Summary
Apresentamos um método para a estimulação química flexível e multimodal e registro da atividade neural simultânea de muitos vermes Caenorhabditis elegans . Esse método usa microfluídica, hardware e software de código aberto e análise automatizada supervisionada de dados para permitir a medição de fenômenos neuronais como adaptação, inibição temporal e crosstalk de estímulos.
Abstract
Indicadores fluorescentes de cálcio codificados geneticamente têm contribuído muito para a nossa compreensão da dinâmica neural, desde o nível de neurônios individuais até circuitos cerebrais inteiros. No entanto, as respostas neurais podem variar devido à experiência prévia, estados internos ou fatores estocásticos, gerando a necessidade de métodos que possam avaliar a função neural em vários indivíduos ao mesmo tempo. Enquanto a maioria das técnicas de registro examina um único animal de cada vez, descrevemos o uso de microscopia de campo largo para ampliar registros neuronais para dezenas de Caenorhabditis elegans ou outros organismos de escala submilimétrica ao mesmo tempo. Hardware e software de código aberto permitem grande flexibilidade na programação de experimentos totalmente automatizados que controlam a intensidade e o tempo de vários tipos de estímulos, incluindo estímulos químicos, ópticos, mecânicos, térmicos e eletromagnéticos. Em particular, os dispositivos de fluxo microfluídico fornecem controle preciso, repetível e quantitativo de estímulos quimiossensoriais com resolução de tempo inferior a um segundo. O pipeline de análise de dados semi-automatizado do NeuroTracker extrai respostas neurais individuais e populacionais para descobrir mudanças funcionais na excitabilidade e dinâmica neural. Este artigo apresenta exemplos de medidas de adaptação neuronal, inibição temporal e crosstalk de estímulos. Essas técnicas aumentam a precisão e a repetibilidade da estimulação, permitem a exploração da variabilidade populacional e são generalizáveis para outros sinais fluorescentes dinâmicos em pequenos biossistemas, desde células e organoides até organismos inteiros e plantas.
Introduction
Técnicas de imagem com cálcio têm permitido o registro não invasivo da dinâmica neural in vivo em tempo real utilizando microscopia de fluorescência e indicadores de cálcio codificados geneticamente, expressos em células-alvo 1,2,3. Esses sensores normalmente usam uma proteína fluorescente verde (GFP), como a família do peptídeo GFP-calmodulina-M13 (GCaMP), para aumentar a intensidade da fluorescência após a ativação neuronal e níveis elevados de cálcio intracelular. A imagem do cálcio tem sido especialmente poderosa no nematoide C. elegans para examinar como neurônios e circuitos neurais funcionam em animais vivos e comportados 4,5,6,7,8,9,10, pois sua natureza transparente significa que nenhum processo cirúrgico é necessário para o acesso óptico, e promotores gênicos específicos de células têm como alvo a expressão para as células de interesse. Essas técnicas frequentemente utilizam dispositivos microfluídicos, que fornecem ambientes precisamente controlados para estudar fenômenos biológicos, químicos e físicos em pequena escala física11,12. Dispositivos microfluídicos são abundantes para medir a atividade neural, com novos projetos continuamente em desenvolvimento, e eles são prontamente fabricados no laboratório de pesquisa. No entanto, muitos delineamentos aprisionam um único animal de cada vez, limitando o rendimento experimental 7,9,13. As respostas neurais geralmente variam substancialmente entre os animais devido a diferenças na experiência anterior, estados internos, como estresse ou fome, ou fatores estocásticos, como níveis de expressão gênica. Essas diferenças estabelecem a necessidade de métodos que possam simultaneamente estimular e observar muitos animais e extrair informações dosindivíduos4.
Além disso, certos fenômenos neuromodulatórios tornam-se aparentes apenas sob condições específicas de estimulação, como a inibição temporal14, que se refere à supressão breve das respostas quando a estimulação ocorre em rápida sucessão. Sistemas eletrofisiológicos podem conduzir a atividade neural através de um amplo espaço de estímulo para esse fim, modulando, por exemplo, a corrente de pulso elétrico, tensão, frequência, forma de onda, ciclo de trabalho e tempo de trens de estímulos periódicos. A estimulação indireta por estímulos naturalmente detectados ou sistemas optogenéticos se beneficiaria de uma amplitude semelhante de mecanismos de controle. Atualmente, muitos estímulos naturais são apresentados de forma simples "on-off", como apresentação e remoção de odores, utilizando sistemas comerciais que têm demorado a agregar flexibilidade. No entanto, microcontroladores de baixo custo agora podem automatizar a entrega de vários tipos de estímulos de uma maneira personalizável às necessidades dos pesquisadores. Combinados com a microfluídica, esses sistemas alcançaram o objetivo de aumentar o rendimento experimental e a flexibilidade, permitindo que respostas neurais a uma variedade de estímulos precisos fossem medidas simultaneamente em muitos animais 4,6. A estimulação multimodal pode ser usada para interrogar ainda mais os circuitos neuronais, como por exemplo, monitorando mudanças na excitabilidade neural ao estimular consistentemente antes, durante e após uma perturbação ortogonal, como a exposição a drogas4. Os benefícios de sistemas de microscopia abertos e de baixo custo são claros para o avanço da pesquisa científica, mas, na prática, a necessidade de fornecimento de peças, construção e validação de desempenho pode impedir a adoção dessas técnicas.
Este protocolo visa atenuar alguns destes desafios técnicos. Considerando que protocolos anteriores enfocaram o uso de dispositivos microfluídicos e estimulação básica 9,15,17, descrevemos aqui a construção e o uso de um sistema flexível, automatizado e multimodal de liberação de estímulos para imagens neurais em C. elegans ou outros pequenos organismos utilizando dispositivos microfluídicos previamente descritos4. O sistema de código aberto é programado através de arquivos de texto simples para definir os experimentos, e o programa de análise de dados NeuroTracker extrai semi-automaticamente os dados de atividade neural dos vídeos do microscópio. Demonstramos esse sistema com exemplos de avaliação de inibição temporal, desinibição e crosstalk de estímulos utilizando o neurônio quimiossensorial AWA, que se despolariza em resposta a diferentes odores alimentares ou em resposta à luz ao expressar canais iônicos optogenéticos sensíveis à luz 5,6.
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Protocol
1. Equipamento de imagem neural
NOTA: Veja Lawler e Albrecht15 para obter instruções detalhadas sobre a construção do sistema de imagem e estimulação, que controla o tempo de iluminação do microscópio, a aquisição da imagem e a entrega de estímulos (Figura 1). Um controlador de estímulo Arduino Nano de baixo custo aciona as válvulas fluídicas através de sinais digitais para um controlador de válvulas e controla a iluminação optogenética através de sinais de tensão analógicos para um controlador LED. Outros estímulos, como motores de vibração e aquecedores térmicos, podem ser controlados por meio de sinais digitais ou analógicos. O controlador de estímulo sincroniza a estimulação e a gravação das imagens por meio de sinais de câmera, conforme especificado pelo software de controle de microscópio Micro-Manager de código aberto (μManager)16. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes, equipamentos e organismos utilizados neste protocolo.
- Montar o equipamento de imagem neural, incluindo um microscópio de epifluorescência com óptica GFP, uma câmera sCMOS com um sinal de saída de exposição digital e um controlador de estímulo15.
- Conecte o controlador de estímulo aos sistemas desejados através de sinais digitais ou analógicos. Para os exemplos apresentados a seguir, são utilizados os seguintes sistemas:
- Use um controlador de válvula para estimulação química. Conecte o controlador de válvula a válvulas solenoides ou pinças fluídicas (Figura 1)15.
- Use um LED vermelho de 615 nm e um controlador para estimulação optogenética, montado acima do estágio do microscópio.
- Configure o computador com o software de controle do microscópio, crie uma Predefinição de Configuração com as configurações do equipamento e garanta o funcionamento adequado do controle do estímulo15.
2. Fabricação de dispositivos microfluídicos
NOTA: Ver Lagoy et al.17 para obter informações detalhadas sobre a obtenção ou fabricação dos moldes mestres e a produção, uso e limpeza dos dispositivos microfluídicos. Essas etapas são resumidas a seguir.
- Obter ou fabricar um molde mestre usando o arquivo de projeto microfluídico fornecido (albrechtlab.github.io/microfluidics)17. Para adultos jovens de C. elegans, certifique-se de que a altura do canal seja de 55-70 μm.
- Combine a base PDMS e o agente de cura em uma proporção de 10:1 por peso e misture completamente com pipetas de transferência.
- Desgaseifique por 30-60 min em um exsicador a vácuo até que as bolhas desapareçam.
- Coloque o molde mestre em uma placa de Petri grande (150 mm de diâmetro) e despeje o PDMS desgaseificado até uma profundidade de 4-5 mm (~100 g). Inspecione e remova qualquer poeira ou bolhas com uma pipeta de transferência.
- Asse a 65 °C em uma prateleira nivelada do forno por 3 h até a noite.
- Uma vez curado, use um bisturi para cortar o PDMS do molde e uma lâmina de barbear reta para separar os dispositivos.
- Perfure os orifícios de entrada e saída usando um punch dérmico de 1 mm e limpe-os com dH 2 O, etanol e novamente comdH2O. Seque o dispositivo em uma corrente de ar (ver Figura 2A).
- Limpe ambos os lados do dispositivo PDMS com fita adesiva, removendo qualquer poeira ou detritos.
- Preparar as lâminas de vidro para completar o dispositivo microfluídico conforme descrito17. Faça furos de entrada na lâmina superior usando uma broca de diamante e torne a lâmina inferior hidrofóbica por exposição a vapores TFOCS ou aplicando tratamento de vidro repelente de água (Figura 2B).
- Monte o sanduíche do dispositivo PDMS de vidro em uma braçadeira (Figura 2C).
3. Preparo dos animais
- Obter ou criar animais com indicadores de cálcio geneticamente codificados expressos nos neurônios de interesse.
Observação : por exemplo, linha NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p: :d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry]) expressa GCaMP e o canal catiônico sensível à luz vermelha Chrimson no par de neurônios sensoriais AWA6. Ambos os transgenes são integrados ao genoma para uma expressão estável em todos os animais. - Um dia antes da experimentação, colocar pelo menos 20 larvas L4 em estágio de C. elegans por experimento em uma placa de ágar meio de crescimento de nematódeo (NGM) semeada com um gramado OP50 E. coli. Quando mantido a 20 °C, sincronizará os animais selvagens na fase de adulto jovem no dia seguinte.
NOTA: Para transgenes de matriz, escolha animais usando um estereoscópio de fluorescência para garantir a expressão de transgenes nos animais escolhidos.
4. Preparação da solução
- Preparar 1x S tampão basal (100 mM NaCl e 0,05 M KPO4, pH 6,0) a partir de uma solução estoque de 10x.
- Preparar tampão tetramisole 1 mM diluindo 1 M em 1x S Basal. Use este buffer paralítico para preparar todos os estímulos. Um experimento normalmente usa cerca de 150 mL.
- Adicionar 0,1-1 μg/mL de fluoresceína aos reservatórios tampão "controle" para visualizar o fluxo.
- Crie soluções de estímulo por diluição seriada até a concentração final desejada. Por exemplo, crie uma diluição de 10−7 de atrativo de diacetil criando primeiro um estoque de 10−3 .
NOTA: Uma pequena quantidade de fluoresceína (0,1–1 μg/mL) pode ser adicionada ao estímulo ou solução tampão para verificar o tempo do estímulo, mas a concentração deve ser mínima para evitar artefatos na fluorescência neural.
5. Preparação do dispositivo microfluídico
NOTA: Veja Reilly et al.9 para um protocolo de vídeo mostrando a geração do reservatório, a configuração do dispositivo e o carregamento dos animais. Ver também Lagoy et al.17 para um protocolo escrito incluindo muitas dicas úteis.
- Prepare três ou mais reservatórios de fluidos. Para cada um, anexe um reservatório de seringa de 30 mL ou 60 mL, uma seringa de priming de 3 mL e um stub de agulha a uma válvula Luer de três vias (Figura 2D). Conecte a agulha à tubulação de microfuro equipada com um tubo de metal na extremidade. Rotule os reservatórios, monte-os em um rack acoplado a um suporte de anel e preencha-os com o buffer ou fluidos de estímulo correspondentes (Figura 2E).
- Desgaseifique o dispositivo microfluídico montado em um exsicador a vácuo por ~1 h.
- Encha e remova as bolhas de ar da tubulação do reservatório usando a seringa de escorvamento. Encha a tubulação de saída com tampão.
- Retire o dispositivo microfluídico do vácuo e insira rapidamente a tubulação de saída e injete o fluido através do dispositivo até que uma gotícula saia de uma entrada.
- Nessa entrada, use uma conexão "drop-to-drop"17 para inserir o tubo de entrada fluídico correspondente (Figura 2F). Certifique-se de que as gotas de líquido estejam presentes na tubulação de entrada e no orifício da porta do dispositivo para evitar a introdução de uma bolha.
- Injete mais líquido da saída, conecte o próximo tubo de entrada e repita até que todas as entradas estejam cheias. Insira um pino de bloqueio sólido em todas as entradas não utilizadas e na porta de carregamento do worm.
- Inicie o fluxo abrindo as válvulas Luer de entrada e saída. Inspecione o dispositivo em busca de vazamentos nas entradas e na base de vidro. Inspecione o dispositivo em busca de bolhas dentro dos canais de fluxo ou entradas usando o software de captura de imagem do microscópio no modo ao vivo.
NOTA: Se houver bolhas, aguarde até que elas sejam absorvidas pelo material do PDMS.
6. Carregamento de animais
NOTA: Ver Lagoy et al.17.
- Transfira animais adultos jovens para uma placa de ágar NGM sem sementes usando uma "picareta" com ponta de arame.
- Inundar a placa com aproximadamente 5 mL de tampão basal 1x S para que os animais estejam nadando.
- Desenhe os vermes para uma seringa de carga (seringa de 1 mL ou 3 mL com tubo anexado que tenha sido pré-preenchida com 1x S Basal).
- Usando um estereoscópio, mova a extremidade da tubulação abaixo da superfície líquida com uma mão para cada animal desejado e desenhe-a para dentro da tubulação usando a seringa segurada na outra mão.
- Desenhe os vermes apenas para dentro da tubulação, não para a seringa.
NOTA: A tubulação normalmente contém apenas cerca de 100 μL. Os animais podem ser expelidos para uma área local e, em seguida, atraídos novamente para a tubulação com um pequeno volume.
- Feche a linha de saída, remova o pino de carregamento do worm e conecte a seringa de carregamento do worm ao dispositivo usando uma conexão drop-to-drop.
- Fluir suavemente os animais para dentro da arena, estabelecer fluxo tampão e permitir até 1 h para imobilização por tetramisole.
NOTA: Durante o período de imobilização, certifique-se de que apenas o fluido tampão entre na arena. Os reservatórios de estímulo e controle podem ser desligados durante esse período, mas abertos, e verificam o fluxo correto antes de executar as tentativas de estimulação.
7. Estimulação automatizada e registro neuronal
- Crie um arquivo de texto de definição de estímulo chamado "User Defined Acquisition Settings.txt" com um editor de texto (por exemplo, Bloco de Notas) contendo as configurações de estimulação para a aquisição automatizada de imagens (veja exemplos na Figura 3). As configurações são divididas em duas seções:
- Configurações de aquisição do microscópio: Defina o tipo de experimento (Single-Stimulus ou Multi-Pattern), o tempo de exposição e excitação, a duração e os intervalos do teste e salve o diretório.
- Configurações de estimulação: Definir os parâmetros de controle de estímulo. Um "comando de estimulação" especifica as ações que ocorrem em determinados quadros de vídeo com a sintaxe
, onde os códigos das letras são A = válvula1, B = válvula2, C = válvula3, L = luz LED; Além disso, maiúsculas = ativadas e minúsculas = desativadas. A intensidade do LED é definida com a letra código "i" e um valor de 0 (desligado) a 255 (brilho máximo).
NOTA: O valor de intensidade do LED de 0 a 255 define a tensão analógica de saída de 0 V a 5 V. O controlador de corrente usado aqui tem uma escala de intensidade linear, e outros devem ser calibrados com um medidor de potência leve.- Para um experimento de estímulo único com apenas um comando de estimulação repetido, use o formato da Figura 3A.
- Para um experimento Multi-Pattern com múltiplos comandos de estimulação, use o formato na Figura 3B. Inclua uma "Sequência de Padrões" de dígitos que represente a ordem dos padrões de estímulo. Para cada padrão, insira um comando de estimulação em uma linha separada.
NOTA: Uma sequência pseudoaleatória ou sequência m pode ser útil para investigar a dependência da história do estímulo.
- Execute o software de controle do microscópio. Verifique se todas as entradas fluídicas estão abertas, se o fluxo está conforme desejado dentro da arena (ver Figura 2H) e se os neurônios de interesse estão em foco dentro da janela ao vivo.
- Feche a janela ao vivo e execute o script "MultiPattern_RunScript.bsh" dentro do software.
NOTA: É útil executar um experimento de teste sem animais para verificar o fluxo e a estimulação adequados. A substituição de uma concentração diferente de fluoresceína para cada fluido de estímulo pode ajudar a visualizar e documentar novos padrões de estímulo. - Após a experimentação, desmonte o dispositivo microfluídico e lave todas as superfícies, tubulações e reservatórios com água.
NOTA: Todos os componentes podem ser reutilizados dezenas de vezes se mantidos limpos. Certifique-se de que reservatórios, tubulações e dispositivos microfluídicos sejam mantidos úmidos ou totalmente secos em uma corrente de ar para evitar a cristalização do sal, que pode entupir e é difícil de remover. Os dispositivos podem ser mantidos em etanol para esterilização, mas devem ser totalmente secos antes da reutilização (>1 h a 65 °C)17.
8. Análise de dados utilizando o NeuroTracker
NOTA: NeuroTracker 4,18,19 é um plugin de software ImageJ/FIJI20 para rastrear a intensidade de fluorescência de vários neurônios e animais, mesmo quando eles se movem durante os testes. Este plugin salva dados como arquivos de texto com a posição de cada neurônio e intensidade de fluorescência corrigida pelo fundo (F). Os dados de fluorescência são normalizados para a fluorescência basal (F 0), por exemplo, a média de vários segundos antes da estimulação, como Δ F/F 0 = (F -F 0)/F 0, que pode ser calculada em média entre as populações.
- Instale scripts do NeuroTracker conforme as instruções (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
- Execute o NeuroTracker clicando em Plugins | Rastreamento | NeuroTracker.
- Selecione a pasta que contém o arquivo . Arquivos de vídeo TIF a serem rastreados e selecione as configurações desejadas.
Observação : se apenas um subconjunto dos arquivos de vídeo devem ser rastreados, selecione o intervalo numérico dos arquivos para analisar no prompt. As configurações de rastreamento padrão são apropriadas para animais não móveis com resolução de 250 pix/mm. Ajuste os parâmetros proporcionalmente para outras resoluções. Consulte o Guia do Usuário19 para obter mais informações sobre configurações. - Defina o limiar de intensidade de forma que os neurônios fiquem visíveis para seleção (Figura 4).
- Abra as janelas de controle Brilho/Contraste (B/C) e Limite usando a Imagem | Ajustar menu.
- Na janela B/C , ajuste os controles deslizantes Mínimo e Máximo até que os neurônios estejam claramente distinguíveis (Figura 4A).
- Na janela Limite , marque Fundo escuro e Não redefinir intervalo.
- Deslize o controle deslizante do quadro para observar o movimento do neurônio e as mudanças de intensidade, observando quaisquer animais a serem excluídos do rastreamento, como devido à sobreposição com outros animais.
- Identifique os neurônios para rastreamento.
- Para cada animal, ajuste o nível de limiar de tal forma que a área de limiar vermelha acima do neurônio seja visível em todos os quadros antes, durante e após a estimulação.
- Clique no neurônio para registrar sua posição e nível de limiar.
- Repita o ajuste e a seleção do limiar para cada animal e neurônio a ser rastreado. Consulte a Figura 4C para obter um bom exemplo de nível de limite e a Figura 4D,E para obter exemplos acima e abaixo do limite. Os neurônios previamente selecionados são indicados por uma pequena caixa.
- Quando todos os neurônios estiverem selecionados, pressione a barra de espaço para iniciar o rastreamento.
NOTA: Para obter exemplos adicionais do NeuroTracker, consulte as referências anteriores 4,19. - Monitore o processo de rastreamento de cada animal e faça as correções necessárias.
- Se o NeuroTracker pausar, ele perdeu o neurônio. Clique novamente no neurônio, ajustando o nível de limiar conforme necessário.
- Se a caixa de integração saltar para outro animal próximo ou estrutura não neuronal, pressione a barra de espaço para pausar, mova o controle deslizante de volta para o primeiro quadro errôneo e clique novamente na localização correta do neurônio.
9. Exploração e visualização dos dados
NOTA: O script de análise MATLAB é usado para processamento e visualização de dados e para gerar PDFs de resumo para cada análise.
- Execute o arquivo "NeuroTrackerSummary_pdf.m" no MATLAB e selecione a pasta que contém os arquivos de texto de dados do NeuroTracker.
- Aguarde a produção de um PDF resumido, permitindo a verificação do processo de rastreamento (Figura 5). Os animais são identificados por um número (Figura 5A), e as respostas neurais de cada animal e ensaio podem ser visualizadas para avaliar a variabilidade populacional (Figura 5B).
- Use a função "databrowse.m" para explorar os dados neurais, por exemplo, agrupando por número de ensaio (Figura 5C), por número de animais (Figura 5D), por padrão de estimulação ou por outra categoria.
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Representative Results
Apresentamos vários exemplos de padrões de estímulos que avaliam diferentes fenômenos neurais, incluindo inibição temporal, adaptação e desinibição. A inibição temporal é a supressão momentânea de uma resposta neural à apresentação de um segundo estímulo que ocorre logo após a apresentação inicial14. Para testar esse fenômeno, em um experimento de pulso pareado, oito padrões consistindo de dois pulsos odorantes de 1 s separados por um intervalo que variava de 0 s a 20 s foram apresentados (Figura 6B; ver Figura 3B para o arquivo de controle de estímulo correspondente). A arena foi montada com fluido de estímulo único (diacetilo de 1,1 μM), tampão e tubo de fluxo controle, com a porta de entrada não utilizada bloqueada com um pino sólido (Figura 6A). Ao ligar a válvula 1, o fluido de controle entra na entrada ctrl1, deslocando as correntes de fluido de tal forma que o estímulo entra na arena; quando a válvula 1 está desligada, o fluido de controle entra na entrada ctrl2 e o buffer flui através da arena (ver Figura 2G,H). Enquanto o primeiro pulso de odor de 1 s provocou igual magnitude de resposta nos neurônios AWA que detectam diacetil, as respostas ao segundo pulso variaram com o intervalo interestímulo (Figura 6D). Para intervalos de pulso inferiores a 10 s, a segunda resposta foi mais fraca, demonstrando o fenômeno de inibição temporal. Usando essa configuração experimental, a ruptura do componente de dineína CHE-3 foi encontrada para impedir a inibição temporal, implicando o transporte axonal neste fenômeno5.
Adaptação é a diminuição gradual das respostas neurais a repetidas apresentações de um mesmo estímulo. Esse fenômeno pode ser causado por diferentes processos, como a inibição ativa, que pode ser revertida rapidamente, ou outros processos que demoram a ser revertidos. Um experimento para avaliar a reversibilidade rápida é um ensaio "catch", no qual um estímulo é repetido para estabelecer adaptação, seguido por um estímulo "desviante" ou novo e, em seguida, um retorno ao estímulo original. A desinibição é observada se as respostas neurais aumentam após o novo estímulo "desinibidor". A Figura 7 demonstra um exemplo utilizando dois odorantes, diacetil e 2-metilpirazina (2-MP), detectados pelos neurônios quimiossensoriais AWA via diferentes receptores4. Dois reservatórios de estímulo e tubulação foram conectados ao dispositivo microfluídico, com uma válvula de pinça adicional de três vias para determinar qual estímulo entra na arena (Figura 7A). Os padrões de estímulo foram definidos para apresentar pulsos químicos de 4 s via válvula 1 para todas as 30 tentativas e para selecionar entre o estímulo S1 ou S2 via válvula 3, que foi ligada após a 25ª tentativa e desligada após a 26ª (Figura 7B). Esse arranjo garantiu tempo suficiente para que os diferentes fluidos de estímulo fluíssem através do dispositivo microfluídico antes da apresentação aos animais. Observou-se adaptação ao estímulo diacetil, mas a apresentação do novo estímulo de 2 MP não provocou forte efeito desinibidor (Figura 7C).
A estimulação optogenética usa a luz para ativar neurônios através de canais iônicos sensíveis à luz. Embora conveniente de usar, a ativação optogenética ignora receptores sensoriais e algumas vias regulatórias, de modo que alguns fenômenos neurais podem diferir em comparação com a ativação por estímulos naturais. Para testar essas diferenças, experimentos multimodais são úteis para apresentar diferentes tipos de estimulação dentro de um mesmo experimento. Os neurônios que expressam a variante Chrimson da canalrodopsina são ativados pela exposição à luz vermelha5. Para avaliar se os neurônios AWA se adaptam de forma semelhante à estimulação química e optogenética, a cepa NZ1091 expressando Chrimson e GCaMP nos neurônios AWA foi mantida em uma placa contendo o cofator all-trans-retinal (ATR, 100 μM) por 14-28 h. Um LED vermelho de 615 nm iluminou a arena microfluídica de cima (Figura 8A), e um conjunto de padrões de estímulos multimodais foi gerado fornecendo pulsos de 5 s de diacetil, luz vermelha ou ambos dentro do mesmo ensaio (Figura 8B). A estimulação química isoladamente causou adaptação, enquanto a estimulação óptica isoladamente não causou (Figura 8C). No entanto, o padrão de estímulo multimodal combinado demonstrou que as respostas optogenéticas foram suscetíveis à adaptação induzida quimicamente (Figura 8C,D). Esses experimentos sugerem que a adaptação é iniciada em receptores sensoriais ou processos dendríticos, mas seus efeitos se espalham por todo o neurônio.
Figura 1: Esquema do equipamento de estimulação e registro do cálcio neural. A captura da imagem do microscópio, a luz de excitação por fluorescência e a estimulação são controladas por um computador e um microcontrolador Arduino de código aberto. A estimulação química na arena microfluídica alterna entre as soluções de tampão B e estímulo S via fluxo de fluido de controle C. Os elementos opcionais do sistema são indicados por um asterisco (*), como válvulas adicionais e modalidades de estimulação óptica ou outras. As imagens do microscópio de fluorescência são usadas para medir a atividade neural via transientes de cálcio, por exemplo, usando o indicador de cálcio GCaMP. As linhas tracejadas representam as conexões elétricas (digitais ou analógicas), as linhas curvas são a tubulação de fluido e as setas sólidas retas são os caminhos ópticos da luz. Abreviação: LED = diodo emissor de luz. Esta figura é modificada de Lawler e Albrecht15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Montagem e configuração do dispositivo microfluídico. O dispositivo microfluídico é composto por um dispositivo PDMS micropadronizado (A) prensado entre um (B) tampo de vidro perfurado e base de vidro hidrofóbico e (C) fixado. (D) Os reservatórios são posicionados acima do dispositivo com um suporte de rack de tubulação (E). A tubulação dos reservatórios é conectada diretamente ao dispositivo ou através de válvulas acionadas para controle fluídico. O aparelho é posicionado acima da objetiva no microscópio. (F) Imagem em close-up do dispositivo microfluídico com toda a tubulação conectada nas entradas, na porta de carregamento do worm e na saída. (G) Esquema do dispositivo microfluídico de 20 mm x 20 mm. As linhas pretas representam os canais de fluido de 55-70 μm de altura. Esta geometria é projetada para permitir um controle espaço-temporal preciso com uma frente de estímulo perpendicular ao fluxo, mantendo os animais dentro da arena e do campo de visão do microscópio. O fluxo Buffer e um fluxo Stimulus (ou opcionalmente Stim2, se usado) fluem continuamente, enquanto apenas um fluxo de entrada de fluido de controle flui por vez, deslocando qual fluido entra na arena. (H) Quando a Válvula 1 é energizada, o fluido de controle flui da porta normalmente fechada para a entrada de controle1, e o estímulo se liga e flui através da arena. Quando a Válvula 1 está desligada, o fluido flui da porta normalmente aberta para a entrada control2 e o buffer entra na arena. O equilíbrio de fluxo adequado é mostrado, com corante fluoresceína usado como fluido de estímulo. Observe que parte do fluido que entra na arena também o contorna através dos canais curvos superior e inferior. Esses córregos devem ser estreitos e ter largura igual nos canais superior e inferior. As alturas do reservatório podem ser ajustadas conforme necessário. Abreviações: PDMS = polidimetilsiloxano; WL = carregamento de worm; Buf = tampão; Stim1 = primeiro estímulo; Stim2 = segundo estímulo; CP = normalmente fechado; NO = normalmente aberto. Esta figura é modificada de Lawler e Albrecht15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exemplo de arquivos de definição de estímulo. (A) Exemplo de experimento de estímulo de repetição única: um pulso de luz de 5 s na intensidade 200 de 2 s a 7 s (quadro 20 a 70). (B) Exemplo de experimento de estímulo multipadrão com oito diferentes padrões de estímulos, correspondentes à Figura 6. Dois pulsos químicos de 1 s são apresentados com um intervalo de 0 s a 20 s entre eles. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Seleção de neurônios e níveis de limiar no NeuroTracker . (A) Campo de visão completo do microscópio, com o brilho e contraste ajustados para ver claramente os neurônios AWA. (B) Visão ampliada da região da cabeça de um animal representando a caixa de integração a partir da qual a intensidade da fluorescência é calculada e o anel de fundo para subtração de fundo. (C) Gráfico de intensidade integrado mostrando uma resposta neural robusta. (D) Uma boa seleção de limite resultará em uma região de limite vermelha que está acima do parâmetro Tamanho mínimo e abaixo do parâmetro Tamanho máximo para cada quadro na pilha de imagens e não inclui regiões próximas, como autofluorescência intestinal (consulte o painel B). (E) Um limiar muito alto pode parecer bom quando o neurônio está ativo, mas quando inativo, o neurônio pode ser perdido. Portanto, é importante verificar os quadros pré e pós-estimulação ao selecionar um limiar. (F) Um limiar muito baixo pode destacar outras estruturas não neuronais. A seleção acima ou abaixo do limiar pode levar o NeuroTracker a perder o neurônio e fazer uma pausa para o feedback do usuário para corrigir o limiar e a posição do neurônio. Abreviação: B&C = brilho e contraste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Exemplo de análise de dados. Respostas neurais de 15 animais expostos a 10 repetições de uma estimulação optogenética de 5 s de duração uma vez por minuto. (A) Imagem sumária indicando os animais rastreados e o movimento dos neurônios dentro do ensaio (caixas vermelhas). O animal 2 se moveu durante o experimento. (B) As respostas individuais dos animais ao longo do tempo mostram uma resposta relativamente consistente à estimulação da luz vermelha. (C) Saída de exploração de dados usando a função dataprocurer . Os rastreamentos são agrupados por repetição de teste (acima), e as médias são mostradas abaixo para testes selecionáveis pelo usuário. (D) Dados agrupados por número individual de animais e calculados em média ao longo de ensaios repetidos. Esse conjunto de dados mostra mínima variabilidade interanimais, justificando respostas médias em toda a população. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Experimento de pulso pareado com intervalo interestímulo variável para avaliar a inibição temporal . (A) Conexões de entrada do dispositivo microfluídico. A entrada não utilizada é bloqueada com um pino sólido (X). O reservatório do fluido de controle e a válvula1 são conectados às entradas c1 e c2, omitidas aqui para maior clareza. (B) Temporização do estímulo para oito padrões. Os pulsos têm 1 s de duração e estão separados por 0-20 s. A sequência de padrões é descrita abaixo; cada padrão foi apresentado seis ou sete vezes. (C) Atividade neural da AWA de 50 ensaios e nove animais. Um mapa de calor de respostas ordenadas por padrão de estimulação é mostrado acima; A média da atividade neural para cada padrão (n=56-63 respostas) é mostrada a seguir. A inibição temporal ocorre por ~10 s após o pulso inicial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Experimento de captura para avaliar a desinibição . (A) Conexões de entrada do dispositivo microfluídico. Uma válvula de pinça de três vias permite que apenas o estímulo S1 passe em repouso e apenas S2 passe quando energizado. (B) Diagrama das três sequências padrão usadas para entregar os pulsos repetidos de odor de diacetil, com o novo estímulo 2-metilpirazina apresentado no local na 26ª tentativa. (C) Respostas médias da atividade neural da AWA em 20 animais. Abreviações: DA = diacetil; 2-MP = 2-metilpirazina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Exemplo de estimulação multimodal . (A) Conexões de entrada do dispositivo microfluídico, com uma entrada não utilizada bloqueada com um pino sólido. Um LED vermelho ilumina a arena de cima. (B) Padrões para estimulação óptica, química ou multimodal. (C) Atividade neural média da AWA (n = 11 animais) para 30 tentativas repetidas com estimulação optogenética e quimiossensorial pareada (superior), optogenética somente (meio) e quimiossensorial somente (inferior). (D) Média da resposta neural de pico para cada ensaio para pulsos optogenéticos acima e pulsos químicos abaixo. Os pulsos optogenéticos não causam diretamente adaptação, mas suas respostas são suscetíveis à adaptação quimiossensorial. Abreviações: DA = diacetil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste protocolo, descrevemos um sistema de microscopia de acesso aberto para a avaliação de fenômenos de atividade neural usando a entrega temporalmente precisa de diferentes padrões de estímulo. A plataforma microfluídica fornece estímulos repetíveis enquanto mantém dezenas de animais no campo de visão do microscópio. Poucos pacotes de software de microscopia comercial permitem a fácil programação de vários padrões de temporização de estímulos, e aqueles que o fazem geralmente exigem a entrada manual de cada padrão ou formatos de arquivo proprietários. Em contraste, os experimentos são definidos neste sistema por arquivos de texto, que podem ser gerados por computador e são legíveis por softwares de análise. Aqui, demonstramos a utilidade de empregar padrões variáveis de estímulo para avaliar fenômenos neuronais como inibição temporal, adaptação e crosstalk durante estimulação multimodal. O pipeline de análise de dados reduz grandes arquivos de vídeo de microscopia a dados de atividade neural que podem ser visualizados e analisados quanto à variabilidade populacional (Figura 5B), mudanças ao longo do tempo (Figura 7C e Figura 8C,D) e mudanças após perturbação (Figura7C).
Um dos principais benefícios da automação é a reprodutibilidade da estimulação entre repetições de experimentos e entre experimentos, e o formato de arena microfluídica permite um aumento de pelo menos 20 vezes no rendimento em comparação com métodos anteriores com um único animal 7,9,13. Submeter uma população de animais ao mesmo estímulo e condições ambientais garante que os dados sejam comparáveis e evita possíveis variações diárias na preparação da solução, temperatura, fontes animais ou outros fatores. No entanto, uma limitação dessa abordagem é a microscopia de baixa magnificação e baixa resolução, que mantém todos os animais no campo de visão. Apenas um neurônio deve ser monitorado por animal para minimizar erros de rastreamento, embora neurônios separados por pelo menos 50 μm possam, em princípio, ser distinguidos. Pares de neurônios bilaterais podem ser fotografados juntos se se espera que as respostas sejam simétricas. É importante primeiro identificar quais neurônios específicos estão envolvidos em um processo neural de interesse, como por imagem de todo o cérebro7, e então expressar GCaMP apenas nos neurônios relevantes para aumentar o rendimento.
As respostas neuronais de cálcio variam de acordo com o animal devido aos níveis de expressão do repórter ou outras diferenças interindividuais. Por exemplo, as respostas normalizadas do AWA GCaMP variam duas vezes em magnitude de pico, mesmo em animais selvagens isogênicos com o repórter de cálcio integrado estavelmente ao genoma4. Alguns estímulos mostram respostas variáveis em toda a população (por exemplo, acetato de butila4), sugerindo expressão variável do receptor. Na prática, pelo menos 20 animais individuais devem ser avaliados para determinar a variabilidade populacional. Recomenda-se fazer uso de dados individuais de animais para aumentar o poder estatístico na determinação de mudanças de resposta, como a comparação estatística de respostas neurais individuais pareadas antes e depois de uma perturbação.
Com grandes conjuntos de dados e experimentação automatizada, é importante validar e verificar a função adequada do experimento, o rastreamento e a redução de dados, especialmente para etapas autônomas. Os padrões de fluxo devem ser verificados com soluções fluorescentes (como na Figura 2H), observando-se a ausência de bolhas ou fluido de controle entrando na arena nos vídeos gravados. Os conjuntos de dados devem ser validados, por exemplo, observando qualquer movimento do animal (como na Figura 5A) e verificando respostas neurais suaves (como na Figura 4C e na Figura 5B). Quaisquer dados problemáticos devem ser excluídos. Também é importante verificar o agrupamento de dados antes da média usando a função "procurar dados" para garantir que a resposta média reflita respostas individuais.
O sistema de controle de estimulação de código aberto é facilmente extensível a outros estímulos através de sinais digitais ou analógicos ou comandos de comunicação serial. Estímulos graduados são tipicamente controláveis por entradas de tensão analógica (0-5 V), como intensidade de luz LED ou magnitude de pulso do estimulador de nervo. Os estímulos liga-desliga são tipicamente controlados com sinais digitais (TTL), como o tempo do estimulador elétrico. Esses sinais digitais também podem acionar interruptores de relé para ativar outros sistemas elétricos, como motores de vibração para estimulação mecanossensorial. Outros equipamentos utilizam comunicação serial, como por conexão USB, com comandos de caracteres específicos transmitidos para definir ações. Por exemplo, experimentos de dose-resposta podem apresentar várias concentrações químicas automaticamente usando uma válvula rotacional controlada por USB5 ou um sistema de placas multipoços6. Esses comandos podem ser adicionados aos scripts de controle de microscópio de código aberto para serem enviados em números de teste específicos. Os atrasos de tempo podem ser igualmente incorporados; Por exemplo, para pausar o teste por 1 h entre duas sessões de estimulação de 30 tentativas, deve-se especificar um experimento de 60 tentativas e adicionar uma única linha de código para pausar por 1 h quando o número do teste atingir 31.
A complexidade experimental é virtualmente ilimitada e pode até mudar durante um experimento baseado em feedback ao vivo em um sistema de "circuito fechado". Por exemplo, a estimulação pode variar em tempo real com base na atividade neural, comportamento animal ou outro parâmetro quantificável. Recentemente, utilizamos este sistema para avaliar as respostas neurais sensoriais em animais dormindo versus acordados, desencadeando estimulação e registro neural após uma mudança de comportamento 8,15. O recurso de rastreamento de movimento do NeuroTracker permite a análise da atividade neural em animais em movimento livre para correlação com a saída comportamental. No entanto, o rastreamento de animais em movimento individuais requer muita atenção, como quando eles se cruzam, e é, portanto, recomendado carregar menos animais por arena (cerca de cinco) para minimizar essas interações.
Em geral, essas técnicas aumentam a precisão da estimulação e o rendimento experimental na exploração da variabilidade populacional e de fenômenos neurais específicos. Além de medir a atividade neuronal, esses métodos são generalizáveis para outros biossistemas, incluindo plantas, que também se comunicam via sinais de cálcio 21, cultura de células neurais e organoides cerebrais 22, bem como para outros sinais fluorescentes dinâmicos, como sensores de atividade sináptica, liberação de neurotransmissores23 e transcrição24.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Agradecemos à Fox Avery por testar esses protocolos e revisar o manuscrito e a Eric Hall pela assistência na programação. O financiamento para os métodos aqui apresentados foi fornecido em parte pela National Science Foundation 1724026 (D.R.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strains | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
| Software and algorithms | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
| 2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
| 3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
| Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
| Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
| Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
| Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
| Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
| Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
| Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
| Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
References
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