Summary
Questo protocollo fornisce istruzioni per l'attivazione e il monitoraggio della pesofagia mediata da Stub1 in cellule vive.
Abstract
Le cellule di mammifero possono trasformare i perossisomi attraverso la pesofagia mediata da Stub1. Il percorso consente potenzialmente il controllo cellulare della quantità e della qualità dei perossisomi. Durante questo processo, la proteina da shock termico 70 e l'ubiquitina E3 ligasi, Stub1, traslocano sui perossisomi per essere girati per iniziare la pexofagia. L'attività della ligasi Stub1 consente l'accumulo di ubiquitina e di altri moduli correlati all'autofagia su perossisomi mirati. L'elevazione dei livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) all'interno del lume perossisomale può attivare la pesofagia mediata da Stub1. Si può, quindi, utilizzare la generazione di ROS assistita da coloranti per innescare e monitorare questo percorso. Questo articolo delinea le procedure per l'utilizzo di due classi di coloranti, proteine fluorescenti e fluorofori sintetici, per avviare la pesofagia all'interno di colture cellulari di mammifero. Questi protocolli basati sulla generazione di ROS assistiti da coloranti non solo possono essere utilizzati per colpire tutti i perossisomi all'interno di una popolazione cellulare a livello globale, ma possono anche consentire la manipolazione di singoli perossisomi all'interno di singole cellule. Descriviamo anche come la pexofagia mediata da Stub1 può essere seguita usando la microscopia a cellule vive.
Introduction
I perossisomi sono organelli legati a membrana singola presenti nella maggior parte delle cellule eucariotiche. I perossisomi sono un compartimento metabolico essenziale per effettuare la beta-ossidazione degli acidi grassi a catena molto lunga, il catabolismo delle purine e la sintesi dei fosfolipidi eterici e degli acidi biliari1. L'acetil-CoA derivata dai perossisomi controlla l'omeostasi lipidica regolando la segnalazione centrale nel metabolismo2. Pertanto, non sorprende che le funzioni perossisomiali compromesse siano implicite in varie malattie, tra cui disturbi neurodegenerativi, invecchiamento, tumori, obesità e diabete 3,4,5. Un processo essenziale nel mantenimento del funzionamento perossisomale è la pesofagia. La pexofagia è un processo catabolico per il turnover selettivo dei perossisomi da parte dell'autofagia. Le cellule usano la pexofagia per aiutare a controllare la quantità e la qualità dei perossisomi, garantendo così una corretta funzione perossisomiale. Uno studio recente ha dimostrato che la perdita di perossisomi causata da mutazioni nei fattori di biogenesi perossisomale PEX1 1 e 6 deriva dalla pexofagia 6 non controllata. In particolare, il 65% di tutti i pazienti con disturbo della biogenesi dei perossisomi (PBD) presenta carenze nel complesso perossisomale AAA ATPasi, composto da PEX1, PEX6 e PEX26 nelle cellule di mammifero7.
Un certo numero di metodi possono essere utilizzati per iniziare e studiare la pesofagia. Nel lievito, la pexofagia viene attivata quando i nutrienti forniti passano da fonti di carbonio dipendenti dai perossisomi a fonti di carbonio indipendenti dai perossisomi (per abbassare il numero di perossisomi cellulari)8. Ad esempio, il trasferimento di cellule di Pichia pastoris coltivate a metanolo dal mezzo di metanolo al mezzo di glucosio e al mezzo di etanolo induce micropexofagia e macropexofagia, rispettivamente 8,9,10. La micropexofagia sequestra i perossisomi raggruppati per la degradazione rimodellando il vacuolo per formare membrane di sequestro vacuolare simili a coppe e una struttura simile a un coperchio chiamata apparato di membrana micropexofagico-specifico (MIPA). Nella macropexofagia, i singoli perossisomi sono inghiottiti da strutture a doppia membrana note come pexofagosomi, seguite dalla fusione con il vacuolo per la degradazione 8,9,10. La fosforilazione dei recettori della pesofagia, come Atg36p in Saccharomyces cerevisiae e Atg30p in Pichia pastoris, è fondamentale per i recettori per reclutare il meccanismo di autofagia centrale e per facilitare il targeting perossisomale agli autofagosomi 8,11.
Nelle cellule di mammifero, la pesofagia può essere indotta dall'ubiquitinazione. La marcatura delle proteine di membrana perossisomale PMP34 o PEX3 con ubiquitina sul lato citosolico induce la pesofagia12. La sovraespressione di PEX3 induce l'ubiquitinazione dei perossisomi e l'eliminazione dei perossisomi da parte dei lisosomi13. Inoltre, la fusione di PEX5 con un EGFP C-terminale compromette l'esportazione di PEX5 monoubiquitinata e provoca la pesofagia14. D'altra parte, la pexofagia può anche essere innescata dal trattamento con H 2 O2. I perossisomi producono specie reattive dell'ossigeno (ROS); nello specifico, l'enzima perossisomale Acox1, che catalizza la fase iniziale della beta-ossidazione degli acidi grassi a catena molto lunga (> 22 carbonio), produce non solo acetil-CoA ma anche ROS perossisomiali. In risposta ai livelli elevati di ROS sotto il trattamento conH 2 O2, le cellule di mammifero attivano la pexofagia per ridurre la produzione di ROS e alleviare lo stress. È stato riportato che il trattamentocon H 2 O2 guida il reclutamento di atassia-telangiectasia mutata (ATM) in perossisomi. ATM quindi fosforila PEX5 per promuovere il turnover perossisomale mediante la pesofagia15.
Poiché i perossisomi sono centri di generazione di ROS, sono anche soggetti a danni da ROS. Le lesioni perossisomiali indotte da ROS costringono le cellule ad attivare la pexofagia per avviare le vie di controllo della qualità dei perossisomi (rimozione del perossisoma danneggiato mediante autofagia). Qui, delineiamo un approccio per l'innesco on-demand di lesioni perossisomiali indotte da ROS. Il protocollo sfrutta la produzione di ROS attivati dalla luce all'interno degli organelli 16,17,18,19,20 (Figura 1). I perossisomi marcati con colorante sono illuminati, portando alla produzione di ROS all'interno del lume perossisomiale, che innesca specificamente la lesione perossisomiale. Utilizzando questo protocollo, è dimostrato che i perossisomi stressati da ROS vengono rimossi attraverso una via di degradazione ubiquitina-dipendente. I perossisomi stressati da ROS reclutano l'ubiquitina E3 ligasi Stub1 per consentire il loro inghiottimento in autofagosomi per la rimozione individuale mediante pexofagia16. Si può usare questo protocollo per confrontare il destino dei perossisomi feriti e sani all'interno della stessa cellula mediante microscopia time-lapse. Il metodo può anche essere utilizzato per danneggiare globalmente tutti i perossisomi (in tutte le cellule) su un piatto di coltura, consentendo l'analisi biochimica della via della pexofagia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione di cellule che esprimono proteine diKillerRed o automarcanti (SLP) nel lume dei perossisomi
- Seminare le cellule desiderate su piatti di coltura cellulare con fondo di vetro. Per l'esperimento qui, seminare 2 x 105 cellule umane SHSY5Y in 840 μL di terreno di coltura (DMEM / F-12 integrato con il 10% di siero bovino fetale e l'1% di penicillina / streptomicina) o 6 x 104 cellule NIH3T3 di topo in 840 μL di terreno di coltura (DMEM integrato con siero bovino al 10% e penicillina / streptomicina) su un piatto di coltura da 35 mm con un micropozzetto di vetro di 20 mm di diametro.
NOTA: Il numero di celle seminate deve essere regolato proporzionalmente in base all'area del micropozzetto di vetro quando si utilizzano piatti con fondo di vetro di altre specifiche. - Far crescere le cellule sotto il 5% di CO2/37 °C per 24 ore.
- Trasfettare le cellule con i plasmidi desiderati usando un reagente di trasfezione.
- Utilizzare PMP34-TagBFP per etichettare i perossisomi nelle cellule vive. Utilizzare diKillerRed-VKSKL o SLP-VKSKL con targeting dei perossisomi (+ ligandi SLP marcati con colorante) per la generazione di ROS nel lume dei perossisomi (attraverso la produzione di ROS attivati dalla luce). In questo protocollo, utilizziamo la proteina auto-etichettante HaloTag-VKSKL21. Per monitorare la traslocazione di Stub1/Hsp70, l'accumulo di proteine ubiquitinate e la formazione di autofagosomi sui perossisomi stressati da ROS, trasfettare rispettivamente EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub o EGFP-LC3B. Per controllare la generazione di ROS nel lume perossisomiale, co-transfettare diKillerRed-VKSKL con la sonda redox fluorescente localizzata dai perossisomi roGFP2-VKSKL22.
- Per la trasfezione cellulare SHSY5Y, diluire i plasmidi in 55 μL di DMEM/F-12 senza siero e diluire 1 μL di reagente di trasfezione in 55 μL di DMEM/F12 privo di siero. Combinare il DNA diluito con il reagente diluito. Mescolare delicatamente e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere il complesso al micropozzetto da 20 mm precedentemente placcato con 100 μL di terreno di coltura per SHSY5Y senza antibiotici (DMEM/F-12 con siero bovino fetale al 10%). Agitare delicatamente il piatto avanti e indietro.
- Per la trasfezione cellulare NIH3T3, sostituire il mezzo sierico ridotto per il DMEM/F-12 privo di siero per diluire i plasmidi e il reagente di trasfezione. Sostituire il terreno di coltura galvanico con SHSY5Y con terreno di coltura per cellule NIH3T3 senza antibiotici (DMEM con siero bovino al 10%).
- Dopo 2 ore di trasfezione, rimuovere il mezzo contenente il reagente di trasfezione e aggiungere 1 mL di terreno di coltura fresco. Incubare le cellule NIH3T3 o SHSY5Y a 37°C e 5% di CO2 per 24 ore.
NOTA: Altre linee cellulari possono anche essere utilizzate per studiare la esofagia mediata da Stub1 (ad esempio, cellule HeLa).
2. Colorazione dei perossisomi con ligandi SLP marcati con colorante (per la produzione di ROS attivati dalla luce)
- A 24 ore dopo la trasfezione, rimuovere il terreno di coltura e aggiungere 100 μL di ligando HaloTag TMR da 200 nM o da 200 nM di legante HaloTag Janelia Fluor 646 sul micropozzetto di vetro da 20 mm.
NOTA: I ligandi SLP marcati con colorante devono essere diluiti con il rispettivo terreno di coltura per ciascuna linea cellulare. La scelta di ligandi marcati con Janelia Fluor 646 libererà i canali blu, verde e rosso per l'imaging a fluorescenza a valle. - Trasferire il piatto in un incubatore a 37°C, 5% CO2 . Macchia per 1 h. Dopo 1 ora, rimuovere accuratamente il terreno di colorazione e aggiungere 1 ml di terreno di coltura fresco.
3. ROS-stressing dei perossisomi su un microscopio confocale a scansione laser
- Posizionare un piatto con fondo di vetro contenente le cellule desiderate su un microscopio confocale a scansione laser dotato di un'incubatrice da palcoscenico.
- Fare clic su Finestra strumento, scegliere Oculare e fare clic sul pulsante DIA (Figura 2A) per accendere la luce trasmessa. Visualizza il piatto attraverso l'oculare del microscopio e metti a fuoco le cellule ruotando la manopola di messa a fuoco.
- Scegliere LSM e fare clic sul pulsante Selezione colorante e rilevatore (Figura 2B). Fare doppio clic sui coloranti desiderati nella finestra pop-up per selezionare le impostazioni laser e di filtro appropriate per l'imaging delle celle (Figura 2C). Fare clic su Livex4 nel pannello Live per avviare la scansione laser veloce e avviare lo screening dei segnali di fluorescenza delle cellule (Figura 2D).
- Spostare lo stage utilizzando il controller del joystick e individuare le cellule medie che esprimono diKillerRed-VKSKL o SLP-VKSKL per applicare lo stress ROS (sui perossisomi). Acquisire un'immagine della cella desiderata.
- Fate clic su Finestra strumento (Tool Window) e scegliete Stimolazione LSM (Figura 2E). Fare clic sul pulsante ellisse e, nella finestra dell'immagine live, utilizzare il mouse per disegnare un ROI circolare di 15 μm di diametro (Figura 2F) contenente i perossisomi desiderati acquisiti nel passaggio 3.4 a cui verrà applicata la sollecitazione ROS (vedere la Figura 3 per un esempio).
- Per applicare lo stress ROS, utilizzare 561 nm per le cellule con il ligando SLP marcato con diKillerRed-PTS1 o TMR e utilizzare 640 nm per le cellule colorate con il ligando SLP marcato con Janelia Fluor 646.
- Selezionare la lunghezza d'onda del laser per applicare la sollecitazione ROS. Immettere la percentuale laser desiderata e la durata (Figura 2G).
- Fare clic su Acquisisci e fare clic sul pulsante Stimolazione (Figura 2H) per avviare la scansione con luce a 561/640 nm attraverso i ROI per 30 s ciascuno. Ciò corrisponde a un'impostazione di potenza laser ~ 5% sia per 561 nm che per 640 nm sul microscopio confocale utilizzato qui. Questa operazione porterà alla produzione di ROS nei perossisomi.
NOTA: è possibile selezionare ROI di diverse dimensioni. Si dovrebbe regolare proporzionalmente il tempo di illuminazione per ogni ROI in base alla sua area. - Dopo 30 secondi di illuminazione laser, i perossisomi all'interno dei ROI avranno perso i loro segnali diKillerRed-PTS1/TMR/Janelia Fluor 646. Questa perdita di segnale consente di distinguere i perossisomi illuminati da quelli non illuminati (danneggiati vs. sani) all'interno di una cellula.
4. Monitoraggio della pexofagia nelle cellule vive mediante imaging time-lapse
- Seguire la traslocazione di Stub1, Hsp70, Ub, p62 o LC3B con tag EGFP sui perossisomi illuminati/ROS-stressati mediante imaging time-lapse utilizzando intervalli di 10 minuti tra i fotogrammi (per esempi, vedere Figure 3-7).
NOTA: i segnali EGFP-Stub1 o EGFP-Hsp70 iniziano ad apparire 10-20 minuti dopo l'illuminazione e rimangono su tutti i perossisomi danneggiati fino a ~ 40 minuti dopo l'illuminazione. I segnali EGFP-Ub appaiono 30 minuti dopo l'illuminazione e durano per 2-3 ore. La traslocazione EGFP-p62 appare 60 minuti dopo l'illuminazione e i segnali EGFP-LC3B diventano visibili ~ 3 ore dopo l'illuminazione. - Quantificare i segnali EGFP sui perossisomi danneggiati (da Stub1, Ub, p62 o LC3B) utilizzando ImageJ. Eseguire la procedura seguente per utilizzare ImageJ per quantificare un'immagine a tre canali (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).
- Aprire l'immagine e applicare le selezioni Ellittiche o Selezioni a mano libera per racchiudere la regione contenente tutti i perossisomi illuminati (segnale PMP34-TagBFP positivo e segnale del ligando HaloTag sbiancato; Figura 8A).
- Fare clic su Duplica per selezionare il canale PMP34-TagBFP (Figura 8A). Impostare una soglia utilizzando il menu a discesa Immagine > Regola soglia > per contrassegnare i perossisomi (Figura 8B).
- Selezionare Analizza > Analizza particelle per determinare le regioni esatte dei perossisomi illuminati. ImageJ registra queste aree di interesse (ROI) nel gestore del ROI (Figura 8C).
- Fare clic su Duplica per scegliere il canale EGFP per analizzare il segnale di fluorescenza da Ub, p62 o LC3B coniugati EGFP (Figura 8D). Selezionare tutti i ROI in ROI Manager (Figura 8E).
- Applicare Measure nel ROI Manager per misurare i segnali EGFP sui perossisomi (Figura 8E). Trova il valore dell'area e della densità integrata (la somma di tutte le intensità di pixel) per ogni ROI nella tabella Risultati (Figura 8E).
- Per ottenere le intensità medie di fluorescenza dell'EGFP in diversi punti temporali dopo l'illuminazione, dividere l'intensità EGFP integrata per l'area totale dei perossisomi illuminati (aree negative del segnale PMP34-TagBFP e del ligando HaloTag). Per ottenere il segnale accumulato sui perossisomi, sottrarre l'intensità media in un punto temporale per l'intensità media al tempo = 0, quindi normalizzare l'intensità media al tempo = 0.
5. Danneggiare globalmente tutti i perossisomi (in ogni cellula) su un piatto di coltura
- Eseguire la fase 1 (preparazione di cellule che esprimono diKillerRed [diKillerRed-VKSKL] o SLP [SLP-VKSKL]) e la fase 2 (colorazione dei perossisomi con il ligando SLP [per la produzione di ROS attivati dalla luce]).
- Dopo 1 ora di colorazione del ligando marcato TMR, rimuovere il mezzo di colorazione e aggiungere 1 mL di terreno di coltura contenente 30 mM 3-AT (3-ammino-1,2,4-triazolo; un inibitore della catalasi).
NOTA: La catalasi è uno scavenger ROS espresso nel lume del perossisoma, quindi il trattamento 3-AT aiuta ad aumentare il danno ossidativo indotto dalla luce sui perossisomi. - Posizionare il piatto di coltura sopra un LED (555-570 nm). Illuminare tutte le celle con una densità di potenza di 1,8 W/cm2 per 9 ore in un'incubatrice.
NOTA: Per eseguire questo passaggio all'esterno di un'incubatrice, posizionare il piatto di coltura su una piastra riscaldante a 37 °C. Aggiungere 20 mM HEPES al mezzo contenente 3-AT e coprire il piatto di coltura con una pellicola trasparente per ridurre al minimo lo scambio di gas. HEPES è un agente tampone che mantiene il pH fisiologico nella coltura cellulare al di fuori di un incubatore di CO2 durante l'illuminazione a LED. - Convalidare il successo del danno indotto da LED mediante l'imaging dei segnali EGFP-Ub, EGFP-p62 o EGFP-LC3B sui perossisomi. Utilizzando la condizione di illuminazione descritta sopra, l'82% delle cellule SHSY5Y che esprimono stabilmente HaloTag-VKSKL ha mostrato una pesofagia mediata da Stub1.
- Raccogliere le cellule per l'analisi biochimica a valle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lo schema di induzione della pesofagia mediata da Stub1 mostrato qui sfrutta la generazione di ROS assistita da coloranti all'interno del lume del perossisoma. Questa operazione richiede intensità luminose minime. I perossisomi contenenti proteine fluorescenti o coloranti possono quindi essere illuminati utilizzando microscopi confocali a scansione laser standard. L'illuminazione focale porta alla produzione istantanea e localizzata di ROS all'interno dei singoli perossisomi, come indicato dal reporter fluorescente roGFP2-VKSKL (Figura 9). Non abbiamo visualizzato diKillerRed-VKSKL nelle misurazioni roGFP2-VKSKL per evitare la generazione aggiuntiva di ROS durante l'imaging. L'immagine diKillerRed-VKSKL in basso a destra nella Figura 9 è stata scattata dopo che tutte le misurazioni roGFP2-VKSKL sono state effettuate per indicare chiaramente dove i perossisomi danneggiati erano13. I dati mostrano anche che i perossisomi non illuminati non sono interessati, indicando la precisione della metodologia. I ROS portano all'ossidazione di una piccola frazione di molecole residenti nei perossisomi, portando alla disfunzione dei perossisomi. Questa operazione acuta consente di sondare in modo robusto i vari percorsi di controllo della qualità dei perossisomi.
Siamo stati in grado di utilizzare questa metodologia per monitorare la pesofagia mediata da Stub1. Nella pexofagia mediata da Stub1, Hsp70 recluta Stub1 su perossisomi stressati da ROS per iniziare il turnover dei perossisomi mediante autofagia. Durante questo processo, Hsp70, Stub1, proteine ubiquitinate, adattatore per autofagia p62 e LC3B appaiono sequenzialmente sui perossisomi stressati da ROS per guidare la pesofagia (Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6 , Figura 7)13. Attraverso l'imaging time-lapse, è stato possibile seguire i tempi e l'ordine del reclutamento di questi fattori critici nella pesofagia. Utilizzando la metodologia per danneggiare i perossisomi focalmente, potremmo facilmente dimostrare che il macchinario Hsp70 / Stub1 si rivolge specificamente ai perossisomi danneggiati (ma non a quelli funzionali). Oltre a suscitare la produzione di ROS all'interno dei singoli perossisomi, è stato possibile utilizzare la stessa strategia per danneggiare simultaneamente tutti i perossisomi su un piatto di coltura per la caratterizzazione biochimica della pesofagia mediata da Stub1 (Figura 10).
Figura 1: Schema per la produzione di ROS attivati dalla luce nei perossisomi. (A) Schema di come innescare la generazione di ROS perossisomali mediante luce. Coloranti come i dimeri tandem KillerRed o i ligandi SLP fluorescenti sono mirati nei perossisomi attraverso l'uso di sequenze di targeting dei perossisomi (VKSKL). (B) Il 3-AT inibisce la catalasi e può essere usato in combinazione con lo schema mostrato qui per aumentare i livelli di ROS nel lume perossisomiale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Utilizzo di un microscopio confocale per attivare la produzione di ROS nei perossisomi. (A) Screenshot per il punto 3.2 del protocollo. (B-D) Schermate per il passaggio 3.3 del protocollo. (E-F) Schermate per il passaggio 3.5 del protocollo. (G) Screenshot per il passaggio 3.7 del protocollo. (H) Screenshot per il passaggio 3.8 del protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Traslocazione di EGFP-Stub1 su perossisomi sollecitati da ROS. Le cellule SHSY5Y sono state trasfettate con HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP e EGFP-Stub1. Un giorno dopo la trasfezione, le cellule sono state colorate con il ligando HaloTag TMR a 37°C (200 nM, 1 h). Qui vengono mostrati i dati di una delle celle in questo esempio. (A) La regione circolare bianca in questa cella è stata selezionata per l'illuminazione a 561 nm. (B) I perossisomi illuminati nella regione circolare bianca hanno immediatamente perso la loro fluorescenza TMR. (C) EGFP-Stub1 traslocato sui perossisomi illuminati a t = 20 min. Inserti in alto a sinistra: vista ingrandita delle regioni quadrate bianche. Tutte le barre della scala: 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Reclutamento di EGFP-Hsp70 da parte di perossisomi stressati da ROS. I perossisomi nelle cellule SHSY5Y che esprimono HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP e EGFP-Hsp70 sono stati colorati con ligando HaloTag TMR 200 nM per 1 ora. Qui vengono mostrati i dati di una delle celle in questo esempio. (A) La regione circolare bianca nella cella è stata sottoposta a un'illuminazione di 561 nm. (B) I perossisomi illuminati in questa regione illuminata hanno immediatamente perso la loro fluorescenza TMR a causa del foto-sbiancamento. (C) EGFP-Hsp70 traslocato sui perossisomi illuminati 20 minuti dopo. Inserti in basso a destra: vista ingrandita delle regioni quadrate bianche. Tutte le barre della scala: 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Imaging time-lapse dell'accumulo di proteine ubiquitinate su perossisomi stressati da ROS. (A) Dopo 1 ora di colorazione del ligando HaloTag TMR, i perossisomi all'interno della regione circolare bianca in una cellula SHSY5Y che esprime EGFP-Ub, PMP34-TagBFP e HaloTag-VKSKL sono stati illuminati con 561 nm. (B) La fluorescenza TMR all'interno della regione è stata sbiancata dopo l'illuminazione. EGFP-Ub successivamente si è accumulato specificamente sui perossisomi illuminati (t = 40 min e 2 h dopo l'illuminazione a 561 nm. Inserti in basso a destra: vista ingrandita delle regioni quadrate bianche in (C). Tutte le barre della scala: 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Accumulo dell'adattatore per autofagia p62 su perossisomi stressati da ROS . (A) La regione circolare bianca in una cellula SHSY5Y che esprime EGFP-p62, PMP34-TagBFP e HaloTag-VKSKL (colorata con il ligando HaloTag TMR; 200 nM, 1 h) è stata illuminata con luce a 561 nm. (B) L'illuminazione ha causato l'immediata perdita dei segnali TMR sui perossisomi mirati. (C) A 2,5 ore dopo l'illuminazione, i perossisomi hanno reclutato EGFP-p62. Inserti in alto a destra: viste ingrandite delle regioni quadrate bianche in (C). Tutte le barre della scala: 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Traslocazione di EGFP-LC3B su perossisomi stressati da ROS. (A) Dopo la colorazione del ligando HaloTag TMR (200 nM, 1 h), una cellula SHSY5Y che esprime EGFP-LC3B, PMP34-TagBFP e HaloTag-VKSKL è stata illuminata con 561 nm all'interno della regione circolare bianca. (B) Dopo l'illuminazione, il segnale TMR dei perossisomi nella regione circolare bianca è stato sbiancato. (C) A 3,5 ore dopo l'illuminazione, EGFP-LC3B traslocato sui perossisomi sollecitati da ROS. Inserti in alto a destra: viste ingrandite delle regioni quadrate bianche in (C). Tutte le barre della scala: 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Quantificazione dei segnali di fluorescenza sui perossisomi danneggiati utilizzando ImageJ . (A) Screenshot per i punti 4.2.1 e 4.2.2 del protocollo. (B) Screenshot per il punto 4.2.2 del protocollo. (C) Screenshot per i passaggi 4.2.3 del protocollo. (D) Screenshot per il punto 4.2.4 del protocollo. (E) Screenshot per i passaggi 4.2.4 e 4.2.5 del protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 9: Produzione di ROS attivati dalla luce all'interno dei singoli perossisomi. La sonda redox localizzata nei perossisomi roGFP2-VKSKL è stata utilizzata per convalidare la produzione di ROS attivati dalla luce all'interno dei perossisomi mirati. I perossisomi all'interno della regione circolare bianca di una cellula NIH3T3 che esprime diKillerRed-VKSKL e roGFP2-VKSKL sono stati illuminati con luce a 561 nm, e questi sono mostrati (A) prima dell'illuminazione luminosa a 561 nm e (B) dopo l'illuminazione luminosa a 561 nm. A sinistra: emissione roGFP2-VKSKL con eccitazione 405 nm (magenta); al centro: emissione roGFP2-VKSKL con eccitazione 488 nm (verde). Il rapporto tra il segnale di emissione roGFP2-VKSKL eccitato da 405 nm (magenta) sul segnale di emissione eccitato da 488 nm (verde) traccia i livelli di ROS all'interno dei perossisomi. La regione circolare bianca in (B) mostra la perdita immediata di emissione di diKillerRed-VKSKL a seguito di un'illuminazione a 561 nm. Tutte le barre della scala: 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 10: Globalmente dannoso per tutti i perossisomi su un piatto di coltura. Le cellule SHSY5Y che esprimono HaloTag-VKSKL, EGFP-Ub e PMP34-TagBFP sono state colorate con ligando HaloTag TMR per 1 ora. (A) Prima dell'illuminazione a LED, la fluorescenza EGFP-Ub era omogenea nel citoplasma e non colocalizzava con i perossisomi (marcati dal ligando HaloTag TMR e PMP34-TagBFP). (B) Dopo 9 ore di illuminazione a LED, il segnale EGFP-Ub si è accumulato su tutti i perossisomi nelle cellule cresciute in un piatto confocale, come indicato nei due pannelli in (B). Tutte le barre della scala: 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo protocollo spiega in dettaglio come innescare la pesofagia mediata da Stub1 all'interno delle colture cellulari elevando i livelli di ROS perossisomale con la luce. Poiché il protocollo si basa sulla generazione di ROS assistita da coloranti, è necessario garantire un'espressione sufficiente di diKillerRed-VKSKL o colorazione del ligando SLP marcato con colorante all'interno delle cellule di interesse. Dato che diversi tipi di cellule o cellule di diverso background genetico possono ospitare perossisomi con proprietà leggermente diverse, potrebbe essere necessario regolare le condizioni esatte di illuminazione per garantire l'induzione della pexofagia. Una misura robusta per lo screening dell'attivazione della esofagia mediata da Stub1 consiste nel monitorare se EGFP-Ub trasloca sui perossisomi illuminati (1 ora dopo l'illuminazione)13. Nelle cellule sane, i segnali EGFP-Ub sono solitamente distribuiti uniformemente nel citoplasma. La sua traslocazione su perossisomi illuminati è quindi facile da osservare. Per ottimizzare le condizioni di illuminazione, è possibile modificare l'intensità della luce o il tempo di illuminazione. È anche meglio evitare la sovrailluminazione dei coloranti quando si cerca di danneggiare i perossisomi, poiché alcuni possono subire processi fotochimici che possono interferire con l'imaging a valle. Ad esempio, è stato dimostrato che la sovrailluminazione di KillerRed può farlo diventare debolmente verde fluorescente. La sovrailluminazione genera deboli segnali verdi sui perossisomi illuminati immediatamente dopo l'illuminazione23 (a differenza della traslocazione dei reporter basati su EGFP, che può richiedere da decine di minuti a ore per verificarsi).
La metodologia consente ai ricercatori di utilizzare microscopi confocali standard a scansione laser per compromettere una frazione di perossisomi all'interno di una cellula, consentendo confronti diretti della differenza nel destino tra perossisomi sani e danneggiati. Rispetto ai metodi esistenti, il protocollo qui causa lo stress ROS solo a una piccola parte dei perossisomi piuttosto che a tutti i perossisomi o altri organelli nelle cellule. Quindi, è possibile studiare l'effetto dei restanti perossisomi sani sulla pesofagia dei perossisomi stressati da ROS nella stessa cellula.
Attraverso l'illuminazione di un intero piatto, è anche possibile indirizzare tutti i perossisomi all'interno di una coltura cellulare, consentendo l'analisi biochimica della pesofagia mediata da Stub1. Come Hsc70/Stub1 riconosce i perossisomi danneggiati e quali substrati perossisomali Stub1 ubiquitinates sono tutte domande che possono essere esplorate usando questo protocollo. Più in generale, il protocollo di compromissione dei perossisomi può essere utilizzato anche per sondare altre vie di controllo della qualità dei perossisomi. Dato che i perossisomi sono intimamente connessi a molti diversi organelli cellulari all'interno della cellula, tra cui il reticolo endoplasmatico, i mitocondri e le goccioline lipidiche, sarebbe anche interessante studiare come le cellule modulano sistematicamente i comportamenti di tutte le strutture cellulari in risposta alla compromissione dei perossisomi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una borsa di ricerca MOST 111-2311-B-001-019-MY3 del Consiglio nazionale della scienza e della tecnologia di Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell | MatTek | P35G-1.5-20-C | 20 mm glass bottomed |
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Sigma Aldrich | A8056 | |
| bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16170060 | |
| Cell culture incubator | Nuaire | NU-4750 | |
| diKillerRed-PTS1 | Academia Sinica | made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL) | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) | ThermoFisher Scientific | 11330032 | |
| EGFP-C1 | Clontech | pEGFP-C1 | The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62 |
| EGFP-Hsp70 | Academia Sinica | Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1 | |
| EGFP-LC3B | Addgene | 11546 | |
| EGFP-p62 | Academia Sinica | generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Stub1 | Academia Sinica | generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Ub | Addgene | 11928 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| HaloTag TMR ligand | Promega | G8252 | |
| HaloTag-PTS1 | Academia Sinica | PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Inverted Confocal Microscope | Olympus | FV3000RS | 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex, microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment |
| Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand | Promega | GA1120 | |
| LED | VitaStar | PAR64 | 80 W, 555-570 nm |
| lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668 | transfection reagent |
| NIH3T3 cell | ATCC | CRL-1658 | adherent |
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 319850 | reduced serum media |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| PMP34-TagBFP | Academia Sinica | PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171) | |
| roGFP2-PTS1 | Academia Sinica | generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1 | |
| SHSY5Y cell | ATCC | CRL-2266 | adherent |
References
- Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).
- He, A., et al. Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation. Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).
- Cipolla, C. M., Lodhi, I. J.
- Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, Springer. Dordrecht, the Netherlands. 45-65 (2013).
- Puri, P., et al. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).
- Law, K. B., et al. The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).
- Nazarko, T. Y. Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).
- Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
- Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -C., Subramani, S. Molecular mechanism and physiological role of pexophagy. FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).
- Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).
- Germain, K., Kim, P. K. Pexophagy: A model for selective autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).
- Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).
- Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy. Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).
- Nordgren, M., et al. Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts. Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).
- Zhang, J., et al. ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS. Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).
- Chen, B. -H., Chang, Y. -J., Lin, S., Yang, W. Y. Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes. Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).
- Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
- Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane. Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428 (2013).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
- Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes. Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).
- Nordgren, M., et al. Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).
