Summary
Wir stellen eine Methode zur flexiblen chemischen und multimodalen Stimulation und Aufzeichnung simultaner neuronaler Aktivität von vielen Caenorhabditis elegans-Würmern vor. Diese Methode nutzt Mikrofluidik, Open-Source-Hard- und Software sowie überwachte automatisierte Datenanalyse, um die Messung neuronaler Phänomene wie Anpassung, zeitliche Hemmung und Reizübersprechen zu ermöglichen.
Abstract
Fluoreszierende genetisch kodierte Kalziumindikatoren haben wesentlich zu unserem Verständnis der neuronalen Dynamik von der Ebene einzelner Neuronen bis hin zu ganzen Gehirnschaltkreisen beigetragen. Neuronale Reaktionen können jedoch aufgrund früherer Erfahrungen, interner Zustände oder stochastischer Faktoren variieren, so dass Methoden erforderlich sind, die die neuronale Funktion bei vielen Individuen gleichzeitig bewerten können. Während die meisten Aufzeichnungstechniken jeweils ein einzelnes Tier untersuchen, beschreiben wir die Verwendung der Weitfeldmikroskopie, um neuronale Aufzeichnungen auf Dutzende von Caenorhabditis elegans oder anderen Organismen im Submillimeterbereich gleichzeitig zu skalieren. Open-Source-Hardware und -Software ermöglichen eine große Flexibilität bei der Programmierung vollautomatischer Experimente, die die Intensität und das Timing verschiedener Stimulustypen steuern, einschließlich chemischer, optischer, mechanischer, thermischer und elektromagnetischer Reize. Insbesondere mikrofluidische Durchflussgeräte ermöglichen eine präzise, wiederholbare und quantitative Steuerung chemosensorischer Reize mit einer Zeitauflösung von weniger als einer Sekunde. Die halbautomatische Datenanalyse-Pipeline von NeuroTracker extrahiert dann individuelle und populationsweite neuronale Reaktionen, um funktionelle Veränderungen in der neuronalen Erregbarkeit und Dynamik aufzudecken. In diesem Artikel werden Beispiele für die Messung der neuronalen Adaptation, der zeitlichen Hemmung und des Stimulus-Crosstalks vorgestellt. Diese Techniken erhöhen die Präzision und Wiederholbarkeit der Stimulation, ermöglichen die Erforschung der Populationsvariabilität und sind auf andere dynamische Fluoreszenzsignale in kleinen Biosystemen von Zellen und Organoiden bis hin zu ganzen Organismen und Pflanzen verallgemeinerbar.
Introduction
Calcium-Bildgebungsverfahren haben die nicht-invasive Aufzeichnung der neuronalen Dynamik in vivo in Echtzeit mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie und genetisch kodierten Calciumindikatoren, die in Zielzellen exprimiert werden, ermöglicht 1,2,3. Diese Sensoren verwenden in der Regel ein grün fluoreszierendes Protein (GFP), wie z. B. die GFP-Calmodulin-M13-Peptidfamilie (GCaMP), um die Fluoreszenzintensität bei neuronaler Aktivierung und erhöhten intrazellulären Kalziumspiegeln zu erhöhen. Die Kalzium-Bildgebung hat sich beim Fadenwurm C. elegans als besonders leistungsfähig erwiesen, um zu untersuchen, wie Neuronen und neuronale Schaltkreise in lebenden, sich verhaltenden Tieren funktionieren 4,5,6,7,8,9,10, da ihre transparente Natur bedeutet, dass kein chirurgischer Prozess für den optischen Zugang erforderlich ist und zellspezifische Genpromotoren die Expression auf die interessierenden Zellen abzielen. Bei diesen Techniken kommen häufig mikrofluidische Geräte zum Einsatz, die präzise kontrollierte Umgebungen bieten, um biologische, chemische und physikalische Phänomene auf kleinem physikalischen Maßstab zu untersuchen11,12. Mikrofluidische Geräte zur Messung der neuronalen Aktivität gibt es in Hülle und Fülle, wobei ständig neue Designs entwickelt werden, und sie werden leicht im Forschungslabor hergestellt. Bei vielen Konstruktionen wird jedoch jeweils ein einzelnes Tier gefangen, was den experimentellen Durchsatz begrenzt 7,9,13. Neuronale Reaktionen variieren oft erheblich zwischen den Tieren, was auf Unterschiede in früheren Erfahrungen, inneren Zuständen wie Stress oder Hunger oder stochastischen Faktoren wie der Genexpression zurückzuführen ist. Diese Unterschiede begründen den Bedarf an Methoden, die gleichzeitig viele Tiere stimulieren und beobachten und Informationen von Individuen extrahieren können4.
Darüber hinaus zeigen sich bestimmte neuromodulatorische Phänomene erst unter bestimmten Stimulationsbedingungen, wie z. B. die zeitliche Hemmung14, die sich auf die kurzzeitige Unterdrückung von Reaktionen bezieht, wenn die Stimulation in schneller Folge erfolgt. Elektrophysiologische Systeme können zu diesem Zweck die neuronale Aktivität über einen breiten Reizraum steuern, indem sie beispielsweise den elektrischen Impulsstrom, die Spannung, die Frequenz, die Wellenform, das Tastverhältnis und das Timing periodischer Reizzüge modulieren. Die indirekte Stimulation durch natürlich detektierte Reize oder optogenetische Systeme würde von einer ähnlichen Bandbreite an Kontrollmechanismen profitieren. Gegenwärtig werden viele natürliche Reize auf einfache "On-Off"-Weise präsentiert, wie z. B. die Geruchspräsentation und -entfernung, wobei kommerzielle Systeme verwendet werden, die nur langsam Flexibilität bieten. Kostengünstige Mikrocontroller können nun jedoch die Abgabe verschiedener Arten von Stimuli auf eine Weise automatisieren, die an die Bedürfnisse der Forscher angepasst werden kann. In Kombination mit der Mikrofluidik haben diese Systeme das Ziel erreicht, den experimentellen Durchsatz und die Flexibilität zu erhöhen, so dass neuronale Reaktionen auf eine Vielzahl präziser Reize bei vielen Tieren gleichzeitig gemessen werden können 4,6. Die multimodale Stimulation kann verwendet werden, um die neuronalen Schaltkreise weiter abzufragen, z. B. durch die Überwachung von Veränderungen der neuronalen Erregbarkeit bei konsistenter Stimulation vor, während und nach einer orthogonalen Störung, wie z. B. einer Arzneimittelexposition4. Die Vorteile kostengünstiger, offener Mikroskopiesysteme liegen auf der Hand, um die wissenschaftliche Forschung voranzutreiben, doch in der Praxis kann die Notwendigkeit der Beschaffung, Konstruktion und Leistungsvalidierung von Teilen die Einführung dieser Techniken behindern.
Dieses Protokoll zielt darauf ab, einige dieser technischen Herausforderungen zu entschärfen. Während sich frühere Protokolle auf die Verwendung mikrofluidischer Vorrichtungen und die grundlegende Stimulation 9,15,17 konzentriert haben, beschreiben wir hier die Konstruktion und Verwendung eines flexiblen, automatisierten, multimodalen Stimulusabgabesystems für die neuronale Bildgebung in C. elegans oder anderen kleinen Organismen unter Verwendung zuvor beschriebener mikrofluidischer Vorrichtungen4. Das Open-Source-System wird über einfache Textdateien programmiert, um die Experimente zu definieren, und das NeuroTracker-Datenanalyseprogramm extrahiert halbautomatisch die neuronalen Aktivitätsdaten aus den Mikroskopvideos. Wir demonstrieren dieses System anhand von Beispielen zur Beurteilung der zeitlichen Hemmung, Enthemmung und des Reizübersprechens mit Hilfe des chemosensorischen Neurons AWA, das als Reaktion auf verschiedene Lebensmittelgerüche oder als Reaktion auf Licht depolarisiert, wenn optogenetische lichtempfindliche Ionenkanäle exprimiertwerden 5,6.
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Protocol
1. Neuronale Bildgebungsgeräte
HINWEIS: In Lawler und Albrecht15 finden Sie detaillierte Anweisungen zum Aufbau des Bildgebungs- und Stimulationssystems, das den Zeitpunkt der Mikroskopbeleuchtung, die Bildaufnahme und die Stimulusabgabe steuert (Abbildung 1). Ein preiswerter Arduino Nano Stimulusregler steuert die fluidischen Ventile durch digitale Signale an einen Ventilregler und steuert die optogenetische Beleuchtung durch analoge Spannungssignale an einen LED-Controller. Andere Reize, wie z. B. Vibrationsmotoren und thermische Heizer, können über digitale oder analoge Signale gesteuert werden. Der Stimulusregler synchronisiert die Stimulation und die Bildaufzeichnung über Kamerasignale, wie sie von der Open-Source-Mikroskopsteuerungssoftware Micro-Manager (μManager) spezifiziert werden16. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien, Geräten und Organismen, die in diesem Protokoll verwendet werden.
- Richten Sie die neuronale Bildgebungsausrüstung ein, einschließlich eines Epifluoreszenzmikroskops mit GFP-Optik, einer sCMOS-Kamera mit einem digitalen Belichtungsausgangssignal und eines Stimulusreglers15.
- Verbinden Sie den Stimulusregler über digitale oder analoge Signale mit den gewünschten Systemen. Für die unten vorgestellten Beispiele werden die folgenden Systeme verwendet:
- Verwenden Sie einen Ventilregler für die chemische Stimulation. Schließen Sie die Ventilsteuerung an fluidische Magnet- oder Quetschventile an (Abbildung 1)15.
- Verwenden Sie eine rote 615-nm-LED und einen Controller für die optogenetische Stimulation, die über dem Mikroskoptisch montiert sind.
- Richten Sie den Computer mit der Mikroskopsteuerungssoftware ein, erstellen Sie eine Konfigurationsvoreinstellung mit Geräteeinstellungen und stellen Sie sicher, dass die Stimulussteuerung15 ordnungsgemäß funktioniert.
2. Herstellung mikrofluidischer Geräte
HINWEIS: Siehe Lagoy et al.17 für detaillierte Informationen über die Beschaffung oder Herstellung der Urformen und die Herstellung, Verwendung und Reinigung der mikrofluidischen Geräte. Diese Schritte sind im Folgenden zusammengefasst.
- Besorgen oder fertigen Sie eine Urform unter Verwendung der bereitgestellten mikrofluidischen Konstruktionsdatei (albrechtlab.github.io/microfluidics)17. Bei jungen erwachsenen C. elegans ist darauf zu achten, dass die Kanalhöhe 55-70 μm beträgt.
- Kombinieren Sie die PDMS-Basis und den Härter im Gewichtsverhältnis 10:1 und mischen Sie sie gründlich mit Transferpipetten.
- 30-60 min in einem Vakuumexsikkator entgasen, bis die Blasen verschwinden.
- Stellen Sie die Urform in eine große Petrischale (150 mm Durchmesser) und gießen Sie das entgaste PDMS bis zu einer Tiefe von 4-5 mm (~100 g) ein. Überprüfen und entfernen Sie Staub oder Blasen mit einer Transferpipette.
- Bei 65 °C auf ebener Schiene 3 h bis über Nacht backen.
- Verwenden Sie nach dem Aushärten ein Skalpell, um das PDMS aus der Form zu schneiden, und eine Rasierklinge, um die Geräte zu trennen.
- Stanzen Sie die Einlass- und Auslasslöcher mit einer 1-mm-Hautstanze und reinigen Sie sie mit dH 2 O, Ethanol und erneut mitdH2O. Trocknen Sie das Gerät in einem Luftstrom (siehe Abbildung 2A).
- Reinigen Sie beide Seiten des PDMS-Geräts mit Klebeband und entfernen Sie Staub oder Schmutz.
- Bereiten Sie die Objektträger vor, um die mikrofluidische Vorrichtung wie beschrieben17 fertigzustellen. Bohren Sie mit einem Diamantbohrer Einlasslöcher in den oberen Schieber und machen Sie den unteren Schieber hydrophob, indem Sie TFOCS-Dämpfen ausgesetzt werden oder eine wasserabweisende Glasbehandlung auftragen (Abbildung 2B).
- Montieren Sie das Glas-PDMS-Geräte-Sandwich zu einer Klemme (Abbildung 2C).
3. Vorbereitung der Tiere
- Erhalten oder erzeugen Sie Tiere mit genetisch kodierten Kalziumindikatoren, die in den interessierenden Neuronen exprimiert werden.
HINWEIS: Beispiel: Die Zeile NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry]) exprimiert GCaMP und den rotlichtsensitiven Kationenkanal Chrimson im AWA-sensorischen Neuronenpaar6. Beide Transgene werden in das Genom integriert, um eine stabile Expression in jedem Tier zu gewährleisten. - Einen Tag vor dem Experiment werden mindestens 20 L4-Larven im Stadium C. elegans pro Experiment auf eine Nematoden-Agarplatte (NGM) gelegt, die mit einem OP50 E. coli-Rasen besiedelt ist. Bei einer Temperatur von 20 °C werden die Wildtyp-Tiere am nächsten Tag im Stadium der jungen Erwachsenen synchronisiert.
HINWEIS: Wählen Sie bei Array-Transgenen Tiere mit einem Fluoreszenzstereoskop aus, um die Transgenexpression in den ausgewählten Tieren sicherzustellen.
4. Lösungsvorbereitung
- Aus einer 10-fachen Stammlösung wird 1x S Basalpuffer (100 mM NaCl und 0,05 MKPO4, pH 6,0) hergestellt.
- Bereiten Sie 1 mM Tetramisol-Puffer vor, indem Sie 1 M Stamm in 1x S Basal verdünnen. Verwenden Sie diesen lähmenden Puffer, um alle Reize vorzubereiten. Ein Experiment verbraucht in der Regel etwa 150 ml.
- Geben Sie 0,1-1 μg/ml Fluorescein in die "Kontroll"-Pufferreservoire, um den Fluss zu visualisieren.
- Erzeugen Sie Stimuluslösungen durch serielle Verdünnung auf die gewünschte Endkonzentration. Erstellen Sie beispielsweise eine 10− 7-Verdünnung des Diacetyllockstoffs, indem Sie zuerst eine 10−3-Aktie erstellen.
Anmerkungen: Eine kleine Menge Fluorescein (0,1–1 μg/ml) kann der Stimulus- oder Pufferlösung zugesetzt werden, um das Timing des Stimulus zu überprüfen, aber die Konzentration sollte minimal sein, um Artefakte in der neuronalen Fluoreszenz zu vermeiden.
5. Vorbereitung des mikrofluidischen Geräts
HINWEIS: Siehe Reilly et al.9 für ein Videoprotokoll, das die Reservoirerzeugung, die Geräteeinrichtung und das Laden der Tiere zeigt. Siehe auch Lagoy et al.17 für ein schriftliches Protokoll mit vielen hilfreichen Tipps.
- Bereiten Sie drei oder mehr Flüssigkeitsbehälter vor. Befestigen Sie jeweils ein 30-ml- oder 60-ml-Spritzenreservoir, eine 3-ml-Ansaugspritze und einen Nadelstummel an einem Dreiwege-Luer-Ventil (Abbildung 2D). Verbinden Sie die Nadel mit einem Mikrobohrungsschlauch, der am Ende mit einem Metallrohr versehen ist. Beschriften Sie die Reservoirs, montieren Sie sie auf einem Gestell, das an einem Ringständer befestigt ist, und füllen Sie sie mit den entsprechenden Puffer- oder Stimulusflüssigkeiten (Abbildung 2E).
- Entgasen Sie das zusammengebaute mikrofluidische Gerät in einem Vakuumexsikkator für ~1 h.
- Füllen und entfernen Sie die Luftblasen mit der Ansaugspritze aus dem Reservoirschlauch. Füllen Sie den Abflussschlauch mit Puffer.
- Nehmen Sie das mikrofluidische Gerät aus dem Vakuum, führen Sie schnell den Auslassschlauch ein und injizieren Sie die Flüssigkeit durch das Gerät, bis ein Tröpfchen aus einem Einlass austritt.
- Verwenden Sie an diesem Einlass eine "Tropfen-zu-Tropfen"-Verbindung17 , um das entsprechende fluidische Einlassrohr einzuführen (2F). Stellen Sie sicher, dass Flüssigkeitstropfen sowohl am Einlassschlauch als auch am Anschlussloch des Geräts vorhanden sind, um das Eindringen einer Blase zu vermeiden.
- Injizieren Sie mehr Flüssigkeit aus dem Auslass, schließen Sie das nächste Einlassrohr an und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Einlässe gefüllt sind. Setzen Sie einen soliden Sperrstift an allen unbenutzten Einlässen und der Schneckenladeöffnung ein.
- Initiieren Sie den Durchfluss, indem Sie die Einlass- und Auslass-Luer-Ventile öffnen. Überprüfen Sie das Gerät auf Undichtigkeiten an den Einlässen und am Glasboden. Untersuchen Sie das Gerät mit der Mikroskopbilderfassungssoftware im Live-Modus auf Blasen in den Strömungskanälen oder -einlässen.
Anmerkungen: Wenn Blasen vorhanden sind, warten Sie, bis sie in das PDMS-Material eingezogen sind.
6. Verladung der Tiere
HINWEIS: Siehe Lagoy et al.17.
- Übertragen Sie junge erwachsene Tiere mit einem "Pick" mit Drahtspitze auf eine unbesäte NGM-Agarplatte.
- Fluten Sie die Platte mit ca. 5 ml 1x S Basalpuffer, so dass die Tiere schwimmen.
- Ziehen Sie die Würmer in eine Ladespritze (1 mL oder 3 mL Spritze mit aufgesetztem Schlauch, der mit 1x S Basal vorgefüllt wurde).
- Bewegen Sie mit einem Stereoskop das Schlauchende mit einer Hand unter die Flüssigkeitsoberfläche zu jedem gewünschten Tier und ziehen Sie es mit der in der anderen Hand gehaltenen Spritze in den Schlauch.
- Ziehen Sie die Würmer nur in den Schlauch, nicht in die Spritze.
HINWEIS: Der Schlauch fasst in der Regel nur etwa 100 μl. Die Tiere können in einen lokalen Bereich ausgestoßen und dann mit einem kleinen Volumen wieder in den Schlauch gezogen werden.
- Schließen Sie die Auslassleitung, entfernen Sie den Schneckenladestift und verbinden Sie die Schneckenladespritze über eine Drop-to-Drop-Verbindung mit dem Gerät.
- Lassen Sie die Tiere vorsichtig in die Arena fließen, stellen Sie einen Pufferfluss her und lassen Sie bis zu 1 Stunde für die Ruhigstellung durch Tetramisol ein.
Anmerkungen: Stellen Sie während der Immobilisierungsphase sicher, dass nur Pufferflüssigkeit in die Arena gelangt. Die Stimulus- und Kontrollreservoirs können während dieser Zeit ausgeschaltet werden, aber öffnen Sie sie und überprüfen Sie den korrekten Fluss, bevor Sie die Stimulationsversuche durchführen.
7. Automatisierte Stimulation und neuronale Aufzeichnung
- Erstellen Sie mit einem Texteditor (z. B. Notepad) eine Textdatei mit dem Namen "User Defined Acquisition Settings.txt", die die Stimulationseinstellungen für die automatische Bildaufnahme enthält (siehe Beispiele in Abbildung 3). Die Einstellungen sind in zwei Abschnitte unterteilt:
- Einstellungen für die Mikroskopaufnahme: Definieren Sie den Experimenttyp (Single-Stimulus oder Multi-Pattern), den Expositions- und Anregungszeitpunkt, die Versuchsdauer und -intervalle sowie das Speicherverzeichnis.
- Stimulations-Einstellungen: Definieren Sie die Parameter für die Stimulussteuerung. Ein "Stimulationsbefehl" gibt die Aktionen an, die bei bestimmten Videobildern mit der Syntax
ausgeführt werden, wobei die Buchstabencodes A = Ventil1, B = Ventil2, C = Ventil3, L = LED-Licht sind; Zusätzlich gilt: Großbuchstaben = ein und Kleinbuchstaben = aus. Die LED-Intensität wird mit dem Buchstabencode "i" und einem Wert von 0 (aus) bis 255 (maximale Helligkeit) eingestellt.
Anmerkungen: Der LED-Intensitätswert von 0 bis 255 stellt die analoge Ausgangsspannung von 0 V bis 5 V ein. Der hier verwendete Stromregler verfügt über eine lineare Intensitätsskalierung, andere sollten mit einem Lichtleistungsmesser kalibriert werden.- Verwenden Sie für ein Single-Stimulus-Experiment mit nur einem wiederholten Stimulationsbefehl das Format in Abbildung 3A.
- Verwenden Sie für ein Multi-Pattern-Experiment mit mehreren Stimulationsbefehlen das Format in Abbildung 3B. Fügen Sie eine "Mustersequenz" von Ziffern hinzu, die die Reihenfolge der Reizmuster darstellt. Geben Sie für jedes Muster einen Stimulationsbefehl in einer separaten Zeile ein.
HINWEIS: Eine pseudozufällige Sequenz oder m-Sequenz kann nützlich sein, um die Abhängigkeit von der Stimulushistorie zu untersuchen.
- Führen Sie die Mikroskopsteuerungssoftware aus. Stellen Sie sicher, dass alle fluidischen Einlässe geöffnet sind, die Strömung innerhalb der Arena wie gewünscht ist (siehe Abbildung 2H) und die interessierenden Neuronen innerhalb des Live-Fensters fokussiert sind.
- Schließen Sie das Live-Fenster und führen Sie das Skript "MultiPattern_RunScript.bsh" in der Software aus.
HINWEIS: Es ist sinnvoll, ein Testexperiment ohne Tiere durchzuführen, um den richtigen Fluss und die richtige Stimulation zu überprüfen. Das Ersetzen einer anderen Fluoresceinkonzentration für jede Reizflüssigkeit kann helfen, neue Reizmuster sichtbar zu machen und zu dokumentieren. - Zerlegen Sie nach dem Experimentieren das mikrofluidische Gerät und spülen Sie alle Oberflächen, Schläuche und Behälter mit Wasser ab.
Anmerkungen: Alle Komponenten können Dutzende Male wiederverwendet werden, wenn sie sauber gehalten werden. Stellen Sie sicher, dass Reservoirs, Schläuche und mikrofluidische Geräte feucht gehalten oder vollständig in einem Luftstrom getrocknet werden, um eine Salzkristallisation zu vermeiden, die verstopfen kann und schwer zu entfernen ist. Die Produkte können zur Sterilisation in Ethanol aufbewahrt werden, sollten aber vor der Wiederverwendung vollständig getrocknet werden (>1 h bei 65 °C)17.
8. Datenanalyse mit NeuroTracker
HINWEIS: NeuroTracker 4,18,19 ist ein ImageJ/FIJI20 Software-Plugin zur Verfolgung der Fluoreszenzintensität mehrerer Neuronen und Tiere, auch wenn sie sich während der Versuche bewegen. Dieses Plugin speichert Daten als Textdateien mit der Position jedes Neurons und der hintergrundkorrigierten Fluoreszenzintensität (F). Die Fluoreszenzdaten werden auf die Basisfluoreszenz (F 0) normalisiert, z. B. den Mittelwert von mehreren Sekunden vor der Stimulation, als Δ F/F 0 = (F -F 0)/F 0, die über Populationen gemittelt werden kann.
- Installieren Sie NeuroTracker-Skripte wie angewiesen (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
- Starten Sie NeuroTracker, indem Sie auf Plugins | Sendungsverfolgung | NeuroTracker.
- Wählen Sie den Ordner aus, der die . TIF-Videodateien, die verfolgt werden sollen, und wählen Sie die gewünschten Einstellungen aus.
HINWEIS: Wenn nur eine Teilmenge der Videodateien verfolgt werden soll, wählen Sie an der Eingabeaufforderung den numerischen Bereich der zu analysierenden Dateien aus. Die Standard-Tracking-Einstellungen sind für unbewegliche Tiere mit einer Auflösung von 250 Pixeln/mm geeignet. Passen Sie die Parameter proportional für andere Auflösungen an. Weitere Informationen zu den Einstellungen finden Sie im Benutzerhandbuch19 . - Stellen Sie den Intensitätsschwellenwert so ein, dass die Neuronen für die Auswahl sichtbar sind (Abbildung 4).
- Öffnen Sie die Steuerungsfenster Helligkeit/Kontrast (B/C) und Schwellenwert über die Schaltfläche Bild | Menü anpassen .
- Passen Sie im B /C-Fenster die Schieberegler Minimum und Maximum an, bis die Neuronen deutlich zu unterscheiden sind (Abbildung 4A).
- Aktivieren Sie im Fenster " Schwellenwert " die Option " Dunkler Hintergrund " und "Bereich nicht zurücksetzen".
- Schieben Sie den Schieberegler des Rahmens, um die Bewegungen und Intensitätsänderungen der Neuronen zu beobachten, und notieren Sie alle Tiere, die von der Verfolgung ausgeschlossen werden sollen, z. B. aufgrund von Überschneidungen mit anderen Tieren.
- Identifizieren Sie die Neuronen, die verfolgt werden sollen.
- Passen Sie für jedes Tier den Schwellenwert so an, dass der rote Schwellenbereich über dem Neuron in jedem Bild vor, während und nach der Stimulation sichtbar ist.
- Klicken Sie auf das Neuron, um seine Position und seinen Schwellenwert aufzuzeichnen.
- Wiederholen Sie die Anpassung und Auswahl des Schwellenwerts für jedes Tier und Neuron, das verfolgt werden soll. In Abbildung 4C finden Sie ein gutes Beispiel für einen Schwellenwert und in Abbildung 4D,E finden Sie Beispiele für Über- und Unterschwellenwerte. Zuvor ausgewählte Neuronen werden durch ein kleines Kästchen angezeigt.
- Wenn alle Neuronen ausgewählt sind, drücken Sie die Leertaste , um mit der Verfolgung zu beginnen.
HINWEIS: Weitere Beispiele für NeuroTracker finden Sie inden vorherigen Referenzen 4,19. - Überwachen Sie den Tracking-Prozess für jedes Tier und nehmen Sie alle erforderlichen Korrekturen vor.
- Wenn der NeuroTracker pausiert, hat er das Neuron verloren. Klicken Sie erneut auf das Neuron und passen Sie den Schwellenwert nach Bedarf an.
- Wenn das Integrationsfeld zu einem anderen Tier oder einer anderen nicht-neuronalen Struktur in der Nähe springt, drücken Sie die Leertaste , um anzuhalten, bewegen Sie den Schieberegler zurück zum ersten fehlerhaften Frame und klicken Sie erneut auf die richtige Neuronenposition.
9. Datenexploration und -visualisierung
HINWEIS: Das MATLAB-Analyseskript wird für die Datenverarbeitung und -visualisierung sowie zum Generieren von zusammenfassenden PDFs für jede Analyse verwendet.
- Führen Sie die Datei "NeuroTrackerSummary_pdf.m" in MATLAB aus und wählen Sie den Ordner aus, der die NeuroTracker-Datentextdateien enthält.
- Warten Sie, bis eine zusammenfassende PDF-Datei erstellt wurde, die die Überprüfung des Nachverfolgungsprozesses ermöglicht (Abbildung 5). Die Tiere werden durch eine Nummer identifiziert (Abbildung 5A), und die neuronalen Reaktionen jedes Tieres und jedes Versuchs können angezeigt werden, um die Populationsvariabilität zu beurteilen (Abbildung 5B).
- Verwenden Sie die Funktion "databrowse.m", um die neuronalen Daten zu untersuchen, z. B. nach Versuchsnummer (Abbildung 5C), nach Tiernummer (Abbildung 5D), nach Stimulationsmuster oder nach einer anderen Kategorie.
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Representative Results
Wir präsentieren mehrere Beispiele für Stimulusmuster, die verschiedene neuronale Phänomene untersuchen, einschließlich zeitlicher Hemmung, Anpassung und Enthemmung. Zeitliche Hemmung ist die kurzzeitige Unterdrückung einer neuronalen Reaktion auf eine zweite Reizpräsentation, die kurz nach der ersten Präsentation auftritt14. Um dieses Phänomen zu testen, wurden in einem Paarpulsexperiment acht Muster präsentiert, die aus zwei 1 s Geruchsimpulsen bestehen, die durch ein Intervall von 0 s bis 20 s getrennt sind (Abbildung 6B; siehe Abbildung 3B für die entsprechende Stimulus-Kontrolldatei). Die Arena wurde mit einer einzigen Stimulusflüssigkeit (1,1 μM Diacetyl), einem Puffer und einem Kontrollflussschlauch eingerichtet, wobei die unbenutzte Einlassöffnung mit einem festen Stift blockiert wurde (Abbildung 6A). Durch Einschalten des Ventils 1 tritt die Steuerflüssigkeit in den Einlass ctrl1 ein, wodurch die Flüssigkeitsströme so verschoben werden, dass der Reiz in die Arena eintritt. Wenn Ventil 1 ausgeschaltet ist, tritt die Steuerflüssigkeit in den CTRL2-Einlass ein und der Puffer fließt durch die Arena (siehe Abbildung 2G,H). Während der erste 1 s Geruchsimpuls in den Diacetyl-detektierenden AWA-Neuronen eine gleiche Antwortgröße hervorrief, variierten die Antworten auf den zweiten Puls mit dem Interstimulusintervall (Abbildung 6D). Bei Pulsintervallen von weniger als 10 s war die zweite Antwort schwächer, was das Phänomen der zeitlichen Hemmung zeigt. Mit Hilfe dieses Versuchsaufbaus konnte festgestellt werden, dass die Störung der Dyneinkomponente CHE-3 eine zeitliche Hemmung verhindert, was auf den axonalen Transport bei diesem Phänomen hindeutet5.
Adaptation ist die allmähliche Abnahme der neuronalen Reaktionen auf wiederholte Präsentationen desselben Reizes. Dieses Phänomen kann durch verschiedene Prozesse verursacht werden, wie z. B. aktive Hemmung, die schnell rückgängig gemacht werden kann, oder andere Prozesse, die sich nur langsam umkehren. Ein Experiment zur Bewertung der schnellen Reversibilität ist ein "Catch"-Versuch, bei dem ein Stimulus wiederholt wird, um eine Anpassung zu etablieren, gefolgt von einem "abweichenden" oder neuartigen Stimulus und dann einer Rückkehr zum ursprünglichen Stimulus. Eine Enthemmung wird beobachtet, wenn die neuronalen Reaktionen nach dem neuartigen " Enthemmungsreiz " zunehmen. Abbildung 7 zeigt ein Beispiel mit zwei Geruchsstoffen, Diacetyl und 2-Methylpyrazin (2-MP), die von den chemosensorischen Neuronen der AWA über verschiedene Rezeptoren4 detektiert werden. Zwei Stimulusreservoirs und Schläuche wurden an das mikrofluidische Gerät angeschlossen, mit einem zusätzlichen Dreiwege-Quetschventil, um zu bestimmen, welcher Stimulus in die Arena eintritt (Abbildung 7A). Die Stimulusmuster wurden so definiert, dass sie für alle 30 Versuche chemische Impulse für 4 s über Ventil 1 präsentieren und zwischen Stimulus S1 oder S2 über Ventil 3 wählen, das nach dem 25. Versuch eingeschaltet und nach dem 26. Versuch ausgeschaltet wurde (Abbildung 7B). Diese Anordnung stellte sicher, dass die verschiedenen Reizflüssigkeiten ausreichend Zeit hatten, durch die mikrofluidische Vorrichtung zu fließen, bevor sie den Tieren präsentiert wurden. Es wurde eine Anpassung an den Diacetyl-Stimulus beobachtet, aber die Präsentation des neuartigen 2-MP-Stimulus löste keinen starken Enthemmungseffekt aus (Abbildung 7C).
Bei der optogenetischen Stimulation werden Nervenzellen mit Hilfe von Licht über lichtempfindliche Ionenkanäle aktiviert. Die optogenetische Aktivierung ist zwar bequem in der Anwendung, umgeht aber sensorische Rezeptoren und einige regulatorische Signalwege, so dass sich einige neuronale Phänomene von der Aktivierung durch natürliche Reize unterscheiden können. Um diese Unterschiede zu testen, sind multimodale Experimente nützlich, um verschiedene Arten von Stimulation innerhalb eines einzigen Experiments darzustellen. Neuronen, die die Channelrhodopsin-Variante Chrimson exprimieren, werden durch Rotlichtexposition aktiviert5. Um zu beurteilen, ob sich die AWA-Neuronen in ähnlicher Weise an chemische und optogenetische Stimulation anpassen, wurde der NZ1091-Stamm, der sowohl Chrimson als auch GCaMP in den AWA-Neuronen exprimiert, für 14-28 h auf einer Platte mit dem Kofaktor all-trans-retinal (ATR, 100 μM) gehalten. Eine rote LED mit 615 nm beleuchtete die mikrofluidische Arena von oben (Abbildung 8A), und eine Reihe multimodaler Stimulusmuster wurde durch die Bereitstellung von 5 s-Impulsen von Diacetyl, rotem Licht oder beidem innerhalb desselben Versuchs erzeugt (Abbildung 8B). Die chemische Stimulation allein bewirkte eine Anpassung, während die optische Stimulation allein dies nicht bewirkte (Abbildung 8C). Das kombinierte multimodale Stimulusmuster zeigte jedoch, dass optogenetische Antworten anfällig für chemisch induzierte Anpassung waren (Abbildung 8C,D). Diese Experimente deuten darauf hin, dass die Anpassung an sensorischen Rezeptoren oder dendritischen Prozessen initiiert wird, sich aber im gesamten Neuron ausbreitet.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der neuronalen Kalziumaufzeichnungs- und Stimulationsgeräte. Die Aufnahme von Mikroskopbildern, das Fluoreszenzanregungslicht und die Stimulation werden von einem Computer und einem Open-Source-Arduino-Mikrocontroller gesteuert. Die chemische Stimulation im mikrofluidischen Bereich schaltet über den Regelflüssigkeitsfluss C zwischen Puffer-B- und Stimulus-S-Lösungen um. Die optionalen Systemelemente sind mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet, wie z. B. zusätzliche Ventile und optische oder andere Stimulationsmodalitäten. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen werden verwendet, um die neuronale Aktivität über Kalziumtransienten zu messen, z. B. mit dem Kalziumindikator GCaMP. Die gestrichelten Linien stellen die elektrischen Verbindungen (digital oder analog) dar, die gekrümmten Linien sind die Flüssigkeitsschläuche und die geraden durchgezogenen Pfeile sind die optischen Lichtwege. Abkürzung: LED = Leuchtdiode. Diese Zahl ist eine Abwandlung von Lawler und Albrecht15. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Montage und Einrichtung von mikrofluidischen Geräten. Die mikrofluidische Vorrichtung besteht aus einer (A) mikrostrukturierten PDMS-Vorrichtung, die zwischen einer (B) gebohrten Glasplatte und einer hydrophoben Glasbasis eingeklemmt und (C) eingespannt ist. (D) Die Ausgleichsbehälter werden mit einem (E) Schlauchgestellständer über dem Gerät positioniert. Die Schläuche aus den Behältern werden entweder direkt in das Gerät oder über betätigte Ventile zur fluidischen Steuerung angeschlossen. Das Gerät wird oberhalb des Objektivs am Mikroskop positioniert. (F) Nahaufnahme des mikrofluidischen Geräts mit allen Schläuchen, die an den Einlässen, der Schneckenladeöffnung und dem Auslass angebracht sind. (G) Schematische Darstellung des 20 mm x 20 mm großen mikrofluidischen Geräts. Die schwarzen Linien stellen die 55-70 μm hohen Flüssigkeitskanäle dar. Diese Geometrie ist so konzipiert, dass sie eine präzise raumzeitliche Steuerung mit einer Stimulusfront senkrecht zur Strömung ermöglicht, während die Tiere im Sichtfeld der Arena und des Mikroskops bleiben. Der Pufferstrom und ein Stimulus-Strom (oder optional Stim2, falls verwendet) fließen kontinuierlich, während jeweils nur ein Steuerflüssigkeitseinlass fließt, wodurch sich die in die Arena eintretende Flüssigkeit verschiebt. (H) Wenn Ventil 1 erregt wird, fließt die Steuerflüssigkeit vom normalerweise geschlossenen Anschluss zum Einlass der Steuer1, und der Stimulus schaltet sich ein und fließt durch die Arena. Wenn Ventil 1 ausgeschaltet ist, fließt Flüssigkeit vom normalerweise geöffneten Anschluss zum Einlass von Control2 und der Puffer tritt in die Arena ein. Das richtige Flussgleichgewicht wird gezeigt, wobei Fluoresceinfarbstoff als Reizflüssigkeit verwendet wird. Beachten Sie, dass ein Teil der Flüssigkeit, die in die Arena gelangt, diese auch über die oberen und unteren gekrümmten Kanäle umgeht. Diese Bäche sollten schmal sein und im oberen und unteren Kanal gleich breit sein. Die Behälterhöhen können je nach Bedarf angepasst werden. Abkürzungen: PDMS = Polydimethylsiloxan; WL = Schneckenbelastung; Buf = Puffer; Stim1 = erster Stimulus; Stim2 = zweiter Stimulus; NC = Öffner; NO = Schließer. Diese Zahl ist eine Abwandlung von Lawler und Albrecht15. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Beispiel-Stimulus-Definitionsdateien. (A) Beispiel für ein sich wiederholendes Stimulus-Experiment: ein 5 s Lichtpuls mit einer Intensität von 200 von 2 s bis 7 s (Bild 20 bis 70). (B) Beispiel für ein Multi-Muster-Stimulus-Experiment mit acht verschiedenen Stimulusmustern, entsprechend Abbildung 6. Es werden zwei chemische Impulse von 1 s mit einem Abstand von 0 s bis 20 s zwischen ihnen präsentiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Auswahl von Neuronen und Schwellenwerten in NeuroTracker . (A) Volles Sichtfeld des Mikroskops, wobei Helligkeit und Kontrast so eingestellt sind, dass die AWA-Neuronen klar zu sehen sind. (B) Vergrößerte Ansicht der Kopfregion eines Tieres, die den Integrationskasten darstellt, aus dem die Fluoreszenzintensität berechnet wird, und den Hintergrundring für die Hintergrundsubtraktion. (C) Integriertes Intensitätsdiagramm, das eine robuste neuronale Antwort zeigt. (D) Eine gute Auswahl des Schwellenwerts führt zu einem roten Schwellenwertbereich, der über dem Parameter " Minimale Größe" und unter dem Parameter "Maximale Größe " für jedes Bild im Bildstapel liegt und keine benachbarten Bereiche wie z. B. die Autofluoreszenz des Darms enthält (siehe Bedienfeld B). (E) Ein zu hoch eingestellter Schwellenwert kann gut erscheinen, wenn das Neuron aktiv ist, aber wenn es inaktiv ist, kann das Neuron verloren gehen. Es ist daher wichtig, bei der Auswahl eines Schwellenwerts sowohl den Rahmen vor als auch nach der Stimulation zu überprüfen. (F) Ein zu niedrig angesetzter Schwellenwert kann andere nicht-neuronale Strukturen hervorheben. Eine Auswahl über oder unter dem Schwellenwert kann dazu führen, dass NeuroTracker das Neuron verliert und auf Benutzerfeedback wartet, um den Schwellenwert und die Neuronenposition zu korrigieren. Abkürzung: B&C = Helligkeit und Kontrast. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Beispiel für eine Datenanalyse. Neuronale Reaktionen von 15 Tieren, die einmal pro Minute 10 Wiederholungen einer optogenetischen Stimulation von 5 s Dauer ausgesetzt waren. (A) Zusammenfassendes Bild, das die verfolgten Tiere und die Bewegung der Neuronen innerhalb der Studie anzeigt (rote Kästchen). Tier 2 bewegte sich während der Prüfung. (B) Die Reaktionen der einzelnen Tiere im Laufe der Zeit zeigen eine relativ konsistente Reaktion auf Rotlichtstimulation. (C) Ausgabe der Datenexploration mithilfe der databrowse-Funktion . Die Ablaufverfolgungen sind nach Versuchswiederholung gruppiert (oben), und die Durchschnittswerte werden unten für vom Benutzer auswählbare Studien angezeigt. (D) Daten, gruppiert nach der Anzahl der einzelnen Tiere, gemittelt über wiederholte Versuche. Dieser Datensatz zeigt eine minimale Variabilität zwischen den Tieren, was die Mittelung der Reaktionen in der gesamten Population rechtfertigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Paar-Puls-Experiment mit variablem Interstimulus-Intervall zur Beurteilung der zeitlichen Inhibition . (A) Einlassanschlüsse für mikrofluidische Geräte. Der unbenutzte Einlass wird mit einem massiven Stift (X) blockiert. Der Steuerflüssigkeitsbehälter und das Ventil1 sind mit den Einlässen c1 und c2 verbunden, die hier aus Gründen der Übersichtlichkeit weggelassen werden. (B) Stimulus-Timing für acht Muster. Die Impulse haben eine Dauer von 1 s und einen Abstand von 0-20 s. Die Abfolge der Muster ist unten dargestellt; Jedes Muster wurde sechs- oder siebenmal präsentiert. (C) neuronale AWA-Aktivität aus 50 Versuchen und neun Tieren. Oben sehen Sie eine Heatmap der Reaktionen, sortiert nach Stimulationsmustern. Die mittlere neuronale Aktivität für jedes Muster (n=56-63 Antworten) ist unten dargestellt. Die zeitliche Hemmung erfolgt für ~10 s nach dem initialen Puls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Versuchsexperiment zur Beurteilung der Enthemmung . (A) Einlassanschlüsse für mikrofluidische Geräte. Ein Drei-Wege-Quetschventil lässt nur den Stimulus S1 im Ruhezustand und nur S2 passieren, wenn er unter Spannung steht. (B) Diagramm der drei Mustersequenzen, die zur Abgabe der wiederholten Diacetyl-Geruchsimpulse verwendet wurden, wobei der neue Stimulus 2-Methylpyrazin im 26. Versuch vorgestellt wurde. (C) Mittlere neuronale AWA-Aktivitätsreaktionen bei 20 Tieren. Abkürzungen: DA = Diacetyl; 2-MP = 2-Methylpyrazin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Beispiel für eine multimodale Stimulation . (A) Einlassanschlüsse für mikrofluidische Geräte, wobei ein unbenutzter Einlass mit einem festen Stift blockiert ist. Eine rote LED beleuchtet die Arena von oben. (B) Muster für optische, chemische oder multimodale Stimulation. (C) Mittlere neuronale AWA-Aktivität (n = 11 Tiere) für 30 wiederholte Versuche mit gepaarter optogenetischer und chemosensorischer (oben), nur optogenetischer (Mitte) und nur chemosensorischer Stimulation (unten). (D) Durchschnittliche neuronale Spitzenantwort für jeden Versuch für optogenetische Impulse oben und chemische Impulse unten. Die optogenetischen Impulse verursachen keine direkte Anpassung, aber ihre Antworten sind anfällig für chemosensorische Anpassungen. Abkürzungen: DA = Diacetyl. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir ein frei zugängliches Mikroskopiesystem zur Beurteilung neuronaler Aktivitätsphänomene unter Verwendung der zeitlich präzisen Abgabe verschiedener Reizmuster. Die mikrofluidische Plattform liefert wiederholbare Stimuli, während Dutzende von Tieren im Sichtfeld des Mikroskops bleiben. Nur wenige kommerzielle Mikroskopie-Softwarepakete ermöglichen die einfache Programmierung verschiedener Stimulus-Timing-Muster, und diejenigen, die dies tun, erfordern oft die manuelle Eingabe jedes Musters oder proprietärer Dateiformate. Im Gegensatz dazu werden Experimente in diesem System durch Textdateien definiert, die computergeneriert werden können und von einer Analysesoftware gelesen werden können. Hier demonstrieren wir die Nützlichkeit der Verwendung variabler Stimulusmuster zur Beurteilung neuronaler Phänomene wie zeitliche Hemmung, Anpassung und Crosstalk während der multimodalen Stimulation. Die Datenanalyse-Pipeline reduziert große Mikroskopie-Videodateien auf neuronale Aktivitätsdaten, die visualisiert und auf Populationsvariabilität (Abbildung 5B), Änderungen im Zeitverlauf (Abbildung 7C und Abbildung 8C, D) und Änderungen nach Störung (Abbildung 7C) analysiert werden können.
Ein wesentlicher Vorteil der Automatisierung ist die Reproduzierbarkeit der Stimulation über Versuchswiederholungen und zwischen Experimenten, und das mikrofluidische Arenaformat ermöglicht eine mindestens 20-fache Steigerung des Durchsatzes im Vergleich zu früheren Einzeltiermethoden 7,9,13. Wenn eine Tierpopulation den gleichen Reizen und Umweltbedingungen ausgesetzt wird, wird sichergestellt, dass die Daten vergleichbar sind, und mögliche tägliche Schwankungen bei der Lösungszubereitung, der Temperatur, den tierischen Quellen oder anderen Faktoren vermieden werden. Eine Einschränkung dieses Ansatzes ist jedoch die Mikroskopie mit geringer Vergrößerung und niedriger Auflösung, die alle Tiere im Sichtfeld hält. Pro Tier sollte nur ein Neuron überwacht werden, um Tracking-Fehler zu minimieren, obwohl Neuronen, die mindestens 50 μm voneinander entfernt sind, prinzipiell unterschieden werden können. Bilaterale Neuronenpaare können zusammen abgebildet werden, wenn erwartet wird, dass die Antworten symmetrisch sind. Es ist wichtig, zunächst zu identifizieren, welche spezifischen Neuronen an einem neuronalen Prozess von Interesse beteiligt sind, z. B. durch Bildgebung des gesamten Gehirns7, und dann GCaMP nur in den relevanten Neuronen zu exprimieren, um den Durchsatz zu erhöhen.
Die neuronalen Kalziumantworten variieren von Tier zu Tier aufgrund der Expression der Reporter oder anderer interindividueller Unterschiede. Zum Beispiel variieren normalisierte AWA GCaMP-Antworten in ihrer Spitzengröße um das Zweifache, selbst bei isogenen Wildtyp-Tieren, bei denen der Kalziumreporter stabil in das Genomintegriert ist 4. Einige Stimuli zeigen unterschiedliche Reaktionen in der Population (z. B. Butylacetat4), was auf eine variable Rezeptorexpression hindeutet. In der Praxis sollten mindestens 20 Einzeltiere bewertet werden, um die Populationsvariabilität zu bestimmen. Es wird empfohlen, die Daten einzelner Tiere zu nutzen, um die statistische Aussagekraft bei der Bestimmung von Reaktionsänderungen zu erhöhen, z. B. durch den statistischen Vergleich einzelner neuronaler Antworten, die vor und nach einer Störung gepaart sind.
Bei großen Datensätzen und automatisierten Experimenten ist es wichtig, die ordnungsgemäße Experimentfunktion, Nachverfolgung und Datenreduzierung zu validieren und zu verifizieren, insbesondere bei unbeaufsichtigten Schritten. Die Strömungsmuster sollten mit fluoreszierenden Lösungen (wie in Abbildung 2H) überprüft werden, indem in den aufgezeichneten Videos keine Blasen oder Kontrollflüssigkeiten in die Arena gelangen. Datensätze sollten validiert werden, indem z. B. alle Tierbewegungen notiert werden (wie in Abbildung 5A) und glatte neuronale Reaktionen überprüft werden (wie in Abbildung 4C und Abbildung 5B). Problematische Daten sollten ausgeschlossen werden. Es ist auch wichtig, die Datengruppierung vor der Mittelwertbildung mit der Funktion "databrowse" zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die durchschnittliche Antwortvariable die einzelnen Antworten widerspiegelt.
Das Open-Source-Stimulationssteuerungssystem kann über digitale oder analoge Signale oder serielle Kommunikationsbefehle problemlos auf andere Stimuli erweitert werden. Abgestufte Reize können in der Regel über analoge Spannungseingänge (0-5 V) gesteuert werden, wie z. B. die LED-Lichtintensität oder die Impulsgröße des Nervenstimulators. Ein-Aus-Stimuli werden in der Regel mit digitalen (TTL) Signalen gesteuert, wie z. B. dem Timing des elektrischen Stimulators. Diese digitalen Signale können auch Relaisschalter betätigen, um andere elektrische Systeme zu aktivieren, wie z. B. Vibrationsmotoren zur mechanosensorischen Stimulation. Andere Geräte verwenden serielle Kommunikation, z. B. über eine USB-Verbindung, wobei bestimmte Zeichenbefehle übertragen werden, um Aktionen zu definieren. Beispielsweise können Dosis-Wirkungs-Experimente mehrere chemische Konzentrationen automatisch unter Verwendung eines USB-gesteuerten Drehventils5 oder eines Multi-Well-Plattensystems6 darstellen. Diese Befehle können zu den Open-Source-Skripten für die Mikroskopsteuerung hinzugefügt werden, die an bestimmte Versuchsnummern gesendet werden. Zeitverzögerungen können in ähnlicher Weise einbezogen werden; Um beispielsweise den Test zwischen zwei 30-Versuchs-Stimulationsphasen für 1 Stunde zu unterbrechen, würde man ein 60-Versuchsexperiment angeben und eine einzelne Codezeile hinzufügen, um 1 Stunde lang zu pausieren, wenn die Versuchszahl 31 erreicht.
Die experimentelle Komplexität ist nahezu unbegrenzt und kann sich sogar während eines Experiments ändern, das auf Live-Feedback in einem "Closed-Loop"-System basiert. Zum Beispiel könnte die Stimulation in Echtzeit basierend auf der neuronalen Aktivität, dem Verhalten der Tiere oder einem anderen quantifizierbaren Parameter variieren. Wir haben kürzlich ein solches System verwendet, um die sensorischen neuronalen Reaktionen bei schlafenden und wachen Tieren zu bewerten, indem wir nach einer Verhaltensänderung Stimulation und neuronale Aufzeichnung auslösten 8,15. Die Motion-Tracking-Funktion von NeuroTracker ermöglicht die Analyse der neuronalen Aktivität bei sich frei bewegenden Tieren im Hinblick auf die Korrelation mit dem Verhaltensoutput. Das Verfolgen einzelner sich bewegender Tiere erfordert jedoch besondere Aufmerksamkeit, z. B. wenn sie sich kreuzen, und es wird daher empfohlen, weniger Tiere pro Arena zu laden (etwa fünf), um diese Interaktionen zu minimieren.
Insgesamt erhöhen diese Techniken die Präzision der Stimulation und den experimentellen Durchsatz bei der Erforschung der Populationsvariabilität und spezifischer neuronaler Phänomene. Zusätzlich zur Messung der neuronalen Aktivität sind diese Methoden auf andere Biosysteme, einschließlich Pflanzen, verallgemeinerbar, die ebenfalls über Kalziumsignale21, neuronale Zellkultur und Gehirnorganoide22 kommunizieren, sowie auf andere dynamische Fluoreszenzsignale, wie Sensoren für synaptische Aktivität, Neurotransmitterfreisetzung 23 und Transkription24.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Fox Avery für das Testen dieser Protokolle und die Durchsicht des Manuskripts und Eric Hall für die Unterstützung bei der Programmierung. Die hier vorgestellten Methoden wurden zum Teil von der National Science Foundation 1724026 (D.R.A.) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strains | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
| Software and algorithms | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
| 2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
| 3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
| Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
| Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
| Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
| Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
| Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
| Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
| Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
| Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
References
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