Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניטור Stub1-Mediated Pexophagy

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65010
Automatic Translation
1, 1,2
1Institute of Biological Chemistry, Academia Sinica, 2Institute of Biochemical Sciences, College of Life Sciences, National Taiwan University

Summary

פרוטוקול זה מספק הוראות להפעלה ולניטור של פקסופאגיה בתיווך Stub1 בתאים חיים.

Abstract

תאי יונקים יכולים להפוך פרוקסיזומים באמצעות פקסופאגיה בתיווך Stub1. המסלול מאפשר בקרה תאית על כמות ואיכות הפרוקסיזומים. במהלך תהליך זה, חלבון הלם חום 70 ויוביקוויטין E3 ליגאז, Stub1, עוברים לפרוקסיזומים כדי להפוך אותם כדי להתחיל פקסופגיה. פעילות ליגאז Stub1 מאפשרת הצטברות של יוביקוויטין ומודולים אחרים הקשורים לאוטופגיה על פרוקסיזומים ממוקדים. העלאת רמות החמצן הריאקטיבי (ROS) בלומן הפרוקסיזומלי יכולה להפעיל פקסופאגיה בתיווך Stub1. ניתן, אם כן, להשתמש ביצירת ROS בסיוע צבע כדי להפעיל ולנטר מסלול זה. מאמר זה מתאר את ההליכים לשימוש בשני סוגים של צבעים, חלבונים פלואורסצנטיים ופלואורופורים סינתטיים, כדי ליזום פקסופאגיה בתוך תרביות תאים של יונקים. פרוטוקולים מבוססי יצירת ROS בסיוע צבע אלה יכולים לשמש לא רק כדי להתמקד בכל הפרוקסיזומים באוכלוסיית תאים ברחבי העולם, אלא גם יכולים לאפשר מניפולציה של פרוקסיזומים בודדים בתוך תאים בודדים. אנו גם מתארים כיצד ניתן לעקוב אחר פקסופאגיה בתיווך Stub1 באמצעות מיקרוסקופ תאים חיים.

Introduction

פרוקסיזומים הם אברונים הקשורים לקרום יחיד הנמצאים ברוב התאים האיקריוטים. פרוקסיזומים הם תא מטבולי חיוני לביצוע חמצון בטא של חומצות שומן ארוכות שרשרת מאוד, קטבוליזם פורין, וסינתזה של פוספוליפידים וחומצות מרה באתר1. אצטיל-CoA המופק מפרוקסיזום שולט בהומאוסטזיס שומנים על ידי ויסות האיתות המרכזי בחילוף החומרים2. לכן, אין זה מפתיע כי תפקודים peroxisomal נפגע משתמע במחלות שונות, כולל הפרעות נוירודגנרטיביות, הזדקנות, סרטן, השמנת יתר, סוכרת 3,4,5. תהליך חיוני בשמירה על פעולה peroxisomal הוא pexophagy. פקסופאגיה היא תהליך קטבולי לתחלופה סלקטיבית של פרוקסיזומים על ידי אוטופגיה. תאים משתמשים בפקסופאגיה כדי לסייע בשליטה על כמות ואיכות הפרוקסיזומים, ובכך להבטיח תפקוד פרוקסיזומלי תקין. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי אובדן פרוקסיזום שנגרם על ידי מוטציות בגורמים הביולוגיים PEX1 peroxisomal 1 ו -6 נובע מפקסופאגיה בלתי מבוקרת6. יש לציין כי 65% מכלל החולים בהפרעת ביוגנזה פרוקסיזומית (PBD) סובלים מליקויים בקומפלקס פרוקסיזומלי AAA ATPase, המורכב מ-PEX1, PEX6 ו-PEX26 בתאי יונקים7.

ניתן להשתמש במספר שיטות כדי ליזום וללמוד פקסופגיה. בשמרים, פקסופאגיה מופעלת כאשר חומרי המזון המסופקים עוברים ממקורות פחמן תלויי פרוקסיזום למקורות פחמן שאינם תלויים בפרוקסיזום (כדי להוריד את מספר הפרוקסיזום בתאים)8. לדוגמה, העברת תאי Pichia pastoris הגדלים מתנול ממדיום מתנול למדיום גלוקוז ומדיום אתנול משרה micropexophagy ו macropexophagy, בהתאמה 8,9,10. ממברנות מיקרופקסופאגיה קיבצו פרוקסיזומים לפירוק על ידי עיצוב מחדש של הוואקול ליצירת קרומי קיבוע ואקולריים דמויי גביע ומבנה דמוי מכסה המכונה מנגנון הממברנה הספציפי למיקרופקסופאגיה (MIPA). ב macropexophagy, peroxisomes בודדים נבלעים על ידי מבנים קרום כפול המכונה pexophagosomes, ואחריו איחוי עם vacuole עבור השפלה 8,9,10. הזרחן של קולטני פקסופגיה, כגון Atg36p ב- Saccharomyces cerevisiae ו- Atg30p ב- Pichia pastoris, הוא קריטי עבור הקולטנים לגייס מכונות אוטופגיה ליבה ולהקל על מיקוד פרוקסיזומלי לאוטופגוזומים 8,11.

בתאי יונקים, פקסופאגיה יכולה להיגרם על ידי יוביקוויטינציה. תיוג חלבוני הממברנה הפרוקסיזומלית PMP34 או PEX3 עם יוביקוויטין בצד הציטוסולי גורם לפקסופאגיה12. ביטוי היתר של PEX3 גורם לאוביקוויטינציה של פרוקסיזום וסילוק פרוקסיזום על ידי ליזוזומים13. בנוסף, המיזוג של PEX5 עם EGFP מסוף C פוגע בייצוא של PEX5 מונוביקוויטינציה וגורם לפקסופאגיה14. מצד שני, pexophagy יכול גם להיות מופעלות על ידי טיפול H 2 O2. פרוקסיזומים מייצרים מיני חמצן תגובתי (ROS); באופן ספציפי, האנזים הפרוקסיזומלי Acox1, אשר מזרז את השלב הראשוני של חמצון בטא של חומצות שומן ארוכות שרשרת מאוד (> 22 פחמן), מייצר לא רק אצטיל-CoA אלא גם ROS פרוקסיזומלי. בתגובה לרמות ROS מוגברות תחת טיפול H 2 O2, תאי יונקים מפעילים פקסופאגיה כדי להפחית את ייצור ה- ROS ולהקל על הלחץ. דווח כי טיפול H 2 O2מניע את הגיוס של אטקסיה-telangiectasia מוטציה (ATM) peroxisomes. כספומט לאחר מכן phosphorylates PEX5 כדי לקדם מחזור peroxisomal על ידי pexophagy15.

מאחר שפרוקסיזומים הם מרכזים המייצרים ROS, הם גם מועדים לנזק ל-ROS. פציעות פרוקסיזומליות המעוררות ROS מאלצות תאים להפעיל פקסופאגיה כדי ליזום מסלולי בקרת איכות פרוקסיזום (הסרת הפרוקסיזום הפגום על ידי אוטופגיה). כאן, אנו מתארים גישה להפעלה לפי דרישה של פגיעה פרוקסיזומלית הנגרמת על ידי ROS. הפרוטוקול מנצל את ייצור ה-ROS המופעל באמצעות אור בתוך אברונים 16,17,18,19,20 (איור 1). פרוקסיזומים המסומנים בצבע מוארים ומובילים לייצור ROS בלומן הפרוקסיזומלי, מה שגורם באופן ספציפי לפגיעה פרוקסיזומלית. באמצעות פרוטוקול זה, נראה כי פרוקסיזומים בסטרס של ROS מוסרים דרך מסלול פירוק תלוי יוביקוויטין. פרוקסיזומים בלחץ ROS מגייסים את היוביקוויטין E3 ליגאז Stub1 כדי לאפשר את בליעתם לתוך אוטופגוזומים להסרה פרטנית על ידי פקסופאגיה16. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי להשוות את גורלם של פרוקסיזומים פצועים ובריאים באותו תא באמצעות מיקרוסקופ בהילוך מהיר. השיטה יכולה לשמש גם לפגיעה גלובלית בכל הפרוקסיזומים (בכל התאים) על צלחת תרבית, מה שמאפשר ניתוח ביוכימי של מסלול הפקסופגיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תאים המבטאים diKillerRed או חלבוני תיוג עצמי (SLPs) בלומן הפרוקסיזום

  1. זרעו את התאים הרצויים על צלחות תרבית תאים בעלות תחתית זכוכית. לצורך הניסוי כאן, זרעו 2 x 105 תאי SHSY5Y אנושיים ב-840 מיקרוליטר של מדיום תרבית (DMEM/F-12 בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין) או 6 x 104 תאי NIH3T3 עכבריים ב-840 מיקרוליטר של מדיום תרבית (DMEM בתוספת 10% נסיוב בקר ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין) על צלחת תרבית בקוטר 35 מ"מ עם מיקרווול זכוכית בקוטר 20 מ"מ.
    הערה: יש להתאים את מספר התאים שנזרעו באופן יחסי בהתאם לאזור מיקרווול הזכוכית בעת שימוש בצלחות תחתית זכוכית של מפרטים אחרים.
  2. גדל את התאים תחת 5% CO2/37 ° C במשך 24 שעות.
  3. Transfecate התאים עם פלסמידים הרצויים באמצעות מגיב transfection.
    1. השתמש PMP34-TagBFP כדי לתייג את peroxisomes בתאים חיים. השתמש ב- diKillerRed-VKSKL או ב- SLP-VKSKL (+ ליגנדות SLP המסומנות בצבע) ליצירת ROS בלומן הפרוקסיזום (באמצעות ייצור ROS המופעל באמצעות אור). בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בחלבון התיוג העצמי HaloTag-VKSKL21. כדי לפקח על טרנסלוקציה של Stub1/Hsp70, הצטברות של חלבונים יוביקוויטינציה, והיווצרות של אוטופגוזומים על peroxisomes ללחץ ROS, transfect EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub, או EGFP-LC3B, בהתאמה. כדי לבדוק את דור ROS בלומן הפרוקסיזומלי, קו-טרנספקט diKillerRed-VKSKL עם בדיקת חמצון-חיזור פלואורסצנטית מקומית roGFP2-VKSKL22.
    2. עבור טרנספקציה של תאי SHSY5Y, לדלל פלסמידים ב- 55 μL של DMEM/F-12 ללא סרום, ולדלל 1 μL של מגיב טרנספקציה ב- 55 μL של DMEM/F12 ללא סרום. שלב את ה- DNA המדולל עם מגיב מדולל. מערבבים בעדינות ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. הוסף את הקומפלקס למיקרווול בקוטר 20 מ"מ שצופה בעבר במדיום תרבית 100 מיקרוליטר עבור SHSY5Y ללא אנטיביוטיקה (DMEM/F-12 עם 10% נסיוב בקר עוברי). נערו בעדינות את המנה קדימה ואחורה.
    4. עבור טרנספקציה של תאי NIH3T3, יש להחליף את מדיום הסרום המוקטן ב-DMEM/F-12 נטול הסרום לדילול הפלסמידים ומגיב הטרנספקציה. החלף את מדיום תרבית הציפוי ב- SHSY5Y במדיום תרבית עבור תאי NIH3T3 ללא אנטיביוטיקה (DMEM עם 10% סרום בקר).
  4. לאחר שעתיים של טרנספקציה, להסיר את המדיום המכיל מגיב transfection, ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום תרבית טרי. יש לדגור על תאי NIH3T3 או SHSY5Y בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך 24 שעות.
    הערה: קווי תאים אחרים יכולים לשמש גם לחקר פקסופאגיה בתיווך Stub1 (למשל, תאי HeLa).

2. צביעת פרוקסיזומים בליגנדות SLP עם תווית צבע (לייצור ROS מופעל באור)

  1. 24 שעות לאחר הטרנספקציה, הסר את מדיום התרבית, והוסף 100 μL של 200 ננומטר HaloTag TMR ligand או 200 nM Janelia Fluor 646 HaloTag ligand על מיקרווול זכוכית 20 מ"מ.
    הערה: יש לדלל את ליגנדות SLP המסומנות בצבע עם מדיום התרבית המתאים לכל קו תאים. בחירה בליגנדות המסומנות על ידי Janelia Fluor 646 תשחרר את התעלות הכחולות, הירוקות והאדומות להדמיית פלואורסצנטיות במורד הזרם.
  2. מעבירים את המנה לאינקובטורCO2 בטמפרטורה של 37°C, 5%. מכתים למשך שעה. לאחר שעה יש להסיר היטב את מצע הכתמים ולהוסיף 1 מ"ל מדיום תרבית טרי.

3. לחץ ROS של פרוקסיזומים במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר

  1. מניחים צלחת בעלת תחתית זכוכית המכילה את התאים הרצויים על מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר המצויד באינקובטור על גבי במה.
  2. לחצו על חלון הכלי, בחרו Ocular ולחצו על כפתור DIA (איור 2A) כדי להדליק את האור המשודר. צפו בצלחת דרך עינית המיקרוסקופ, והביאו את התאים למיקוד על ידי סיבוב ידית המיקוד.
  3. בחרו LSM ולחצו על הלחצן Dye & Detector Select (איור 2B). לחצו פעמיים על הצבעים הרצויים בחלון הנפתח כדי לבחור את הגדרות הלייזר והסינון המתאימות להדמיית התאים (איור 2C). לחצו על Livex4 בחלונית Live כדי להתחיל סריקת לייזר מהירה כדי להתחיל בסינון אותות הפלואורסצנטיות של התאים (איור 2D).
  4. הזז את הבמה באמצעות בקר הג'ויסטיק, ואתר את התאים המבטאים diKillerRed-VKSKL- או SLP-VKSKL המדיום כדי להפעיל לחץ ROS (על הפרוקסיזומים). לרכוש תמונה של התא הרצוי.
  5. לחצו על Tool Window ובחרו LSM Stimulation (איור 2E). לחצו על כפתור האליפסה , ובחלון התמונה החיה, השתמשו בעכבר כדי לצייר החזר השקעה מעגלי בקוטר 15 מיקרומטר (איור 2F) המכיל את הפרוקסיזומים הרצויים שנרכשו בשלב 3.4 שעליו יופעל לחץ ROS (ראו איור 3 לדוגמה).
  6. כדי להחיל לחץ ROS, השתמש ב- 561 ננומטר עבור תאים עם ליגנד SLP שכותרתו diKillerRed-PTS1 או TMR, והשתמש ב- 640 ננומטר עבור תאים המוכתמים בליגנד SLP עם תווית Janelia Fluor 646.
  7. בחר את אורך גל הלייזר להחלת מתח ROS. הזן את אחוז הלייזר הרצוי ואת משך הזמן (איור 2G).
  8. לחצו על Acquire, ולחצו על כפתור הגירוי (איור 2H) כדי להתחיל את הסריקה עם אור של 561/640 ננומטר דרך החזר ההשקעה במשך 30 שניות כל אחת. זה מתאים להגדרת עוצמת לייזר ~ 5% הן עבור 561 ננומטר והן עבור 640 ננומטר במיקרוסקופ הקונפוקלי המשמש כאן. פעולה זו תוביל לייצור ROS בפרוקסיזומים.
    הערה: ניתן לבחור ROI בגדלים שונים. יש להתאים באופן פרופורציונלי את זמן ההארה לכל החזר השקעה בהתאם לשטחו.
  9. לאחר 30 שניות של תאורת לייזר, פרוקסיזומים בתוך החזר ההשקעה יאבדו את אותות diKillerRed-PTS1/TMR/Janelia Fluor 646 שלהם. אובדן אות זה מאפשר להבחין בין הפרוקסיזומים המוארים לבין הפרוקסיזומים הלא מוארים (פגומים לעומת בריאים) בתוך התא.

4. ניטור פקסופאגיה בתאים חיים על ידי הדמיה בהילוך מהיר

  1. עקבו אחר הטרנסלוקציה של Stub1, Hsp70, Ub, p62 או LC3B המתויגים ב-EGFP על הפרוקסיזומים המוארים/בעלי הלחץ של ROS באמצעות הדמיה בהילוך מהיר במרווחים של 10 דקות בין מסגרות (לדוגמה, ראו איורים 3-7).
    הערה: אותות EGFP-Stub1 או EGFP-Hsp70 מתחילים להופיע 10-20 דקות לאחר ההארה ונשארים על כל הפרוקסיזומים הפגומים עד ~ 40 דקות לאחר ההארה. אותות EGFP-Ub מופיעים 30 דקות לאחר ההארה ונמשכים 2-3 שעות. טרנסלוקציה של EGFP-p62 מופיעה 60 דקות לאחר ההארה, ואותות EGFP-LC3B נראים ~ 3 שעות לאחר התאורה.
  2. כמת את אותות ה-EGFP על הפרוקסיזומים הפגומים (מ-Stub1, Ub, p62 או LC3B) באמצעות ImageJ. בצע את השלבים הבאים לשימוש ב- ImageJ לכימות תמונה תלת-ערוצית (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).
    1. פתחו את התמונה והחילו בחירות אליפטיות או בחירות חופשיות כדי להקיף את האזור הכולל את כל הפרוקסיזומים המוארים (אות PMP34-TagBFP חיובי ואות ליגנד HaloTag מולבן; איור 8A).
    2. לחץ על שכפל כדי לבחור את ערוץ PMP34-TagBFP (איור 8A). הגדר סף באמצעות התפריט הנפתח תמונה > התאם סף > כדי לסמן את הפרוקסיזומים (איור 8B).
    3. בחר נתח > נתח חלקיקים כדי לקבוע את האזורים המדויקים של הפרוקסיזומים המוארים. ImageJ מתעדת את אזורי העניין האלה (ROIs) במנהל החזר ההשקעה (איור 8C).
    4. לחצו על ' שכפל ' כדי לבחור את ערוץ ה-EGFP לניתוח האות הפלואורסצנטי מ-Ub מצומד ל-EGFP, עמ' 62 או LC3B (איור 8D). בחר את כל החזר ההשקעה במנהל החזר ההשקעה (איור 8E).
    5. החל מדידה במנהל החזר ההשקעה כדי למדוד את אותות ה-EGFP על הפרוקסיזומים (איור 8E). מצא את הערך של השטח והצפיפות המשולבת (סכום כל עוצמות הפיקסלים) עבור כל החזר השקעה בטבלת התוצאות (איור 8E).
    6. כדי לקבל את העוצמות הפלואורסצנטיות הממוצעות של EGFP בנקודות זמן שונות לאחר התאורה, חלק את עוצמת ה-EGFP המשולבת בשטח הכולל של פרוקסיזומים מוארים (PMP34-TagBFP אות חיובי ואזורי ליגנד שליליים של אות HaloTag). כדי לקבל את האות המצטבר על הפרוקסיזומים, הפחיתו את העוצמה הממוצעת בנקודת זמן בעוצמה הממוצעת בזמן = 0, ולאחר מכן נרמלו בעוצמה הממוצעת בזמן = 0.

5. פגיעה גלובלית בכל הפרוקסיזומים (בכל תא) על צלחת תרבית

  1. בצע את שלב 1 (הכנת תאים המבטאים diKillerRed ממוקד פרוקסיזום [diKillerRed-VKSKL] או SLP [SLP-VKSKL]) ושלב 2 (צביעת פרוקסיזומים עם ליגנד SLP [לייצור ROS מופעל אור]).
  2. לאחר שעה אחת של צביעת ליגנד המסומן בתווית TMR, הסר את מדיום הצביעה והוסף 1 מ"ל של מדיום תרבית המכיל 30 mM 3-AT (3-amino-1,2,4-triazole; מעכב קטלאז).
    הערה: קטלאז הוא מסלק ROS המתבטא בלומן פרוקסיזום, כך שטיפול 3-AT עוזר להגדיל את נזקי החמצון הנובעים מאור על הפרוקסיזומים.
  3. מניחים את צלחת התרבית מעל LED (555-570 ננומטר). להאיר את כל התאים בצפיפות הספק של 1.8 W/cm2 למשך 9 שעות באינקובטור.
    הערה: כדי לבצע שלב זה מחוץ לאינקובטור, הניחו את צלחת התרבית על פלטת חימום בטמפרטורה של 37°C. הוסיפו HEPES של 20 מ"מ למדיום המכיל 3 AT, וכסו את צלחת התרבית בסרט שקוף כדי למזער את חילוף הגזים. HEPES הוא חומר חציצה השומר על pH פיזיולוגי בתרבית תאים מחוץ לאינקובטור CO2 במהלך תאורת LED.
  4. אמת את ההצלחה של נזק הנגרם על-ידי LED על-ידי הדמיה של אותות EGFP-Ub, EGFP-p62 או EGFP-LC3B על הפרוקסיזומים. באמצעות תנאי ההארה המתוארים לעיל, 82% מתאי SHSY5Y המבטאים ביציבות את HaloTag-VKSKL הציגו פקסופאגיה בתיווך Stub1.
  5. קצור את התאים לניתוח ביוכימי במורד הזרם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

סכמת השראת הפקסופגיה בתיווך Stub1 המוצגת כאן מנצלת את היתרון של יצירת ROS בסיוע צבע בתוך לומן פרוקסיזום. פעולה זו דורשת עוצמות אור מינימליות. לכן, ניתן להאיר פרוקסיזומים המכילים חלבונים או צבעים פלואורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופים קונפוקליים סטנדרטיים לסריקת לייזר. הארה מוקדית מובילה לייצור ROS מיידי ומקומי בתוך פרוקסיזומים בודדים, כפי שמצוין על-ידי הכתב הפלואורסצנטי roGFP2-VKSKL (איור 9). לא צילמנו את diKillerRed-VKSKL במדידות roGFP2-VKSKL כדי למנוע יצירת ROS נוספת במהלך ההדמיה. התמונה הימנית התחתונה diKillerRed-VKSKL באיור 9 צולמה לאחר שכל המדידות של roGFP2-VKSKL נעשו כדי לציין בבירור היכן היו13 הפרוקסיזומים הפגועים. הנתונים מראים גם כי פרוקסיזומים לא מוארים אינם מושפעים, מה שמצביע על דיוק המתודולוגיה. ROS מוביל לחמצון של חלק קטן מהמולקולות המתגוררות בפרוקסיזום, מה שמוביל לתפקוד לקוי של פרוקסיזום. פעולה חריפה זו מאפשרת לבחון את מסלולי בקרת האיכות הפרוקסיזומיים השונים בצורה איתנה.

הצלחנו להשתמש במתודולוגיה זו כדי לנטר פקסופאגיה בתיווך Stub1. בפקסופאגיה בתיווך Stub1, Hsp70 מגייס את Stub1 לפרוקסיזומים בלחץ ROS כדי ליזום תחלופת פרוקסיזום על ידי אוטופגיה. במהלך התהליך הזה, Hsp70, Stub1, חלבונים בכל מקום, מתאם אוטופגיה p62 ו-LC3B מופיעים ברצף על פרוקסיזומים בסטרס של ROS כדי להניע פקסופאגיה (איור 3, איור 4, איור 5, איור 6 , איור 7)13. באמצעות הדמיה בהילוך מהיר, ניתן היה לעקוב אחר העיתוי והסדר של גיוס גורמים קריטיים אלה בפקסופגיה. על ידי שימוש במתודולוגיה כדי לפגוע בפרוקסיזומים באופן מוקדי, אנו יכולים בקלות להוכיח כי מנגנון Hsp70/Stub1 מכוון באופן ספציפי לפרוקסיזומים פגומים (אך לא פונקציונליים). מלבד יצירת ROS בתוך פרוקסיזומים בודדים, אפשר היה להשתמש באותה אסטרטגיה כדי לפגוע בו זמנית בכל הפרוקסיזומים בצלחת תרבית לצורך אפיון ביוכימי של פקסופאגיה בתיווך Stub1 (איור 10).

Figure 1
איור 1: סכמטי לייצור ROS המופעל באמצעות אור בפרוקסיזומים . (A) סכמה של איך להפעיל יצירת ROS פרוקסיזומלית על ידי אור. צבעים כגון דימרים טנדם KillerRed או ליגנדות SLP פלואורסצנטיות ממוקדים לפרוקסיזומים באמצעות שימוש ברצפי מיקוד פרוקסיזום (VKSKL). (B) 3-AT מעכב קטלאז וניתן להשתמש בו בשילוב עם התוכנית המוצגת כאן כדי להגדיל את רמות ROS בלומן הפרוקסיזומלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי להפעיל ייצור ROS בפרוקסיזומים. (A) צילום מסך עבור שלב 3.2 בפרוטוקול. (ב-ד) צילומי מסך לשלב 3.3 בפרוטוקול. (ה-ו) צילומי מסך לשלב 3.5 בפרוטוקול. (G) צילום מסך עבור שלב 3.7 בפרוטוקול. (H) צילום מסך לשלב 3.8 בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: טרנסלוקציה של EGFP-Stub1 על פרוקסיזומים בסטרס של ROS. תאי SHSY5Y הודבקו ב- HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP ו- EGFP-Stub1. יום לאחר הטרנספקציה, התאים הוכתמו בליגנד HaloTag TMR בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (200 ננומטר, שעה אחת). כאן, נתונים מאחד התאים במדגם זה מוצגים. (A) האזור העגול הלבן בתא זה נבחר להארה של 561 ננומטר. (B) הפרוקסיזומים המוארים באזור המעגלי הלבן איבדו מיד את פלואורסצנטיות ה-TMR שלהם. (C) EGFP-Stub1 מועתק על הפרוקסיזומים המוארים ב t = 20 דקות. כניסות שמאליות עליונות: תצוגה מוגדלת של אזורי הריבוע הלבן . כל פסי קנה המידה: 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: גיוס של EGFP-Hsp70 על-ידי פרוקסיזומים בסטרס של ROS. פרוקסיזומים בתאי SHSY5Y המבטאים HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP ו-EGFP-Hsp70 הוכתמו בליגנד HaloTag TMR של 200 ננומטר למשך שעה אחת. כאן, נתונים מאחד התאים במדגם זה מוצגים. (A) האזור העגול הלבן בתא היה נתון להארה של 561 ננומטר. (B) הפרוקסיזומים המוארים באזור המואר הזה איבדו מיד את פלואורסצנטיות ה-TMR שלהם בגלל הלבנה. (C) EGFP-Hsp70 עבר טרנסלוקציה על הפרוקסיזומים המוארים 20 דקות מאוחר יותר. כניסות מימין למטה: תצוגה מוגדלת של אזורי הריבוע הלבן. כל פסי קנה המידה: 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: הדמיה בהילוך מהיר של הצטברות חלבון יוביקוויטין על פרוקסיזומים בסטרס של ROS. (A) לאחר שעה אחת של צביעת ליגנד HaloTag TMR, פרוקסיזומים בתוך האזור המעגלי הלבן בתא SHSY5Y המבטאים EGFP-Ub, PMP34-TagBFP ו-HaloTag-VKSKL הוארו ב-561 ננומטר. (B) פלואורסצנטיות ה-TMR באזור הולבנה לאחר ההארה. EGFP-Ub הצטבר מאוחר יותר באופן ספציפי על הפרוקסיזומים המוארים (t = 40 דקות ושעתיים לאחר ההארה של 561 ננומטר. כניסות מימין למטה: תצוגה מוגדלת של אזורי הריבוע הלבן ב- (C). כל פסי קנה המידה: 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: הצטברות של מתאם אוטופגיה p62 על פרוקסיזומים בסטרס של ROS . (A) האזור המעגלי הלבן בתא SHSY5Y המבטא EGFP-p62, PMP34-TagBFP ו-HaloTag-VKSKL (מוכתם בליגנד HaloTag TMR; 200 ננומטר, שעה אחת) הואר באור של 561 ננומטר. (B) התאורה גרמה לאובדן מיידי של אותות TMR על הפרוקסיזומים הממוקדים. (C) ב-2.5 שעות לאחר ההארה, הפרוקסיזומים גייסו את EGFP-p62. כניסות מימין למעלה: תצוגה מוגדלת של אזורי הריבוע הלבן ב- (C). כל פסי קנה המידה: 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: טרנסלוקציה של EGFP-LC3B על פרוקסיזומים בסטרס של ROS. (A) לאחר צביעת ליגנד HaloTag TMR (200 ננומטר, 1 שעות), תא SHSY5Y המבטא EGFP-LC3B, PMP34-TagBFP ו-HaloTag-VKSKL הואר ב-561 ננומטר בתוך האזור המעגלי הלבן. (B) לאחר ההארה, אות ה-TMR של הפרוקסיזומים באזור העגול הלבן הולבן. (C) ב-3.5 שעות לאחר ההארה, EGFP-LC3B עבר טרנספוזיה לפרוקסיזומים בעלי לחץ ROS. כניסות מימין למעלה: תצוגה מוגדלת של אזורי הריבוע הלבן ב- (C). כל פסי קנה המידה: 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: כימות אותות הפלואורסצנטיות על פרוקסיזומים פגומים באמצעות ImageJ . (A) צילום מסך עבור שלב 4.2.1 ושלב 4.2.2 בפרוטוקול. (B) צילום מסך עבור שלב 4.2.2 בפרוטוקול. (C) צילום מסך עבור שלבים 4.2.3 בפרוטוקול. (D) צילום מסך עבור שלב 4.2.4 בפרוטוקול. (E) צילום מסך עבור שלב 4.2.4 ושלב 4.2.5 בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: ייצור ROS המופעל באמצעות אור בתוך פרוקסיזומים בודדים. הגשושית roGFP2-VKSKL (roGFP2-VKSKL) של בדיקת חמצון-חיזור מקומית של פרוקסיזומים שימשה לאימות ייצור ה-ROS המופעל באור בתוך הפרוקסיזומים הממוקדים. הפרוקסיזומים בתוך האזור המעגלי הלבן של תא NIH3T3 המבטאים diKillerRed-VKSKL ו-roGFP2-VKSKL הוארו באור של 561 ננומטר, ואלה מוצגים (A) לפני תאורת האור של 561 ננומטר ו-(B) אחרי תאורת האור של 561 ננומטר. משמאל: פליטת roGFP2-VKSKL עם עירור 405 ננומטר (מגנטה); באמצע: פליטת roGFP2-VKSKL עם עירור של 488 ננומטר (ירוק). היחס בין אות הפליטה roGFP2-VKSKL המעורר ב-405 ננומטר (מגנטה) על פני אות הפליטה המעורר ב-488 ננומטר (ירוק) עוקב אחר רמות ה-ROS בתוך הפרוקסיזומים. האזור המעגלי הלבן ב-(B) מראה את האובדן המיידי של פליטת diKillerRed-VKSKL לאחר תאורה של 561 ננומטר. כל פסי קנה המידה: 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 10
איור 10: נזק גלובלי לכל הפרוקסיזומים בצלחת תרבית. תאי SHSY5Y המבטאים את HaloTag-VKSKL, EGFP-Ub ו-PMP34-TagBFP הוכתמו בליגנד HaloTag TMR למשך שעה אחת. (A) לפני תאורת ה-LED, פלואורסצנטיות EGFP-Ub הייתה הומוגנית בציטופלסמה ולא לוקליזציה עם הפרוקסיזומים (מסומנים על ידי ליגנד HaloTag TMR ו-PMP34-TagBFP). (B) לאחר 9 שעות של תאורת LED, אות EGFP-Ub הצטבר על כל הפרוקסיזומים בתאים שגדלו בצלחת קונפוקלית, כפי שמצוין בשני הלוחות ב-(B). כל פסי קנה המידה: 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מפרט כיצד להפעיל פקסופאגיה בתיווך Stub1 בתוך תרביות תאים על ידי העלאת רמות ROS פרוקסיזומליות עם אור. מכיוון שהפרוטוקול מסתמך על ייצור ROS בעזרת צבע, יש להבטיח ביטוי מספיק של diKillerRed-VKSKL או צביעת ליגנד SLP מסומן בצבע בתוך התאים המעניינים. בהתחשב בכך שסוגי תאים שונים או תאים בעלי רקע גנטי שונה יכולים להכיל פרוקסיזומים בעלי תכונות מעט שונות, ייתכן שיהיה צורך לכוונן את תנאי ההארה המדויקים כדי להבטיח את השראת הפקסופגיה. אמצעי חזק לסינון ההפעלה של פקסופאגיה בתיווך Stub1 הוא לפקח אם EGFP-Ub עובר טרנסלוקציה לפרוקסיזומים המוארים (שעה אחת לאחר התאורה)13. בתאים בריאים, אותות EGFP-Ub מופצים בדרך כלל באופן שווה בציטופלסמה. הטרנסלוקציה שלו על פרוקסיזומים מוארים היא, אם כן, קלה לצפייה. כדי למטב את תנאי התאורה, ניתן לשנות את עוצמת האור או את זמן התאורה. כמו כן, עדיף להימנע מהארת יתר של צבעים כאשר מנסים לפגוע בפרוקסיזומים, שכן חלקם עשויים לעבור תהליכים פוטוכימיים שיכולים להפריע להדמיה במורד הזרם. לדוגמה, הוכח כי תאורת יתר של KillerRed יכולה לגרום לו להפוך לפלורסנט ירוק חלש. תאורת יתר יוצרת אותות ירוקים קלושים על הפרוקסיזומים המוארים מיד לאחר הארה23 (בניגוד לטרנסלוקציה של כתבים מבוססי EGFP, שיכולה להימשך עשרות דקות עד שעות).

המתודולוגיה מאפשרת לחוקרים להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי לסריקת לייזר כדי לפגוע בשבריר של פרוקסיזומים בתוך התא, ומאפשרת השוואה ישירה של ההבדל בגורל בין פרוקסיזומים בריאים ופגומים. בהשוואה לשיטות הקיימות, הפרוטוקול כאן גורם לעקה של ROS רק לחלק קטן מהפרוקסיזומים ולא לכל הפרוקסיזומים או אברונים אחרים בתאים. לכן, ניתן לחקור את ההשפעה של הפרוקסיזומים הבריאים הנותרים על הפקסופאגיה של הפרוקסיזומים הלחוצים ROS באותו תא.

באמצעות הארה של צלחת שלמה, ניתן גם לכוון את כל הפרוקסיזומים בתוך תרבית תאים, מה שמאפשר ניתוח ביוכימי של פקסופאגיה בתיווך Stub1. כיצד Hsc70/Stub1 מזהה פרוקסיזומים פגומים ואילו מצעים פרוקסיזומליים Stub1 יוביקוויטינטים הן כולן שאלות שניתן לחקור באמצעות פרוטוקול זה. באופן כללי יותר, פרוטוקול ליקוי פרוקסיזום יכול לשמש גם כדי לבדוק מסלולים אחרים של בקרת איכות פרוקסיזום. בהתחשב בכך שפרוקסיזומים קשורים קשר הדוק לאברונים תאיים רבים ושונים בתוך התא, כולל הרשתית האנדופלסמית, המיטוכונדריה וטיפות השומנים, יהיה מעניין גם לחקור כיצד תאים מווסתים באופן שיטתי את ההתנהגויות של כל המבנים התאיים בתגובה לפגיעה בפרוקסיזום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק מחקר MOST 111-2311-B-001-019-MY3 מהמועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה בטייוואן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell  MatTek P35G-1.5-20-C 20 mm glass bottomed
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) Sigma Aldrich A8056
bovine serum ThermoFisher Scientific 16170060
Cell culture incubator Nuaire NU-4750
diKillerRed-PTS1 Academia Sinica made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher Scientific 11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) ThermoFisher Scientific 11330032
EGFP-C1 Clontech pEGFP-C1 The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70 Academia Sinica Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1
EGFP-LC3B Addgene 11546
EGFP-p62 Academia Sinica generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Stub1 Academia Sinica generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Ub Addgene 11928
fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10437028
HaloTag TMR ligand  Promega G8252
HaloTag-PTS1 Academia Sinica PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080
Inverted Confocal Microscope  Olympus FV3000RS 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment
Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand Promega GA1120
LED VitaStar PAR64 80 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000  ThermoFisher Scientific 11668 transfection reagent
NIH3T3 cell ATCC CRL-1658 adherent
Opti-MEM ThermoFisher Scientific 319850 reduced serum media
penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140
PMP34-TagBFP Academia Sinica PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1 Academia Sinica generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1
SHSY5Y cell ATCC CRL-2266 adherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).
  2. He, A., et al. Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation. Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).
  3. Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. Peroxisomal dysfunction in age-related diseases. Trends in Endocrinology & Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).
  4. Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, Springer. Dordrecht, the Netherlands. 45-65 (2013).
  5. Puri, P., et al. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).
  6. Law, K. B., et al. The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).
  7. Nazarko, T. Y. Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).
  8. Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
  9. Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -C., Subramani, S. Molecular mechanism and physiological role of pexophagy. FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).
  10. Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).
  11. Germain, K., Kim, P. K. Pexophagy: A model for selective autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).
  12. Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).
  13. Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy. Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).
  14. Nordgren, M., et al. Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts. Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).
  15. Zhang, J., et al. ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS. Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).
  16. Chen, B. -H., Chang, Y. -J., Lin, S., Yang, W. Y. Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes. Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).
  17. Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
  18. Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane. Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).
  19. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
  20. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428 (2013).
  21. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  22. Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes. Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).
  23. Nordgren, M., et al. Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).

Tags

ביולוגיה גיליון 195 פקסופגיה פרוקסיזומים Hsc70 Stub1 אוטופגיה ROS
ניטור Stub1-Mediated Pexophagy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, B. H., Yang, W. Y. Monitoring… More

Chen, B. H., Yang, W. Y. Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy. J. Vis. Exp. (195), e65010, doi:10.3791/65010 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter