Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

On-Chip oktanolassistert liposommontering for bioteknologi

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65032
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Laboratory of Physical Chemistry and Soft Matter, Wageningen University & Research
* These authors contributed equally

Summary

Den nåværende protokollen beskriver oktanolassistert liposommontering (OLA), en mikrofluidisk teknikk for å generere biokompatible liposomer. OLA produserer monodispergerte liposomer i mikronstørrelse med effektiv innkapsling, noe som muliggjør umiddelbar eksperimentering på brikken. Denne protokollen forventes å være spesielt egnet for syntetisk biologi og syntetisk celleforskning.

Abstract

Mikrofluidikk er et mye brukt verktøy for å generere dråper og vesikler av forskjellige slag på en kontrollert og høy gjennomstrømningsmåte. Liposomer er forenklede cellulære etterligninger sammensatt av et vandig interiør omgitt av et lipid-dobbeltlag; De er verdifulle i utformingen av syntetiske celler og forstå grunnleggende biologiske celler in vitro mote og er viktige for anvendt vitenskap, for eksempel lastlevering for terapeutiske applikasjoner. Denne artikkelen beskriver en detaljert arbeidsprotokoll for en on-chip mikrofluidisk teknikk, oktanolassistert liposommontering (OLA), for å produsere monodispergerte, mikronstore, biokompatible liposomer. OLA fungerer på samme måte som bobleblåsing, hvor en indre vandig (IA) fase og en omkringliggende lipidbærende 1-oktanolfase klemmes av av overflateaktive ytre væskestrømmer. Dette genererer lett dobbeltemulsjonsdråper med utstående oktanollommer. Når lipid-dobbeltlaget samles ved dråpegrensesnittet, løsner lommen spontant for å gi opphav til et unilamellært liposom som er klar for videre manipulering og eksperimentering. OLA gir flere fordeler, for eksempel jevn liposomgenerering (>10 Hz), effektiv innkapsling av biomaterialer og monodispergerte liposompopulasjoner, og krever svært små prøvevolumer (~ 50 μL), noe som kan være avgjørende når du arbeider med dyrebare biologiske. Studien inkluderer detaljer om mikrofabrikasjon, myklitografi og overflatepassivering, som er nødvendig for å etablere OLA-teknologi i laboratoriet. En proof-of-principle syntetisk biologi anvendelse er også vist ved å indusere dannelsen av biomolekylære kondensater inne i liposomene via transmembran protonfluks. Det forventes at denne medfølgende videoprotokollen vil gjøre det lettere for leserne å etablere og feilsøke OLA i laboratoriene sine.

Introduction

Alle celler har en plasmamembran som deres fysiske grense, og denne membranen er i hovedsak et stillas i form av et lipid-dobbeltlag dannet ved selvmontering av amfifile lipidmolekyler. Liposomer er de minimale syntetiske motstykkene til biologiske celler; De har et vandig lumen omgitt av fosfolipider, som danner et lipid-dobbeltlag med de hydrofile hodegruppene som vender mot den vandige fase og de hydrofobe haler begravet innover. Liposomenes stabilitet styres av den hydrofobe effekten, samt hydrofiliteten mellom polargruppene, van der Waals-kreftene mellom de hydrofobe karbonhalene og hydrogenbindingen mellom vannmolekyler og de hydrofile hodene 1,2. Avhengig av antall lipid-dobbeltlag kan liposomer klassifiseres i to hovedkategorier, nemlig unilamellære vesikler som består av et enkelt dobbeltlag og multilamellære vesikler konstruert fra flere dobbeltlag. Unilamellære vesikler klassifiseres videre basert på deres størrelser. Vanligvis sfæriske i form, kan de produseres i en rekke størrelser, inkludert små unilamellære vesikler (SUV, 30-100 nm diameter), store unilamellære vesikler (LUV, 100-1,000 nm diameter), og til slutt, gigantiske unilamellære vesikler (GUV, >1,000 nm diameter) 3,4. Ulike teknikker har blitt utviklet for å produsere liposomer, og disse kan kategoriseres bredt i bulkteknikker5 og mikrofluidiske teknikker6. Vanlige praktiserte bulkteknikker inkluderer lipidfilmrehydrering, elektroformasjon, invertert emulsjonsoverføring og ekstrudering 7,8,9,10. Disse teknikkene er relativt enkle og effektive, og disse er de viktigste årsakene til deres utbredt bruk i det syntetiske biologisamfunnet. Imidlertid lider de samtidig av store ulemper med hensyn til polydispersiteten i størrelse, mangelen på kontroll over lamellariteten og lav innkapslingseffektivitet 7,11. Teknikker som kontinuerlig dråpegrensesnittkryssende innkapsling (cDICE)12 og dråpeskyting og størrelsesfiltrering (DSSF)13 overvinner til en viss grad disse begrensningene.

Mikrofluidiske tilnærminger har blitt fremtredende i løpet av det siste tiåret. Mikrofluidisk teknologi gir et kontrollerbart miljø for å manipulere væskestrømmer innenfor brukerdefinerte mikrokanaler på grunn av den karakteristiske laminær strømning og diffusjonsdominert masseoverføring. De resulterende lab-on-a-chip-enhetene gir unike muligheter for spatiotemporal kontroll av molekyler, med betydelig reduserte prøvevolumer og multipleksingsevner14. Tallrike mikrofluidiske metoder for å lage liposomer har blitt utviklet, inkludert pulserende jetting 15, dobbel emulsjon templating 16, forbigående membranutstøting 17, dråpeemulsjonsoverføring18 og hydrodynamisk fokusering 19. Disse teknikkene produserer monodispergerte, unilamellar, liposomer i cellestørrelse med høy innkapslingseffektivitet og høy gjennomstrømning.

Denne artikkelen beskriver prosedyren for oktanolassistert liposommontering (OLA), en mikrofluidisk metode på brikken basert på den hydrodynamiske klemmemekanismen og påfølgende løsningsmiddelavfuktingsmekanisme20 (figur 1). Man kan relatere arbeidet med OLA til en bobleblåsingsprosess. Et seksveis kryss fokuserer den indre vandige (IA) fasen, to lipidbærende organiske (LO) strømmer og to overflateaktivt middelholdige ytre vandige (OA) strømmer på et enkelt sted. Dette resulterer i vann-i-(lipider + oktanol)-i-vann doble emulsjonsdråper. Når disse dråpene strømmer nedstrøms, fører grenseflateenergiminimering, ekstern skjærstrøm og interaksjon med kanalveggene til dannelsen av et lipiddobbeltlag ved grensesnittet når løsningsmiddellommen løsner og danner dermed unilamellære liposomer. Avhengig av størrelsen på oktanollommen, kan dewetting-prosessen ta titalls sekunder til et par minutter. På slutten av utgangskanalen flyter de mindre tette oktanoldråpene til overflaten, mens de tyngre liposomene (på grunn av en tettere innkapslet løsning) synker til bunnen av visualiseringskammeret klar for eksperimentering. Som et representativt eksperiment demonstreres prosessen med væske-væskefaseseparasjon (LLPS) inne i liposomer. For det er de nødvendige komponentene innkapslet i liposomer ved en sur pH som forhindrer LLPS. Ved eksternt å utløse en pH-endring og dermed en transmembran protonfluks, dannes faseseparerte kondensatdråper inne i liposomene. Dette fremhever de effektive innkapslings- og manipuleringsfunksjonene til OLA-systemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av masterwaferen

  1. Ta en 4 tommer (10 cm) diameter ren silisiumskive (se materialfortegnelse). Rengjør den ytterligere med trykkluft for å fjerne støvpartikler.
  2. Monter skiven på en rotasjonsfrakk, og dispenser forsiktig ~ 5 ml av en negativ fotoresist (se materialfortegnelse) i midten av skiven. Prøv å unngå luftbobler, da de kan forstyrre nedstrøms utskriftsprosessen til skiven.
  3. For å oppnå et 10 μm tykt fotoresistlag, spinnbelegg waferen ved 500 o / min i 30 s med en akselerasjon på 100 o / s for første spredning, etterfulgt av et 60 s spinn ved 3,000 o / min med en akselerasjon på 500 o / s. Hvis du ønsker en annen tykkelse, må du endre spinnparametrene i henhold til produsentens instruksjoner.
  4. Stek platen på en varmeplate i 2 min ved 65 °C og deretter i 5 min ved 95 °C.
  5. Når skiven er avkjølt, monterer du skiven i trykkkammeret til den optiske litografimaskinen med direkte skriving (se Materialfortegnelse) og mater OLA-designet (figur 2A, tilleggskodingsfil 1) inn i programvaren.
    MERK: OLA-designet består i hovedsak av to OA-kanaler, to LO-kanaler og en IA-kanal, som fusjonerer for å danne et seksveiskryss som fortsetter som en etterproduksjonskanal og ender opp i eksperimentell brønn (EW).
  6. Skriv ut OLA-designen(e) på den belagte platen ved hjelp av en UV-laser (se materialfortegnelsen) med en dose på 300 mJ/cm2.
  7. Når designet er trykt, stek platen ved 65 °C i 1 min, etterfulgt av 95 °C i 3 minutter.
  8. På dette tidspunktet må du kontrollere at omrisset av den trykte enheten vises på waferen og er synlig for det blotte øye. For å vaske av den uherdede fotoresisten, dypp platen i et glassbeger som inneholder utviklerløsningen (se materialfortegnelsen) til den uherdede fotoresisten er helt fjernet.
    MERK: Overflødig utviklerbehandling kan påvirke designoppløsningen.
  9. Vask waferen med aceton, isopropanol og avionisert (DI) vann i rekkefølge, og til slutt, med trykkluft / N2 ved hjelp av en blåspistol.
  10. Stek skiven hardt ved 150 °C i 30 minutter for å sikre at det trykte designet er godt festet til waferoverflaten og ikke løsner i nedstrøms fabrikasjonsprosessen. Masterskiven er deretter klar til videre bruk (figur 2B).

2. Klargjøre den mikrofluidiske enheten

  1. Plasser hovedskiven på et firkantet stykke aluminium, og pakk aluminiumsfolien rundt platen, slik at du danner en vellignende struktur (figur 2C).
  2. Mål 40 g polydimetylsiloksan (PDMS) og 4 g herdemiddel (10:1, vektforhold, se materialfortegnelse) i et 50 ml sentrifugerør, og bland kraftig med en slikkepott eller pipettespiss i 2-3 minutter.
  3. Den kraftige blandingen av PDMS og herdemiddel fanger luftbobler inne i blandingen. Spinn røret på 100 x g i 2-3 minutter for å fjerne de fleste store luftbobler.
  4. Hell ca. 15-20 g av blandingen fremstilt i trinn 2.3 over hovedskiven, og avgass med en tørkemaskin. Lagre overflødig blanding for å lage PDMS-belagte glassglass (trinn 3).
  5. Inkuber monteringen i en ovn ved 70 °C i minst 2 timer.
  6. Ta hovedskiven ut av ovnen og la den avkjøles. For å fjerne den størknede PDMS-blokken, fjern aluminiumsfolien og fjern forsiktig PDMS-blokken fra kanten av platen.
    MERK: Platen er skjør og kan gå i stykker, så det er viktig å gjøre denne prosessen nøye.
  7. Når PDMS-blokken er fjernet, hold den mønstrede strukturen vendt oppover, og bruk et skarpt blad eller en skalpell, kutt individuelle PDMS-blokker, som hver inneholder en enkelt mikrofluidisk enhet.
  8. Plasser PDMS-blokken på en mørk overflate, og juster lysretningen (en bordlampe er nyttig for dette) slik at de graverte kanalene er skinnende og som et resultat synlige. Lag hull i innløpene og utgangskanalen ved hjelp av biopsistanser på henholdsvis 0,5 mm og 3 mm diameter (se materialtabell).
    MERK: Bruk et skarpt biopsislag for å unngå sprekker i PDMS, noe som kan forårsake lekkasje senere. Skyv forsiktig biopsi-stansen gjennom PDMS-blokken, og sørg for at den passerer helt gjennom den. For å fjerne biopsistansen, trekk den forsiktig tilbake mens du roterer den i alternative retninger. PDMS-blokken med det graverte OLA-designet er nå klar til å bindes til et PDMS-belagt glassglass.

3. Gjør det PDMS-belagte glassglasset

  1. Ta et gjennomsiktig glassdeksel, hell ca. 0,5 ml PDMS (tilberedt i overskudd i trinn 2.4) på midten av glassglasset, og spred det over dekselet ved å vippe glassglasset forsiktig, og sikre total dekning av glassglasset med PDMS.
  2. Monter glassglasset på rotasjonsbelegget, sørg for at det er sentralt plassert (slik at midten av lysbildet overlapper midten av trykkakselen), og spinn glasslysbildet ved 500 o / min i 15 s (i trinn på 100 o / s) og deretter ved 1000 o / min i 30 s (i trinn på 500 o / s).
  3. Plasser den PDMS-belagte glasssklien (belagt side vendt oppover) på en hevet plattform som en blokk med PDMS (1 cm x 1 cm) i en dekket petriskål, og stek den ved 70 °C i 2 timer.

4. Liming av mikrofluidisk enhet

  1. Rengjør PDMS-blokken (klargjort i trinn 2) ved å feste og fjerne kommersielt tilgjengelig skotsk tape (se materialfortegnelse) to ganger. Sørg for å holde den rengjorte siden vendt opp til bruk.
  2. Rengjør den PDMS-belagte glasssliden med trykkluft / N2 med en blåspistol, og hold den rene siden vendt oppover.
  3. Plasser PDMS-blokken (graverte kanaler vendt oppover) og det PDMS-belagte glassglassglasset (belagt side vendt opp) i vakuumkammeret til plasmarenseren (se materialfortegnelsen).
  4. Slå på vakuumet, og utsett innholdet for luftplasma med en radiofrekvens på 12 MHz (RF-modus høy) i 15 s for å aktivere overflatene. Oksygenplasma kan ses i form av en rosa nyanse.
  5. Umiddelbart etter plasmabehandlingen, plasser det PDMS-belagte glassglasset på en ren overflate med PDMS-siden vendt oppover. Plasser forsiktig PDMS-blokken med det mikrofluidiske mønsteret som nå vender mot det PDMS-belagte glassglasset, slik at de kan binde seg (figur 2D).
    MERK: Fjerning av luften fanget i enheten er avgjørende for å sikre grundig liming.
  6. Stek de limte enhetene ved 70 °C i 2 timer.

5. Overflatefunksjonalisering av den mikrofluidiske enheten

MERK: Før overflatefunksjonalisering er det viktig å kalibrere trykkpumpen i henhold til produsentens protokoll (se materialtabell) og montere slangen for å koble den til mikrofluidenheten.

  1. Koble den mikrofluidiske enheten til trykkpumpene
    1. Koble den trykkdrevne strømningsregulatoren til en ekstern trykkkilde (opptil 6 bar). Minst fire uavhengige lufttrykkkanaler kreves: tre individuelle moduler på 0-2 bar og en modul på -0,9-4 bar.
    2. Kalibrer trykkpumpen i henhold til produsentens protokoll (se materialfortegnelse).
    3. Klipp slangen (1/16 i OD x 0,02 i ID) i fire like store stykker som er ca. 20 cm lange.
    4. Sett inn 23 G 90° bøyde koblinger i rustfritt stål (se materialfortegnelse) i den ene enden av hvert stykke. Denne enden settes senere inn i de tre innløpene (OA, LO og IA) til den mikrofluidiske enheten, og den fjerde brukes til å fjerne overflødig løsning (trinn 5.2.5).
    5. Sett den andre enden av slangen inn i det mikrofluidiske reservoarstativet, og forsegl det ved hjelp av mikrofluidiske beslag, slik at slangen er lang nok til å berøre bunnen av reservoaret (1,5 ml rør, se materialfortegnelse). Dette forhindrer at uønskede luftbobler kommer inn i det mikrofluidiske apparatet under PVA-behandlingen/liposomproduksjonen.
  2. PVA-behandling av utgangskanalen
    MERK: Før liposomgenerering er det avgjørende å gjøre enheten delvis hydrofil nedstrøms for produksjonskrysset. Dette gjøres ved å behandle disse kanalene med 5% (w / v) polyvinylalkohol (PVA) løsning. PVA-oppløsningen fremstilles ved å løse opp PVA-pulveret (se materialfortegnelse) i vann ved 80 °C i 3 timer under konstant omrøring ved hjelp av en magnetomrører. Filtrer oppløsningen før du bruker den til overflatebehandling. Umiddelbart etter binding av enheten er de mikrofluidiske kanalene hydrofile på grunn av plasmaindusert overflateaktivering, og de vil gradvis bli hydrofobe igjen. Det anbefales å vente i 2 timer etter bakingen (trinn 4.6) før du starter PVA-behandlingen.
    1. Dispenser 200 mikrol 5 % w/v PVA-oppløsning i et 1,5 ml rør, og koble det til reservoarstativet for mikrofluid. Sett inn slangen (den som er nevnt i trinn 5.1.3) slik at den ene enden er nedsenket i PVA-oppløsningen og den andre enden er koblet til innløpet til OA-kanalen til den mikrofluidiske enheten.
      MERK: En lavere PVA-konsentrasjon kan føre til substandard overflatefunksjonalisering.
    2. Gjenta trinnet ovenfor uten PVA (tomt 1,5 ml rør), og koble det til LO- og IA-kanalene.
    3. Øk trykket i OA-fasen til 100 mbar for å strømme PVA-løsningen i OA-kanalene. Øk trykket i IA- og LO-fasene til 120 mbar for å forhindre tilbakestrømning av PVA-oppløsning inne i disse kanalene (figur 2E).
      MERK: Juster om nødvendig trykket på de enkelte kanalene for å holde menisken stabil ved produksjonskrysset.
    4. Flyt PVA-løsningen på denne måten i ca. 5 minutter, og sørg for fullstendig funksjonalisering av utgangskanalen.
    5. For å fjerne PVA-oppløsningen, løsne slangen fra OA-inntaket og øk trykket i LO- og IA-kanalene umiddelbart til 2 bar. Bruk samtidig et slange koblet til en undertrykkskanal (-900 mbar) fjern overflødig PVA først fra utgangskanalen og deretter fra OA-innløpet (figur 2F).
    6. Stek apparatet ved 120 °C i 15 minutter, og la det avkjøles før bruk. Enheten kan oppbevares under omgivelsesforhold i minst 1 måned.
      MERK: Det anbefales å vente i 1 dag (ved romtemperatur) før du fortsetter med OLA for å sikre at den ubehandlede PDMS gjenvinner sin hydrofobicitet etter plasmabehandlingen.

6. Oktanolassistert liposommontering (OLA)

  1. Klargjøring av lipidbestanden
    MERK: Her brukes en blanding av 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC) og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-(lissamin rhodamine B sulfonyl) (Liss Rhod PE) lipider (se materialfortegnelse) som et eksempel; Brukere bør forberede lipidsammensetningen de trenger på lignende måte.
    1. Dispenser 76 mikrol DOPC (25 mg/ml) og 16,6 mikrol Liss Rhod PE (1 mg/ml) i en rundbunnskolbe med separate glasssprøyter.
    2. Hold den rundbunnede kolben stående, og bruk en komprimert N2 blåspistol for å gi en mild strøm av nitrogen for å fordampe kloroformen og danne en tørket lipidfilm i bunnen av kolben.
    3. Plasser kolben i tørketrommelen i minst 2 timer under et kontinuerlig vakuum for å fjerne gjenværende kloroform.
    4. Tilsett 100 μL etanol i rundbunnskolben, etterfulgt av forsiktig pipettering eller risting for å sikre at lipidene oppløses for å danne en 10% (w / v) lipidlager.
      MERK: Hvis en bestemt lipidsammensetning ikke er fullstendig løselig i etanol, bruk en etanol / kloroformblanding, og hold volumet av kloroform så lite som mulig.
    5. Pipett oppløsningen inn i et hetteglass av mørkt glass. Skyll hetteglasset forsiktig med nitrogen med en blåsekanon for å erstatte luften med en inert atmosfære. Forsegl lokket med parafinfilm, og oppbevar ved -20 °C.
      MERK: Lagerløsningen kan brukes i opptil noen måneder. Hver gang hetteglasset åpnes, erstatt luften forsiktig med nitrogen og forsegl med lokket med parafinfilm.
  2. Klargjøring av OLA-løsningene
    1. Lag lagerløsninger av de uunnværlige komponentene: 20 mM dextran (Mw 6000); 60% (v / v) glyserol; en buffer av valg. I dette tilfellet ble det fremstilt 5x fosfatbufret saltvann (0,68 M NaCl, 13,5 mM KCl, 50 mM Na 2 HPO 4, 9mM KH2PO 4; pH 7,4) (se materialfortegnelse).
      MERK: Siden ren glyserol er svært tyktflytende, anbefales det å kutte ut et lite stykke på enden av pipettespissen på en skrå måte for effektiv pipettering.
    2. Forbered 100 μL IA-, OA- og utgangsløsning (ES, ønsket løsning for å fylle EW) -prøvene. For enkel visualisering ble gult fluorescerende protein (YFP) tilsatt IA-løsningen i dette tilfellet. Kontroller den osmotiske balansen mellom IA og OA ved å beregne osmolariteten til de innkapslede komponentene og tilsette en passende mengde sukker eller salt i OA om nødvendig. Dette gjøres for å forhindre sprengning eller krymping av liposomene under produksjonen.
      MERK: De endelige komposisjonene i de tre fasene er som følger:
      IA: 15% glyserol, 5 mM dextran (Mw 6,000), 5,4 μM YFP, 1x PBS
      OA: 15% glyserol, 5% F68 overflateaktivt middel, 1x PBS
      ES: 15% glyserol, 1x PBS
      En lavere konsentrasjon av F68 overflateaktivt middel påvirker negativt genereringen av doble emulsjoner.
    3. Forbered 80 μL av LO-fasen ved å pipetere 4 μL stamlipid til 76 μL 1-oktanol (se materialfortegnelse). Den endelige konsentrasjonen av DOPC er 5 mg / ml.
    4. Sentrifuge prøvene ved 700 x g i 60 s for å fjerne eventuelle store aggregater før du fortsetter med mikrofluidiske eksperimenter. Dette forhindrer at åpenbare tilstoppingsfaktorer kommer inn i mikrofluidbrikken.
  3. Liposomproduksjon
    1. Dispenser løsningene (IA, LO, OA) i tre 1,5 ml rør, sett dem sammen (som nevnt i trinn 5.1), og koble dem til den PVA-behandlede mikrofluidbrikken (trinn 5.2.6).
    2. Påfør et positivt trykk på de tre kanalene: ~ 100 mbar på IA- og LO-kanalene og ~ 200 mbar på OA-kanalen.
      MERK: Siden OA-trykket er høyere enn de andre, vil OA-løsningen være den første som kommer til EW; Dette anbefales på det sterkeste.
    3. Når OA-løsningen når EW, senk OA-trykket til 100 mbar og øk LO til 200 mbar.  LO-løsningen som ankommer produksjonskrysset vil sannsynligvis føre til luftbobler på grunn av luft som forskyves fra LO-kanalene. Når luftboblene er sluppet inn i EW, justeres LO-trykket til 100 mbar. Til slutt, øk IA-trykket til 200 mbar, og vent til all luften i IA-kanalen er fjernet. Den ideelle ankomstsekvensen til krysset mellom de tre fasene er altså OA, LO og IA.
    4. Etter å ha fjernet luften fra de tre kanalene, juster alle kanaltrykkene til 50 mbar og pipett 10 μL ES inn i utgangskammeret. Etter pipettering av ES, sett et deksel på utgangshullet for å unngå fordampning. I tilfelle LO skyves tilbake, øk LO-trykket gradvis i trinn på 1 mbar til det begynner å strømme til krysset.
    5. Når alle tre fasene begynner å strømme sammen i krysset, må du sørge for at dobbel emulsjonsproduksjon begynner, og justeres i henhold til kvaliteten (figur 3A-C). Endre trykket gradvis (trinn på 0,1-1 mbar) i stedet for brått med mindre trykket endres for å eliminere en uønsket tette i kanalen.
      MERK: Kanalene som skal justeres, avhenger av hva som skjer i krysset. For eksempel må IA reduseres hvis emulsjonene er for store; OA må økes hvis doble emulsjoner dannes, men sprekker i stedet for å bli klemt av; og LO må reduseres hvis oktanollommen er for stor.
    6. Kontroller at dobbeltemulsjonsdråpene strømmer nedstrøms til EW. Når de flyter, blir oktanollommer mer og mer fremtredende og blir til slutt klemt av, og danner liposomer (figur 3D-F). Forsikre deg om at etterproduksjonskanalen er lang nok, og at migrasjonen av de doble emulsjonene er langsom nok til dewetting.
      MERK: I løpet av minutter etter anstendig produksjon vil liposomer og oktanoldråper forlate etterproduksjonskanalen og gå inn i EW. Som et resultat, er mindre tett enn vann, flyter oktanoldråpene til overflaten av ES. På grunn av tilsetningen av dextran i IA er liposomene tyngre enn omgivelsene og går til bunnen av kammeret klar for observasjon og videre manipulasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne studien demonstrerer dannelsen av membranløse kondensater via prosessen med væske-væskefaseseparasjon (LLPS) inne i liposomer som et representativt eksperiment.

Prøve forberedelse
IA, OA, ES og fôrløsning (FS) fremstilles som følger:

IA: 12 % glyserol, 5 mM dekstran, 150 mM KCl, 5 mg/ml poly-L-lysin (PLL), 0,05 mg/ml poly-L-lysin-FITC-merket (PLL-FITC), 8 mM adenosintrifosfat (ATP), 15 mM citrat-HCl (pH 4)

OA: 12 % v/v glyserol, 5 % w/v F68, 150 mM KCl, 15 mM citrat-HCl (pH 4)

ES: 12% glyserol, 150 mM KCl, 15 mM citrat-HCl (pH 4)

FS: 12% glyserol, 150 mM KCl, 75 mM Tris-HCl (pH 9)

Kondensatdannelse inne i liposomer
En enkel analyse av pH-sensitiv kompleks koaservasjon av positivt ladet poly-L-lysin (PLL) og negativt ladet multivalent adenosintrifosfat (ATP) ble valgt for å demonstrere fenomenene LLPS i liposomer. For å forhindre faseseparasjon av polylysin og ATP under innkapsling ble pH i løsningen opprettholdt ved 4, hvor ATP er nøytral. Å øke pH i ES ved å legge til FS (en buffer på pH 9) økte til slutt pH inne i liposomene på grunn av transmembran protonfluks, noe som gjorde ATP negativt ladet og utløste faseseparasjonen med positivt ladet PLL21 (figur 4A). Etter ca. 2 timers liposomgenerering ble IA- og LO-trykket slått av. OA-kanaltrykket ble holdt på 100 mbar for å strømme de gjenværende liposomene langsomt inn i observasjonskammeret. Når alle liposomene i kanalen ble gjenvunnet i EW, ble trykket slått av for å stoppe strømmen og forhindre liposomene i å bevege seg. Liposomene generert ved en lavere pH viste en homogen fluorescens (fra den innkapslede fluorescerende PLL-FITC) i lumen (figur 4B,D). Oktanoldråper som flyter på overflaten ble fjernet ved forsiktig å pipetere ut 5 mikrol oppløsning fra toppen for å forhindre at de påvirker ytterligere pipetteringstrinn. Deretter ble 10 μL FS-buffer tilsatt til EW, som induserte faseseparasjon av den innkapslede PLL og ATP. Den homogene FITC-fluorescensen fra hvert liposom ble gradvis omdannet til distinkte fluorescerende kondensatdråper. Til slutt fusjonerte de enkelte dråpene til en større kondensatdråpe som fritt diffunderte i liposomene (figur 4C, E-G).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av montering og arbeid av OLA. Trykkregulatoren er koblet til reservoarene som inneholder ytre vandige, lipid-i-oktanol og indre vandige løsninger. Rørene som settes inn i reservoarene er koblet til de respektive innløpene til OLA-enheten. Passende strømmer i de tre kanalene fører til dannelsen av vann-i-(lipid-i-oktanol)-i-vann doble emulsjoner. De dannede doble emulsjonene migrerer til utgangsbrønnen, hvor oktanollommene løsner for å danne liposomer. De dannede liposomene samles på bunnen av brønnen for visualisering og videre eksperimentering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Klargjøring av OLA-brikken (fotolitografi, mikrofabrikasjon, overflatebehandling). (A) Digital design som viser nøkkelfunksjonene i OLA-designet, inkludert tre innløp, et uttak og en seksveis produksjonskobling. (B) Et skjema over masterskiven som viser flere OLA-design produsert ved hjelp av UV-litografi. (C) En PDMS-elastomer støpt på hovedskiven, plassert i en brønn laget av aluminiumsfolie, og herdet ved baking ved 70 ° C i 2 timer. (D) En mikrofluidisk enhet bundet ved hjelp av oksygenplasmabehandling, hvor PDMS-blokken som inneholder OLA-designet, er festet til et PDMS-belagt glassglass. (E) Overflatefunksjonalisering av den fabrikkerte brikken for å gjøre enheten delvis hydrofil. Dette gjøres ved å strømme 5% w / v PVA i 5 min fra den ytre vandige kanalen mot utgangskanalen. Positivt lufttrykk i de andre kanalene hindrer PVA-løsningen i å komme inn i disse kanalene. (F) PVA fjernes ved å påføre et vakuum i utgangskanalen. Apparatet stekes ved 120 °C i 15 minutter og er deretter klart til bruk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Demonstrasjon av OLA som effektivt produserer monodispergerte dobbeltemulsjoner og til slutt liposomer med utmerket innkapsling. (A) Et bilde med et lysfelt som viser rask generering av dobbeltemulsjonsdråper. (B) Den fluorescerende lipidkanalen viser dannelsen av en oktanollomme på grunn av delvis dewetting. Lipid-i-oktanolfasen inneholdt en blanding av DOPC (5 mg / ml) og Lis Rhod PE i forholdet 1000: 1. (C) Den indre vandige kanalen som viser innkapsling av gult fluorescerende protein (YFP). Innsatsene i (A-C) viser representative innzoomede visninger av de respektive panelene (skalastolper = 10 μm). (VG Nett) Dewetting av oktanollommen i utgangskanalen, som danner et liposom. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: pH-utløst væske-væskefaseseparasjon av pLL/ATP i liposomer. (A) Skjematisk fremstilling av den pH-avhengige overgangen av den homogene løsningen av pLL og ATP innkapslet i liposomet (venstre) til faseseparerte pLL / ATP-koacervater (høyre). Det første sure miljøet i liposomet gjør den molekylære ladningen av ATP til å være nøytral, og hemmer koacervasjon. Når pH inne i liposomene likevekter med den eksternt påførte pH-økningen, får ATP en negativ ladning som utløser koacervasjon. (B-C) Linjediagrammer (tilsvarer de stiplede linjene i henholdsvis panelene [D] og [G]) som viser den romlige fordelingen av pLL (grønn kanal) og membranen (rød kanal). (VG Nett) Time-lapse-bilder som viser dannelsen av pLL/ATP-koaservater i liposomene. Den eksterne tilsetningen av en basisk buffer øker pH-nivået inne i liposomene i løpet av minutter og initierer koacervasjon. t = 0 min refererer til tiden like før forekomsten av den første koacervasjonshendelsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende kodefil 1: CAD-fil for OLA-designet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cellulær kompleksitet gjør det ekstremt vanskelig å forstå levende celler når de studeres som en helhet. Å redusere redundans og sammenkobling av celler ved å rekonstituere nøkkelkomponentene in vitro er nødvendig for å fremme vår forståelse av biologiske systemer og skape kunstige cellulære etterligninger for bioteknologiske applikasjoner22,23,24. Liposomer fungerer som et utmerket minimalt system for å forstå cellulære fenomener. En ikke-uttømmende liste over disse fenomenene inkluderer cytoskjelettdynamikk og resulterende membrandeformasjoner 25,26, spatiotemporal regulering av biomolekylære kondensater 27,28 og deres interaksjon med membranen 29, innkapsling av et bredt utvalg av biomolekyler, inkludert cellefrie transkripsjonsoversettelsessystemer 30, cellefri lipidsyntese 31 og evolusjon av proteiner 32,33,34. Liposomer har også blitt mye brukt som bærere for legemiddellevering og har blitt godkjent av Food and Drug Administration (FDA) og European Medicines Agency (EMA) for klinisk bruk11. Liposomer og lipidbaserte nanopartikler brukes som bærere for legemiddellevering, inkludert mRNA-vaksiner som den nylige COVID-19-vaksinen35.

Denne studien beskriver en detaljert protokoll for fotolitografi, mikrofluidisk montering og overflatefunksjonalisering for å utføre OLA-teknikken for å generere limosomer på brikken (figur 1 og figur 3). Liposomene produsert ved hjelp av OLA er monodispererte (variasjonskoeffisient: 4% -11% av gjennomsnittet) og i det biologiske cellestørrelsesområdet (vanligvis mellom 5-50 μm i diameter), og de kan justeres ved hjelp av passende strømningshastigheter for de indre og ytre vandige kanalene36. For eksempel har liposompopulasjonen sett i figur 1 en størrelsesfordeling på 23,3 μm ± 1,8 μm (n = 50). Med typiske produksjonshastigheter på 10-30 Hz er de dannede liposomene unilamellar, som tidligere ble bekreftet ved å sette inn et enkelt dobbeltlagsspesifikt transmembranprotein, alfa-hemolysin36, i membranen, samt ved å bruke dithionat-blekingsanalysen37. OLA er også kompatibel med et bredt utvalg av lipidsammensetninger, noe som gir brukeren fleksibilitet i valg av lipider. Det er viktig at den opprinnelig brukte lipidsammensetningen reflekteres i den endelige liposomsammensetningen38.

Å være en relativt ny teknologi, er det ytterligere rom for å forbedre OLA. For eksempel er overflatefunksjonalisering ved hjelp av PVA avgjørende, men kjedelig å utføre. En enklere og enklere måte å overflatefunksjonalisere enheten på, vil redusere chipfabrikasjonstiden betydelig, så vel som chip-til-chip-variabilitet. Pluronic F68 overflateaktivt middel er en viktig komponent i den ytre vandige fase for først å stabilisere de doble emulsjoner; Likevel kan bruken være restriktiv i visse tilfeller. Å erstatte Pluronic F68 med et mer biokompatibelt surfaktant eller fullstendig fjerning av surfaktanter kan forbedre allsidigheten til systemet. Under migreringen av genererte doble emulsjoner i utgangskanalen kan de sprekke på grunn av skjær. Oppgradering av OLA-designet for å forbedre dobbeltemulsjonsstabiliteten og oktanollommeseparasjonen kan dermed øke gjennomstrømningen. Ikke desto mindre har OLA flere fordeler, som hovedsakelig inkluderer effektiv innkapsling, monodispergerte og unilamellære liposomer, og kontrollert eksperimentering på brikken.

OLA har blitt brukt og tilpasset i et mangfoldig utvalg av studier, inkludert vekst og deling av liposomer39, studere prosessen med væske-væskefaseseparasjon27 og dens interaksjon med membranen21, og forstå bakteriell vekst bioproduktdannelse i liposomer40. OLA-baserte høykapasitetsanalyser blir også brukt til å forstå ionetransport over membranen 41 og legemiddelpermeabilitet over lipid-dobbeltlaget37, som et legemiddelleveringssystem for terapeutiske formål42, for å studere effekten av antimikrobielle stoffer på membran 43, og som et verktøy for å innkapsle flytende krystaller 44. I tillegg til det brede spekteret av applikasjoner av OLA-teknologi, utvikles modifiserte versjoner av OLA egnet for spesielle formål 45,46,47,48,49,50. Samlet sett, med tanke på fordeler og ulemper, har vi stor tro på at OLA er en allsidig plattform for syntetisk biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi ønsker å anerkjenne Dolf Weijers, Vera Gorelova og Roosjen for vennlig å gi oss YFP. SD anerkjenner økonomisk støtte fra det nederlandske forskningsrådet (tilskuddsnummer: OCENW. KLEIN.465).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Octanol Sigma-Aldrich No. 297887
1.5 mL tubes Fisher scientific 10451043 Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes
ATP Sigma-Aldrich No. A2383
Biopsy punch Darwin microfluidics PT-T983-05 0.5 mm and 3 mm diameter
Citrate-base Sigma-Aldrich No. 71405
Dextran Sigma-Aldrich No. 31388 Mr~6,000
Direct-write optical lithography machine Durham Magneto Optics Ltd MicroWriter ML3 Baby setup and software
DOPC lipid Avanti SKU:850375C
F68 Sigma-Aldrich No. 24040032
Glass cover slip Corning #1, 24 x 40 mm
Glycerol Sigma-Aldrich No. G2025
Hydrochloric acid Thermo Scientific Acros No. 124630010
Liss Rhod PE lipid Avanti SKU:810150C
Parafilm Sigma-Aldrich No. P7793
Photoresist Micro resist technology GmbH EpoCore 10
Photoresist developer micro resist technology GmbH mr-Dev 600
Plasma cleaner Harrick plasma PDC-32G
Polydimethylsiloxane Dow Sylgard 184 PDMS and curing agent
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich No. P7890
Poly-L-lysine–FITC Labeled Sigma-Aldrich No. P3543
Polyvinyl alcohol Sigma-Aldrich no. P8136 molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed
Pressure controller Elveflow  OBK1 Mk3+ Flow controller
Scotch tape Magic Tape Invisible Matt Tape
Silicon wafer Silicon Materials 0620R16002
Spin coater  Laurell Technologies Corporation Model WS-650MZ-23NPP
Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers Darwin microfluidics PN-BEN-23G
Tris-base Sigma-Aldrich No. 252859
Tygon tubing Darwin microfluidics 1/16" OD x 0.02" ID
UV laser  365 nm wavelength

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frezard, F. Liposomes: From biophysics to the design of peptide vaccines. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 32 (2), 181-189 (1999).
  2. Monteiro, N., Martins, A., Reis, R. L., Neves, N. M. Liposomes in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of the Royal Society Interface. 11 (101), 20140459 (2014).
  3. Mishra, H., Chauhan, V., Kumar, K., Teotia, D. A comprehensive review on liposomes: A novel drug delivery system. Journal of Drug Delivery and Therapeutics. 8 (6), 400-404 (2018).
  4. Liu, W., et al. Research progress on liposomes: Application in food, digestion behavior and absorption mechanism. Trends in Food Science & Technology. 104, 177-189 (2020).
  5. Kamiya, K., Takeuchi, S. Giant liposome formation toward the synthesis of well-defined artificial cells. Journal of Materials Chemistry B. 5 (30), 5911-5923 (2017).
  6. van Swaay, D., DeMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on a Chip. 13 (5), 752-767 (2013).
  7. Lombardo, D., Kiselev, M. A. Methods of liposomes preparation: Formation and control factors of versatile nanocarriers for biomedical and nanomedicine application. Pharmaceutics. 14 (3), 543 (2022).
  8. Zhang, H. Thin-film hydration followed by extrusion method for liposome preparation. Liposomes: Methods and Protocols. D’Souza, G. G. M. , Humana. New York, NY. 17-22 (2017).
  9. Filipczak, N., Pan, J., Yalamarty, S. S. K., Torchilin, V. P. Recent advancements in liposome technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 156, 4-22 (2020).
  10. Has, C., Sunthar, P. A comprehensive review on recent preparation techniques of liposomes. Journal of Liposome Research. 30 (4), 336-365 (2020).
  11. Large, D. E., Abdelmessih, R. G., Fink, E. A., Auguste, D. T. Liposome composition in drug delivery design, synthesis, characterization, and clinical application. Advanced Drug Delivery Reviews. 176, 113851 (2021).
  12. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  13. Morita, M., et al. Droplet-shooting and size-filtration (DSSF) method for synthesis of cell-sized liposomes with controlled lipid compositions. ChemBioChem. 16 (14), 2029-2035 (2015).
  14. Convery, N., Gadegaard, N. 30 years of microfluidics. Micro and Nano Engineering. 2, 76-91 (2019).
  15. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  16. Chu, L. Y., Utada, A. S., Shah, R. K., Kim, J. W., Weitz, D. A. Controllable monodisperse multiple emulsions. Angewandte Chemie. 119 (47), 9128-9132 (2007).
  17. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  18. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  19. Carugo, D., Bottaro, E., Owen, J., Stride, E., Nastruzzi, C. Liposome production by microfluidics: Potential and limiting factors. Scientific Reports. 6, 25876 (2016).
  20. Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
  21. Last, M. G., Deshpande, S., Dekker, C. pH-controlled coacervate-membrane interactions within liposomes. ACS Nano. 14 (4), 4487-4498 (2020).
  22. Jia, H., Schwille, P. Bottom-up synthetic biology: reconstitution in space and time. Current Opinion in Biotechnology. 60, 179-187 (2019).
  23. Ganar, K. A., Leijten, L., Deshpande, S. Actinosomes: Condensate-Templated Containers for Engineering Synthetic Cells. ACE Synthetic Biology. 11 (8), 2869-2879 (2022).
  24. Gaut, N. T., Adamala, K. P. Reconstituting Natural Cell Elements in Synthetic Cells. Advanced Biology. 5 (3), 2000188 (2021).
  25. Ganar, K. A., Honaker, L. W., Deshpande, S. Shaping synthetic cells through cytoskeleton-condensate-membrane interactions. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 54, 101459 (2021).
  26. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  27. Deshpande, S., et al. Spatiotemporal control of coacervate formation within liposomes. Nature Communications. 10, 1800 (2019).
  28. Love, C., et al. Reversible pH-responsive coacervate formation in lipid vesicles activates dormant enzymatic reactions. Angewandte Chemie. 132 (15), 6006-6013 (2020).
  29. Lu, T., et al. Endocytosis of coacervates into liposomes. Journal of the American Chemical Society. 144 (30), 13451-13455 (2022).
  30. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  31. Blanken, D., Foschepoth, D., Serrão, A. C., Danelon, C. Genetically controlled membrane synthesis in liposomes. Nature Communications. 11, 4317 (2020).
  32. Bouzetos, E., Ganar, K. A., Mastrobattista, E., Deshpande, S., vander Oost, J. (R) evolution-on-a-chip. Trends in Biotechnology. 40 (1), 60-76 (2022).
  33. Kamalinia, G., Grindel, B. J., Takahashi, T. T., Millward, S. W., Roberts, R. W. Directing evolution of novel ligands by mRNA display. Chemical Society Reviews. 50 (16), 9055-9103 (2021).
  34. Godino, E., et al. De novo synthesized Min proteins drive oscillatory liposome deformation and regulate FtsA-FtsZ cytoskeletal patterns. Nature Communications. 10, 4969 (2019).
  35. Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. Lipid nanoparticles─From liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement. ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).
  36. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
  37. Schaich, M., et al. An integrated microfluidic platform for quantifying drug permeation across biomimetic vesicle membranes. Molecular Pharmaceutics. 16 (6), 2494-2501 (2019).
  38. Schaich, M., Sobota, D., Sleath, H., Cama, J., Keyser, U. F. Characterization of lipid composition and diffusivity in OLA generated vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1862 (9), 183359 (2020).
  39. Deshpande, S., Spoelstra, W. K., Van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
  40. Jusková, P., et al. 34;Basicles": Microbial growth and production monitoring in giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (38), 34698-34706 (2019).
  41. Fletcher, M., et al. DNA-based optical quantification of ion transport across giant vesicles. ACS Nano. 16 (10), 17128-17138 (2022).
  42. Vaezi, Z., et al. Investigation of the programmed cell death by encapsulated cytoskeleton drug liposomes using a microfluidic platform. Microfluidics and Nanofluidics. 24 (7), 48 (2020).
  43. Al Nahas, K., et al. A microfluidic platform for the characterisation of membrane active antimicrobials. Lab on a Chip. 19 (5), 837-844 (2019).
  44. Bao, P., et al. Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals. Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).
  45. Yandrapalli, N., Petit, J., Bäumchen, O., Robinson, T. Surfactant-free production of biomimetic giant unilamellar vesicles using PDMS-based microfluidics. Communications Chemistry. 4, 100 (2021).
  46. Cama, J., et al. An ultrasensitive microfluidic approach reveals correlations between the physico-chemical and biological activity of experimental peptide antibiotics. Scientific Reports. 12, 4005 (2022).
  47. Guerzoni, L. P., et al. High macromolecular crowding in liposomes from microfluidics. Advanced Science. 9 (27), 2201169 (2022).
  48. Gonzales, D. T., Yandrapalli, N., Robinson, T., Zechner, C., Tang, T. D. Cell-free gene expression dynamics in synthetic cell populations. ACS Synthetic Biology. 11 (1), 205-215 (2022).
  49. Ushiyama, R., Koiwai, K., Suzuki, H. Plug-and-play microfluidic production of monodisperse giant unilamellar vesicles using droplet transfer across water-oil interface. Sensors and Actuators B: Chemical. 355, 131281 (2022).
  50. Banlaki, I., Lehr, F. -X., Niederholtmeyer, H. Microfluidic production of porous polymer cell-mimics capable of gene expression. Cell-Free Gene Expression. Karim, A. S., Jewett, M. C. , Humana. New York, NY. 237-255 (2022).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 193
On-Chip oktanolassistert liposommontering for bioteknologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C., Ganar, K. A., Deshpande,… More

Chen, C., Ganar, K. A., Deshpande, S. On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering. J. Vis. Exp. (193), e65032, doi:10.3791/65032 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter