de dispositivos em outros contextos médicos (por exemplo, os sistemas cardiovascular, esquelético ou gástrico) devido ao seu grande tamanho de órgãos e fácil manuseio dos animais ^6,7,8. No entanto, poucas aplicações direcionadas ao cérebro para neurofisiologia são descritas na literatura, principalmente devido a limitações da abordagem cirúrgica e integração do sistema de implante em um animal vivo9,10,11,12. Estes muitas vezes não são compatíveis com a implantação crônica em animais vivos, pois exigiriam, por exemplo, o desenvolvimento de hardware complexo, como eletrônica embarcada implantável. Além disso, não investigam a influência do sistema de implantes sobre o tecido alvo, o que é crucial para o aspecto de biossegurança em estudos translacionais. O modelo porcino aproxima-se da anatomia humana em termos de estrutura cortical, osso do crânio e espessura da pele¹³. Além disso, sua capacidade de aprender tarefas comportamentais os torna um modelo poderoso para investigar estratégias de reabilitação funcional ou percepções sensoriais¹⁴.

A tradução de novas tecnologias e terapias para humanos requer a avaliação de segurança e eficácia, conforme exigido pelas autoridades médicas competentes. Estes são geralmente descritos em documentos técnicos e normas¹⁵, porém requerem apenas a aprovação nesses testes e não investigam o real efeito do implante do dispositivo ou coleta de outros dados úteis em paralelo ao estudo de segurança. Para um estudo completo de biossegurança e desempenho no cérebro, apresentamos aqui uma coleção longitudinal e sistemática de dados de imagens cerebrais, medidas eletrofisiológicas, avaliação das propriedades eletroquímicas dos eletrodos implantados e histologia post-mortem em modelo porcino. Para isso, vários aspectos precisam ser considerados, a fim de criar um modelo experimental completo: (i) acesso cirúrgico minimamente invasivo para implante do dispositivo juntamente com um portal transdérmico mecanicamente estável para conexão aos eletrodos, (ii) um paradigma robusto de registro eletrofisiológico que sirva como saída de desempenho para os eletrodos implantados tanto sob anestesia quanto em condições de movimento livre, (iii) imagens in vivo (tomografia computadorizada [TC] e/ou ressonância magnética [RM]) em diferentes momentos para acompanhar a evolução do cérebro e do implante, bem como a compatibilidade do sistema implantado com o equipamento de imagem, e (iv) um pipeline de preparação tecidual para extrair o cérebro para análise histológica.

Aqui, relatamos o método para implantação a longo prazo (6 meses) e a avaliação de matrizes ECoG moles no modelo minipig (mostrado esquematicamente na Figura 1). Os arranjos de eletrodos moles foram apresentados em nossos relatos anteriores e são feitos de membranas finas de silicone incorporando filmes finos elásticos de ouro usados como trilhos elétricos^16,17. O contato com o tecido é feito através de uma mistura de nanopartículas de platina embebidas em uma matriz de silicone para uma interface eletroquímica suave e eficiente com o tecido cerebral¹⁸. Os implantes são conectados através de um cabo flexível tunelizado subduralmente através do crânio e da pele a um orifício transdérmico que abriga os conectores na cabeça do animal. O tamanho e a forma do implante podem ser personalizados de acordo com o alvo e as necessidades do estudo. As tiras de eletrodos atuais neste estudo espelham o tamanho real das tiras clínicas. Tiras e grades subdurais clinicamente disponíveis foram usadas como comparadores usando a mesma abordagem. O portal transdérmico polimérico compatível com RM é colocado no crânio usando um sistema de platina que o ancora firmemente ao crânio. Aqui, descrevemos detalhadamente o procedimento cirúrgico, desde a implantação subdural de ambos os hemisférios até a recuperação do animal. Focalizamos o córtex auditivo como uma área alvo de exemplo, onde os potenciais evocados são induzidos por estimulação acústica tanto em condições anestesiadas quanto em movimento livre. Em diferentes momentos, o cérebro do animal é fotografado em ressonância magnética (ou TC para os eletrodos clínicos) sob anestesia e as propriedades eletroquímicas dos eletrodos são medidas. Métodos de caracterização de eletrodos são utilizados para acompanhar a evolução do implante e da interface eletrodo-tecido (ver Schiavone et ^al.19 para mais detalhes). Estes incluem cronoamperometria para sondar as habilidades de estimulação do contato do eletrodo, espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE) que pode indicar a evolução dos componentes resistivo e capacitivo do eletrodo, e medidas de resistência intercanal para sondar falhas de encapsulação hermética. Finalmente, desenvolvemos um pipeline de extração de tecido para perfundir o cérebro após a eutanásia, explantá-lo com os eletrodos no lugar, seccioná-lo e realizar análise histológica usando diferentes marcadores de inflamação. De modo geral, este método permitirá estudos pré-clínicos com coleta de dados multimodais robustos para futura tradução clínica de novas tecnologias e terapias no cérebro.

Protocol

Os procedimentos cirúrgicos e comportamentais foram aprovados pelo comitê de ética local de acordo com as diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelas autoridades veterinárias locais (Cantão de Genebra) e federais (Suíça) com o número de autorização GE11120A. Miniporcos fêmeas da raça Göttingen (n = 7) aos 2-6 meses de idade (5-8 kg) foram utilizados neste estudo.

1. Planejamento pré-cirúrgico

1. Caracterização in vitro do sistema de implantes moles
   1. Cronoamperometria: Registra a queda de tensão após a injeção de uma evolução de pulso de corrente bifásica (ou seja, o transiente de tensão [VT]) usando um osciloscópio conectado em paralelo a um gerador de pulsos. Conecte o gerador de pulsos sequencialmente a cada eletrodo e a um contador de platina em solução salina (solução salina tamponada com fosfato [PBS] 1x). Consulte a etapa 3.1 para obter as configurações.
   2. Espectrograma de impedância eletroquímica: Medir a impedância eletroquímica em diferentes frequências usando um potenciômetro. Conecte o potenciômetro sequencialmente a cada eletrodo usando o contador de platina e um eletrodo de referência Ag/AgCl em solução salina (PBS 1x). Consulte a etapa 3.2 para obter as configurações.
   3. Resistência intercanal: No estado seco, meça a resistência de corrente contínua (CC) entre canais adjacentes usando um multímetro portátil.
   4. Seleção do implante: Após as três medidas citadas acima, selecionar o implante juntamente com os seguintes critérios: impedância a 1 kHz abaixo de 100 kΩ e nenhuma resistência intercanal abaixo de 1 MΩ.
2. Esterilização
   1. Esterilização de implantes: Coloque os implantes selecionados individualmente em sacos de esterilização juntamente com um marcador de esterilização e lacre-os. Utilize embalagem dupla para garantir a esterilidade durante a cirurgia.
      NOTA: Neste caso, a esterilização do gás peróxido de hidrogênio (H 2 O₂) é usada devido ao ciclo de tempo curto e baixa temperatura (55 °C). As alternativas são o gás óxido de etileno (ETO) ou a esterilização em autoclave, mas a compatibilidade com o sistema de implante deve ser garantida.
   2. Esterilização de instrumentos: Coloque os instrumentos limpos em sacos duplos de esterilização ou caixas de instrumentos estéreis juntamente com marcadores de esterilização. A esterilização em autoclave é mais comum para instrumentais, masH 2 O₂ ou ETO são alternativas possíveis.

2. Implante cirúrgico de matrizes ECoG moles

1. Anestesia
   1. Pré-medicação: Isole o animal e jejue-o durante a noite. Injetar uma mistura de midazolam a 0,75 mg/kg, atropina a 0,25 μg/kg e haldol a 0,1 mg/kg por via intradérmica e aguardar até que o animal esteja sedado. Pesar o animal antes de prosseguir.
   2. Instalação de eletrodo intravenoso (IV):
      1. Coloque o animal sobre a mesa de cirurgia em uma almofada de aquecimento. Induzir anestesia colocando máscara facial no animal, utilizando sevoflurano a 3%-3,5%.
      2. Coloque eletrocardiograma no abdômen, um sensor de saturação sanguínea na cauda e um sensor de temperatura na narina.
      3. Coloque um chumbo IV em uma veia da orelha e confirme o acesso ao sangue usando uma seringa cheia de soro fisiológico. Certifique-se de que os olhos são mantidos hidratados usando pomada.
   3. Intubação: Injetar um bolus de atracúrio a 0,5 mg/kg, cetamina a 1 mg/kg e fentanil a 1-2 μg/kg. Coloque o animal de costas para intubação. Insira um tubo de 4,5 mm.
   4. Medicação: Após a intubação, suspender a anestesia com sevoflurano e instalar infusão de propofol na dose de 10 mg/kg/h, fentanil na dose de 2 μg/kg/h, atracúrio na dose de 0,2-0,5 mg/kg/h e solução salina na dose de 4-7 mg/kg/h. Inicie uma perfusão de manitol a 1 g/kg/h para reduzir o inchaço cerebral durante a cirurgia.
      NOTA: Um regime de analgesia multimodal pode ser usado se recomendado pelo comitê de ética animal local.
2. Radiografia pré-operatória
   1. Coloque o animal em seu abdômen na posição de esfinge. Remova temporariamente qualquer objeto metálico nas proximidades do cérebro e do crânio do animal (por exemplo, chumbo de temperatura na narina).
   2. Adquira uma radiografia axial e sagital com contraste ósseo. Coloque um objeto metálico com dimensões conhecidas no campo de aquisição sagital para servir como uma escala para medir a espessura do crânio na frente e atrás do cérebro.
   3. Identificar a localização dos seios frontais (visíveis por vazios abaixo do crânio) e marcar a localização mais posterior na cabeça do animal utilizando um marcador permanente. Isso indicará o ponto mais distante onde qualquer craniotomia ou colocação de parafuso pode ser feita na abordagem cirúrgica descrita abaixo.
3. Campo asséptico e preparação da pele: Raspe toda a superfície da cabeça além do campo cirúrgico. Usando uma almofada estéril, esfregue bem a cabeça com betadine. Em seguida, colocar campos estéreis sobre a mesa de instrumentação e sobre o animal para revelar apenas a janela cirúrgica. Finalmente, esfregue a cabeça novamente com uma almofada estéril usando betadina.
4. Craniotomia e durotomia
   1. Corte de pele: Incise a pele com uma faca de bisturi ao longo da linha média. Separe o músculo e o periósteo (25 mm lateralmente do bregma em ambos os lados e 40 mm anterior e posterior ao bregma) do osso usando um raspador e coloque espalhadores para obter o melhor acesso para posterior perfuração.
   2. Medidas e marcação: Identificar bregma e lambda e marcá-los com caneta cirúrgica estéril (Figura 2A, B). Usando uma régua estéril, defina o contorno do retalho ósseo centrado ao redor do alvo de implantação em ambos os hemisférios. Neste caso específico, optou-se pelo córtex auditivo, com coordenadas de -5 mm a -15 mm de bregma e -4 mm a -20 mm lateralmente. Em seguida, ajustar a craniotomia ao tamanho do implante e dos pontos anatômicos, limitando o tamanho da abertura.
   3. Craniotomia:
      1. Usando uma broca óssea com uma broca redonda de corte, perfurar o contorno da craniotomia, levando em consideração a espessura do crânio medida no passo 2.2. Irrigar o local de perfuração com solução salina para evitar o superaquecimento do osso.
      2. Perfure cuidadosamente o contorno de forma homogênea até atingir a dura-máter. No primeiro avanço, termine de perfurar o contorno até que ele tenha afinado o suficiente para quase romper. Em seguida, utilizar espátula plana (do lado da linha média ou lateral) para romper o retalho ósseo em peça única, utilizando a borda da craniotomia como alavanca. Se for encontrada muita resistência, continue afinando o osso.
      3. Coloque o pedaço de osso em soro fisiológico estéril.
      4. Uma vez removido o retalho ósseo, lasque cuidadosamente a borda da craniotomia, usando um Kerison para evitar que a borda óssea afiada corte na dura-máter.
      5. Se ocorrer sangramento excessivo na dura-máter ou no osso, use Gelfoam ou cera de osso, respectivamente. Colocar compressa úmida (coxim padrão em soro fisiológico estéril) na craniotomia e repetir essa etapa no outro hemisfério (Figura 2B).
   4. Durotomia:
      1. Usando a agulha de um kit de sutura 6-0, perfure e levante cuidadosamente a dura-máter na extremidade anterior ou posterior da craniotomia no meio do caminho entre os lados medial e lateral e crie o início de uma incisão com o canivete.
      2. Em seguida, usando uma pequena espátula plana inserida no espaço subdural atuando como base de corte para proteger a cortical, crie uma fenda anteroposterior na dura-máter avançando simultaneamente com ambas as ferramentas. Certifique-se de que a fenda seja ligeiramente maior que a largura do implante (Figura 2C). Se ocorrer algum sangramento ou dano nesta etapa, cubra com espuma de gel e aguarde até que pare.
         NOTA: A trajetória da fenda deve ser adaptada se grandes vasos sanguíneos estiverem presentes na dura-máter para evitar sangramento.
5. Implantação
   1. Inserção do dispositivo:
      1. Irrigar o implante (Figura 1A suplementar) com soro fisiológico em ambos os lados para que deslize para o espaço subdural com mais facilidade. Coloque o implante acima da fenda da dura-máter e, com pinças pequenas, insira o dispositivo por via subdural, deslizando-o sequencialmente em cada borda.
      2. Segure cuidadosamente a extremidade do pedestal do dispositivo e avance com o implante para não criar tensão que atrapalhe a inserção. Quando a borda do conector estiver localizada na parte superior da fenda, pare a inserção.
   2. Fixar o implante: Para fixar o implante no lugar, coloque uma ponte de titânio sobre o cabo após a borda da craniotomia ou nas asas de ancoragem e fixe-o com um ou dois parafusos de titânio usando a chave de fenda apropriada (Figura 2D).
   3. Colocação no solo: Remover cuidadosamente 1 cm do isolamento dos fios terra e inseri-lo epiduralmente na extremidade posterior da craniotomia (ou qualquer localização epidural distante do córtex de interesse ou dos grandes vasos sanguíneos) (fio na Figura 2E)
   4. Repita as etapas 2.4.4. e 2.5.1.-2.5.3 no hemisfério contralateral.
   5. Raio-x intraoperatório para confirmar a colocação:
      1. Coloque uma almofada úmida (almofada padrão em solução salina estéril) sobre o local da cirurgia para manter o tecido hidratado. Em seguida, coloque um pano cirúrgico estéril para cobrir a cabeça do animal.
      2. Tome imagens de raios-X planas (axiais e sagitais) para garantir que os implantes estejam bem posicionados e não sejam dobrados, usando os marcadores de raios X como indicadores. Caso contrário, remova o drape e explante o dispositivo para inseri-lo novamente (siga os passos 2.4.4. e 2.5.1.-2.5.3 novamente).
   6. Fechamento da dura-máter: Suture a dura-máter cuidadosamente ao redor do cabo do implante usando uma sutura reabsorvível 3-0 e um pequeno suporte de agulha. Aproximar ao máximo as duas bordas da dura-máter sem romper a fina membrana com o fio de sutura (Figura 2D, E).
   7. Colocação do retalho ósseo: Fixar uma ponte de titânio na parte anterior e posterior de cada retalho ósseo com um parafuso de titânio. Tenha o cuidado de planejar o posicionamento das pontes em Ti com relação à colocação das pernas da platina nas próximas etapas. Parafusar a extremidade das pontes de titânio ao crânio (Figura 2F, G).
6. Colocação de pedestal e platina
   1. Posicionamento: Nesta configuração, a platina possui seis pernas com dois orifícios de parafuso cada (Figura 1B Suplementar). Planejar a colocação da platina no crânio para otimizar a localização dos parafusos (evite colocá-los na borda da craniotomia ou no músculo temporal). Pule os orifícios nas pernas se eles não puderem ser parafusados dentro.
   2. Fixação da plata: Parafuso nos parafusos de titânio da platina até que esteja firmemente no lugar (ver Figura 2H).
   3. Colocação do pedestal: Remova as pontes de titânio sobre os cabos de conexão e vire sobre o pedestal para pousar na placa de pedestre. Rosqueie o pedestal na platina do pé. Verifique se o pedestal está firmemente posicionado (Figura 2I).
7. Sutura e fechamento
   1. Limpeza da ferida: Limpe o espaço subcutâneo de qualquer osso ou outros detritos lavando com soro fisiológico. Corte um pouco de pele ao redor das bordas do pedestal para criar uma borda redonda seguindo o cilindro.
   2. Suturas subcutâneas: Remova os espalhadores e dobre os retalhos de pele. Criar suturas subcutâneas com fio de sutura 4-0 não reabsorvível, com 3 mm de distância usando suturas simples interrompidas ou suturas contínuas simples. Comece longe do pedestal, movendo-se em direção a ele em ambos os lados da incisão.
   3. Suturas dérmicas: Sutura da pele com fio de sutura 6-0 não reabsorvível, com suturas separadas por 5 mm. Comece longe do pedestal, movendo-se em direção a ele em ambos os lados da incisão. Tome o cuidado de conseguir uma boa aposição tecidual entre os dois retalhos cutâneos e próximo à borda do pedestal para evitar um vazio (Figura 2J).
   4. Curativo: Limpe a área da ferida novamente com uma almofada estéril e betadina. Aplique uma bandagem estéril autoadesiva sobre a ferida.
8. Medições in vivo: Para medições in vivo , siga as seções 3, 4 e 5.
9. Despertar: Após todas as medidas terem sido realizadas, retirar o animal de todos os anestésicos, mas manter sob ventilação. Para analgesia, aplicar um adesivo de buprenorfina (25 mg/h) por 24 h. Coloque o animal em uma almofada de aquecimento coberta com cortinas para acelerar o tempo de despertar. Quando a respiração espontânea for recuperada, extube o animal e coloque sob uma máscara facial de oxigênio até que a consciência seja recuperada (o que pode levar de 1 a 4 h).
10. Cuidados pós-operatórios com o animal: Durante 5 dias, mantenha o animal sob estreita vigilância. Dê uma dose de cefalexina a 75 mg duas vezes por dia com alimentos, separados de outros animais. Realizar a desinfecção da ferida diariamente, aplicando quantidades abundantes de betadina com almofadas estéreis embebidas (melhor feito durante a alimentação).
    OBS: Cuidados prolongados e alojamento: O animal operado é mantido isolado por 24 horas. Ele é colocado de volta em seu grupo social original se o animal estiver bem o suficiente para interagir socialmente com seus pares. A observação diária do pedestal e da abertura da pele precisa ser realizada para acompanhar a integração do dispositivo na cabeça. Quando apropriado, limpe o local ao redor do pedestal com quantidades abundantes de betadina.

3. Caracterização in vivo do implante mole

1. Cronoamperometria: Registra a queda de tensão após a injeção de uma evolução de pulso de corrente bifásica (i.e., o VT) usando um osciloscópio conectado em paralelo a um gerador de pulsos. Conecte o gerador de pulsos sequencialmente a cada eletrodo e ao fio terra. Realizar o pulso de estimulação a 100 μA com largura de pulso de 300 μs a 100 Hz.
2. Espectroscopia de impedância eletroquímica: Mede a impedância eletroquímica em diferentes frequências usando um potenciômetro. Conecte o gerador de pulsos sequencialmente a cada eletrodo, usando o fio terra como contra-eletrodo e terra. Ajuste a tensão de excitação para 200 mV e a faixa de frequência de 1 Hz a 1 MHz, com três pontos por década.
3. Medições curtas entre canais: Meça a resistência DC entre canais adjacentes usando um multímetro portátil. In vivo, a resistência DC intercanal só é medida para verificar se não há escassez abaixo de 1 kΩ, indicando falha total do encapsulamento.

4. Registro eletrofisiológico

1. Atividade espontânea: Conecte o sistema de gravação sem fio através do pedestal e registre a atividade basal por 2-3 min. Estes registros servirão como controle para análise dos potenciais evocados auditivos.
2. Potenciais evocados auditivos: Além do sistema sem fio, inserir alto-falantes em campo fechado nas orelhas dos animais. Play tone burst estimulação acústica em diferentes frequências (variando de 200-20.000 Hz) em torno de 70 dB nível de pressão sonora (NPS) ao longo de 120 repetições. Em seguida, faça a média dos registros e alinhe-os ao longo do período de estímulo para análise.
3. Potenciais evocados sensoriais: Coloque as agulhas no focinho em três posições diferentes. Evocar potenciais sensoriais estimulando o focinho por ~30 s com o gerador de pulsos em diferentes amplitudes para obtenção das curvas de recrutamento.

5. Imagem in vivo

1. Transporte do animal: Manter o animal sob anestesia com propofol, conforme descrito no passo 2.1. Use um carrinho de transporte que abriga um ventilador, bomba de seringa e monitor de sinais vitais para transportar o animal da sala de cirurgia para as instalações de imagem e de volta.
2. Tomografia computadorizada de raios-x: Coloque o animal sobre a mesa do scanner e remova qualquer objeto metálico ao redor da cabeça (por exemplo, o sensor de temperatura). Adquira uma tomografia computadorizada na menor resolução (espessura de corte de 0,4 mm) usando aquisição isométrica com seleção automática de corrente e tensão para contraste ósseo.
3. Imagem por ressonância magnética: Remova todos os equipamentos que contenham metal do animal (use eletrodos intravenosos compatíveis com ressonância magnética e tubo de intubação). Manter o animal ventilado e anestesiado sob sevoflurano a 3%-3,5%, utilizando ventilador situado fora da câmara de RM e ligado através de um tubo longo ao animal. Antes da primeira sequência, injetar um bolus de fentanil a 1-2 μg/kg. Use três sequências isométricas na menor resolução: sequências ponderadas em T1, T2 e TSE (turbo spin echo) (parâmetros mostrados no Arquivo Suplementar 1).

6. Gravação em movimento livre

1. Siga o mesmo procedimento descrito na secção 4 para registar sinais de vigília do cérebro. Conecte o headstage sem fio segurando o animal nos braços do experimentador ou alimentando-o com guloseimas para distraí-lo. Proporcionar a estimulação acústica utilizando alto-falantes externos colocados próximos ao animal.

7. Perfusão e preparo tecidual

1. OPCIONAL: Se o animal ainda não estiver sob anestesia, siga o passo 2.1 para o protocolo de anestesia.
2. Inserção de cateter na artéria carótida para perfusão (Figura 2 Suplementar)
   1. Dissecção da artéria carótida e veia jugular: Cortar a garganta na linha média usando um cauterizador/cortador. Cortar primeiro a pele e depois o músculo seguindo a linha branca média (sem vasos por baixo) (Figura 2A suplementar).
   2. Abra mais, usando os dedos para abrir espaço ao redor da traqueia e sob o músculo. Procure a artéria carótida (batendo e rosada); O nervo vago às vezes também está ao redor (branco), e a veia jugular pode estar embaixo ou na lateral (vermelho). Coloque os espalhadores (ver Figura 2B Suplementar).
   3. Iniciar a dissecção da artéria carótida com pinça fina e tesoura redonda. Use tesoura para abrir o tecido conjuntivo. Se não houver vasos sanguíneos, corte; se houver vasos sanguíneos, cauterizar e avançar (Figura 2C Suplementar, D). Quando dissecado o suficiente, utilizar uma pinça para passar por baixo da artéria carótida para que fique completamente isolada (Figura 2E suplementar).
   4. Repetir a mesma operação com a veia jugular (Figura 2F Suplementar).
   5. Quando ambos os vasos estiverem totalmente dissecados e isolados, colocar fio de sutura ao redor deles. Não os feche ainda. Duas suturas ao redor da carótida, uma na própria base (sutura 1-lado do coração para perfusão cerebral) e outra no outro lado (sutura 2), são mostradas na Figura 2G Suplementar.
   6. Colocar uma sutura ao redor da veia jugular (sutura 3), não fechada; Marque os fios com fita adesiva para posterior seccionamento da veia.
   7. Feche a sutura 1 com muita firmeza, caso contrário irá sangrar (Figura 2H Suplementar). Amarre três nós. Coloque uma braçadeira no fio para engordar e criar tensão na artéria carótida.
   8. Apertar a artéria carótida usando uma pinça de vaso no lado oposto da dissecção da artéria carótida (lado cerebral para perfusão cerebral; Figura Suplementar 2I). A sutura 2 está no meio, ainda não fechada.
   9. Use pinças pretas para pegar e puxar a artéria carótida. Com tesoura fina, seccionou-se metade da artéria carótida próximo à base da dissecção (próximo à sutura 1, lado do coração; ver Figura 2J Suplementar). Certifique-se de que a seção seja a mais limpa possível e atinja o próprio vaso, não apenas a "bainha"; caso contrário, o cateter não passará. Insira o cateter conforme mostrado na Figura 2K Suplementar.
   10. Lave e preencha o cateter, primeiro com PBS, para que não haja mais ar no cateter (Figura Suplementar 2K inset).
   11. Fechar a sutura 2 com firmeza suficiente para que não desapareça, mas não muito para que o cateter ainda possa se mover um pouco (Figura 2L Suplementar). Em seguida, remova a pinça do vaso, termine de inserir o cateter na medida do possível e finalize o fechamento da sutura 2 (fechar firmemente).
   12. Se desejar, use fios de sutura na sutura 1 para fixar a base do cateter à pele na saída da ferida como um passo extra de segurança. Em seguida, transferir o animal para a zona de perfusão e conectá-lo ao PBS/heparina. Quando a perfusão se iniciar, puxar a sutura 3 e cortar a veia jugular
3. Eutanásia: Administrar pentobarbital (90 mg/kg) por via intravenosa e lavar a linha com soro fisiológico para garantir que a dose completa seja administrada com sucesso.
4. Perfusão: Com bomba de perfusão (200 mL/min), conectar o cateter carotídeo em PBS/heparina (1 L para um porco de 15 kg) e, em seguida, em PBS contendo paraformaldeído (PFA) a 4% (5 L para um porco de 15 kg). Quando a perfusão se iniciar, puxe a sutura 3 e corte a veia jugular.
5. Coleta de tecidos
   1. Decapitação: Quando a perfusão terminar, desprenda a cabeça do animal do corpo usando um bisturi, cortando a pele e o músculo e inserindo a lâmina entre a primeira e a segunda vértebras.
   2. Pós-fixação: Mergulhar a cabeça em PFA a 4% em PBS por mais 48 h a 4 °C e depois transferir para PBS antes da extração cerebral.
   3. Extração de cérebro e implante:
      1. Retire a pele usando um bisturi e comece a cortar o osso cuidadosamente usando um rongeur a partir das primeiras vértebras, seguindo a medula espinhal até o cerebelo. Uma vez exposto o cerebelo, remova cuidadosamente os ossos temporais e exponha os lobos parietal e frontal.
      2. Neste ponto, rosqueie o pedestal da platina e corte os pés da platina com um alicate. Remova o osso perto da entrada do cabo no crânio para liberar o sistema de implante do osso, sem puxar os implantes para fora da saída da dura-máter.
      3. Se os cabos do implante estiverem embutidos no osso, corte o cabo o mais próximo possível da saída. Uma vez que a superfície cerebral suficiente é exposta, corte cuidadosamente a dura-máter seguindo a linha média usando pequenas tesouras.
      4. Liberte os cabos do implante da saída da dura-máter. Tire fotografias da colocação do implante no cérebro. Em seguida, use uma colher pequena para separar o cérebro dos nervos cranianos abaixo. Extraia cuidadosamente o cérebro. Remova os implantes do cérebro.
   4. Pós-fixação do cérebro: Dependendo da qualidade da perfusão, pós-fixar o cérebro extraído novamente por 24 h em PFA a 4% em PBS a 4 °C. Manter em 0,1 M PBS a 4 °C até que o cérebro seja cortado.
   5. Corte cerebral: Separe os dois hemisférios usando uma lâmina de barbear. Em seguida, corte o cérebro ortogonalmente em quatro pedaços diferentes. Corte a zona implantada ao meio para obter dois blocos contendo a zona implantada e uma área de controle. Armazene os outros dois blocos se mais slides de controle forem necessários.
   6. Crioproteção e congelamento cerebral: Transfira os blocos cerebrais para uma solução de 15% de sacarose primeiro e depois 30% de sacarose a 4 °C até que o cérebro mergulhe e atinja o equilíbrio. Em seguida, congelar o tecido em isopentano a -55 °C em um sistema de congelamento de tecido.

8. Histologia

1. Secção tecidual
   1. Criostat: Coloque o cérebro congelado em um criostato e corte até que seções completas sejam alcançadas. Em seguida, corte o cérebro em seções de 40 μm e mergulhe em grupos de três em PBS 0,1 M em placas de poço. Observe cuidadosamente a ordem das placas.
   2. Seleção de seções: Selecione as seções dependendo da zona a ser analisada (região implantada ou zona de controle). Retire as seções sequencialmente das placas do poço, usando uma escova fina para inspecioná-las em busca de danos. Coloque-os em novas placas de poço preenchidas com PBS 0,1 M para coloração adicional.
2. Imuno-histoquímica
   1. Preparo: Incubar os cortes em Triton X/PBS a 0,3% por 15 min, seguido de albumina de soro bovino (BSA)/PBS a 3% por 1 h à temperatura ambiente (TR).
   2. Anticorpos primários: Incubar os tecidos com anticorpos primários por 48 h na RT (anti-GFAP, rato, diluído a 1/300; anti Iba1, coelho, diluído a 1/400; anti-NeuN, cobaia, diluído a 1/1.000; tudo em 1% BSA/PBS). Cubra as placas do poço com papel alumínio.
   3. Lavagem: Lave os poços com PBS 0,1 M três vezes por 5 min.
   4. Anticorpos secundários: Incubar os tecidos com anticorpos secundários por 2 h na RT (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 555; todos diluídos a 1/400 em 1% BSA/PBS).
   5. DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol): Incubar os tecidos com DAPI por 15 min (1/1.000 em 1% BSA/PBS).
   6. Lavagem: Lave os poços com PBS 0,1 M cinco vezes por 15 min.
   7. Montagem: Monte as corrediças usando mídia de montagem e uma lamínula. Mantenha as lâminas no escuro num frigorífico a 4 °C.
3. Imagiologia
   1. Imagem de lâminas inteiras: Obtenha imagens das lâminas em aumento de 10x (valor da distância objetiva de trabalho = 3.100 μm) usando um microscópio de scanner de lâminas em três comprimentos de onda diferentes (640 nm, 560 nm, 485 nm). Todas as informações de poder e ganho podem ser encontradas no Arquivo Suplementar 2.
   2. Imagem microscópica: Imagem da região de interesse em aumento de 20x (apocromático 20x/0,8 M27) usando um microscópio confocal em quatro comprimentos de onda (Alexa Fluor 647, DAPI, Cy3, EGFP). Todas as informações de poder e ganho podem ser encontradas no Arquivo Suplementar 3.

Representative Results

Para confirmar o posicionamento (Figura 3A) e a funcionalidade dos aparelhos, são realizados registros eletrofisiológicos no intraoperatório após a colocação do pedestal. O sinal basal é adquirido pela primeira vez ao longo de 2 min sem estímulos como controle da atividade basal. Em segundo lugar, o animal é estimulado acusticamente com um tone burst em diferentes frequências (500-20.000 Hz), e os dados brutos são calculados em média ao longo do período de estímulo para mapear potenciais evocados auditivos em toda a matriz (por exemplo, a 800 Hz em comparação com a linha de base; Figura 3B). Os dados mostrados aqui não são processados, mas se muito ruído estiver presente, filtros de entalhe e passa-banda podem ser aplicados. As fontes típicas de ruído no centro cirúrgico incluem almofadas de aquecimento, brocas tampadas e sucção ou cauterizadores (entre outros) que devem ser removidos antes da aquisição. Em gravações acordadas, grandes movimentos musculares ao redor da cabeça, como mastigação, devem ser evitados para conjuntos de dados mais limpos.

Esse protocolo foi aplicado em todos os momentos de gravação, e os sinais de um único canal puderam ser comparados ao longo do tempo. Um exemplo é ilustrado na Figura 3C, mostrando a robustez e evolução da resposta. A capacidade de registro de cada contato ao longo do tempo do experimento pode ser avaliada calculando-se o desvio padrão do sinal basal em cada momento (Figura 3D). Neste estudo, a relação sinal-ruído diminuiu e se estabilizou entre o dia 0 e o mês 6, apesar de alguma variabilidade devido à duração limitada do período de gravação (i.e., 2 min). Isso pode ser correlacionado com as impedâncias dos eletrodos.

As imagens in vivo são realizadas no pós-operatório para avaliar o estado cerebral e o posicionamento do implante. Na primeira iteração do protocolo, nenhuma radiografia intraoperatória foi realizada, resultando em um aparelho dobrado, como é visível na Figura 4A em uma sequência de RM ponderada em T1 (ver além da Figura 4B). Nenhuma mudança comportamental foi observada no animal, mas com o passar do tempo, isso resultou em um encapsulamento fibrótico ao redor do dispositivo devido à compressão macroscópica do cérebro ao redor do local do implante (Figura 4C). Após essa experiência, foi introduzida radiografia intraoperatória, como mostra a Figura 4D, onde os marcadores radiopacos (barras pretas visíveis no implante na Figura 4D inserida) mostram-se bem posicionados. A superfície do encéfalo encontra-se então intacta, como pode ser observado na RM pós-operatória na Figura 4E. No geral, com este implante e sistema de pedestal, a imagem de todo o cérebro é possível. Diferentes sequências nos planos coronais permitem visualizar estruturas anatômicas (Figura 4F,G; RM em T1 e T2) ou presença de líquido e sangue ao redor do implante (Figura 4H; Sequência de RM ponderada em EET). O sistema de pedestal quase não cria artefatos, exceto por alguns pequenos vazios contrastados em preto ao redor dos parafusos de titânio (ver Figura 4G). Além disso, eletrodos clínicos são usados como comparadores neste estudo, mas não podem ser imageados na RM devido a preocupações de aquecimento e segurança. Portanto, a TC é adquirida nesses animais, como mostra a Figura 4I. Os eletrodos são claramente visíveis, e o sistema pedestal não está influenciando a qualidade da imagem.

Após o período de implantação, o animal é perfundido e o cérebro extraído. Neste estudo, a análise da resposta inflamatória é realizada em cada hemisfério de forma independente. Cortar o cérebro ao meio é mais fácil para a preparação do tecido antes da secção, e tem a vantagem de que as seções podem ser montadas em lâminas de microscopia padrão. Um exemplo de amostra de cérebro é mostrado antes (Figura 5A) e depois (Figura 5B) do corte em blocos. O contorno do implante é claramente visível e criou um pequeno amassado no cérebro. Ao cortar em planos paralelos, o tecido já está alinhado ao criostato, e os cortes podem ser facilmente cortados sem perda de tecido para aparamento (Figura 5C). Após a coloração, todo o corte de tecido é fotografado (Figura 5D), onde, por exemplo, a camada de neurônios é claramente visível em detalhes (ver marcador NeuN). Seções inteiras são frágeis e às vezes podem levar a alguma perda de tecido (veja a parte inferior da Figura 5D), mas a área de interesse está intacta. Em uma visão mais detalhada, possibilitada pela microscopia confocal em 40x, as células são claramente definidas e permitem a investigação fina de marcadores inflamatórios, por exemplo (Figura 5E). Uma análise quantitativa adicional pode ser realizada para comparar a inflamação entre os hemisférios controle e implantado. A Figura 6 mostra a caracterização eletroquímica dos eletrodos implantados. A espectroscopia de impedância eletroquímica in vitro do arranjo de eletrodos moles com módulo e fase de impedância é mostrada na Figura 6A e o módulo de impedância a 1 kHz ao longo de 6 meses de implantação é mostrado na Figura 6B.

Figura 1: Esquema do experimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Implante minimamente invasivo de ECoG mole no cérebro . (A) Acesso cirúrgico ao crânio, com indicação de bregma. (B) Craniotomia bilateral com dura-máter visível. (C) Durotomia de fenda no primeiro hemisfério. (D) Implante subdural de ECoG mole e fechamento da dura-máter. (E) Durotomia de fenda no segundo hemisfério. Fixação do retalho ósseo no primeiro hemisfério com pontes de titânio. (F) Implantação de ECoG mole no segundo hemisfério e fechamento da dura-máter. (G) Fixação do retalho ósseo no segundo hemisfério. (H) Posicionamento da platina no crânio. (I) Fixação do pedestal na platina do pé. (J) Fechamento da pele ao redor da base do pedestal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Registro dos potenciais evocados auditivos . (A) Esquema de colocação dos eletrodos na superfície do lobo temporal. (B) Mapeamento representativo da atividade basal (traços de cinza) e dos potenciais evocados auditivos em resposta à estimulação tone burst de 800 Hz (traço roxo). Cada média corresponde a um canal no array ECoG flexível. A média é acionada no sinal de entrada analógica da estimulação sonora. Os períodos de estimulação acústica "ON" e "OFF" são anotados em um canal no canto inferior esquerdo. (C) Evolução ao longo do tempo (dia 0, mês 2 e mês 5) de resposta de um único canal após o estímulo acústico, em comparação com o sinal basal quando nenhum estímulo é apresentado (cinza). A média é acionada no sinal de entrada analógica da estimulação sonora. Os períodos de estimulação "ON" e "OFF" são anotados na parte inferior. O potencial evocado da estimulação "ON" é marcado com setas. (D) Desvio padrão por canal (pontos coloridos) por ponto de tempo do registro da linha de base. Os valores medianos são representados em azul negrito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagem in vivo do cérebro e eletrodos implantados . (A) RM ponderada em T1 no plano coronal no pós-operatório. Uma seta indica um implante dobrado. (B) Porção ampliada de A, onde a dobra do implante cria um amassado no cérebro. (C) RM ponderada em T1 com implante de 1 mês, mostrando compressão do cérebro devido ao encapsulamento fibrótico do cérebro no mesmo local que C. (D) Radiografia no plano intraoperatório verificando a colocação do implante e a ausência de dobramento, conforme observado pela colocação do marcador radiopaco. Inset: Fotografia do implante com marcador radiopaco visível. (E) RM ponderada em T1 no plano coronal no pós-operatório com ótima colocação do implante. (F) RM ponderada em T1 com implante de 1 mês. (G) RM ponderada em T2 com implante de 1 mês. Uma seta mostra o artefato de imagem dos parafusos de titânio que seguram a platina no lugar no crânio. (H) RM ponderada em EET com implante de 1 mês. (I) TC do animal implantado com os eletrodos clínicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Análise histológica do encéfalo após implante a longo prazo. (A) Fotografia de um hemisfério esquerdo explantado e perfundido. (B) Corte cerebral perfundido em blocos antes da etapa de congelamento. (C) Imagem da configuração de seccionamento de bloco inteiro no criostato; Todos os "blocos pré-cortados" podem ser seccionados. (D) Imagem de imunomarcação de todo o hemisfério (scanner de lâminas, objetiva de 20x) e (E) zoom nas primeiras camadas do córtex (imagem confocal, objetiva de 40x) mostrando células gliais, astrócitos e neurônios. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Caracterização eletroquímica dos eletrodos implantados. (A) Espectroscopia de impedância eletroquímica in vitro do arranjo de eletrodos moles (pequenas linhas cinzas para cada canal, a média em vermelho) com módulo de impedância (superior) e fase (inferior). (B) Evolução do módulo de impedância em 1 kHz ao longo de 6 meses de implantação (média em azul; linhas cinzas são os canais individuais; a medida in vitro é dada como referência em vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Pedestal compatível com RM. (A) Sistema de conexão transdérmica crônico compatível com RM (pedestal) para acessar o arranjo de eletrodos moles. (B) Pedestal com eletrodos montados na platina para ancoragem do crânio. Inset: Detalhes da platina de pé. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 2 suplementar: Acesso cirúrgico para ótima perfusão do cérebro. (A) Corte cutâneo e acesso à localização da artéria carótida e veia jugular. (B) Dissecção do tecido ao redor dos vasos sanguíneos. (C,D) Identificação e dissecção do tecido ao redor da artéria carótida e veia jugular. (E) Isolamento da artéria carótida do tecido abaixo. (F) Isolamento da veia jugular do tecido abaixo. (G) Colocação de fio de sutura ao redor da artéria carótida (sutura 1 e sutura 2) e da veia jugular (sutura 3). (H) Fechamento da sutura 3 na base da artéria carótida (lado do coração) para evitar sangramento durante a abertura do vaso. (I) Clampeamento da artéria carótida no lado oposto ao H. (J) Secção da artéria carótida. (K) Cateter inserido na abertura de J. Inset: Cateter preparado com soro fisiológico lavado de uma seringa para a ponta do cateter. (L) Fechamento da sutura 2 para manter o cateter no local e ao longo da artéria. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Parâmetros para as sequências de RM ponderadas em T1- (páginas 1-2), T2- (páginas (3-4) e TSE (páginas 5-6), respectivamente. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2: Metadados para scanner de lâminas para imagens de lâminas inteiras de fatias cerebrais manchadas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Metadados para imagens confocais de cortes cerebrais ampliados corados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Relatamos aqui um método para implantação e avaliação a longo prazo de matrizes ECoG moles. Neste estudo, desenhamos uma abordagem cirúrgica consistente e minimamente invasiva para a implantação bilateral de grades de eletrodos funcionais sobre os lobos temporais (aqui, visando o córtex auditivo). Primeiro, avaliamos a funcionalidade da grade registrando com sucesso os potenciais evocados ao longo do tempo do estudo (6 meses) e rastreando as propriedades eletroquímicas dos eletrodos (ver Figura 6). Em segundo lugar, avaliamos a biossegurança das grades, in vivo usando RM e estabelecendo um sistema totalmente compatível com RM, e post-mortem desenhando um protocolo para coleta de tecidos e imunomarcação.

Para minimizar a invasividade, otimizamos o tamanho da janela de craniotomia. Para alcançar o córtex auditivo localizado no lobo temporal e evitar a ressecção do músculo temporal, desenvolvemos uma técnica para deslizar o implante sob a dura-máter. Esta técnica permite reduzir drasticamente a superfície do cérebro exposto e ainda alcançar alvos distantes. Embora esse tipo de implante possa parecer cego, a implementação de marcadores radiopacos nos dispositivos visualizados na radiografia no plano intraoperatório permite a verificação do posicionamento e garante que o arranjo não seja dobrado sob a dura-máter. O deslizamento subdural mostrou-se seguro na maioria das repetições realizadas. Além disso, a durotomia em fenda minimiza o abaulamento cerebral durante o tempo em que a craniotomia é aberta e facilita o fechamento ao redor do implante sem a necessidade de material adicional, como a dura-máter artificial, o que poderia enviesar a resposta inflamatória. Finalmente, o ponto forte dessa abordagem cirúrgica é sua capacidade de ser transposta para diferentes regiões corticais. Brincar com as coordenadas, a posição da craniotomia e o tamanho do dispositivo, que podem ser ajustados, permite que esse método atinja a maior parte da área do córtex.

O método cirúrgico aqui apresentado, juntamente com a avaliação funcional e investigação da biointegração ao longo do tempo, não se limita à tecnologia de eletrodos moles utilizada neste relato. Outros eletrodos subdurais que estão sendo desenvolvidos para tradução humana poderiam ser avaliados com o mesmo protocolo. A força desse método depende do fato de que a maioria das peças, como o cabo e o pedestal, são modulares, personalizáveis e podem ser adaptadas ao dispositivo específico em teste. Além disso, sondas intracorticais ou penetrantes profundas também podem ser usadas em vez ou em combinação com os eletrodos subdurais, pois isso requer apenas o ajuste da geometria da craniotomia e durotomia. Os resultados a longo prazo podem então ser comparados com os seus homólogos clínicos, como fizemos aqui.

Uma das principais limitações do método apresentado é a presença de seios cranianos em miniporcos, que se desenvolvem ao longo do primeiro^ano12. Nesse sentido, aspectos importantes a serem levados em conta incluem a idade de implantação e também o tamanho do animal. A realização de craniotomias no crânio adulto quebra a integridade dos seios da face e leva a um alto risco de infecção maior em ambientes crônicos. Tais seios são visíveis na radiografia plana e na tomografia computadorizada no pré-operatório. Por outro lado, realizar o implante crônico muito cedo, em um animal muito pequeno, também não é o ideal quando o crânio está passando por um grande crescimento e remodelação. Levantamos a hipótese de que esses "movimentos do crânio" pós-cirurgia poderiam fazer com que o implante se movesse e dobrasse, o que acaba sendo prejudicial para o experimento. Descobrimos aqui que os miniporcos Göttingen, com aproximadamente 5-6 meses de idade (e 8 kg) no momento da implantação, devem dar os melhores resultados.

Para avaliar o desempenho do ECoG implantado para registros eletrofisiológicos, foi estabelecido um protocolo rápido de registro do potencial evocado auditivo (PEATE) que pode ser utilizado em animais em movimento livre e sob sedação. Consiste em apresentar uma série de rajadas de tons acústicos em frequências específicas ao longo de alguns minutos. A vantagem de tal protocolo é o fato de que ele pode ser sintonizado com o comprimento disponível de gravação, reduzindo o número de frequências sondadas. Um desafio ao registrar sinais corticais sob anestesia é que o nível de consciência do animal deve ser levado em consideração ao analisar e comparar os dados.

O protocolo de perfusão foi ajustado ao longo do tempo pela observação da qualidade do cérebro extraído. De fato, foi mais fácil cateterizar apenas a artéria carótida e não a veia jugular. Inicialmente, a literatura apresenta métodos em que a veia jugular é cateterizada para drenagem de^resíduos20. Na prática, isso limita o fluxo para fora do cérebro e leva a uma extração mais pobre de sangue e à qualidade geral da perfusão. Ao cortar a veia jugular e deixar o líquido escapar em um recipiente grande onde o animal se encontra, a eficiência da perfusão aumenta.

Desenvolvemos um método robusto de preparação de tecidos que funciona com anticorpos usados rotineiramente para o rastreamento da inflamação. Separamos os dois hemisférios por razões práticas, pois metade do cérebro do porco cabe em lâminas de microscópio padrão e, portanto, é compatível com a maioria dos equipamentos de imagem disponíveis nos laboratórios de histologia. Ao cortar o cérebro em blocos, o acesso direto à zona de interesse é possível sem exigir mais cortes de todo o cérebro ou aparar partes extensas do tecido. Os cortes cerebrais a 40 μm podem ser agrupados em placas de poço padrão e corados de forma flutuante sem grandes mudanças de protocolo a partir de imunomarcações de outras espécies. A imunomarcação completa do cérebro também poderia ser imaginada utilizando-se, por exemplo, os métodos CLARITY²¹.

No geral, esse protocolo, que abrange o projeto personalizado do implante para implantação, acompanhamento da funcionalidade e avaliação de biossegurança, é robusto e consistente. Demonstramos aqui sua viabilidade para o estudo do sistema auditivo, mas ele pode ser transposto para testar outras funções fisiológicas. Além disso, a força do nosso método reside no fato de que ele não se restringe aos miniporcos, mas é totalmente transponível para outras espécies, como ovinos, caprinos ou primatas não humanos. Até certo ponto, também pode ser facilmente adaptado a ratos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bone drill	BBraun	Elan 4 with  GA861 handpiece
Bone drill bit	BBraun	Neurocutter GP204R
Bonewax	Ethicon	W31G
Catheter	Venisystems	Abbocath 14G
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 880
Cryostat	Leica	CM1950
Gelfoam	Pfizer	Gelfoam
Insert speakers	Etymotic	Etymotic ER2 insert Earphones
Multimeter	Fluke	Fluke 1700
Oscilloscope	Tektronix	MDO3014 Mixed Domain Oscilloscope
Perfusion pump	Shenzen	LabS3/UD15
Potentiostat	Gamry Instruments	Reference 600
Primary Antibody Anti-GFAP	Thermofischer	Anti-GFAP, Rat, # 13-0300
Primary Antibody Anti-Iba1	Fujifilm	Anti Iba1, Rabbit, 019-19741
Primary Antibody Anti-NeuN	SigmaAldrich	Anti-NeuN, GuineaPig, ABN90
Pulse Generator	AM Systems	Model 2100 Isolated Pulse Stimulator
Recording headstage	Multichannel systems	W2100-HS32
Recording system	Multichannel systems	W2100
Screwdriver	Medtronic	Handle: 001201, Shaft: 8001205
Secondary Antibody 488	Thermofischer	Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488, # A-11006
Secondary Antibody 555	Thermofischer	Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555, # A-21435
Secondary Antibody 647	Thermofischer	Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647, # A-21245
Slide Scanner	Olympus	VS120
Snapfrost	Excilone	Excilone Snapfrost
Stab knife	Fine Science Tools	10316-14
Suture wire dermal	Ethicon	Vicryl 2-0
Suture wire dura mater	Ethicon	Mersilk 5-0
Suture wire for catheter	Ethicon	Vycril 3-0 without needle
Suture wire for lifting dura	Ethicon	Prolene 6-0 with BV-1 needle
Suture wire subcutaneous	Ethicon	Vicryl 4-0
Titanium bridge	Medtronic	TiMesh 015-2001-4	Cut out the required size
Titanium screws	Medtronic	9001635, 9001640
X-ray system	GE	GE OEC 9800 Plus C-Arm