Summary
Este protocolo fornece instruções para o desencadeamento e monitoramento da pexefagia mediada por Stub1 em células vivas.
Abstract
Células de mamíferos podem transformar peroxissomas através da pexofagia mediada por Stub1. A via potencialmente permite o controle celular da quantidade e qualidade dos peroxissomos. Durante esse processo, a proteína de choque térmico 70 e a ubiquitina E3 ligase, Stub1, translocam-se em peroxissomas para serem viradas para iniciar a pexofagia. A atividade da ligase Stub1 permite o acúmulo de ubiquitina e outros módulos relacionados à autofagia em peroxissomas alvo. A elevação dos níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) dentro da luz peroxissomal pode ativar a pexofagia mediada por Stub1. Pode-se, portanto, usar a geração de ROS assistida por corante para desencadear e monitorar essa via. Este artigo descreve os procedimentos para o uso de duas classes de corantes, proteínas fluorescentes e fluoróforos sintéticos, para iniciar a pexofagia em culturas de células de mamíferos. Esses protocolos baseados na geração de ROS assistida por corante podem não apenas ser usados para atingir todos os peroxissomas dentro de uma população celular globalmente, mas também podem permitir a manipulação de peroxissomas individuais dentro de células únicas. Também descrevemos como a pexofagia mediada por Stub1 pode ser acompanhada usando microscopia de células vivas.
Introduction
Os peroxissomas são organelas ligadas a uma única membrana presentes na maioria das células eucarióticas. Os peroxissomas são um compartimento metabólico essencial para a realização da beta-oxidação de ácidos graxos de cadeia muito longa, catabolismo de purinas e síntese de fosfolipídios éteres e ácidos biliares1. O acetil-CoA derivado do peroxissomo controla a homeostase lipídica regulando a sinalização central no metabolismo2. Portanto, não é surpresa que o comprometimento das funções peroxissomais esteja implicado em várias doenças, incluindo doenças neurodegenerativas, envelhecimento, cânceres, obesidade e diabetes 3,4,5. Um processo essencial na manutenção da operação peroxissomal é a pexofagia. A puxofagia é um processo catabólico para o turnover seletivo de peroxissomas por autofagia. As células usam a pexofagia para ajudar a controlar a quantidade e a qualidade dos peroxissomos, garantindo assim a função peroxissomal adequada. Um estudo recente demonstrou que a perda de peroxissomo causada por mutações nos fatores 1 e 6 da biogênese peroxissomal PEX1 resulta de pexofagia não controlada6. Notavelmente, 65% de todos os pacientes com transtorno da biogênese do peroxissomo (DBP) apresentam deficiências no complexo ATPase AAA peroxissomal, composto por PEX1, PEX6 e PEX26em células de mamíferos7.
Vários métodos podem ser usados para iniciar e estudar a pexofagia. Em leveduras, a pexofagia é desencadeada quando os nutrientes fornecidos são trocados de fontes de carbono dependentes de peroxissomo para fontes de carbono independentes de peroxissomo (para diminuir o número de peroxissomas celulares)8. Por exemplo, a transferência de células de Pichia pastoris cultivadas com metanol do meio metanol para o meio glicosado e etanol induz micropexofagia e macropexofagia, respectivamente 8,9,10. A micropexofagia sequestra peroxissomas agrupados para degradação, remodelando o vacúolo para formar membranas de sequestro vacuolar em forma de taça e uma estrutura semelhante a uma tampa denominada aparato de membrana específico para micropexofagia (MIPA). Na macropexofagia, os peroxissomas individuais são engolidos por estruturas de membrana dupla conhecidas como pexofagossomos, seguidos de fusão com o vacúolo para degradação 8,9,10. A fosforilação de receptores de pexofagia, como Atg36p em Saccharomyces cerevisiae e Atg30p em Pichia pastoris, é crítica para recrutar maquinaria de autofagia central e facilitar o direcionamento peroxissomal para autofagossomos 8,11.
Em células de mamíferos, a pexofagia pode ser induzida por ubiquitinação. A marcação das proteínas da membrana peroxissomal PMP34 ou PEX3 com ubiquitina no lado citosólico induz a pexofagia12. A superexpressão de PEX3 induz a ubiquitinação do peroxissomo e a eliminação do peroxissomo pelos lisossomos13. Além disso, a fusão de PEX5 com um EGFP C-terminal prejudica a exportação de PEX5 monoubiquitinado e resulta em pexofagia14. Por outro lado, a pexofagia também pode ser desencadeada pelo tratamento com H 2 O2. Os peroxissomas produzem espécies reativas de oxigênio (EROs); especificamente, a enzima peroxissomal Acox1, que catalisa a etapa inicial da beta-oxidação de ácidos graxos de cadeia muito longa (carbono > 22), produz não apenas acetil-CoA, mas também ROS peroxissomal. Em resposta aos níveis elevados de ROS sob o tratamento comH 2 O2, as células de mamíferos ativam a pexofagia para diminuir a produção de ROS e aliviar o estresse. Tem sido relatado que o tratamento com H 2 O2direciona o recrutamento de ataxia-telangiectasia mutada (ATM) para peroxissomas. A ATM fosforila então PEX5 para promover o turnover peroxissomal pela pexofagia15.
Como os peroxissomas são centros geradores de ROS, eles também são propensos a danos de ROS. Lesões peroxissomais provocadas por ERO forçam as células a ativar a pexofagia para iniciar vias de controle de qualidade do peroxissomo (remoção do peroxissomo danificado por autofagia). Aqui, delineamos uma abordagem para o desencadeamento sob demanda de lesão peroxissomal provocada por ROS. O protocolo aproveita a produção de ERO ativadas por luz dentro de organelas 16,17,18,19,20 (Figura 1). Os peroxissomas marcados com corante são iluminados, levando à produção de ERO dentro da luz peroxissomal, o que desencadeia especificamente a lesão peroxissomal. Usando este protocolo, mostra-se que os peroxissomas estressados por ROS são removidos através de uma via de degradação dependente de ubiquitina. Os peroxissomas estressados com ROS recrutam a ubiquitina E3 ligase Stub1 para permitir seu engolfamento em autofagossomos para remoção individual por pexofagia16. Pode-se usar este protocolo para comparar o destino de peroxissomas lesionados e saudáveis dentro de uma mesma célula por microscopia de lapso de tempo. O método também pode ser usado para danificar globalmente todos os peroxissomas (em todas as células) em uma placa de cultura, permitindo a análise bioquímica da via da pexofagia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação de células expressando diKillerRed ou proteínas auto-marcadas (SLPs) no lúmen do peroxissomo
- Seme as células desejadas em placas de cultura celular com fundo de vidro. Para o experimento, foram utilizadas 2 x10 5 células SHSY5Y humanas em 840 μL de meio de cultura (DMEM/F-12 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina) ou 6 x 104 células NIH3T3 de camundongo em 840 μL de meio de cultura (DMEM suplementado com 10% de soro bovino e 1% de penicilina/estreptomicina) em uma placa de cultura de 35 mm com micropoço de vidro de 20 mm de diâmetro.
NOTA: O número de células semeadas deve ser ajustado proporcionalmente de acordo com a área do micropoço de vidro ao usar placas de fundo de vidro de outras especificações. - Cultivar as células a 5% de CO2/37 °C durante 24 horas.
- Transfectar as células com plasmídeos desejados usando um reagente de transfecção.
- Use PMP34-TagBFP para marcar os peroxissomas em células vivas. Use diKillerRed-VKSKL ou SLP-VKSKL (+ ligantes SLP marcados com corante) para geração de ROS no lúmen do peroxissomo (através da produção de ROS ativadas por luz). Neste protocolo, utilizamos a proteína de automarcação HaloTag-VKSKL21. Para monitorar a translocação de Stub1/Hsp70, o acúmulo de proteínas ubiquitinadas e a formação de autofagossomos em peroxissomas estressados por ROS, transfect EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub ou EGFP-LC3B, respectivamente. Para verificar a geração de ROS no lúmen peroxissomal, co-transfecte diKillerRed-VKSKL com a sonda redox fluorescente localizada em peroxissomo roGFP2-VKSKL22.
- Para a transfecção de células SHSY5Y, diluir plasmídeos em 55 μL de DMEM/F-12 livre de soro e diluir 1 μL de reagente de transfecção em 55 μL de DMEM/F12 livre de soro. Combinar o ADN diluído com o reagente diluído. Misture delicadamente e incube por 30 min à temperatura ambiente.
- Adicionar o complexo ao micropoço de 20 mm previamente plaqueado com 100 μL de meio de cultura para SHSY5Y sem antibióticos (DMEM/F-12 com 10% de soro fetal bovino). Agite suavemente o prato para frente e para trás.
- Para a transfecção celular NIH3T3, substituir o meio de soro reduzido pelo DMEM/F-12 livre de soro para diluir os plasmídeos e o reagente de transfecção. Substituir o meio de cultura de plaqueamento por SHSY5Y por meio de cultura para células NIH3T3 sem antibióticos (DMEM com 10% de soro bovino).
- Após 2 h da transfecção, retirar o meio contendo o reagente de transfecção e adicionar 1 mL de meio de cultura fresco. Incubar as células NIH3T3 ou SHSY5Y a 37°C e 5% CO2 por 24 h.
NOTA: Outras linhagens celulares também podem ser usadas para estudar a pexofagia mediada por Stub1 (por exemplo, células HeLa).
2. Coloração de peroxissomas com ligantes SLP marcados com corante (para produção de ROS ativadas por luz)
- Em 24 h após a transfecção, remova o meio de cultura e adicione 100 μL do ligante HaloTag TMR 200 nM ou o ligante HaloTag Janelia Fluor 646 HaloTag 200 nM no micropoço de vidro de 20 mm.
NOTA: Os ligantes SLP marcados com corante devem ser diluídos com o respectivo meio de cultura para cada linhagem celular. A escolha dos ligantes marcados com Janelia Fluor 646 liberará os canais azul, verde e vermelho para imagens de fluorescência a jusante. - Transfira o prato para uma incubadora a 37°C, 5% CO2 . Manchar por 1 h. Após 1 h, retirar bem o meio de coloração e adicionar 1 mL de meio de cultura fresco.
3. EROsstress de peroxissomas em microscópio confocal de varredura a laser
- Coloque um prato com fundo de vidro contendo as células desejadas em um microscópio confocal de varredura a laser equipado com uma incubadora de palco.
- Clique em Tool Window, escolha Ocular e clique no botão DIA (Figura 2A) para acender a luz transmitida. Visualize o prato através da ocular do microscópio e coloque as células em foco girando o botão de foco.
- Escolha LSM e clique no botão Dye & Detector Select (Figura 2B). Clique duas vezes nos corantes desejados na janela pop-up para selecionar as configurações apropriadas de laser e filtro para obter imagens das células (Figura 2C). Clique em Livex4 no painel Live para iniciar a varredura rápida a laser para iniciar a triagem dos sinais de fluorescência das células (Figura 2D).
- Mova o palco usando o controlador de joystick e localize as células médias que expressam diKillerRed-VKSKL- ou SLP-VKSKL para aplicar estresse ROS (nos peroxissomos). Adquira uma imagem da célula desejada.
- Clique em Tool Window e escolha LSM Stimulation (Estimulação LSM ) (Figura 2E). Clique no botão de elipse e, na janela de imagem ao vivo, use o mouse para desenhar uma ROI circular de 15 μm de diâmetro (Figura 2F) contendo os peroxissomas desejados adquiridos na etapa 3.4 à qual a tensão ROS será aplicada (veja a Figura 3 para um exemplo).
- Para aplicar o estresse ROS, use 561 nm para células com o ligante SLP marcado com diKillerRed-PTS1- ou TMR, e use 640 nm para células coradas com o ligante SLP marcado com Janelia Fluor 646.
- Selecione o comprimento de onda do laser para aplicar a tensão ROS. Insira a porcentagem de laser desejada e a duração (Figura 2G).
- Clique em Adquirir e clique no botão Estimulação (Figura 2H) para iniciar a varredura com luz de 561/640 nm através das ROIs de 30 s cada. Isso corresponde a uma configuração de ~5% de potência do laser para 561 nm e 640 nm no microscópio confocal usado aqui. Esta operação levará à produção de ROS nos peroxissomos.
NOTA: Pode-se selecionar ROIs de diferentes tamanhos. Deve-se ajustar proporcionalmente o tempo de iluminação para cada ROI de acordo com sua área. - Após 30 s de iluminação a laser, os peroxissomas dentro das ROIs terão perdido seus sinais diKillerRed-PTS1/TMR/Janelia Fluor 646. Essa perda de sinal permite distinguir os peroxissomas iluminados dos não iluminados (danificados vs. saudáveis) dentro de uma célula.
4. Monitoramento da pexofagia em células vivas por meio de imagens por lapso de tempo
- Siga a translocação de Stub1, Hsp70, Ub, p62 ou LC3B marcados com EGFP para os peroxissomas iluminados/estressados por ROS, usando imagens de lapso de tempo usando intervalos de 10 min entre quadros (por exemplo, veja as Figuras 3-7).
NOTA: Os sinais EGFP-Stub1 ou EGFP-Hsp70 começam a aparecer 10-20 min após a iluminação e permanecem em todos os peroxissomas danificados até ~40 min após a iluminação. Os sinais EGFP-Ub aparecem 30 min após a iluminação e duram 2-3 h. A translocação EGFP-p62 aparece 60 min após a iluminação, e os sinais EGFP-LC3B tornam-se visíveis ~3 h após a iluminação. - Quantifique os sinais EGFP nos peroxissomas danificados (de Stub1, Ub, p62 ou LC3B) usando ImageJ. Execute as etapas a seguir para usar o ImageJ para quantificar uma imagem de três canais (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).
- Abra a imagem e aplique seleções elípticas ou seleções à mão livre para delimitar a região que contém todos os peroxissomas iluminados (sinal PMP34-TagBFP positivo e sinal ligante HaloTag branqueado; Figura 8A).
- Clique em Duplicar para selecionar o canal PMP34-TagBFP (Figura 8A). Defina um limite usando o menu suspenso Image > Adjust > Threshold para marcar os peroxissomas (Figura 8B).
- Selecione Analisar > Analisar partículas para determinar as regiões exatas dos peroxissomas iluminados. O ImageJ registra essas regiões de interesse (ROIs) no gerenciador de ROI (Figura 8C).
- Clique em Duplicar para escolher o canal EGFP para analisar o sinal de fluorescência de Ub, p62 ou LC3B conjugado com EGFP (Figura 8D). Selecione todos os ROIs no ROI Manager (Figura 8E).
- Aplique Measure no ROI Manager para medir os sinais EGFP nos peroxissomas (Figura 8E). Encontre o valor da área e da densidade integrada (a soma de todas as intensidades de pixel) para cada ROI na tabela Resultados (Figura 8E).
- Para obter as intensidades médias de fluorescência do EGFP em diferentes momentos após a iluminação, divida a intensidade integrada do EGFP pela área total dos peroxissomas iluminados (áreas positivas do sinal PMP34-TagBFP e negativo do sinal do ligante HaloTag). Para obter o sinal acumulado nos peroxissomos, subtraia a intensidade média em um ponto de tempo pela intensidade média no tempo = 0 e, em seguida, normalize pela intensidade média no tempo = 0.
5. Danificando globalmente todos os peroxissomas (em todas as células) em um prato de cultura
- Realizar a etapa 1 (preparação das células que expressam diKillerRed direcionado ao peroxissomo [diKillerRed-VKSKL] ou SLP [SLP-VKSKL]) e a etapa 2 (coloração dos peroxissomas com o ligante SLP [para produção de ROS ativadas pela luz]).
- Após 1 h de coloração com ligante marcado com TMR, remover o meio de coloração e adicionar 1 mL de meio de cultura contendo 3-AT 30 mM (3-amino-1,2,4-triazol; um inibidor da catalase).
NOTA: A catalase é um sequestrador de ROS expresso no lúmen do peroxissomo, de modo que o tratamento com 3-AT ajuda a aumentar o dano oxidativo provocado pela luz nos peroxissomos. - Coloque o prato de cultura acima de um LED (555-570 nm). Ilumine todas as células com uma densidade de potência de 1,8 W/cm2 por 9 h em uma incubadora.
NOTA: Para executar esta etapa fora de uma incubadora, coloque o prato de cultura em uma placa de aquecimento de 37°C. Adicione 20 mM HEPES ao meio contendo 3-AT e cubra a placa de cultura com um filme transparente para minimizar as trocas gasosas. O HEPES é um agente tampão que mantém o pH fisiológico em cultura celular fora de uma incubadora de CO2 durante a iluminação por LED. - Valide o sucesso do dano provocado por LED por imagem dos sinais EGFP-Ub, EGFP-p62 ou EGFP-LC3B nos peroxissomas. Usando a condição de iluminação descrita acima, 82% das células SHSY5Y expressando estavelmente HaloTag-VKSKL exibiram pexofagia mediada por Stub1.
- Colheita das células para análise bioquímica a jusante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O esquema de indução de pelofagia mediado por Stub1 mostrado aqui aproveita a geração de ROS assistida por corante dentro do lúmen do peroxissomo. Esta operação requer intensidades luminosas mínimas. Peroxissomas contendo proteínas fluorescentes ou corantes podem, portanto, ser iluminados usando microscópios confocais de varredura a laser padrão. A iluminação focal leva à produção instantânea e localizada de ERO dentro de peroxissomas individuais, como indicado pelo repórter fluorescente roGFP2-VKSKL (Figura 9). Não obtivemos imagens de diKillerRed-VKSKL nas medidas de roGFP2-VKSKL para evitar a geração adicional de ROS durante a aquisição de imagens. A imagem inferior direita do diKillerRed-VKSKL na Figura 9 foi obtida depois que todas as medidas de roGFP2-VKSKL foram feitas para indicar claramente onde os peroxissomas danificados estavam13. Os dados também mostram que os peroxissomas não iluminados não são afetados, indicando a precisão da metodologia. As ROS levam à oxidação de uma pequena fração de moléculas residentes no peroxissomo, levando à disfunção do peroxissomo. Esta operação aguda permite sondar as várias vias de controle de qualidade do peroxissomo de forma robusta.
Conseguimos usar essa metodologia para monitorar a pexofagia mediada por Stub1. Na pexofagia mediada por Stub1, Hsp70 recruta Stub1 em peroxissomas estressados por ROS para iniciar o turnover do peroxissomo por autofagia. Durante esse processo, Hsp70, Stub1, proteínas ubiquitinadas, adaptador de autofagia p62 e LC3B aparecem sequencialmente em peroxissomas estressados por ROS para conduzir a pexofagia (Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6 , Figura 7)13. Através de imagens de lapso de tempo, foi possível acompanhar o tempo e a ordem do recrutamento desses fatores críticos na pexofagia. Usando a metodologia para lesar os peroxissomas focalmente, pudemos facilmente demonstrar que a maquinaria Hsp70/Stub1 visa especificamente os peroxissomas danificados (mas não os funcionais). Além de provocar a produção de ROS dentro dos peroxissomas individuais, foi possível usar a mesma estratégia para danificar simultaneamente todos os peroxissomas em uma placa de cultura para a caracterização bioquímica da pexofagia mediada por Stub1 (Figura 10).
Figura 1: Esquema para produção de ROS ativadas por luz em peroxissomos . (A) Esquema de como desencadear a geração de ROS peroxissomais pela luz. Corantes como dímeros em tandem KillerRed ou ligantes SLP fluorescentes são direcionados para peroxissomas através do uso de sequências de direcionamento de peroxissomo (VKSKL). (B) O 3-AT inibe a catalase e pode ser usado em conjunto com o esquema mostrado aqui para aumentar os níveis de ROS na luz peroxissomal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Utilização de microscópio confocal para ativação da produção de ROS em peroxissomos. (A) Captura de tela da etapa 3.2 do protocolo. (B-D) Capturas de tela para a etapa 3.3 no protocolo. (E-F) Capturas de tela para a etapa 3.5 no protocolo. (G) Captura de tela para a etapa 3.7 do protocolo. (H) Captura de tela para a etapa 3.8 do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Translocação de EGFP-Stub1 em peroxissomas estressados por ROS. Células SHSY5Y foram transfectadas com HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP e EGFP-Stub1. Um dia após a transfecção, as células foram coradas com o ligante HaloTag TMR a 37°C (200 nM, 1 h). Aqui, os dados de uma das células neste exemplo são mostrados. (A) A região circular branca nesta célula foi selecionada para iluminação de 561 nm. (B) Os peroxissomas iluminados na região circular branca perderam imediatamente a fluorescência TMR. (C) EGFP-Stub1 translocado para os peroxissomas iluminados em t = 20 min. Todas as barras de escala: 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Recrutamento de EGFP-Hsp70 por peroxissomas estressados por ROS. Os peroxissomas nas células SHSY5Y expressando HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP e EGFP-Hsp70 foram corados com o ligante 200 nM HaloTag TMR por 1 h. Aqui, os dados de uma das células neste exemplo são mostrados. (A) A região circular branca da célula foi submetida à iluminação de 561 nm. (B) Os peroxissomas iluminados nesta região iluminada perderam imediatamente sua fluorescência TMR devido ao fotoclareamento. (C) EGFP-Hsp70 translocado para os peroxissomas iluminados 20 min depois. Inserções no canto inferior direito: vista ampliada das regiões quadradas em branco. Todas as barras de escala: 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagem em time-lapse do acúmulo de proteínas ubiquitinadas em peroxissomas estressados por ROS. (A) Após 1 h de coloração com o ligante HaloTag TMR, os peroxissomas dentro da região circular branca em uma célula SHSY5Y expressando EGFP-Ub, PMP34-TagBFP e HaloTag-VKSKL foram iluminados com 561 nm. (B) A fluorescência do TMR dentro da região foi branqueada após a iluminação. EGFP-Ub posteriormente acumulado especificamente sobre os peroxissomas iluminados (t = 40 min e 2 h após a iluminação de 561 nm. Inserções no canto inferior direito: vista ampliada das regiões quadradas brancas em (C). Todas as barras de escala: 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Acúmulo do adaptador de autofagia p62 em peroxissomas estressados por ROS . (A) A região circular branca em uma célula SHSY5Y expressando EGFP-p62, PMP34-TagBFP e HaloTag-VKSKL (corada com o ligante HaloTag TMR; 200 nM, 1 h) foi iluminada com luz de 561 nm. (B) A iluminação causou a perda imediata dos sinais TMR nos peroxissomas visados. (C) A 2,5 h após a iluminação, os peroxissomas recrutaram EGFP-p62. Inserções no canto superior direito: vistas ampliadas das regiões quadradas brancas em (C). Todas as barras de escala: 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Translocação de EGFP-LC3B para peroxissomas estressados por ROS. (A) Após a coloração do ligante HaloTag TMR (200 nM, 1 h), uma célula SHSY5Y expressando EGFP-LC3B, PMP34-TagBFP e HaloTag-VKSKL foi iluminada com 561 nm dentro da região circular branca. (B) Após a iluminação, o sinal TMR dos peroxissomas na região circular branca foi branqueado. (C) A 3,5 h após a iluminação, o EGFP-LC3B translocou para os peroxissomas estressados por ROS. Inserções no canto superior direito: vistas ampliadas das regiões quadradas brancas em (C). Todas as barras de escala: 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Quantificação dos sinais de fluorescência em peroxissomas danificados usando ImageJ . (A) Captura de tela para a etapa 4.2.1 e etapa 4.2.2 no protocolo. (B) Captura de tela para a etapa 4.2.2 do protocolo. (C) Captura de tela para as etapas 4.2.3 no protocolo. (D) Captura de tela para a etapa 4.2.4 no protocolo. (E) Captura de tela para a etapa 4.2.4 e etapa 4.2.5 no protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Produção de ROS ativadas por luz dentro de peroxissomas individuais. A sonda redox localizada no peroxissomo roGFP2-VKSKL foi usada para validar a produção de ROS ativadas por luz dentro dos peroxissomas alvo. Os peroxissomas dentro da região circular branca de uma célula NIH3T3 expressando diKillerRed-VKSKL e roGFP2-VKSKL foram iluminados com luz de 561 nm, e estes são mostrados (A) antes da iluminação luminosa de 561 nm e (B) após a iluminação luminosa de 561 nm. Esquerda: emissão de roGFP2-VKSKL com excitação de 405 nm (magenta); meio: emissão roGFP2-VKSKL com excitação de 488 nm (verde). A razão entre o sinal de emissão roGFP2-VKSKL excitado por 405 nm (magenta) sobre o sinal de emissão excitado por 488 nm (verde) rastreia os níveis de ROS dentro dos peroxissomos. A região circular branca em (B) mostra a perda imediata da emissão de diKillerRed-VKSKL após iluminação de 561 nm. Todas as barras de escala: 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Danificando globalmente todos os peroxissomas em uma placa de cultura. Células SHSY5Y expressando HaloTag-VKSKL, EGFP-Ub e PMP34-TagBFP foram coradas com o ligante HaloTag TMR por 1 h. (A) Antes da iluminação por LED, a fluorescência do EGFP-Ub era homogênea no citoplasma e não colocalizava com os peroxissomas (marcados pelo ligante HaloTag TMR e PMP34-TagBFP). (B) Após 9 h de iluminação por LED, o sinal EGFP-Ub acumulou-se sobre todos os peroxissomas das células cultivadas em placa confocal, conforme indicado nos dois painéis em (B). Todas as barras de escala: 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo detalha como desencadear a pexofagia mediada por Stub1 em culturas de células elevando os níveis de ROS peroxissomais com luz. Como o protocolo depende da geração de ROS assistida por corante, é necessário garantir a expressão suficiente de diKillerRed-VKSKL ou coloração de ligante SLP marcada com corante dentro das células de interesse. Dado que diferentes tipos celulares ou células de diferentes origens genéticas podem abrigar peroxissomas com propriedades ligeiramente diferentes, pode-se precisar ajustar as condições exatas de iluminação para garantir a indução da pexofagia. Uma medida robusta para rastrear a ativação da pexofagia mediada por Stub1 é monitorar se o EGFP-Ub se transloca para os peroxissomas iluminados (1 h após a iluminação)13. Em células saudáveis, os sinais de EGFP-Ub são geralmente distribuídos uniformemente no citoplasma. Sua translocação para peroxissomas iluminados é, portanto, fácil de observar. Para otimizar a condição de iluminação, a intensidade da luz ou o tempo de iluminação podem ser alterados. Também é melhor evitar a iluminação excessiva de corantes ao tentar danificar os peroxissomos, pois alguns podem sofrer processos fotoquímicos que podem interferir na imagem a jusante. Por exemplo, foi mostrado que a iluminação excessiva do KillerRed pode fazer com que ele se torne fracamente verde fluorescente. A iluminação excessiva gera sinais verdes fracos nos peroxissomas iluminados imediatamente após a iluminação23 (ao contrário da translocação de repórteres baseados em EGFP, que pode levar de dezenas de minutos a horas para ocorrer).
A metodologia permite que os pesquisadores usem microscópios confocais de varredura a laser padrão para prejudicar uma fração de peroxissomas dentro de uma célula, permitindo comparações diretas da diferença de destino entre peroxissomas saudáveis e danificados. Em comparação com os métodos existentes, o protocolo aqui causa estresse de ROS para apenas uma pequena porção dos peroxissomas em vez de todos os peroxissomas ou outras organelas nas células. Assim, é viável estudar o efeito dos peroxissomas sadios remanescentes sobre a pexofagia dos peroxissomas estressados por ROS na mesma célula.
Através da iluminação de um prato inteiro, também é possível atingir todos os peroxissomas dentro de uma cultura celular, permitindo a análise bioquímica da pexefagia mediada por Stub1. Como Hsc70/Stub1 reconhece peroxissomas danificados e quais substratos peroxissomais Stub1 ubiquitinatos são todas questões que podem ser exploradas usando este protocolo. De forma mais geral, o protocolo de comprometimento do peroxissomo também pode ser usado para sondar outras vias de controle de qualidade do peroxissomo. Dado que os peroxissomas estão intimamente ligados a muitas organelas celulares diferentes dentro da célula, incluindo o retículo endoplasmático, as mitocôndrias e as gotículas lipídicas, também seria interessante investigar como as células modulam sistematicamente o comportamento de todas as estruturas celulares em resposta ao comprometimento do peroxissomo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado em parte por uma bolsa de pesquisa MOST 111-2311-B-001-019-MY3 do Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia de Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell | MatTek | P35G-1.5-20-C | 20 mm glass bottomed |
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Sigma Aldrich | A8056 | |
| bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16170060 | |
| Cell culture incubator | Nuaire | NU-4750 | |
| diKillerRed-PTS1 | Academia Sinica | made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL) | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) | ThermoFisher Scientific | 11330032 | |
| EGFP-C1 | Clontech | pEGFP-C1 | The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62 |
| EGFP-Hsp70 | Academia Sinica | Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1 | |
| EGFP-LC3B | Addgene | 11546 | |
| EGFP-p62 | Academia Sinica | generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Stub1 | Academia Sinica | generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Ub | Addgene | 11928 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| HaloTag TMR ligand | Promega | G8252 | |
| HaloTag-PTS1 | Academia Sinica | PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Inverted Confocal Microscope | Olympus | FV3000RS | 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex, microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment |
| Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand | Promega | GA1120 | |
| LED | VitaStar | PAR64 | 80 W, 555-570 nm |
| lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668 | transfection reagent |
| NIH3T3 cell | ATCC | CRL-1658 | adherent |
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 319850 | reduced serum media |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| PMP34-TagBFP | Academia Sinica | PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171) | |
| roGFP2-PTS1 | Academia Sinica | generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1 | |
| SHSY5Y cell | ATCC | CRL-2266 | adherent |
References
- Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).
- He, A., et al. Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation. Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).
- Cipolla, C. M., Lodhi, I. J.
- Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, Springer. Dordrecht, the Netherlands. 45-65 (2013).
- Puri, P., et al. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).
- Law, K. B., et al. The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).
- Nazarko, T. Y. Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).
- Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
- Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -C., Subramani, S. Molecular mechanism and physiological role of pexophagy. FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).
- Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).
- Germain, K., Kim, P. K. Pexophagy: A model for selective autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).
- Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).
- Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy. Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).
- Nordgren, M., et al. Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts. Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).
- Zhang, J., et al. ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS. Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).
- Chen, B. -H., Chang, Y. -J., Lin, S., Yang, W. Y. Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes. Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).
- Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
- Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane. Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428 (2013).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
- Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes. Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).
- Nordgren, M., et al. Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).
