Summary
Dit protocol geeft instructies voor het activeren en monitoren van Stub1-gemedieerde pexofagie in levende cellen.
Abstract
Zoogdiercellen kunnen peroxisomen omkeren via Stub1-gemedieerde pexofagie. De route maakt mogelijk cellulaire controle van de kwantiteit en kwaliteit van peroxisomen mogelijk. Tijdens dit proces transloceren heat shock protein 70 en het ubiquitine E3 ligase, Stub1, op peroxisomen om te worden omgedraaid om pexofagie te initiëren. De Stub1 ligase-activiteit maakt de accumulatie van ubiquitine en andere autofagie-gerelateerde modules op gerichte peroxisomen mogelijk. Het verhogen van reactieve zuurstofsoorten (ROS) niveaus binnen het peroxisomale lumen kan Stub1-gemedieerde pexofagie activeren. Men kan daarom kleurstof-ondersteunde ROS-generatie gebruiken om deze route te activeren en te monitoren. Dit artikel schetst de procedures voor het gebruik van twee klassen kleurstoffen, fluorescerende eiwitten en synthetische fluoroforen, om pexofagie in zoogdiercelculturen te initiëren. Deze op kleurstof ondersteunde ROS-generatie gebaseerde protocollen kunnen niet alleen worden gebruikt om alle peroxisomen binnen een celpopulatie wereldwijd aan te pakken, maar kunnen ook de manipulatie van individuele peroxisomen binnen afzonderlijke cellen mogelijk maken. We beschrijven ook hoe Stub1-gemedieerde pexofagie kan worden gevolgd met behulp van live-cell microscopie.
Introduction
Peroxisomen zijn enkelmembraangebonden organellen die aanwezig zijn in de meeste eukaryote cellen. Peroxisomen zijn een metabolisch compartiment dat essentieel is voor het uitvoeren van de bèta-oxidatie van vetzuren met een zeer lange keten, purinekatabolisme en etherfosfolipide- en galzuursynthese1. Peroxisoom-afgeleid acetyl-CoA regelt lipidehomeostase door de centrale signalering in metabolisme2 te reguleren. Daarom is het geen verrassing dat gecompromitteerde peroxisomale functies worden geïmpliceerd in verschillende ziekten, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen, veroudering, kanker, obesitas en diabetes 3,4,5. Een essentieel proces bij het handhaven van peroxisomale werking is pexofagie. Pexofagie is een katabolisch proces voor de selectieve omzetting van peroxisomen door autofagie. Cellen gebruiken pexofagie om de kwantiteit en kwaliteit van peroxisomen te helpen beheersen, waardoor een goede peroxisomale functie wordt gegarandeerd. Een recente studie toonde aan dat peroxisoomverlies veroorzaakt door mutaties in PEX1 peroxisomale biogenese factoren 1 en 6 het gevolg is van ongecontroleerde pexofagie6. Met name 65% van alle patiënten met peroxisoombiogenesestoornis (PBD) heeft tekortkomingen in het peroxisomale AAA ATPase-complex, bestaande uit PEX1, PEX6 en PEX26 in zoogdiercellen7.
Een aantal methoden kan worden gebruikt om pexofagie te initiëren en te bestuderen. In gist wordt pexofagie geactiveerd wanneer de geleverde voedingsstoffen worden overgeschakeld van peroxisoomafhankelijke koolstofbronnen naar peroxisoomonafhankelijke koolstofbronnen (naar lagere cellulaire peroxisoomaantallen)8. De overdracht van methanol-gekweekte Pichia pastoris-cellen van methanolmedium naar glucosemedium en ethanolmedium induceert bijvoorbeeld micropexofagie en macropexofagie, respectievelijk 8,9,10. Micropexofagie-sequesters clusterden peroxisomen voor afbraak door de vacuole te hermodelleren om cup-achtige vacuolaire sekwestratiemembranen en een dekselachtige structuur te vormen die het micropexofagie-specifieke membraanapparaat (MIPA) wordt genoemd. Bij macropexofagie worden individuele peroxisomen overspoeld door dubbelmembraanstructuren die bekend staan als pexofagosomen, gevolgd door fusie met de vacuole voor afbraak 8,9,10. De fosforylering van pexofagiereceptoren, zoals Atg36p in Saccharomyces cerevisiae en Atg30p in Pichia pastoris, is van cruciaal belang voor de receptoren om kernautofagiemachines te rekruteren en om peroxisomale targeting op autofagosomen 8,11 te vergemakkelijken.
In zoogdiercellen kan pexofagie worden geïnduceerd door ubiquitinatie. Het labelen van de peroxisomale membraaneiwitten PMP34 of PEX3 met ubiquitine aan de cytosolische kant induceert pexofagie12. De overexpressie van PEX3 induceert peroxisoom ubiquitinatie en peroxisoom eliminatie door lysosomen13. Bovendien schaadt de fusie van PEX5 met een C-terminale EGFP de export van monoubiquitinated PEX5 en resulteert in pexofagie14. Aan de andere kant kan pexofagie ook worden veroorzaakt door H 2 O2-behandeling. Peroxisomen produceren reactieve zuurstofsoorten (ROS); specifiek produceert het peroxisomale enzym Acox1, dat de eerste stap van bèta-oxidatie van zeer lange keten vetzuren (> 22 koolstof) katalyseert, niet alleen acetyl-CoA, maar ook peroxisomale ROS. Als reactie op de verhoogde ROS-niveaus onder H 2 O2-behandelingactiveren zoogdiercellen pexofagie om de ROS-productie te verlagen en stress te verlichten. Er is gemeld dat H 2 O2-behandelingde rekrutering van ataxie-teleangiëctasieën gemuteerd (ATM) naar peroxisomen stimuleert. ATM fosforyleert vervolgens PEX5 om de peroxisomale omzet te bevorderen door pexofagie15.
Omdat peroxisomen ROS-genererende centra zijn, zijn ze ook gevoelig voor ROS-schade. ROS-uitgelokte peroxisomale letsels dwingen cellen om pexofagie te activeren om peroxisoomkwaliteitscontroleroutes te initiëren (verwijdering van het beschadigde peroxisoom door autofagie). Hier schetsen we een aanpak voor het on-demand triggeren van ROS-uitgelokt peroxisomale schade. Het protocol maakt gebruik van lichtgeactiveerde ROS-productie binnen organellen 16,17,18,19,20 (figuur 1). Peroxisomen met kleurstoflabel worden verlicht, wat leidt tot ROS-productie in het peroxisomale lumen, wat specifiek peroxisomale schade veroorzaakt. Met behulp van dit protocol wordt aangetoond dat ROS-gestresste peroxisomen worden verwijderd via een ubiquitine-afhankelijke afbraakroute. ROS-gestreste peroxisomen rekruteren het ubiquitine E3-ligase Stub1 om hun overspoeling in autofagosomen mogelijk te maken voor individuele verwijdering door pexofagie16. Men kan dit protocol gebruiken om het lot van gewonde en gezonde peroxisomen in dezelfde cel te vergelijken door middel van time-lapse microscopie. De methode kan ook worden gebruikt om alle peroxisomen (in alle cellen) op een kweekschaal globaal te beschadigen, waardoor de biochemische analyse van de pexofagieroute mogelijk is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van cellen die diKillerRed of zelflabelende eiwitten (SLPs) tot expressie brengen in het peroxisoomlumen
- Zaai de gewenste cellen op celkweekschalen met glazen bodem. Voor het experiment hier, zaad 2 x 105 menselijke SHSY5Y-cellen in 840 μL kweekmedium (DMEM / F-12 aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine) of 6 x 104 muis NIH3T3-cellen in 840 μL kweekmedium (DMEM aangevuld met 10% runderserum en 1% penicilline / streptomycine) op een 35 mm kweekschaal met een glazen microwell met een diameter van 20 mm.
OPMERKING: Het aantal gezaaide cellen moet proportioneel worden aangepast aan het glazen microwell-gebied bij gebruik van glazen bodemschalen met andere specificaties. - Kweek de cellen onder 5% CO2/37 °C gedurende 24 uur.
- Transfecteer de cellen met de gewenste plasmiden met behulp van een transfectiereagens.
- Gebruik PMP34-TagBFP om de peroxisomen in levende cellen te labelen. Gebruik peroxisoom-targeting diKillerRed-VKSKL of SLP-VKSKL (+ kleurstof-gelabelde SLP-liganden) voor ROS-generatie in het peroxisoomlumen (door lichtgeactiveerde ROS-productie). In dit protocol gebruiken we het zelflabelende eiwit HaloTag-VKSKL21. Om de translocatie van Stub1/Hsp70, de accumulatie van ubiquitinated eiwitten en de vorming van autofagosomen op ROS-gestresste peroxisomen te monitoren, transfecteren EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub of EGFP-LC3B, respectievelijk. Om de ROS-generatie in het peroxisomale lumen te controleren, co-transfecteert diKillerRed-VKSKL met de peroxisoom-gelokaliseerde fluorescerende redoxsonde roGFP2-VKSKL22.
- Voor SHSY5Y-celtransfectie verdunt u plasmiden in 55 μl serumvrij DMEM/F-12 en verdunt u 1 μl transfectiereagens in 55 μl serumvrije DMEM/F12. Combineer het verdunde DNA met het verdunde reagens. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg het complex toe aan de 20 mm microwell die eerder is bekleed met 100 μL kweekmedium voor SHSY5Y zonder antibiotica (DMEM/F-12 met 10% foetaal runderserum). Schud de schaal voorzichtig heen en weer.
- Vervang voor NIH3T3-celtransfectie gereduceerd serummedium voor het serumvrije DMEM/F-12 voor het verdunnen van de plasmiden en het transfectiereagens. Vervang het platingkweekmedium door SHSY5Y door kweekmedium voor NIH3T3-cellen zonder antibiotica (DMEM met 10% runderserum).
- Verwijder na 2 uur transfectie het transfectiereagensbevattende medium en voeg 1 ml vers kweekmedium toe. Incubeer de NIH3T3- of SHSY5Y-cellen bij 37°C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
OPMERKING: Andere cellijnen kunnen ook worden gebruikt om Stub1-gemedieerde pexofagie (bijv. HeLa-cellen) te bestuderen.
2. Kleuring peroxisomen met kleurstof-gelabelde SLP liganden (voor licht-geactiveerde ROS productie)
- Verwijder 24 uur na de transfectie het kweekmedium en voeg 100 μL 200 nM HaloTag TMR-ligand of 200 nM Janelia Fluor 646 HaloTag-ligand toe aan de 20 mm glazen microwell.
OPMERKING: De met kleurstof gelabelde SLP-liganden moeten worden verdund met het respectieve kweekmedium voor elke cellijn. Het kiezen van Janelia Fluor 646-gelabelde liganden zal de blauwe, groene en rode kanalen vrijmaken voor downstream fluorescentiebeeldvorming. - Breng de schaal over in een 37°C, 5% CO2 incubator. Vlek gedurende 1 uur. Verwijder na 1 uur het kleurmedium grondig en voeg 1 ml vers kweekmedium toe.
3. ROS-spanning van peroxisomen op een laser-scanning confocale microscoop
- Plaats een schaal met glazen bodem met de gewenste cellen op een laserscannende confocale microscoop die is uitgerust met een podiumincubator.
- Klik op Gereedschapsvenster, kies Oculair en klik op de DIA-knop (Figuur 2A) om het doorgelaten licht in te schakelen. Bekijk de schotel door het microscoopoculair en breng de cellen scherp door aan de scherpstelknop te draaien.
- Kies LSM en klik op de knop Kleurstof & Detector selecteren (figuur 2B). Dubbelklik op de gewenste kleurstoffen in het pop-upvenster om de juiste laser- en filterinstellingen te selecteren voor het afbeelden van de cellen (figuur 2C). Klik op Livex4 in het Live-paneel om een snelle laserscanning te starten om te beginnen met het screenen op de fluorescentiesignalen van de cellen (figuur 2D).
- Verplaats het podium met behulp van de joystickcontroller en zoek de medium diKillerRed-VKSKL- of SLP-VKSKL-expresserende cellen om ROS-spanning (op de peroxisomen) toe te passen. Verkrijg een afbeelding van de gewenste cel.
- Klik op Gereedschapsvenster en kies LSM-stimulatie (figuur 2E). Klik op de ellipsknop en gebruik in het live beeldvenster de muis om een cirkelvormige ROI van 15 μm in diameter (figuur 2F) te tekenen met de gewenste peroxisomen die in stap 3.4 zijn verkregen en waarop ROS-spanning wordt toegepast (zie figuur 3 voor een voorbeeld).
- Om ROS-stress toe te passen, gebruikt u 561 nm voor cellen met de diKillerRed-PTS1- of TMR-gelabelde SLP-ligand en gebruikt u 640 nm voor cellen die zijn gekleurd met de Janelia Fluor 646-gelabelde SLP-ligand.
- Selecteer de lasergolflengte voor het toepassen van de ROS-spanning. Voer het gewenste laserpercentage en de duur in (figuur 2G).
- Klik op Acquire en klik op de stimulatieknop (figuur 2H) om het scannen met 561/640 nm-licht door de ROI's voor elk 30 s te starten. Dit komt overeen met een laservermogensinstelling van ~5% voor zowel 561 nm als 640 nm op de confocale microscoop die hier wordt gebruikt. Deze bewerking zal leiden tot ROS-productie in de peroxisomen.
OPMERKING: Men kan ROI's van verschillende groottes selecteren. Men moet de verlichtingstijd voor elke ROI proportioneel aanpassen aan het gebied. - Na 30 s laserverlichting hebben peroxisomen binnen de ROIs hun diKillerRed-PTS1/TMR/Janelia Fluor 646-signalen verloren. Dit signaalverlies maakt het mogelijk om de verlichte van de niet-verlichte peroxisomen (beschadigd versus gezond) in een cel te onderscheiden.
4. Monitoring van pexofagie in levende cellen door time-lapse beeldvorming
- Volg de translocatie van EGFP-gelabelde Stub1, Hsp70, Ub, p62 of LC3B op de verlichte/ROS-gespannen peroxisomen door time-lapse beeldvorming met intervallen van 10 minuten tussen frames (zie bijvoorbeeld figuren 3-7).
OPMERKING: EGFP-Stub1- of EGFP-Hsp70-signalen beginnen 10-20 minuten na de verlichting te verschijnen en blijven op alle beschadigde peroxisomen tot ~ 40 minuten na de verlichting. De EGFP-Ub-signalen verschijnen 30 minuten na de verlichting en duren 2-3 uur. EGFP-p62-translocatie verschijnt 60 minuten na verlichting en EGFP-LC3B-signalen worden zichtbaar ~ 3 uur na verlichting. - Kwantificeer de EGFP-signalen op de beschadigde peroxisomen (van Stub1, Ub, p62 of LC3B) met behulp van ImageJ. Voer de volgende stappen uit voor het gebruik van ImageJ om een driekanaals image te kwantificeren (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).
- Open de afbeelding en pas elliptische selecties of selecties uit de vrije hand toe om het gebied met alle verlichte peroxisomen (PMP34-TagBFP-signaalpositief en HaloTag-ligandsignaal gebleekt) te omsluiten; Figuur 8A).
- Klik op Dupliceren om het PMP34-TagBFP-kanaal uit te kiezen (Figuur 8A). Stel een drempel in met behulp van het vervolgkeuzemenu Afbeelding > Pas > drempel aan om de peroxisomen te markeren (afbeelding 8B).
- Selecteer Analyseren > Deeltjes analyseren om de exacte gebieden van de verlichte peroxisomen te bepalen. ImageJ registreert deze interessegebieden (ROI's) in de ROI-manager (Figuur 8C).
- Klik op Dupliceren om het EGFP-kanaal uit te kiezen voor het analyseren van het fluorescentiesignaal van EGFP-geconjugeerd Ub, p62 of LC3B (figuur 8D). Selecteer alle ROI's in de ROI Manager (Figuur 8E).
- Pas Measure toe in de ROI Manager om de EGFP-signalen op de peroxisomen te meten (Figuur 8E). Zoek de waarde van het gebied en de geïntegreerde dichtheid (de som van alle pixelintensiteiten) voor elke ROI in de resultatentabel (figuur 8E).
- Om de gemiddelde EGFP-fluorescentie-intensiteiten op verschillende tijdstippen na verlichting te verkrijgen, deelt u de geïntegreerde EGFP-intensiteit door het totale oppervlak van verlichte peroxisomen (PMP34-TagBFP-signaalpositieve en HaloTag-ligandsignaalnegatieve gebieden). Om het geaccumuleerde signaal op de peroxisomen te verkrijgen, trekt u de gemiddelde intensiteit op een tijdstip af van de gemiddelde intensiteit op tijd = 0 en normaliseert u vervolgens met de gemiddelde intensiteit op tijd = 0.
5. Wereldwijd beschadigen van alle peroxisomen (in elke cel) op een kweekschaal
- Voer stap 1 (voorbereiding van cellen die peroxisoomgerichte diKillerRed [diKillerRed-VKSKL] of SLP [SLP-VKSKL]) en stap 2 (kleuring van peroxisomen met de SLP-ligand [voor lichtgeactiveerde ROS-productie] uitvoeren).
- Verwijder na 1 uur TMR-gelabelde ligandkleuring het kleurmedium en voeg 1 ml kweekmedium toe met 30 mM 3-AT (3-amino-1,2,4-triazool; een katalaseremmer).
OPMERKING: Catalase is een ROS-aaseter uitgedrukt in het peroxisoomlumen, dus 3-AT-behandeling helpt de door licht opgewekte oxidatieve schade aan de peroxisomen te vergroten. - Plaats de kweekschaal boven een LED (555-570 nm). Verlicht alle cellen met een vermogensdichtheid van 1,8 W/cm2 gedurende 9 uur in een incubator.
OPMERKING: Om deze stap buiten een incubator uit te voeren, plaatst u de kweekschaal op een verwarmingsplaat van 37 °C. Voeg 20 mM HEPES toe aan het 3-AT-bevattende medium en bedek de kweekschaal met een transparante film om gasuitwisseling te minimaliseren. HEPES is een buffermiddel dat de fysiologische pH in celkweek buiten een CO 2-incubator handhaaft tijdens LED-verlichting. - Valideer het succes van LED-opgewekte schade door de EGFP-Ub-, EGFP-p62- of EGFP-LC3B-signalen op de peroxisomen af te beelden. Met behulp van de hierboven beschreven verlichtingsconditie vertoonde 82% van de SHSY5Y-cellen die stabiel HaloTag-VKSKL tot expressie brachten Stub1-gemedieerde pexofagie.
- Oogst de cellen voor downstream biochemische analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hier getoonde Stub1-gemedieerde pexofagie-inductieschema maakt gebruik van kleurstofondersteunde ROS-generatie binnen het peroxisoomlumen. Deze bewerking vereist minimale lichtintensiteiten. Peroxisomen die fluorescerende eiwitten of kleurstoffen bevatten, kunnen daarom worden verlicht met behulp van standaard laserscannende confocale microscopen. Focale verlichting leidt tot onmiddellijke en gelokaliseerde ROS-productie binnen individuele peroxisomen, zoals aangegeven door de fluorescerende reporter roGFP2-VKSKL (figuur 9). We hebben diKillerRed-VKSKL niet in beeld gebracht in de roGFP2-VKSKL-metingen om extra ROS-generatie tijdens beeldvorming te voorkomen. De diKillerRed-VKSKL-afbeelding rechtsonder in figuur 9 is genomen nadat alle roGFP2-VKSKL-metingen waren gedaan om duidelijk aan te geven waar de beschadigde peroxisomen13 waren. De gegevens tonen ook aan dat niet-geanolumineerde peroxisomen niet worden beïnvloed, wat wijst op de precisie van de methodologie. ROS leidt tot de oxidatie van een kleine fractie van peroxisoomresidente moleculen, wat leidt tot peroxisoomdisfunctie. Deze acute operatie maakt het mogelijk om de verschillende peroxisoomkwaliteitscontrolepaden robuust te onderzoeken.
We konden deze methodologie gebruiken om Stub1-gemedieerde pexofagie te monitoren. In Stub1-gemedieerde pexofagie rekruteert Hsp70 Stub1 op ROS-gestresste peroxisomen om peroxisoomomzet door autofagie te initiëren. Tijdens dit proces verschijnen Hsp70, Stub1, ubiquitinated proteins, autophagy adaptor p62 en LC3B sequentieel op ROS-gestresste peroxisomen om pexofagie aan te drijven (Figuur 3, Figuur 4, Figuur 5, Figuur 6 , Figuur 7)13. Door middel van time-lapse beeldvorming was het mogelijk om de timing en volgorde van de rekrutering van deze kritische factoren in pexofagie te volgen. Door de methodologie te gebruiken om peroxisomen focal te verwonden, konden we gemakkelijk aantonen dat de Hsp70 / Stub1-machines zich specifiek richten op beschadigde peroxisomen (maar niet op functionele). Afgezien van het opwekken van ROS-productie binnen individuele peroxisomen, was het mogelijk om dezelfde strategie te gebruiken om tegelijkertijd alle peroxisomen op een kweekschaal te beschadigen voor de biochemische karakterisering van Stub1-gemedieerde pexofagie (figuur 10).
Figuur 1: Schema voor lichtgeactiveerde ROS-productie in peroxisomen. (A) Schema van hoe peroxisomale ROS-generatie door licht kan worden geactiveerd. Kleurstoffen zoals KillerRed tandemdimeren of fluorescerende SLP-liganden worden gericht op peroxisomen door het gebruik van peroxisoom-targetingsequenties (VKSKL). (B) De 3-AT remt catalase en kan worden gebruikt in combinatie met het hier getoonde schema om de ROS-niveaus in het peroxisomale lumen te verhogen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Een confocale microscoop gebruiken om de ROS-productie in peroxisomen te activeren. (A) Screenshot voor stap 3.2 in het protocol. (B-D) Screenshots voor stap 3.3 in het protocol. (E-F) Screenshots voor stap 3.5 in het protocol. (G) Screenshot voor stap 3.7 in het protocol. (H) Screenshot voor stap 3.8 in het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Translocatie van EGFP-Stub1 op ROS-gestresste peroxisomen. SHSY5Y-cellen werden getransfecteerd met HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP en EGFP-Stub1. Een dag na transfectie werden de cellen gekleurd met de HaloTag TMR-ligand bij 37°C (200 nM, 1 h). Hier worden gegevens van een van de cellen in dit voorbeeld weergegeven. (A) Het witte cirkelvormige gebied in deze cel werd geselecteerd voor 561 nm verlichting. (B) De verlichte peroxisomen in het witte cirkelvormige gebied verloren onmiddellijk hun TMR-fluorescentie. (C) EGFP-Stub1 getransloceerd op de verlichte peroxisomen bij t = 20 min. Inzetstukken linksboven: vergrote weergave van de witte vierkante gebieden . Alle schaalstaven: 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Rekrutering van EGFP-Hsp70 door ROS-gestresste peroxisomen. Peroxisomen in de SHSY5Y-cellen die HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP en EGFP-Hsp70 tot expressie brengen, werden gedurende 1 uur gekleurd met 200 nM HaloTag TMR-ligand. Hier worden gegevens van een van de cellen in dit voorbeeld weergegeven. (A) Het witte cirkelvormige gebied in de cel werd blootgesteld aan een verlichting van 561 nm. (B) De verlichte peroxisomen in dit verlichte gebied verloren onmiddellijk hun TMR-fluorescentie als gevolg van fotobleken. (C) EGFP-Hsp70 20 minuten later getransloceerd op de verlichte peroxisomen. Inzet rechtsonder: vergrote weergave van de witte vierkante gebieden. Alle schaalstaven: 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Time-lapse beeldvorming van ubiquitinated eiwitaccumulatie op ROS-gestresste peroxisomen. (A) Na 1 h HaloTag TMR-ligandkleuring werden peroxisomen in het witte cirkelvormige gebied in een SHSY5Y-cel die EGFP-Ub, PMP34-TagBFP en HaloTag-VKSKL tot expressie bracht, verlicht met 561 nm. (B) De TMR-fluorescentie in het gebied werd na verlichting gebleekt. EGFP-Ub later specifiek geaccumuleerd op de verlichte peroxisomen (t = 40 min en 2 h nadat de 561 nm verlichting wordt weergegeven. Inzet rechtsonder: vergrote weergave van de witte vierkante gebieden in (C). Alle schaalstaven: 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Accumulatie van de autofagieadapter p62 op ROS-belaste peroxisomen . (A) Het witte cirkelvormige gebied in een SHSY5Y-cel dat EGFP-p62, PMP34-TagBFP en HaloTag-VKSKL uitdrukt (gekleurd met de HaloTag TMR-ligand; 200 nM, 1 h) werd verlicht met 561 nm licht. (B) De verlichting veroorzaakte het onmiddellijke verlies van de TMR-signalen op de beoogde peroxisomen. (C) 2,5 h na de verlichting werden de peroxisomen gerekruteerd EGFP-p62. Inzet rechtsboven: vergrote weergaven van de witte vierkante gebieden in (C). Alle schaalstaven: 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Translocatie van EGFP-LC3B op ROS-gestresste peroxisomen. (A) Na HaloTag TMR ligandkleuring (200 nM, 1 h) werd een SHSY5Y-cel die EGFP-LC3B, PMP34-TagBFP en HaloTag-VKSKL tot expressie bracht, verlicht met 561 nm binnen het witte cirkelvormige gebied. (B) Na verlichting werd het TMR-signaal van de peroxisomen in het witte cirkelvormige gebied gebleekt. (C) 3,5 h na verlichting transloceerde EGFP-LC3B op de ROS-gespannen peroxisomen. Inzet rechtsboven: vergrote weergaven van de witte vierkante gebieden in (C). Alle schaalstaven: 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Kwantificeren van de fluorescentiesignalen op beschadigde peroxisomen met behulp van ImageJ . (A) Screenshot voor stap 4.2.1 en stap 4.2.2 in het protocol. (B) Screenshot voor stap 4.2.2 in het protocol. (C) Screenshot voor stappen 4.2.3 in het protocol. (D) Screenshot voor stap 4.2.4 in het protocol. (E) Screenshot voor stap 4.2.4 en stap 4.2.5 in het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Lichtgeactiveerde ROS-productie binnen individuele peroxisomen. De peroxisoom-gelokaliseerde redoxsonde roGFP2-VKSKL werd gebruikt om de lichtgeactiveerde ROS-productie binnen de beoogde peroxisomen te valideren. De peroxisomen in het witte cirkelvormige gebied van een NIH3T3-cel die diKillerRed-VKSKL en roGFP2-VKSKL tot expressie brengen, werden verlicht met 561 nm licht, en deze worden getoond (A) vóór de 561 nm lichtverlichting en (B) na de 561 nm lichtverlichting. Links: roGFP2-VKSKL emissie met 405 nm excitatie (magenta); midden: roGFP2-VKSKL emissie met 488 nm excitatie (groen). De verhouding van het roGFP2-VKSKL-emissiesignaal geëxciteerd door 405 nm (magenta) over het emissiesignaal geëxciteerd door 488 nm (groen) volgt de ROS-niveaus binnen de peroxisomen. Het witte cirkelvormige gebied in (B) toont het onmiddellijke verlies van diKillerRed-VKSKL-emissie na 561 nm verlichting. Alle schaalstaven: 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Wereldwijd beschadigen van alle peroxisomen op een kweekschaal. SHSY5Y-cellen die HaloTag-VKSKL, EGFP-Ub en PMP34-TagBFP tot expressie brachten, werden gedurende 1 uur gekleurd met HaloTag TMR-ligand. (A) Vóór LED-verlichting was EGFP-Ub-fluorescentie homogeen in het cytoplasma en colokaliseerde niet met de peroxisomen (gemarkeerd door het HaloTag TMR-ligand en PMP34-TagBFP). (B) Na 9 uur LED-verlichting heeft het EGFP-Ub-signaal zich opgehoopt op alle peroxisomen in de cellen die in een confocale schaal zijn gekweekt, zoals aangegeven in de twee panelen onder (B). Alle schaalstaven: 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft hoe Stub1-gemedieerde pexofagie in celculturen kan worden geactiveerd door peroxisomale ROS-niveaus met licht te verhogen. Omdat het protocol afhankelijk is van kleurstof-geassisteerde ROS-generatie, moet men zorgen voor voldoende expressie van diKillerRed-VKSKL of kleurstof-gelabelde SLP-ligandkleuring in de cellen van belang. Gezien het feit dat verschillende celtypen of cellen met verschillende genetische achtergronden peroxisomen met enigszins verschillende eigenschappen kunnen bevatten, moet men mogelijk de exacte verlichtingsomstandigheden afstemmen om de inductie van pexofagie te garanderen. Een robuuste maatregel om te screenen op de activering van Stub1-gemedieerde pexofagie is om te controleren of EGFP-Ub transloceert op de verlichte peroxisomen (1 uur na verlichting)13. In gezonde cellen zijn EGFP-Ub-signalen meestal gelijkmatig verdeeld in het cytoplasma. De translocatie op verlichte peroxisomen is daarom gemakkelijk waar te nemen. Om de verlichtingsconditie te optimaliseren, kan de lichtintensiteit of de verlichtingstijd worden gewijzigd. Het is ook het beste om de overbelichting van kleurstoffen te vermijden bij het proberen de peroxisomen te beschadigen, omdat sommige fotochemische processen kunnen ondergaan die de stroomafwaartse beeldvorming kunnen verstoren. Er is bijvoorbeeld aangetoond dat de overbelichting van KillerRed ervoor kan zorgen dat het zwak groen fluorescerend wordt. Overbelichting genereert zwakke groene signalen op de verlichte peroxisomen onmiddellijk na verlichting23 (in tegenstelling tot de translocatie van EGFP-gebaseerde verslaggevers, die tientallen minuten tot uren kan duren om op te treden).
De methodologie stelt onderzoekers in staat om standaard laserscannende confocale microscopen te gebruiken om een fractie van peroxisomen in een cel aan te tasten, waardoor directe vergelijkingen van het verschil in lot tussen gezonde en beschadigde peroxisomen mogelijk zijn. In vergelijking met de bestaande methoden veroorzaakt het protocol hier ROS-stress voor slechts een klein deel van de peroxisomen in plaats van alle peroxisomen of andere organellen in de cellen. Het is dus mogelijk om het effect van de resterende gezonde peroxisomen op de pexofagie van de ROS-gestresste peroxisomen in dezelfde cel te bestuderen.
Door de verlichting van een hele schaal is het ook mogelijk om alle peroxisomen in een celcultuur te richten, waardoor de biochemische analyse van Stub1-gemedieerde pexofagie mogelijk is. Hoe Hsc70/Stub1 beschadigde peroxisomen herkent en welke peroxisomale substraten Stub1 ubiquitinaten zijn allemaal vragen die met behulp van dit protocol kunnen worden onderzocht. Meer in het algemeen kan het peroxisoomstoornisprotocol ook worden gebruikt om te tasten naar andere peroxisoomkwaliteitscontroleroutes. Gezien het feit dat peroxisomen nauw verbonden zijn met veel verschillende cellulaire organellen in de cel, waaronder het endoplasmatisch reticulum, de mitochondriën en lipidedruppels, zou het ook interessant zijn om te onderzoeken hoe cellen systematisch het gedrag van alle cellulaire structuren moduleren als reactie op peroxisoomstoornissen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een MOST 111-2311-B-001-019-MY3 onderzoeksbeurs van de National Science and Technology Council in Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell | MatTek | P35G-1.5-20-C | 20 mm glass bottomed |
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Sigma Aldrich | A8056 | |
| bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16170060 | |
| Cell culture incubator | Nuaire | NU-4750 | |
| diKillerRed-PTS1 | Academia Sinica | made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL) | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) | ThermoFisher Scientific | 11330032 | |
| EGFP-C1 | Clontech | pEGFP-C1 | The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62 |
| EGFP-Hsp70 | Academia Sinica | Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1 | |
| EGFP-LC3B | Addgene | 11546 | |
| EGFP-p62 | Academia Sinica | generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Stub1 | Academia Sinica | generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Ub | Addgene | 11928 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| HaloTag TMR ligand | Promega | G8252 | |
| HaloTag-PTS1 | Academia Sinica | PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Inverted Confocal Microscope | Olympus | FV3000RS | 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex, microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment |
| Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand | Promega | GA1120 | |
| LED | VitaStar | PAR64 | 80 W, 555-570 nm |
| lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668 | transfection reagent |
| NIH3T3 cell | ATCC | CRL-1658 | adherent |
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 319850 | reduced serum media |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| PMP34-TagBFP | Academia Sinica | PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171) | |
| roGFP2-PTS1 | Academia Sinica | generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1 | |
| SHSY5Y cell | ATCC | CRL-2266 | adherent |
References
- Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).
- He, A., et al. Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation. Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).
- Cipolla, C. M., Lodhi, I. J.
- Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, Springer. Dordrecht, the Netherlands. 45-65 (2013).
- Puri, P., et al. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).
- Law, K. B., et al. The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).
- Nazarko, T. Y. Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).
- Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
- Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -C., Subramani, S. Molecular mechanism and physiological role of pexophagy. FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).
- Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).
- Germain, K., Kim, P. K. Pexophagy: A model for selective autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).
- Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).
- Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy. Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).
- Nordgren, M., et al. Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts. Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).
- Zhang, J., et al. ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS. Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).
- Chen, B. -H., Chang, Y. -J., Lin, S., Yang, W. Y. Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes. Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).
- Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
- Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane. Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428 (2013).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
- Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes. Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).
- Nordgren, M., et al. Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).
