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Bioengineering

Ensemble liposome assisté par octanol sur puce pour la bio-ingénierie

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65032
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Laboratory of Physical Chemistry and Soft Matter, Wageningen University & Research
* These authors contributed equally

Summary

Le présent protocole décrit l’assemblage de liposomes assisté par octanol (OLA), une technique microfluidique pour générer des liposomes biocompatibles. OLA produit des liposomes monodispersés de la taille d’un micron avec une encapsulation efficace, permettant une expérimentation immédiate sur puce. Ce protocole devrait être particulièrement adapté à la biologie synthétique et à la recherche sur les cellules synthétiques.

Abstract

La microfluidique est un outil largement utilisé pour générer des gouttelettes et des vésicules de divers types de manière contrôlée et à haut débit. Les liposomes sont des imitations cellulaires simplistes composées d’un intérieur aqueux entouré d’une bicouche lipidique; Ils sont précieux pour concevoir des cellules synthétiques et comprendre les principes fondamentaux des cellules biologiques de manière in vitro et sont importants pour les sciences appliquées, telles que la livraison de fret pour des applications thérapeutiques. Cet article décrit un protocole de travail détaillé pour une technique microfluidique sur puce, l’assemblage de liposomes assisté par octanol (OLA), pour produire des liposomes biocompatibles monodispersés de la taille d’un micron. L’OLA fonctionne de la même manière que le soufflage de bulles, où une phase aqueuse interne (IA) et une phase 1-octanol transportant des lipides environnants sont pincées par des flux de fluides externes contenant du surfactant. Cela génère facilement des gouttelettes à double émulsion avec des poches d’octanol saillantes. Au fur et à mesure que la bicouche lipidique s’assemble à l’interface des gouttelettes, la poche se détache spontanément pour donner naissance à un liposome unilamellaire prêt à être manipulé et expérimenté. L’OLA offre plusieurs avantages, tels que la génération régulière de liposomes (>10 Hz), l’encapsulation efficace des biomatériaux et les populations de liposomes monodispersés, et nécessite de très petits volumes d’échantillons (~ 50 μL), ce qui peut être crucial lorsque l’on travaille avec des produits biologiques précieux. L’étude comprend des détails sur la microfabrication, la lithographie douce et la passivation de surface, qui sont nécessaires pour établir la technologie OLA en laboratoire. Une application de preuve de principe en biologie synthétique est également démontrée en induisant la formation de condensats biomoléculaires à l’intérieur des liposomes via un flux transmembranaire de protons. On s’attend à ce que ce protocole vidéo d’accompagnement facilite l’établissement et le dépannage de l’OLA dans leurs laboratoires.

Introduction

Toutes les cellules ont une membrane plasmique comme limite physique, et cette membrane est essentiellement un échafaudage sous la forme d’une bicouche lipidique formée par l’auto-assemblage de molécules lipidiques amphiphiles. Les liposomes sont les contreparties synthétiques minimales des cellules biologiques; Ils ont une lumière aqueuse entourée de phospholipides, qui forment une bicouche lipidique avec les groupes de tête hydrophiles face à la phase aqueuse et les queues hydrophobes enfouies vers l’intérieur. La stabilité des liposomes est régie par l’effet hydrophobe, ainsi que par l’hydrophilie entre les groupes polaires, les forces de van der Waals entre les queues de carbone hydrophobes, et la liaison hydrogène entre les molécules d’eau et les têtes hydrophiles 1,2. Selon le nombre de bicouches lipidiques, les liposomes peuvent être classés en deux catégories principales, à savoir les vésicules unilamellaires comprenant une seule bicouche et les vésicules multilamellaires construites à partir de plusieurs bicouches. Les vésicules unilamellaires sont en outre classées en fonction de leur taille. De forme typiquement sphérique, ils peuvent être produits dans une variété de tailles, y compris de petites vésicules unilamellaires (SUV, 30-100 nm de diamètre), de grandes vésicules unilamellaires (LUV, 100-1 000 nm de diamètre) et enfin, des vésicules unilamellaires géantes (GUV, >1 000 nm de diamètre)3,4. Diverses techniques ont été développées pour produire des liposomes, et celles-ci peuvent être classées en grandes catégories en techniques de vrac5 et techniques microfluidiques6. Les techniques de vrac couramment pratiquées comprennent la réhydratation du film lipidique, l’électroformation, le transfert d’émulsion inversée et l’extrusion 7,8,9,10. Ces techniques sont relativement simples et efficaces, et ce sont les principales raisons de leur utilisation répandue dans la communauté de la biologie synthétique. Cependant, en même temps, ils souffrent d’inconvénients majeurs en ce qui concerne la polydispersité en taille, le manque de contrôle de la lamellarité et la faible efficacité d’encapsulation 7,11. Des techniques telles que l’encapsulation continue par croisement d’interface de gouttelettes (cDICE)12 et le tir par gouttelettes et la filtration granulométrique (DSSF)13 surmontent ces limites dans une certaine mesure.

Les approches microfluidiques ont pris de l’importance au cours de la dernière décennie. La technologie microfluidique fournit un environnement contrôlable pour manipuler les écoulements de fluides dans les microcanaux définis par l’utilisateur en raison du flux laminaire caractéristique et du transfert de masse dominé par diffusion. Les dispositifs de laboratoire sur puce qui en résultent offrent des possibilités uniques pour le contrôle spatio-temporel des molécules, avec des volumes d’échantillons considérablement réduits et des capacités de multiplexage14. De nombreuses méthodes microfluidiques pour fabriquer des liposomes ont été développées, notamment le jet pulsé 15, le templage à double émulsion 16, l’éjection membranaire transitoire 17, le transfert d’émulsion de gouttelettes 18 et la focalisation hydrodynamique 19. Ces techniques produisent des liposomes monodispersés, unilamellaires, de la taille d’une cellule, avec une efficacité d’encapsulation élevée et un débit élevé.

Cet article détaille la procédure d’assemblage de liposomes assisté par octanol (OLA), une méthode microfluidique sur puce basée sur le mécanisme de pincement hydrodynamique et de mouillage ultérieurpar solvant 20 (Figure 1). On peut relier le fonctionnement de l’OLA à un processus de soufflage de bulles. Une jonction à six voies concentre la phase aqueuse interne (IA), deux flux organiques porteurs de lipides (LO) et deux flux aqueux externes (OA) contenant des tensioactifs en un seul endroit. Il en résulte des gouttelettes à double émulsion eau dans (lipides + octanol) dans l’eau. Au fur et à mesure que ces gouttelettes s’écoulent en aval, la minimisation de l’énergie interfaciale, le flux de cisaillement externe et l’interaction avec les parois du canal conduisent à la formation d’une bicouche lipidique à l’interface lorsque la poche de solvant se détache, formant ainsi des liposomes unilamellaires. Selon la taille de la poche d’octanol, le processus de démoulage peut prendre de quelques dizaines à quelques minutes. À la fin du canal de sortie, les gouttelettes d’octanol moins denses flottent à la surface, tandis que les liposomes plus lourds (en raison d’une solution encapsulée plus dense) coulent au fond de la chambre de visualisation prêts à être expérimentés. En tant qu’expérience représentative, le processus de séparation en phase liquide-liquide (LLPS) à l’intérieur des liposomes est démontré. Pour cela, les composants requis sont encapsulés à l’intérieur des liposomes à un pH acide qui empêche LLPS. En déclenchant à l’extérieur un changement de pH et, par conséquent, un flux transmembranaire de protons, des gouttelettes de condensat séparées en phase se forment à l’intérieur des liposomes. Cela met en évidence les capacités efficaces d’encapsulation et de manipulation du système OLA.

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Protocol

1. Fabrication de la plaquette maîtresse

  1. Prenez une plaquette de silicium propre de 4 po (10 cm) de diamètre (voir le tableau des matériaux). Nettoyez-le davantage en utilisant de l’air sous pression pour éliminer les particules de poussière.
  2. Montez la plaquette sur une enrobeuse de spin et distribuez doucement ~5 mL d’une résine photosensible négative (voir Tableau des matériaux) au centre de la plaquette. Essayez d’éviter les bulles d’air, car elles pourraient interférer avec le processus d’impression en aval de la plaquette.
  3. Pour obtenir une couche de résine photosensible de 10 μm d’épaisseur, essorer la plaquette à 500 tr/min pendant 30 s avec une accélération de 100 tr/min pour l’étalement initial, suivie d’une rotation de 60 s à 3 000 tr/min avec une accélération de 500 tr/min. Si une épaisseur différente est souhaitée, modifiez les paramètres de filature selon les instructions du fabricant.
  4. Cuire la gaufrette sur une plaque chauffante pendant 2 min à 65 °C, puis pendant 5 min à 95 °C.
  5. Une fois la plaquette refroidie, montez-la dans la chambre d’impression de la machine de lithographie optique à écriture directe (voir Tableau des matériaux) et introduisez la conception OLA (Figure 2A, Fichier de codage supplémentaire 1) dans le logiciel.
    REMARQUE : La conception OLA se compose essentiellement de deux canaux OA, deux canaux LO et un canal IA, qui fusionnent pour former une jonction à six voies qui continue comme canal de post-production et se termine dans le puits expérimental (EW).
  6. Imprimez le(s) dessin(s) OLA(s) sur la plaquette revêtue à l’aide d’un laser UV (voir Tableau des matériaux) avec une dose de 300 mJ/cm2.
  7. Une fois le dessin imprimé, cuire la gaufrette à 65 °C pendant 1 min, puis 95 °C pendant 3 min.
  8. À ce stade, assurez-vous que le contour du dispositif imprimé apparaît sur la plaquette et est visible à l’œil nu. Pour laver la résine photosensible non durcie, trempez la plaquette dans un bécher en verre contenant la solution de révélateur (voir le tableau des matériaux) jusqu’à ce que la résine photosensible non durcie soit complètement retirée.
    REMARQUE : un traitement excessif du révélateur peut affecter la résolution de conception.
  9. Laver la plaquette avec de l’acétone, de l’isopropanol et de l’eau désionisée (DI) en séquence, et enfin, avec de l’air sous pression/N2 à l’aide d’une sarbacane.
  10. Cuire la plaquette à 150 °C pendant 30 minutes pour s’assurer que le dessin imprimé est solidement fixé à la surface de la plaquette et ne se détache pas pendant le processus de fabrication en aval. La plaquette principale est alors prête à être utilisée (Figure 2B).

2. Préparation du dispositif microfluidique

  1. Placez la plaquette principale sur une pièce carrée d’aluminium et enroulez la feuille d’aluminium autour de la plaquette, formant ainsi une structure bien semblable (figure 2C).
  2. Mesurer 40 g de polydiméthylsiloxane (PDMS) et 4 g d’agent durcissant (10:1, rapport pondéral, voir le tableau des matières) dans un tube à centrifuger de 50 mL et mélanger vigoureusement à l’aide d’une spatule ou d’un embout de pipette pendant 2 à 3 minutes.
  3. Le mélange vigoureux du PDMS et de l’agent de durcissement piège les bulles d’air à l’intérieur du mélange. Faites tourner le tube à 100 x g pendant 2-3 minutes pour éliminer la majorité des grosses bulles d’air.
  4. Verser environ 15 à 20 g du mélange préparé à l’étape 2.3 sur la plaquette maîtresse, et dégazer à l’aide d’un dessiccateur. Enregistrez l’excès de mélange pour faire des lames de verre revêtues de PDMS (étape 3).
  5. Incuber l’ensemble dans une étuve à 70 °C pendant au moins 2 h.
  6. Sortez la gaufrette maîtresse du four et laissez-la refroidir. Pour retirer le bloc PDMS solidifié, retirez le papier d’aluminium et décollez soigneusement le bloc PDMS du bord de la plaquette.
    REMARQUE: La plaquette est fragile et peut se casser, il est donc important de faire ce processus avec soin.
  7. Une fois le bloc PDMS retiré, gardez la structure à motifs tournée vers le haut et, à l’aide d’une lame tranchante ou d’un scalpel, coupez les blocs PDMS individuels, chacun contenant un seul dispositif microfluidique.
  8. Placez le bloc PDMS sur une surface sombre et ajustez la direction de la lumière (une lampe de table est pratique pour cela) afin que les canaux gravés soient brillants et, par conséquent, visibles. Faites des trous dans les entrées et le canal de sortie à l’aide de poinçons de biopsie de 0,5 mm et 3 mm de diamètre (voir le tableau des matériaux), respectivement.
    REMARQUE: Utilisez un poinçon de biopsie tranchant pour éviter les fissures dans le PDMS, qui peuvent causer des fuites plus tard. Poussez doucement le poinçon de biopsie à travers le bloc PDMS et assurez-vous qu’il passe complètement à travers lui. Pour retirer le poinçon de biopsie, rétractez-le doucement tout en le tournant dans d’autres directions. Le bloc PDMS avec la conception OLA gravée est maintenant prêt à être lié à une lame de verre revêtue de PDMS.

3. Fabrication de la lame de verre revêtue PDMS

  1. Prenez un couvercle en verre transparent, versez environ 0,5 ml de PDMS (préparé en excès à l’étape 2.4) au centre de la lame de verre et étalez-le sur le couvercle en inclinant doucement la lame de verre, assurant ainsi une couverture totale de la lame de verre avec PDMS.
  2. Montez la glissière de verre sur le patineur, assurez-vous qu’elle est placée au centre (de sorte que le milieu de la glissière chevauche le centre de l’arbre de pression) et faites tourner la lame de verre à 500 tr/min pendant 15 s (par incrément de 100 tr/min), puis à 1 000 tr/min pendant 30 s (par incrément de 500 tr/min).
  3. Placez la lame de verre revêtue de PDMS (côté couché vers le haut) sur une plate-forme surélevée comme un bloc de PDMS (1 cm x 1 cm) dans une boîte de Petri couverte et faites-la cuire à 70 °C pendant 2 h.

4. Collage du dispositif microfluidique

  1. Nettoyez le bloc PDMS (préparé à l’étape 2) en collant et en retirant deux fois le scotch disponible dans le commerce (voir le tableau des matières). Assurez-vous de garder le côté nettoyé vers le haut jusqu’à l’utilisation.
  2. Nettoyez la lame de verre revêtue de PDMS avec de l’air sous pression/N2 à l’aide d’une sarbacane et gardez le côté propre orienté vers le haut.
  3. Placez le bloc PDMS (canaux gravés orientés vers le haut) et la lame de verre revêtue de PDMS (côté revêtu orienté vers le haut) dans la chambre à vide du nettoyeur plasma (voir Tableau des matériaux).
  4. Allumez le vide et exposez le contenu au plasma de l’air à une fréquence radio de 12 MHz (mode RF élevé) pendant 15 s pour activer les surfaces. Le plasma d’oxygène peut être vu sous la forme d’une teinte rosâtre.
  5. Immédiatement après le traitement au plasma, placez la lame de verre revêtue de PDMS sur une surface propre, le côté PDMS tourné vers le haut. Placez délicatement le bloc PDMS avec le motif microfluidique maintenant orienté vers la lame de verre revêtue de PDMS, ce qui leur permet de se lier (Figure 2D).
    REMARQUE: L’élimination de l’air emprisonné dans l’appareil est cruciale pour assurer une liaison complète.
  6. Cuire les appareils collés à 70 °C pendant 2 h.

5. Fonctionnalisation de surface du dispositif microfluidique

REMARQUE : Avant la fonctionnalisation de surface, il est important d’étalonner la pompe sous pression conformément au protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux) et d’assembler le tube pour le connecter au dispositif microfluidique.

  1. Connexion du dispositif microfluidique aux pompes à pression
    1. Connectez le régulateur de débit entraîné par pression à une source de pression externe (jusqu’à 6 bars). Au moins quatre canaux de pression d’air indépendants sont nécessaires : trois modules individuels de 0-2 bar et un module de −0,9-4 bar.
    2. Étalonner la pompe sous pression conformément au protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux).
    3. Couper le tube (1/16 po DO x 0,02 po ID) en quatre morceaux de taille égale d’environ 20 cm de longueur.
    4. Insérez des connecteurs courbés à 90° en acier inoxydable de 23 G (voir le tableau des matériaux) à une extrémité de chaque pièce. Cette extrémité est ensuite insérée dans les trois entrées (OA, LO et IA) du dispositif microfluidique et la quatrième est utilisée pour éliminer l’excès de solution (étape 5.2.5).
    5. Insérez l’autre extrémité du tube dans le support du réservoir microfluidique et scellez-le à l’aide de raccords microfluidiques, en veillant à ce que le tube soit suffisamment long pour toucher le fond du réservoir (tubes de 1,5 mL, voir le tableau des matériaux). Cela empêche les bulles d’air indésirables de pénétrer dans le dispositif microfluidique pendant le traitement PVA / production de liposomes.
  2. Traitement PVA du canal de sortie
    REMARQUE: Avant la génération de liposomes, il est crucial de rendre le dispositif partiellement hydrophile en aval de la jonction de production. Cela se fait en traitant ces canaux avec une solution d’alcool polyvinylique (PVA) à 5% (p/v). La solution de PVA est préparée en dissolvant la poudre de PVA (voir tableau des matériaux) dans de l’eau à 80 °C pendant 3 h sous agitation constante à l’aide d’un agitateur magnétique. Filtrer la solution avant de l’utiliser pour le traitement de surface. Immédiatement après la liaison du dispositif, les canaux microfluidiques sont hydrophiles en raison de l’activation de surface induite par le plasma, et ils redeviendront progressivement hydrophobes. Il est recommandé d’attendre 2 h après la cuisson (étape 4.6) avant de commencer le traitement PVA.
    1. Distribuer 200 μL de solution de PVA à 5 % p/v dans un tube de 1,5 mL et le raccorder au support du réservoir microfluidique. Insérer le tube (celui mentionné à l’étape 5.1.3) de telle sorte qu’une extrémité soit immergée dans la solution PVA et que l’autre extrémité soit connectée à l’entrée du canal OA du dispositif microfluidique.
      REMARQUE: Une concentration plus faible de PVA peut entraîner une fonctionnalisation de surface inférieure aux normes.
    2. Répétez l’étape ci-dessus sans PVA (tube vide de 1,5 mL) et connectez-le aux canaux LO et IA.
    3. Augmenter la pression de la phase OA à 100 mbar pour faire circuler la solution PVA dans les canaux OA. Augmenter les pressions des phases IA et LO à 120 mbar afin d’empêcher le refoulement de la solution PVA à l’intérieur de ces canaux (Figure 2E).
      REMARQUE: Si nécessaire, ajustez les pressions des canaux individuels afin de maintenir le ménisque stable à la jonction de production.
    4. Écouler la solution PVA de cette manière pendant environ 5 min, en assurant une fonctionnalisation complète du canal de sortie.
    5. Pour retirer la solution PVA, détachez le tube de l’entrée OA et augmentez immédiatement la pression dans les canaux LO et IA à 2 bar. Simultanément, utiliser un tube relié à un canal à pression négative (−900 mbar) pour éliminer l’excès de PVA d’abord du canal de sortie, puis de l’entrée OA (figure 2F).
    6. Cuire l’appareil à 120 °C pendant 15 min et laisser refroidir avant utilisation. L’appareil peut être stocké dans des conditions ambiantes pendant au moins 1 mois.
      REMARQUE: Il est recommandé d’attendre 1 jour (à température ambiante) avant de procéder à l’OLA pour s’assurer que le PDMS non traité retrouve son hydrophobicité après le traitement au plasma.

6. Assemblage de liposomes assisté par octanol (OLA)

  1. Préparation du stock lipidique
    NOTE: Ici, un mélange de 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC) et de 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyle) (Liss Rhod PE) lipides (voir le tableau des matériaux) est utilisé à titre d’exemple; Les utilisateurs doivent préparer la composition lipidique dont ils ont besoin d’une manière similaire.
    1. Distribuer 76 μL de DOPC (25 mg/mL) et 16,6 μL de Liss Rhod PE (1 mg/mL) dans une fiole à fond rond à l’aide de seringues en verre séparées.
    2. Maintenir la fiole à fond rond à la verticale et utiliser une sarbacane N2 comprimée pour donner un léger jet d’azote pour évaporer le chloroforme et former un film lipidique séché au fond de la fiole.
    3. Placer la fiole dans le dessiccateur pendant au moins 2 h sous vide continu pour éliminer le chloroforme restant.
    4. Ajouter 100 μL d’éthanol dans la fiole à fond rond, puis le pipeter ou l’agiter doucement pour s’assurer que les lipides sont dissous pour former un stock de lipides à 10 % (p/v).
      NOTE: Dans le cas où une composition lipidique particulière n’est pas complètement soluble dans l’éthanol, utilisez un mélange éthanol/chloroforme, en gardant le volume de chloroforme aussi petit que possible.
    5. Introduire la solution dans un flacon en verre foncé. Rincer doucement le flacon avec de l’azote à l’aide d’une sarbacane pour remplacer l’air par une atmosphère inerte. Sceller le couvercle avec un film de paraffine et conserver à −20 °C.
      REMARQUE: La solution mère peut être utilisée jusqu’à quelques mois. Chaque fois que le flacon est ouvert, remplacez doucement l’air avec de l’azote et refermez avec le couvercle avec un film de paraffine.
  2. Préparation des solutions OLA
    1. Faire des solutions de stock des composants indispensables: 20 mM de dextrane (Mw 6 000); 60 % (v/v) de glycérol; un tampon de choix. Dans ce cas, une solution saline tamponnée au phosphate 5x (0,68 M NaCl, 13,5 mM KCl, 50 mMNa2HPO 4, 9 mM KH2PO 4; pH 7,4) a été préparée (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE: Comme le glycérol pur est très visqueux, il est recommandé de découper un petit morceau à l’extrémité de la pointe de la pipette de manière inclinée pour un pipetage efficace.
    2. Préparer 100 μL d’échantillons d’IA, d’OA et de solution de sortie (ES, la solution souhaitée pour remplir le EW). Pour faciliter la visualisation, la protéine fluorescente jaune (YFP) a été ajoutée à la solution d’IA dans ce cas particulier. Vérifiez l’équilibre osmotique entre l’IA et l’OA en calculant l’osmolarité des composants encapsulés et en ajoutant une quantité appropriée de sucre ou de sel dans l’OA si nécessaire. Ceci est fait afin d’empêcher l’éclatement ou le rétrécissement des liposomes pendant la production.
      NOTE: Les compositions finales des trois phases sont les suivantes:
      IA : 15 % de glycérol, 5 mM de dextrane (Mw 6 000), 5,4 μM YFP, 1x PBS
      OA: 15% glycérol, 5% tensioactif F68, 1x PBS
      ES: 15% glycérol, 1x PBS
      Une concentration plus faible de tensioactif F68 affecte négativement la génération de doubles émulsions.
    3. Préparer 80 μL de la phase LO en pipetant 4 μL de lipides mères dans 76 μL de 1-octanol (voir le tableau des matières). La concentration finale de DOPC est de 5 mg/mL.
    4. Centrifuger les échantillons à 700 x g pendant 60 s pour éliminer les gros agrégats avant de procéder aux expériences microfluidiques. Cela empêche tout facteur de colmatage évident de pénétrer dans la puce microfluidique.
  3. Production de liposomes
    1. Distribuer les solutions (IA, LO, OA) en trois tubes de 1,5 mL, les assembler (comme mentionné à l’étape 5.1) et les connecter à la puce microfluidique traitée au PVA (étape 5.2.6).
    2. Appliquer une pression positive sur les trois canaux : ~100 mbar sur les canaux IA et LO et ~200 mbar sur le canal OA.
      NOTE: Comme la pression OA est plus élevée que les autres, la solution OA sera la première à arriver à EW; Ceci est fortement recommandé.
    3. Une fois que la solution OA atteint EW, diminuer la pression OA à 100 mbar et augmenter la LO à 200 mbar.  La solution LO arrivant à la jonction de production entraînera probablement des bulles d’air en raison du déplacement d’air des canaux LO. Une fois les bulles d’air distribuées dans l’EW, réglez la pression LO à 100 mbar. Enfin, augmentez la pression IA à 200 mbar et attendez que tout l’air dans le canal IA soit éliminé. La séquence idéale d’arrivée à la jonction des trois phases est donc OA, LO et IA.
    4. Après avoir retiré l’air des trois canaux, régler toutes les pressions du canal à 50 mbar et pipeter 10 μL d’ES dans la chambre de sortie. Après avoir pipeté l’ES, placez une glissière de couverture sur le trou de sortie pour éviter l’évaporation. Dans le cas où le LO est repoussé, augmentez progressivement la pression LO par incréments de 1 mbar jusqu’à ce qu’elle commence à s’écouler vers la jonction.
    5. Une fois que les trois phases commencent à co-couler à la jonction, assurez-vous que la production de double émulsion commence et ajustez-les en fonction de sa qualité (Figure 3A-C). Changez les pressions progressivement (pas de 0,1-1 mbar) plutôt que brusquement à moins que la pression ne soit modifiée pour éliminer un bouchon indésirable dans le canal.
      REMARQUE: Les canaux à ajuster dépendent de ce qui se passe à la jonction. Par exemple, l’IA doit être diminuée si les émulsions sont trop grosses; l’OA doit être augmenté si des doubles émulsions se forment mais éclatent au lieu d’être pincées; et le LO doit être diminué si la poche octanol est trop grande.
    6. Vérifiez que les gouttelettes à double émulsion s’écoulent en aval vers EW. Au fur et à mesure qu’elles coulent, les poches d’octanol deviennent de plus en plus proéminentes et finissent par se pincer, formant des liposomes (Figure 3D-F). Assurez-vous que le canal de post-production est suffisamment long et que la migration des doubles émulsions est suffisamment lente pour la démoulage.
      REMARQUE: Quelques minutes après une production décente, les liposomes et les gouttelettes d’octanol quitteront le canal de post-production et entreront dans l’EW. En conséquence, étant moins denses que l’eau, les gouttelettes d’octanol flottent à la surface de l’ES. En raison de l’ajout de dextran dans l’IA, les liposomes sont plus lourds que leur environnement et vont au fond de la chambre prêts à être observés et manipulés davantage.

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Representative Results

Cette étude démontre la formation de condensats sans membrane via le processus de séparation en phase liquide-liquide (LLPS) à l’intérieur des liposomes en tant qu’expérience représentative.

Préparation des échantillons
L’IA, OA, ES et la solution d’alimentation (FS) sont préparés comme suit:

IA : 12 % glycérol, 5 mM de dextran, 150 mM de KCl, 5 mg/mL de poly-L-lysine (PLL), 0,05 mg/mL de poly-L-lysine-FITC marqué (PLL-FITC), 8 mM d’adénosine triphosphate (ATP), 15 mM de citrate-HCl (pH 4)

OA: 12% v/v glycérol, 5% p/v F68, 150 mM KCl, 15 mM citrate-HCl (pH 4)

ES : 12 % glycérol, 150 mM KCl, 15 mM de citrate-HCl (pH 4)

FS : 12 % glycérol, 150 mM KCl, 75 mM Tris-HCl (pH 9)

Formation de condensats à l’intérieur des liposomes
Un essai simple de coacervation complexe sensible au pH de poly-L-lysine (PLL) chargée positivement et d’adénosine triphosphate multivalente chargée négativement (ATP) a été sélectionné pour démontrer les phénomènes de LLPS dans les liposomes. Pour éviter la séparation de phase de la polylysine et de l’ATP pendant l’encapsulation, le pH de la solution a été maintenu à 4, auquel l’ATP est neutre. L’augmentation du pH de l’ES en ajoutant du FS (un tampon de pH 9) a finalement augmenté le pH à l’intérieur des liposomes en raison du flux transmembranaire de protons, rendant l’ATP chargé négativement et déclenchant sa séparation de phase avec la PLL21 chargée positivement (Figure 4A). Après environ 2 h de génération de liposomes, les pressions IA et LO ont été désactivées. La pression du canal OA a été maintenue à 100 mbar pour faire circuler lentement les liposomes restants dans la chambre d’observation. Une fois que tous les liposomes du canal ont été récupérés dans l’EW, les pressions ont été désactivées pour arrêter l’écoulement et empêcher les liposomes de se déplacer. Les liposomes générés à un pH plus bas ont montré une fluorescence homogène (à partir du PLL-FITC fluorescent encapsulé) dans leur lumière (Figure 4B,D). Les gouttelettes d’octanol flottant à la surface ont été éliminées en pipetant soigneusement 5 μL de solution par le haut pour les empêcher d’affecter les étapes ultérieures du pipetage. Par la suite, 10 μL de tampon FS ont été ajoutés à l’EW, ce qui a induit une séparation de phase de la LPL et de l’ATP encapsulées. La fluorescence FITC homogène de chaque liposome s’est progressivement transformée en gouttelettes de condensat fluorescentes distinctes. Finalement, les gouttelettes individuelles ont fusionné en une gouttelette de condensat plus grosse qui a diffusé librement dans les liposomes (Figure 4C, E-G).

Figure 1
Figure 1 : Schéma montrant l’assemblage et le fonctionnement de l’OLA. Le régulateur de pression est connecté aux réservoirs contenant des solutions aqueuses externes, lipidiques dans octanol et aqueuses internes. Les tubes insérés dans les réservoirs sont connectés aux entrées respectives de l’appareil OLA. Des écoulements appropriés dans les trois canaux conduisent à la formation de doubles émulsions eau-dans-(lipide-dans-octanol)-dans-eau. Les doubles émulsions formées migrent vers le puits de sortie, au cours duquel les poches d’octanol se détachent pour former des liposomes. Les liposomes formés sont collectés au fond du puits pour la visualisation et l’expérimentation ultérieure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Préparation de la puce OLA (photolithographie, microfabrication, traitement de surface). (A) Conception numérique montrant les principales caractéristiques de la conception OLA, y compris trois entrées, une sortie et une jonction de production à six voies. (B) Un schéma de la plaquette maîtresse montrant plusieurs modèles OLA produits par lithographie UV. (C) Un élastomère PDMS coulé sur la plaquette maîtresse, placé dans un puits créé à partir de papier d’aluminium, et durci par cuisson à 70 °C pendant 2 h. (D) Un dispositif microfluidique lié par un traitement plasma à l’oxygène, où le bloc PDMS contenant la conception OLA est fixé à une lame de verre revêtue de PDMS. (E) Fonctionnalisation de surface de la puce fabriquée pour rendre le dispositif partiellement hydrophile. Cela se fait en faisant circuler 5% p/v PVA pendant 5 min du canal aqueux externe vers le canal de sortie. Une pression d’air positive dans les autres canaux empêche la solution PVA de pénétrer dans ces canaux. (F) Le PVA est éliminé en appliquant un vide dans le canal de sortie. L’appareil est cuit à 120 °C pendant 15 min et est ensuite prêt à l’emploi. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Démonstration de l’OLA produisant efficacement des doubles émulsions monodispersées et éventuellement des liposomes avec une excellente encapsulation. (A) Image en fond clair montrant la génération rapide de gouttelettes à double émulsion. (B) Le canal lipidique fluorescent montre la formation d’une poche octanol due à un mouillage partiel. La phase lipidique dans octanol contenait un mélange de DOPC (5 mg/mL) et de Lis Rhod PE à un rapport de 1 000:1. (C) Le canal aqueux interne montrant l’encapsulation de la protéine fluorescente jaune (YFP). Les encarts en (A-C) montrent des vues agrandies représentatives des panneaux respectifs (barres d’échelle = 10 μm). (D-F) Déshumidification de la poche octanol dans le canal de sortie, qui forme un liposome. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Séparation en phase liquide-liquide déclenchée par le pH du pLL/ATP dans les liposomes. (A) Schéma de la transition dépendante du pH de la solution homogène de pLL et d’ATP encapsulée dans le liposome (à gauche) vers des coacervates pLL/ATP séparés en phase (à droite). L’environnement acide initial dans le liposome rend la charge moléculaire de l’ATP neutre, inhibant la coacervation. Lorsque le pH à l’intérieur des liposomes s’équilibre avec l’augmentation du pH appliqué à l’extérieur, l’ATP gagne une charge négative, déclenchant la coacervation. (B-C) Graphiques linéaires (correspondant aux lignes pointillées dans les panneaux [D] et [G], respectivement) montrant la distribution spatiale de pLL (canal vert) et de la membrane (canal rouge). (D-G) Images accélérées montrant la formation de coacervates pLL/ATP dans les liposomes. L’ajout externe d’un tampon basique augmente le niveau de pH à l’intérieur des liposomes au cours des minutes et initie la coacervation. t = 0 min fait référence au temps juste avant la survenue du premier événement de coacervation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier de codage supplémentaire 1 : fichier CAO de la conception OLA. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

La complexité cellulaire rend extrêmement difficile la compréhension des cellules vivantes lorsqu’elles sont étudiées dans leur ensemble. Réduire la redondance et l’interconnectivité des cellules en reconstituant les composants clés in vitro est nécessaire pour approfondir notre compréhension des systèmes biologiques et créer des imitations cellulaires artificielles pour des applications biotechnologiques22,23,24. Les liposomes constituent un excellent système minimal pour comprendre les phénomènes cellulaires. Une liste non exhaustive de ces phénomènes comprend la dynamique du cytosquelette et les déformations membranaires qui en résultent 25,26, la régulation spatio-temporelle des condensats biomoléculaires 27,28 et leur interaction avec la membrane 29, l’encapsulation d’une grande variété de biomolécules, y compris les systèmes de transcription-traduction acellulaires 30, la synthèse lipidique acellulaire 31 et l’évolution des protéines 32,33,34. Les liposomes ont également été largement utilisés comme supports pour l’administration de médicaments et ont été approuvés par la Food and Drug Administration (FDA) et l’Agence européenne des médicaments (EMA) pour un usage clinique11. Les liposomes et les nanoparticules à base de lipides sont utilisés comme vecteurs pour l’administration de médicaments, y compris les vaccins à ARNm comme le récent vaccin COVID-1935.

Cette étude décrit un protocole détaillé sur la photolithographie, l’assemblage microfluidique et la fonctionnalisation de surface pour effectuer la technique OLA afin de générer des liposomes sur puce (Figure 1 et Figure 3). Les liposomes produits à l’aide d’OLA sont monodispersés (coefficient de variation: 4% -11% de la moyenne) et dans la gamme biologique de taille cellulaire (généralement entre 5-50 μm de diamètre), et ils peuvent être accordés en utilisant les vitesses d’écoulement appropriées des canaux aqueux interne et externe36. Par exemple, la population de liposomes illustrée à la figure 1 a une distribution granulométrique de 23,3 μm ± 1,8 μm (n = 50). Avec des taux de production typiques de 10-30 Hz, les liposomes formés sont unilamellaires, comme cela a été confirmé précédemment par l’insertion d’une seule protéine transmembranaire spécifique à la bicouche, l’alpha-hémolysine36, dans la membrane, ainsi qu’en utilisant le test de blanchiment du dithionate37. OLA est également compatible avec une grande variété de compositions lipidiques, offrant à l’utilisateur une flexibilité dans le choix des lipides. Il est important de noter que la composition lipidique initialement utilisée se reflète dans la composition finale du liposome38.

Étant donné qu’il s’agit d’une technologie relativement nouvelle, il est encore possible d’améliorer la LOL. Par exemple, la fonctionnalisation de surface à l’aide de PVA est cruciale mais fastidieuse à réaliser. Un moyen plus simple et plus simple de fonctionnaliser la surface de l’appareil réduirait considérablement le temps de fabrication de la puce ainsi que la variabilité d’une puce à l’autre. Le tensioactif pluronique F68 est un composant important dans la phase aqueuse externe pour stabiliser initialement les doubles émulsions; Néanmoins, son utilisation peut être restrictive dans certains cas. Le remplacement de Pluronic F68 par un tensioactif plus biocompatible ou l’élimination complète du tensioactif peut améliorer la polyvalence du système. Lors de la migration des doubles émulsions générées dans le canal de sortie, elles peuvent éclater en raison du cisaillement. La mise à niveau de la conception OLA pour améliorer la stabilité de la double émulsion et la séparation de la poche octanol pourrait donc augmenter le débit. Néanmoins, OLA présente plusieurs avantages, qui comprennent principalement l’encapsulation efficace, les liposomes monodispersés et unilamellaires et l’expérimentation contrôlée sur puce.

OLA a été utilisé et adapté dans un large éventail d’études, y compris la croissance et la division des liposomes39, l’étude du processus de séparation de la phase liquide-liquide27 et son interaction avec la membrane21, et la compréhension de la formation de bioproduits de croissance bactérienne dans les liposomes40. Des tests à haut débit à base d’OLA sont également utilisés pour comprendre le transport des ions à travers la membrane 41 et la perméabilité des médicaments à travers la bicouche lipidique37, comme système d’administration de médicaments à des fins thérapeutiques 42, pour étudier l’effet des antimicrobiens sur la membrane43 et comme outil pour encapsuler des cristaux liquides 44. Outre le large éventail d’applications de la technologie OLA, des versions modifiées d’OLA adaptées à des fins particulières sont en cours de développement 45,46,47,48,49,50. Dans l’ensemble, compte tenu des avantages et des inconvénients, nous croyons fermement que l’OLA est une plate-forme polyvalente pour la biologie synthétique.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Dolf Weijers, Vera Gorelova et Mark Roosjen pour avoir aimablement fourni YFP. S.D. reconnaît le soutien financier du Conseil néerlandais de la recherche (numéro de subvention: OCENW. KLEIN.465).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Octanol Sigma-Aldrich No. 297887
1.5 mL tubes Fisher scientific 10451043 Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes
ATP Sigma-Aldrich No. A2383
Biopsy punch Darwin microfluidics PT-T983-05 0.5 mm and 3 mm diameter
Citrate-base Sigma-Aldrich No. 71405
Dextran Sigma-Aldrich No. 31388 Mr~6,000
Direct-write optical lithography machine Durham Magneto Optics Ltd MicroWriter ML3 Baby setup and software
DOPC lipid Avanti SKU:850375C
F68 Sigma-Aldrich No. 24040032
Glass cover slip Corning #1, 24 x 40 mm
Glycerol Sigma-Aldrich No. G2025
Hydrochloric acid Thermo Scientific Acros No. 124630010
Liss Rhod PE lipid Avanti SKU:810150C
Parafilm Sigma-Aldrich No. P7793
Photoresist Micro resist technology GmbH EpoCore 10
Photoresist developer micro resist technology GmbH mr-Dev 600
Plasma cleaner Harrick plasma PDC-32G
Polydimethylsiloxane Dow Sylgard 184 PDMS and curing agent
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich No. P7890
Poly-L-lysine–FITC Labeled Sigma-Aldrich No. P3543
Polyvinyl alcohol Sigma-Aldrich no. P8136 molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed
Pressure controller Elveflow  OBK1 Mk3+ Flow controller
Scotch tape Magic Tape Invisible Matt Tape
Silicon wafer Silicon Materials 0620R16002
Spin coater  Laurell Technologies Corporation Model WS-650MZ-23NPP
Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers Darwin microfluidics PN-BEN-23G
Tris-base Sigma-Aldrich No. 252859
Tygon tubing Darwin microfluidics 1/16" OD x 0.02" ID
UV laser  365 nm wavelength

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Ce mois-ci dans JoVE numéro 193
Ensemble liposome assisté par octanol sur puce pour la bio-ingénierie
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Chen, C., Ganar, K. A., Deshpande,… More

Chen, C., Ganar, K. A., Deshpande, S. On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering. J. Vis. Exp. (193), e65032, doi:10.3791/65032 (2023).

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