Крио-STEM-томография позволяет визуализировать органеллы интактных клеток без встраивания, сечения или других инвазивных препаратов. Полученное 3D-разрешение в настоящее время находится в диапазоне нескольких нанометров, с полем зрения в несколько микрометров и доступной толщиной порядка 1 мкм.
Криогенная электронная микроскопия (крио-ЭМ) основана на визуализации биологических или органических образцов, встроенных в их нативную водную среду; Вода затвердевает в стакане (т.е. остекловывается) без кристаллизации. Метод крио-ЭМ в последнее время широко используется для определения структуры биологических макромолекул с околоатомным разрешением. Этот подход был распространен на изучение органелл и клеток с помощью томографии, но традиционный режим широкопольной трансмиссионной ЭМ-визуализации страдает от серьезного ограничения толщины образца. Это привело к практике фрезерования тонких ламелей с помощью сфокусированного ионного пучка; Высокое разрешение достигается путем усреднения субтомограмм по реконструкциям, но трехмерные связи за пределами оставшегося слоя теряются. Ограничение толщины можно обойти с помощью сканированной зондовой визуализации, аналогичной сканирующему ЭМ или конфокальному лазерному сканирующему микроскопу. В то время как сканирующая просвечивающая электронная микроскопия (STEM) в материаловедении обеспечивает атомное разрешение на отдельных изображениях, чувствительность криогенных биологических образцов к электронному облучению требует особых соображений. Этот протокол представляет собой установку для криотомографии с использованием STEM. Описана базовая топическая конфигурация микроскопа как для двух-, так и для трехконденсорных систем, в то время как автоматизация обеспечивается некоммерческим программным обеспечением SerialEM. Также описаны усовершенствования для сбора партий и корреляционного выравнивания с ранее полученными флуоресцентными картами. В качестве примера мы показываем реконструкцию митохондрии, указывая на внутреннюю и внешнюю мембрану и гранулы фосфата кальция, а также окружающие микротрубочки, актиновые филаменты и рибосомы. Крио-STEM-томография превосходно выявляет театр органелл в цитоплазме и, в некоторых случаях, даже ядерную периферию адгезивных клеток в культуре.
Трехмерная (3D) визуализация органелл является первостепенной задачей в современной клеточной биологии. Учитывая масштабы, варьирующиеся от десятков нанометров для секреторных везикул до многих микрон для ядра клетки, сложно найти единый метод микроскопии, подходящий для всех приложений. В то время как современная флуоресцентная микроскопия может охватывать большую часть диапазона с точки зрения разрешения, появляются только меченые молекулы. Клеточный театр остается областью электронной микроскопии. Традиционные методы химической фиксации, пластического встраивания и окрашивания тяжелыми металлами являются сильно инвазивными, поэтому результаты могут зависеть от деталей пробоподготовки. Крио-ЭМ, с другой стороны, ограничен необходимостью остекловывания водной среды; Кристаллы льда, которые образуют дифрагию электронного освещения, вызывают контрастные артефакты более высокого контраста, чем интересующий органический материал.
В последнее десятилетие наблюдается распространение методов ЭМ-визуализации, разработанных или адаптированных для клеточных исследований1. Замораживание под высоким давлением в сочетании с итеративным фрезерованием сфокусированным ионным пучком (FIB) и последовательной визуализацией поверхности с использованием сканирующего электронного микроскопа (т.е. FIB-SEM) в настоящее время является предпочтительным методом для больших образцов2. Криогенная мягкая рентгеновская томография (крио-SXT) подходит для образцов размером в несколько микрон, ограниченных характерной длиной поглощения мягких рентгеновских лучей в воде 3,4,5. Эта шкала включает в себя множество типов интактных клеток, а количественный характер контраста поглощения рентгеновских лучей добавляет аспект измерения концентрации6 или спектроскопии7. В сочетании с субтомограммным усреднением крио-просвечивающая электронная томография (крио-ЭТ), основанная на фазово-контрастной просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), обеспечивает самое высокое разрешение для макромолекул или комплексов 8,9,10. Однако редко бывает, что интактные органеллы настолько регулярны, что их можно усреднить целиком. Кроме того, обычный режим широкопольной ПЭМ ограничен для толщины образца несколькими сотнями нанометров сочетанием неупругого рассеяния (с потерей энергии) в образце и хроматической аберрации в магнитной линзеобъектива 11,12. Большой разброс энергии диктует использование энергетического фильтра для удаления образующейся не в фокусе дымки, но чувствительный образец по-прежнему страдает от радиационного повреждения, в то время как сигнал изображения становится экспоненциально слабее с увеличением толщины.
Альтернативный режим визуализации, сканирующий пропускание EM (STEM), обходит необходимость фильтрации энергии и сохраняет неупруго рассеянные электроны для формирования изображения, хотя в настоящее время с более низким разрешением, чем для ПЭМ-томографии (рис. 1). На самом деле никакого реального образа не образуется. Вместо этого, как и в сканирующем ЭМ, измерения производятся точка за точкой, а изображение собирается компьютером. Увеличение определяется только размером шагов сканирования без изменения токов объектива. При правильной настройке полезный диапазон толщины образца для крио-STEM-томографии (CSTET) может достигать 1,5 или даже 2 мкм, хотя зона комфорта, где полезная интенсивность сигнала остается значительной частью освещенности, составляет около 600-900 нм11,13. Этого достаточно, чтобы увидеть большую часть цитоплазмы, а иногда и край клеточного ядра. На практике мы обнаруживаем, что витрификация стандартным методом погружения в криогенную жидкость накладывает более серьезные ограничения на толщину, чем STEM-визуализация. Цель этой видеостатьи — облегчить включение CSTET в инструментальный сундук для визуализации клеток и органелл в исследовательских лабораториях и микроскопических установках.
Первая проблема заключается в том, что микроскопические операции в CSTET еще не стандартизированы для применения в науках о жизни так, как это было для крио-ПЭМ-томографии. Аппаратное обеспечение STEM редко (если вообще когда-либо) было нацелено на рынок крио-ЭМ. Однако ситуация меняется с появлением микроскопов новейшего поколения, и многие существующие инструменты могут быть модернизированы. STEM как метод получил широкое распространение и в значительной степени завоевал популярность в материаловедении, где также растет интерес к криогенным и низкодозовым методам14,15. Материаловедческая литература изобилует аббревиатурами BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM и т. д., которые добавляют путаницы. Мы предлагаем здесь рекомендуемую отправную точку, которая, по нашему коллективному опыту в Научном институте Вейцмана, предоставляет наиболее общий протокол для полезных результатов, основанных на визуализации STEM светлого поля (BF)16. Он ни в коем случае не исчерпывает и даже не исследует спектр возможностей, но послужит основой для дальнейших улучшений. Несмотря на то, что мы делаем упор на крио-STEM, большая часть протокола в равной степени актуальна для STEM-томографии при комнатной температуре пластиковых срезов.
Суть STEM заключается в сканировании образца сфокусированным электронным зондом (рис. 1), конусом освещения и записи сигналов из дифракционной (рассеивающей) плоскости пропускания, пиксель за пикселем, для получения 2D-изображений17,18. Аморфные образцы, включая большинство клеточных материалов, будут производить диффузную картину рассеяния при передаче. Простейшая практическая конфигурация STEM заключается в размещении круглого детектора для записи центрального диска (т. е. освещения зонда, которое будет передаваться без образца). Образец рассеивает электроны от этого конуса освещения до такой степени, что сигнал уменьшается. В результате получается изображение BF – образец кажется темным на ярком фоне. Кольцевой детектор также может быть использован (или вместо него) для обнаружения рассеяния от образца за пределами конуса освещения. При удаленном образце сигнала нет. Когда образец находится на месте, объекты выглядят яркими на темном фоне на изображении темного поля (DF). Номенклатура для STEM (BF, кольцевое темное поле [ADF], высокоугловое кольцевое темное поле [HAADF] и т. Д.) Относится в основном к диапазонам углов сбора для детекторов.
Угол схождения освещения представляет собой существенную адаптацию STEM к клеточной томографии. Когда главным приоритетом является высокое разрешение, угол схождения должен быть как можно больше. (Это похоже на конфокальную лазерную сканирующую микроскопию; разрешение определяется диаметром зонда, который масштабируется как длина волны, деленная на числовую апертуру. Обратите внимание, что мы ссылаемся на угол полуугла или полуконвергенции для EM.) С другой стороны, когда приоритетом является глубина резкости, компромисс в разрешении дает большое преимущество, поскольку сфокусированный луч остается примерно параллельным на расстоянии, равном удвоенной длине волны, деленной на полуугол в квадрате. В идеале весь объем ячейки остается в фокусе19. Например, при 300 кэВ длина волны де Бройля электрона составляет 0,002 нм, поэтому сходимость в 1 мрад дает разрешение 2 нм и глубину резкости 4 мкм. В этих условиях томография может быть выполнена даже без фокусировки в процессе сбора данных, но только один раз в начале сбора. Обычный STEM с возможностью томографии может достигать угла полуконвергенции 7 или 8 мрад; Поэтому, в принципе, мы могли бы достичь разрешения порядка 0,25 нм, но тогда с фокусной глубиной всего 62 нм. Это явно слишком тонко для клеточной визуализации. Более совершенные микроскопы с тремя конденсорными линзами обеспечивают непрерывную регулировку угла полуконвергенции в значительном диапазоне. В более традиционной конфигурации с двумя конденсаторами сходимость дискретно фиксируется апертурой конденсатора (C2).
Для прочных образцов, залитых пластиком, можно записать фокальную серию при каждом наклоне и объединить их для получения высокого разрешения20, но для криогенных образцов радиационный бюджет слишком сильно ограничен. Наконец, при взвешивании преимуществ визуализации BF или DF для толстых образцов следует учитывать эффекты многократного упругого рассеяния в образце. Сигнал BF менее искажен многократным рассеянием и показывает более высокое разрешение для толстых образцов16,21.
Полезное эмпирическое правило заключалось в том, чтобы установить углы сбора, в несколько раз превышающие конвергенцию. Чем толще образец, тем больше должен быть коллекционный диск. Слишком маленький диск обеспечит низкую интенсивность сигнала; Слишком большой диск приведет к плохой контрастности изображения, так как будет способствовать только рассеивание под самым высоким углом. Углы сбора должны быть оптимизированы для данного образца. Углы детектора в зависимости от длины камеры (дифракции) должны быть откалиброваны независимо. Они могут быть удобно отображены программным обеспечением микроскопа. На практике коэффициент от двух до пяти в отношении полууглов сбора к освещению, θ к α соответственно (рис. 1), является рекомендуемой отправной точкой для CSTET клеточных образцов.
Следующий протокол описывает работу STEM-томографии с использованием популярного программного обеспечения SerialEM для управления микроскопом22,23. SerialEM не привязан к конкретному производителю, и он широко используется в ПЭМ-томографии. Большинство операций по настройке томографии могут быть перенесены непосредственно из ТЭМ. Стратегия SerialEM заключается в моделировании системы сканирования в виде камеры. Это позволяет легко перейти от TEM к STEM. Однако следует иметь в виду, что такие параметры, как увеличение и биннинг, являются полностью искусственными. Важными параметрами являются поле зрения в микронах, количество пикселей в поле зрения и время экспозиции. Интервал между пикселями, или дискретизация, — это линейное поле, деленное на количество пикселей, а время выдержки — это количество пикселей, деленное на время экспозиции.
Минимальная конфигурация для STEM и CSTET включает в себя три функции микроскопа: генератор сканирования, детектор STEM и программное обеспечение для управления томографией. Протокол относится к номенклатуре FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), но концепции являются общими. Проприетарное программное обеспечение TFS было описано в JoVE для TEM24, и операция STEM очень похожа.
Мы предполагаем, что микроскоп был заранее выровнен сервисной группой или опытным персоналом и что выравнивание столбцов можно вызвать, загрузив файл. Незначительные корректировки называются прямыми выравниваниями и могут храниться в так называемых регистрах FEG (микроскопы TFS). Прямое выравнивание включает центр вращения, точки поворота, дифракционное выравнивание и компенсацию астигматизма конденсатора. Корректировки должны выполняться итеративно. Обратите внимание, что микроскопы TFS реализуют различные режимы нанозонда (nP) и микрозонда (μP); для данной апертуры конденсатора они обеспечивают относительно узкое или широкое поле зрения с параллельным освещением в ПЭМ и более или менее сходящимся (плотно сфокусированным) электронным пучком в STEM соответственно. Другие производители используют другие схемы, чтобы покрыть диапазон углов сходимости.
Перед началом следует выбрать поле зрения, L, и выборку (ширину пикселя), l, в зависимости от исследуемого образца. Например, для l = 1 нм/пиксель следует выбрать изображение размером 4 000 x 4 000 пикселей, которое будет охватывать поле зрения 4мкм2 . Разрешение будет, в лучшем случае, в два раза больше пространственной выборки, поэтому 2 нм и диаметр зонда, d, должны соответствовать этому. Калибровка угла зонда выходит за рамки этого протокола, поэтому мы предполагаем, что доступна таблица или чтение с экрана. Диаметр зонда равен примерно длине волны электрона, деленной на угол полусходимости (в радианах): d = λ/θ. Длина волны λ составляет 0,002 нм для электронов 300 кэВ и 0,0025 нм для электронов 200 кэВ, поэтому θ 1 мрад обеспечит диаметр пятна 2 или 2,5 нм соответственно.
Протокол представлен в прогрессии возрастающей сложности. Первая задача — получить STEM-изображение, которое зависит от программного обеспечения производителя микроскопа, а затем наклонную серию, для которой мы используем SerialEM. Многие читатели, несомненно, знакомы с SerialEM, поэтому более сложные задачи придут естественным образом. Нет необходимости строго следовать процедурам. Разработки, связанные с автоматизацией, могут быть реализованы непосредственно как для STEM, так и для TEM. Опытные пользователи, скорее всего, инвертируют протокол, начиная с корреляционной регистрации флуоресцентных карт и заканчивая настройкой пакетной томографии. Более подробную информацию можно найти в обширной документации и библиотеках учебных пособий для самого SerialEM, включая недавнюю статью JoVE о последних разработках в области автоматизации25.
Протокол должен помочь специалистам по микроскопам в области медико-биологических наук, которые заинтересованы в получении 3D-изображения внутриклеточных органелл в областях клетки, недоступных для обычной томографии ПЭМ. Тот же протокол может быть использован и для STEM-томографии пластических срезов с ослабленными ограничениями на экспозицию. Протокол следует рассматривать как отправную точку, а не как набор жестких правил. Действительно, сила STEM заключается в его гибкости; Не существует единственно правильного способа его эксплуатации.
Подчеркнем, что STEM сам по себе относится только к сканируемому зонду и не определяет формирование изображения. Контрастность зависит, прежде всего, от конфигурации детекторов. В более простых методах используются детекторы с осевой симметрией, либо диск, центрированный на оптической оси, либо кольцевое кольцо, окружающее его. Как правило, когда освещение воздействует непосредственно на детектор, мы записываем изображение BF, на котором образец (рассеивающий электроны) кажется темным; И наоборот, когда детектор собирает только рассеянные электроны, мы записываем DF-изображение, на котором плотный образец кажется ярким. При наличии подходящего оборудования SerialEM может получать и записывать оба этих сигнала одновременно. Доступны еще более сложные конфигурации, начиная от детекторов с несколькими сегментами и заканчивая полностью пиксельными камерами. Фазово-контрастная визуализация может быть достигнута, например, путем оценки разницы между внеосевыми детекторными элементами32,33. Сбор всей картины 2D-рассеяния (дифракции) на пиксель определяет метод, известный как 4D STEM34, который позволяет реконструировать несколько контрастов изображения из одних и тех же исходных данных. Четырехмерная STEM позволяет проводить электронную птихографию, которая обеспечивает еще один способ получения фазового контраста35.
Мы сосредоточились на конкретном методе STEM, который мы считаем наиболее полезным для изучения органелл и интактных клеток или срезов клеток толщиной в микрон. Это влечет за собой, в частности, использование BF-изображений с небольшим углом полусходимости в освещении и относительно большим углом сбора на детекторе. Малая сходимость обеспечивает большую глубину резкости, так что весь образец остается в фокусе на протяжении всей сериинаклона 19. На практике, при хорошем столике микроскопа, это также может устранить необходимость регулировки фокуса во время съемки. Цена является компромиссом в разрешении, как описано в разделе 3 протокола. Мы предложили изображения 4k с зондом ~2 нм, который с шагом пикселя 1 нм достигает поля зрения 4 мкм. Тем не менее, читателю настоятельно рекомендуется экспериментировать. Второе соображение находится на стороне детектора. Когда диск осветки недополняет осевой детектор БФ, фазовый контраст подавляется и преобладает рассеивающий (амплитудный) контраст; Это состояние было названо некогерентным контрастом яркого поля36. Вопрос в том, какой фракцией недоливать, и ответ зависит от пробы. Очень тонкий образец покажет наилучший контраст с полностью заполненным детектором (т. е. угол сбора совпадает с углом освещения), но более толстый образец рассеет всю интенсивность, оставляя зашумленный сигнал с плохим контрастом. Полезное эмпирическое правило заключается в том, что чем толще образец, тем больший внешний угол среза детектора BF должен бытьравен 21. Размер и положение детектора, конечно, фиксированы, поэтому размер дифракционного диска регулируется с помощью длины камеры, как описано в разделе 1. Если настройки усилителя детектора таковы, что сигнал заполняет динамический диапазон, но не насыщается при прямом освещении (1.12.3), то длину камеры можно увеличивать до тех пор, пока не будет достигнута разумная интенсивность и контрастность сигнала. Опять же, читателю предлагается экспериментировать. Искусство, так сказать, в углах.
Еще одним параметром, не рассматриваемым в протоколе, является напряжение ускорения микроскопа. Взаимодействие освещающих электронов с образцом будет сильнее при более низком напряжении. При прочих равных условиях мы можем ожидать более высокой контрастности при более низком напряжении. С другой стороны, именно начало многократного рассеяния в образце ограничивает полезную толщину образца, поэтому более высокое напряжение позволяет использовать более толстые образцы. Однако эти эффекты довольно тонкие. Наш опыт на сегодняшний день с ускорениями 200 кВ и 300 кВ аналогичен.
Учитывая, что можно ожидать от STEM с точки зрения разрешения, это опять же зависит от образца и конфигурации детектора. Используя подход к анализу с одной частицей, ионы металлов на ферритине могут быть локализованы кольцевым темным полем STEM с точностью до нескольких ангстрем37. Совсем недавно субнанометровое разрешение было достигнуто для образцов вирусов и белков с использованием изображений, полученных с помощью интегрированного дифференциального фазового контраста (iDPC) STEM32 , а также птихографии35. Для уникальных объектов в толстоклеточных образцах и при описанных здесь методах такое высокое разрешение нереально. Оптимальным разрешением является диаметр зонда, который относится к описанному углу полусходимости. Другие факторы ухудшают разрешение, в частности, грубая выборка пикселей для достижения большого поля зрения, смещения в серии наклона и распространение луча зонда при передаче. Снимки хорошо сравниваются с томографией пластического сечения. Например, с помощью описанной здесь установки должно быть легко увидеть полое ядро микротрубочек, но не отдельные протофиламенты.
Подводя итог, можно сказать, что методы STEM и аппаратное обеспечение находятся на стадии разработки. Мы можем ожидать, что инновации в области визуализации также повлияют на томографию, что приведет STEM к областям, которые не были доступны другим методам. Мы ожидаем, что конвергенция с корреляционной криогенной флуоресцентной визуализацией, основанной на современных оптических методах сверхразрешения, будет особенно плодотворной. Масштаб органелл, 100-1000 нм, является идеальной мишенью для этих новых методов.
The authors have nothing to disclose.
Мы чрезвычайно благодарны за постоянную и постоянную поддержку со стороны автора и сопровождающего программного пакета SerialEM Дэвида Мастронаде и Гюнтера Реша. P.K. финансировался Австрийским научным фондом (FWF) через стипендию Шредингера J4449-B. В целях открытого доступа авторы применили публичную лицензию CC-BY об авторском праве к любой версии рукописи, принятой автором, вытекающей из этого представления. М.Е. и С.Г.В. признают финансирование Израильского научного фонда, грант No 1696/18, и твиннинг-проекта Европейского Союза «Горизонт 2020», ImpaCT (грант No 857203). M.E. признает финансирование со стороны ERC в проекте CryoSTEM (грант No 101055413). М.Е. является действующим профессором кафедры Сэма и Айялы Закс и главой Центра нано- и био-нановизуализации Ирвинга и Черны Московиц. Лаборатория М.Е. извлекла выгоду из исторической щедрости семьи Гарольда Перлмана. Мы также признаем финансирование со стороны Европейского союза. Однако выраженные взгляды и мнения принадлежат только автору (авторам) и не обязательно отражают взгляды и мнения Европейского Союза или Исполнительного агентства Европейского исследовательского совета. Ни Европейский Союз, ни орган, предоставляющий гранты, не могут нести за них ответственность.
SerialEM | University of Colorado | Veriosn 4.0 | SerialEM is a free software platform for microscope control and data acquisition. |
STEM-capable transmission electron microscope | The protocol was written based on experience with several microscopes of Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica, and Tecnai T20-F. In principle it should be applicable to other manufacturers as well. |