Summary
تتمتع الخيول بقدرة استثنائية على ممارسة التمارين الهوائية ، مما يجعل العضلات الهيكلية للخيول نسيجا مهما لكل من دراسة فسيولوجيا تمرين الخيول وكذلك فسيولوجيا الميتوكوندريا في الثدييات. توضح هذه المقالة تقنيات التقييم الشامل لوظيفة الميتوكوندريا في العضلات الهيكلية للخيول.
Abstract
وظيفة الميتوكوندريا - الفسفرة التأكسدية وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية - أمر بالغ الأهمية في كل من الصحة والمرض. وبالتالي ، فإن قياس وظيفة الميتوكوندريا أمر أساسي في البحوث الطبية الحيوية. تعد العضلات الهيكلية مصدرا قويا للميتوكوندريا ، خاصة في الحيوانات ذات القدرة الهوائية العالية جدا ، مثل الخيول ، مما يجعلها موضوعات مثالية لدراسة فسيولوجيا الميتوكوندريا. توضح هذه المقالة استخدام قياس التنفس عالي الدقة مع القياس الفلوري المتزامن ، مع الميتوكوندريا العضلية الهيكلية التي تم حصادها حديثا ، لتحديد القدرة على أكسدة الركائز تحت حالات الميتوكوندريا المختلفة وتحديد القدرات النسبية للعناصر المميزة لتنفس الميتوكوندريا. يستخدم ميثيل ميثيل إستر رباعي ميثيل رودامين لإثبات إنتاج إمكانات غشاء الميتوكوندريا الناتجة عن أكسدة الركيزة ، بما في ذلك حساب الكفاءة النسبية للميتوكوندريا عن طريق حساب جهد الغشاء النسبي المتولد لكل وحدة من تدفق الأكسجين المتزامن. ينتج عن تحويل جزيء ADP إلى جزيء ATP تغير في تركيز المغنيسيوم في غرفة التفاعل، بسبب اختلاف تقارب الأدينيل للمغنيسيوم. لذلك ، يمكن استخدام المغنيسيوم الأخضر لقياس معدل تخليق ATP ، مما يسمح بمزيد من الحساب لكفاءة الفسفرة التأكسدية (نسبة الفسفرة إلى الأكسدة [P / O]). أخيرا ، يسمح استخدام Amplex UltraRed ، الذي ينتج منتجا فلوريا (resorufin) عند دمجه مع بيروكسيد الهيدروجين ، بالقياس الكمي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية أثناء تنفس الميتوكوندريا ، وكذلك العلاقة بين إنتاج ROS والتنفس المتزامن. تسمح هذه التقنيات بالقياس الكمي القوي لفسيولوجيا الميتوكوندريا في ظل مجموعة متنوعة من ظروف المحاكاة المختلفة ، وبالتالي إلقاء الضوء على مساهمة هذا المكون الخلوي الحاسم في كل من الصحة والمرض.
Introduction
تنتج الميتوكوندريا في الخلايا حقيقية النواة غالبية ATP الذي تستخدمه الخلايا للعمل والصيانة1. تتمثل إحدى الخطوات الرئيسية في إنتاج الميتوكوندريا ل ATP في تحويل الأكسجين إلى ماء ، وبالتالي يتم تحديد القدرة الأيضية للميتوكوندريا والخلايا المرتبطة بها بشكل متكرر من خلال قياس استهلاك الأكسجين2. ومع ذلك ، فإن فسيولوجيا الميتوكوندريا أكثر تعقيدا من العملية البسيطة لاستهلاك الأكسجين ، والاعتماد على نقطة النهاية هذه يوفر حصريا تقييما غير مكتمل لتأثير وظيفة الميتوكوندريا والخلل الوظيفي على الصحة الخلوية. يتطلب التوصيف الكامل لوظيفة الميتوكوندريا تقييم ليس فقط استهلاك الأكسجين ، ولكن أيضا إنتاج ATP وكذلك أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS).
يمكن تحقيق مقاييس إضافية لوظائف الميتوكوندريا الرئيسية بالتزامن مع قياس التنفس من خلال استخدام فلوروفورات محددة. رباعي ميثيل رودامين ميثيل إستر (TMRM) هو فلوروفور كاتيوني يتراكم في مصفوفة الميتوكوندريا بما يتناسب مع جهد الميتوكوندريا عبر الغشاء ، مما يؤدي إلى انخفاض في شدة الفلورسنت بسبب هذا التراكم3. يمكن استخدام TMRM كمؤشر للتغيرات النسبية في إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، أو يمكن استخدامه لتحديد التغيرات الدقيقة في الجهد عبر الغشاء مع تجارب إضافية لتحديد الثوابت التي تسمح بتحويل إشارة الفلورسنت إلى mV. المغنيسيوم الأخضر (MgG) هو فلوروفور يتألق عند ربطه ب Mg2+ ، ويستخدم لقياسات تخليق ATP بناء على التقارب التفاضلي ل ADP و ATP لكاتيون المغنيسيوم ثنائي التكافؤ4. يجب على الباحثين تحديد ثوابت التقارب / التفكك المحددة (Kd) لكل من ADP و ATP في ظل ظروف تحليلية محددة لتحويل التغيرات في مضان MgG إلى تغيير في تركيز ATP. Amplex UltraRed (AmR) هو الفلوروفور المستخدم لقياس إنتاج بيروكسيد الهيدروجين وأنواع الأكسجين التفاعلية الأخرى أثناء تنفس الميتوكوندريا5. ينتج التفاعل بين H 2O2 و AmR (الذي يتم تحفيزه بواسطة بيروكسيديز الفجل) ريزوروفين ، والذي يمكن اكتشافه من خلال التألق عند 530 نانومتر. يمكن إضافة كل من هذه المقايسات بشكل فردي إلى فحوصات التنفس الميتوكوندريا في الوقت الفعلي ، لتوفير قياسات متزامنة للجوانب المعنية من فسيولوجيا الميتوكوندريا ، وبالتالي توفير صلة مباشرة بين التنفس وإخراج الميتوكوندريا.
الخيول قادرة على معدلات عالية جدا من استهلاك الأكسجين الخاص بالكتلة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى المحتوى العالي جدا من الميتوكوندريا في عضلات الهيكل العظمي للخيول ، مما يجعل هذا النسيج وثيق الصلة بدراسة فسيولوجيا الميتوكوندريا. مع تطور قياس التنفس عالي الدقة ، ساعدت الدراسات التي تستخدم هذه التقنية الجديدة في تحديد مساهمات الميتوكوندريا العضلية الهيكلية للخيول في كل من قدرة التمرين الرائعة للخيول والفيزيولوجيا المرضية لأمراض العضلات الهيكلية6،7،8،9،10،11،12،13،14. تعتبر الدراسات المتعلقة بوظيفة الميتوكوندريا في عضلات الهيكل العظمي للخيول مفيدة بشكل خاص ، حيث أن الحصول على كميات كبيرة من هذا النسيج غير نهائي. وبالتالي ، لا يمكن لموضوعات الخيول توفير أنسجة كافية للتوصيف الكامل لوظيفة الميتوكوندريا فحسب ، بل تعمل أيضا كضوابط طولية للدراسات الميكانيكية عالية الجودة في فسيولوجيا الميتوكوندريا. لهذا السبب ، تم تطوير فحوصات إضافية لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، وتوليف ATP ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية التي تكمل قياس استهلاك الأكسجين في هذا النسيج ، من أجل توفير توصيف أكثر قوة لفسيولوجيا الميتوكوندريا في عضلات الهيكل العظمي للخيول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة ولاية أوكلاهوما. تم استخدام أربعة مخصيات أصيلة (17.5 ± 1.3 سنة ، 593 ± 45 كجم) في هذه الدراسة لتوليد النتائج التمثيلية.
1. الحصول على عينة خزعة العضلات والهيكل العظمي
- احصل على خزعات العضلات الهيكلية (اتبع تقنية معقمة) من مركز العضلة نصف الوترية (أو أي عضلة أخرى ذات أهمية) ، باستخدام إبرة خزعة 12 G في مستشفى الكلية الجامعية (UCH) (انظر جدول المواد) أثناء التخدير الخفيف ، واستخدام التخدير الموضعي بعد تقرير نشر مسبقا11.
- انقل عينات الخزعة على الفور إلى قوارير باستخدام محلول وسائط نقل الخزعة الباردة (2.77 mM CaK 2-EGTA ، 7.23 mMK 2-EGTA ، 20 mM إيميدازول ، 20 mM توراين ، 50 mM K-MES ، 0.5 mM dithiothreitol ، 6.56 mM MgCl2 ، 5.77 mM ATP ، و 15 mM phosphocreatine ، معدلة إلى الرقم الهيدروجيني 7.1 ؛ انظر جدول المواد). النقل إلى المختبر للتحليل.
ملاحظة: ارجع إلى Doerrier et al.15 للحصول على تعليمات محددة حول تحضير وسائط نقل الخزعة. - اعزل الميتوكوندريا من عينات الخزعة باستخدام مجموعة تجارية ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). يجب ألا يحتوي المخزن المؤقت النهائي على ركائز مثل ADP و ATP والسكسينات ، والتي تعد جزءا من اختبار قياس التنفس.
- أعد تعليق الحبيبات النهائية للميتوكوندريا المعزولة باستخدام 80 ميكرولتر من وسائط التعليق (225 مللي مول مانيتول ، 75 مللي مول سكروز ، و 1 مللي مول EGTA ؛ انظر جدول المواد) لكل 100 ملغ من العضلات المستخدمة لعزل الميتوكوندريا.
- قلل الفاصل الزمني من وقت إجراء الخزعة إلى عزل الميتوكوندريا ، واحتفظ بالعينات عند 0-4 درجة مئوية طوال خطوات المعالجة حتى تضاف إلى مقاييس التنفس عالية الدقة.
ملاحظة: وجدت الدراسات الأولية أن معلقات الميتوكوندريا المعزولة تبدأ في فقدان القدرة الوظيفية بعد حوالي 2 ساعة عند الحفاظ عليها عند 0-4 درجة مئوية.
2. إعداد مقياس التنفس عالي الدقة
- تستخدم أجهزة قياس التنفس عالية الدقة لقياس تنفس الميتوكوندريا والعمليات المرتبطة به. استخدم برنامج التحكم الذي توفره الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) للتحكم في مقياس التنفس ومعايرة المستشعرات وجمع البيانات الأولية. تحليل العينات في نسختين لكل حالة اختبار.
ملاحظة: في جميع الحالات، تستند المعايرة بالتحليل الحجمي الموصى بها وتركيزات الكاشف النهائية الموصوفة في هذا البروتوكول إلى غرفة قياس التنفس سعة 2 مل. - حدد تدفق الخلفية O 2 ونقطة الصفر لمستشعر O 2 كل2-4 أسابيع من خلال المعايرة التسلسلية للديثيونايت ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. احتفظ بثوابت المعايرة هذه للمقايسات اللاحقة حتى يتم تكرار المعايرة.
ملاحظة: على عكس الإجراءات المنشورة سابقا باستخدام ألياف العضلات المتداخلة11،12،13،16 ، حيث يكون فرط التأكسج (250-500 ميكرومتر) ضروريا لتجنب تقييد انتشار O 2 إلى الميتوكوندريا ، يمكن تقييم الميتوكوندريا المعزولة باستخدام نطاق 50-200 ميكرومتر O2. يمكن تحقيق ذلك ببساطة عن طريق السماح لوسائط التنفس بالتوازن مع هواء الغرفة قبل إضافة تعليق الميتوكوندريا (أي بعد المعايرة اليومية أحادية النقطة). وبالمثل، يمكن تحقيق إعادة أكسجة غرفة التنفس بمجرد فتح الحجرة حتى يذوب الأكسجين المحيط الكافي في وسط قياس التنفس لرفع تركيز الأكسجين إلى المستوى المطلوب. - املأ غرف مقياس التنفس بوسائط خالية من المغنيسيوم (0.5 مللي مول EGTA ، 60 مللي مول K-lactobionate ، 20 mM توراين ، 10 mM KH2PO4 ، 20 mM HEPES ، 110 mM سكروز ، و 1 جم / لتر من ألبومين مصل الأبقار [BSA] خال من الأحماض الدهنية بشكل أساسي ، معدل إلى درجة الحموضة 7.1 ؛ انظر جدول المواد).
ملاحظة: ارجع إلى Komlodi et al.17 للحصول على تعليمات محددة حول تحضير وسائط التنفس.- اضبط درجة حرارة حضانة الجهاز على 38 درجة مئوية لتمثيل درجة الحرارة القاعدية لعضلة الهيكل العظمي للخيول ، واضبط خلط وسائط التنفس على 800 دورة في الدقيقة باستخدام محرك مغناطيسي يدور في الجزء السفلي من غرفة مقياس التنفس.
- قم بإيقاف تشغيل إضاءة الغرفة لتجنب التداخل مع مستشعرات الفلورسنت.
- قم بتنشيط قطب الأكسجين بجهد استقطاب 800 مللي فولت ، وقم بتضخيم الإشارة الناتجة بإعداد كسب 1.
- سجل تركيز الأكسجين كل 2 ثانية ، واحسب تدفق الأكسجين باعتباره المنحدر السلبي لقياس الأكسجين خلال ال 40 ثانية السابقة (20 نقطة بيانات) ، وأبلغ عن pmol x s-1 x mL من محلول الحضانة.
- قم بمعايرة مستشعر الأكسجين عن طريق السماح للوسائط بالتوازن مع هواء الغرفة. احسب الضغط الجزئي المرجعي للأكسجين، استنادا إلى الضغط الجوي المقاس بواسطة مقياس التنفس عالي الدقة وتركيز الأكسجين القياسي في الغلاف الجوي.
3. قياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا باستخدام TMRM
- استخدم مستشعرات الفلورسنت "الخضراء" (الطول الموجي السائد 530 نانومتر) لتحديد إشارة الفلورسنت من غرفة التنفس. تنشيط أجهزة الاستشعار عند 400-500 مللي فولت ؛ يتم تضخيم الإشارة الناتجة بكسب 1: 1,000.
ملاحظة: يجب تحسين الإعدادات المحددة للأجهزة الفردية لالتقاط الإشارة المتوقعة ضمن النطاق الخطي للمستشعر. - أضف TMRM (4 ميكرولتر من محلول 1 mM لتركيز نهائي قدره 2 μM ؛ انظر جدول المواد) قبل إضافة الميتوكوندريا.
- قم بمعايرة إشارة الفلورسنت باستخدام معايرة بسيطة من نقطتين لإشارة الفلورسنت (الجهد) مقابل كمية الفلوروفور المضافة (mM) ، قبل إضافة الميتوكوندريا.
ملاحظة: استخدم وظيفة معايرة إشارة الفلورسنت في برنامج التحكم في الماكينة لمعايرة هذه الإشارة. يمكن أن تتطلب الإشارة الخام من مسبار الفلورسنت 30 دقيقة أو أكثر لتحقيق الاستقرار من أجل تسجيل النقطة الثانية من المعايرة. - إجراء المعايرة النهائية لإشارة TMRM بعد الانتهاء من بروتوكول معايرة قياس التنفس عن طريق إجراء عدة معايرات لعامل الفصل (سيانيد الكربونيل m-chlorophenyl hydrazone ؛ 2 ميكرولتر لكل معايرة) حتى لا تلاحظ أي زيادات أخرى في إشارة الفلورسنت TMRM ، مما يشير إلى الانهيار الكامل لإمكانات غشاء الميتوكوندريا (الشكل 1).
ملاحظة: تعتبر قيمة إشارة الفلورسنت هذه مساوية لجهد الغشاء 0 mV ، وتستخدم كنقطة مرجعية لقيم جهد الغشاء النسبية المسجلة أثناء بروتوكول معايرة التنفس.
4. قياس إنتاج ATP باستخدام المغنيسيوم الأخضر (MgG)
- استخدم مستشعرات الفلورسنت "الزرقاء" (الطول الموجي السائد 465 نانومتر) لتحديد إشارة الفلورسنت من غرفة التنفس. قم بتنشيط هذه المستشعرات للأجهزة الفردية لالتقاط الإشارة المتوقعة ضمن النطاق الخطي للمستشعر.
- قم بإجراء الإعداد الكيميائي ومعايرة إشارة الفلورسنت MgG بعد إضافة الميتوكوندريا ، ولكن قبل إضافة أي ركائز. أضف 8 ميكرولتر من 2 mM حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) إلى غرفة قياس التنفس لتخليب الكاتيونات (خاصة Ca 2+) التي من شأنها أن تتنافس مع Mg2+ للارتباط ب MgG ، ثم أضف 4 ميكرولتر من 1 mM MgG (1.1 μM) إلى غرفة التنفس.
- قم بمعايرة إشارة التألق الخام بمعايرة متسلسلة 10 × 2 ميكرولتر تبلغ 100 mM MgCl 2 ، مما يسمح بدقيقة واحدة بين عمليات المعايرة لتثبيت إشارة الفلورسنت (الشكل 2).
ملاحظة: هذه العملية ، التي تكتمل دون اتصال بالإنترنت بعد الانتهاء من الفحص وباستخدام القوالب التي توفرها الشركة المصنعة للجهاز والبرامج المرتبطة به ، تنتج منحنى من الدرجة الثانية لتركيز المغنيسيوم إلى إشارة الفلورسنت (المتوقع r2 > 0.98) ، والذي سيتم استخدامه مع كمية معروفة من ADP المضافة إلى غرفة قياس التنفس وقيم Kd المحددة مسبقا لتحديد التركيز المقابل ل ATP11. - أوجد معدل تخليق الأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP)، وهو ميل تركيز جزيء ATP بمرور الزمن في جميع أنحاء البروتوكول (الشكل 3).
5. قياس إنتاج الميتوكوندريا من أنواع الأكسجين التفاعلية باستخدام Amplex UltraRed (AmR)
- استخدم مستشعرات الفلورسنت "الخضراء" (الطول الموجي السائد 530 نانومتر) لتحديد إشارة الفلورسنت من غرفة التنفس. تنشيط المستشعرات عند 300-400 مللي فولت ؛ يتم تضخيم الإشارة الناتجة بكسب 1: 1,000. قم بتحسين الإعدادات المحددة للأجهزة الفردية لالتقاط الإشارة المتوقعة ضمن النطاق الخطي للمستشعر.
ملاحظة: في حالة استخدام وسائط التنفس بدون MgCl 2 ، فيجب إضافة ذلك (20-60 ميكرولتر من 100 mM MgCl 2 لإنتاج 1-3 ميكرومتر MgCl2) قبل إضافة الكواشف لمقايسة AmR. - قم بإجراء الإعداد الكيميائي والمعايرة الأولية لمقايسة AmR قبل إضافة الميتوكوندريا. أضف 30 ميكرومول من DTPA (6 ميكرولتر من محلول 5 mM) إلى الكاتيونات المخلبية التي قد تتداخل مع التفاعل ، ثم أضف ديسموتاز الفائق الأكسيد (2 ميكرولتر من محلول مخزون 5000 وحدة / مل لتحويل أنيونات الأكسيد الفائق إلى H 2 O2للكشف الأكثر شمولا عن توليد الأكسجين التفاعلي) ، بيروكسيديز الفجل (5 ميكرولتر من محلول مخزون 500 وحدة / مل) ، و Amplex UltraRed (2 ميكرولتر من محلول مخزون 10 مللي مول) (انظر جدول المواد) لإنتاج 5 وحدة / مل ، 1 وحدة / مل ، و 10 ميكرومتر في غرفة قياس التنفس ، على التوالي.
- اسمح لإشارة الفلورسنت بالاستقرار ، ثم أضف 0.2 ميكرومول من بيروكسيد الهيدروجين (5 ميكرولتر من محلول 40 ميكرومتر طازج يوميا) مرتين ، بفارق 5 دقائق تقريبا.
ملاحظة: توفر إشارة الفلورسنت قبل وبعد معايرتي H 2 O 2 منحنى معايرة خطي ثلاثي النقاط للنظام (متوقع r 2 > 0.95) ، يعكس ميله الاستجابة الكلية للنظام في الإبلاغ عن العلاقة بين إشارة الفلورسنت وإنتاج (أو إضافة) H 2 O 2. استخدم وظيفة معايرة إشارة الفلورسنت في برنامج التحكم في الماكينة لمعايرة هذه الإشارة. - قم بإجراء معايرة إضافية من نقطتين (5 ميكرولتر من محلول 40 ميكرومتر طازج يوميا) طوال فترة الفحص ، للسماح بتعديل استجابة الفحص مع تغير كيمياء قياس التنفس طوال فترة الفحص ، مع التوقيت المحدد لنقاط المعايرة هذه وفقا لتقدير الباحث (الشكل 4).
6. قياس التنفس الميتوكوندريا
- أضف 15 ميكرولتر من معلق الميتوكوندريا المعزول (الخطوة 1.4) إلى كل غرفة حضانة سعة 2 مل ، بحيث تمثل النتائج عائد الميتوكوندريا البالغ 18.75 مجم من العضلات. ختم غرفة الحضانة. دوامة العينة بين كل معايرة بالتحليل الحجمي للحفاظ على تعليق موحد للعينة.
- قم بقياس استهلاك الأكسجين المتبقي (ROX) قبل إضافة أي ركائز. اطرح هذه القيمة (عادة أقل من 0.2 pmol O2 x s-1 x mL-1) من قيم استهلاك الأكسجين لكل خطوة في بروتوكول معايرة الركيزة / فك التوصيل / المانع (SUIT)11 بعد الانتهاء من البروتوكول.
ملاحظة: من الأهمية بمكان أن يسمح للإشارات الصادرة من كل من مستشعر الأكسجين ومستشعر التألق بالاستقرار لمدة 1 دقيقة على الأقل (كما تم تقييمها بواسطة المنحدر المحسوب المستقر لإشارات المستشعر الأولية) ، حيث يتم تغيير الحالة العامة للتنفس بواسطة المعايرات من أجل الحصول على نتائج موثوقة. ينطبق هذا على جميع خطوات المعايرة. - استخدم بدلة للأغراض العامة تسمح بالتوصيف الأولي لوظيفة الميتوكوندريا في عضلات الهيكل العظمي للخيول. ابدأ بمعايرة متسلسلة من البيروفات (5 ميكرولتر من محلول مائي 2 M) ، والغلوتامات (10 ميكرولتر من محلول مائي 2 M) ، ومالات (10 ميكرولتر من محلول مائي 0.4 M) (انظر جدول المواد) في كل غرفة لإنتاج نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADH) وتحفيز التنفس غير الفسفري (التسرب) المدعوم ب NADH المؤكسد من خلال المركب I (LN) (الشكل 1 ، الشكل 3 والشكل 4).
- أضف ADP (20 ميكرولتر من محلول مائي 500 mM ؛ انظر جدول المواد) لتحفيز التنفس الفسفرة من خلال المركب I (PN).
- أضف السكسينات (20 ميكرولتر من محلول مائي 1 M ؛ انظر جدول المواد) لإنتاج التنفس الفسفري من خلال الجمع بين المركب I والمركب II (PN + S).
ملاحظة: مع الجمع بين التنفس من خلال كل من المركب الأول والمركب الثاني ، قد يكون استهلاك الأكسجين مرتفعا بما يكفي لاستهلاك معظم الأكسجين المذاب في وسط الحضانة. إذا انخفض تركيز O 2 إلى أقل من 50 ميكرومتر ، فقم بإعادة أكسجة وسائط الحضانة عن طريق فتح غرفة الحضانة حتى يزيد تركيز O2 المقاس فوق 150 ميكرومتر. كرر هذه الخطوة حسب الضرورة للحفاظ على O2 كافية لتنفس الميتوكوندريا. - أضف روتينون (2 ميكرولتر من محلول الإيثانول 0.1 مللي متر ؛ انظر جدول المواد) لمنع المركب الأول. يمثل تدفق الأكسجين الناتج قدرة المجمع الثاني على دعم استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا عن طريق أكسدة السكسينات وحدها (PS).
تنبيه: روتينون مادة سامة. استخدم سلامة المختبر القياسية وتجنب الابتلاع أو الاستنشاق. - احسب القيمة المتوسطة لحالة تجريبية معينة عبر غرف قياس التنفس الفردية التي تحتوي على حصص خزعة واحدة.
ملاحظة: تعتبر الحسابات المشتقة ، مثل نسب التحكم في التدفق (FCRs) ، ذات قيمة في تحديد التغيرات النسبية في المسارات المختلفة ، وتشملتسرب FCR (L N / P N) و FCR N (P N / P N + S) و FCR S (P S / P N + S). توفر كفاءة الفسفرة التأكسدية المحسوبة (1-LN / PN + S) تقديرا للتأثير الكلي للتنفس المتسرب المعدل لإجمالي سعة التنفس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الحالة المرجعية المقترحة هي حالة أصيلة مستقرة صحية (لا توجد لياقة متزايدة بسبب التمرين الإلزامي) وعينة عضلية جديدة تم جمعها من مركز عضلة وضعية ، تحتوي على نسبة عالية من ألياف العضلات الهيكلية من النوع الأول الغنية بالميتوكوندريا وحضنها في ظل ظروف تقترب من التمثيل الغذائي أثناء الراحة (أي 38 درجة مئوية ودرجة الحموضة 7.0). في ظل هذه الظروف ، يمكن للباحث أن يتوقع قيم L N 2.71 ± 0.90 ، وقيم P N 62.40 ± 26.22 ، وقيم PN + S 93.67 ± 34.76 ، وقيم PS 46.93 ± 14.58 pmolO 2 x s-1 x mL-1 (الشكل 3 والشكل 4). قيم التنفس للميتوكوندريا المحتضنة ب TMRM أقل بسبب التأثير المثبط لهذا الفلوروفور (الشكل 1). تسرب FCR و FCRN و FCRS هي 0.05 ± 0.01 و 0.66 ± 0.07 و 0.51 ± 0.07 على التوالي. كفاءة الفسفرة التأكسدية المحسوبة هي 0.97 ± 0.01. تختلف القيم المطلقة لهذه الحالات التنفسية بسبب الموضوع الفردي والقدرة التأكسدية للأنسجة ، ولكن النمط النسبي لهذه القيم يتوافق مع النتائج المنشورة من ألياف العضلات الهيكلية للخيول المتداخلة (أي الزيادات في التنفس مع إضافة ركائز محددة ، يكون الجمع بين التنفس من خلال المركب الأول والمركب الثاني أقل من كل مصدر من مصادر الإلكترون هذه بشكل فردي بسبب تشبع نظام نقل الإلكترون [ETS] قدرة المصب). تتوافق الكفاءة المحسوبة للميتوكوندريا العضلية الهيكلية المعزولة للخيول مع القيم المقابلة المبلغ عنها لألياف العضلات الهيكلية للخيولالمتداخلة 11.
من المتوقع أن يكون معدل تخليق ATP 438.59 ± 397.10 pM x s-1 للتنفس P N ، و 383.18 ± 397.19 للتنفس PN + S ، و 172.07 ± 125.60 للتنفس PS ، لكل ملغ من الأنسجة المصدر المستخدمة لعزل الميتوكوندريا. من المحتمل أن يكون الانخفاض في تخليق ATP مع إضافة السكسينات بسبب المنافسة عند تقاطع الكينون ل ETS بواسطة مغذيات الإلكترون ، مع التغذية من Complex II (التي لا تساهم بشكل مباشر في إمكانات غشاء الميتوكوندريا) مما يقلل من تدفق الإلكترونات عبر المجمع الأول (الذي يساهم بشكل مباشر في إمكانات غشاء الميتوكوندريا من خلال ضخ البروتونات عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلي).
من المتوقع أن يكون معدلإنتاج H 2 O2 0.079 ± 0.095 nmol.s-1 للتنفس L N ، و 0.021 ± 0.043 للتنفس P N ، و 0.026 ± 0.056 للتنفس P N + S ، و 0.237 ± 0.248 للتنفس PS ، لكل ملغ من الأنسجة المصدر المستخدمة لعزل الميتوكوندريا (الشكل 4). يتوافق المعدل النسبي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية مع الحجم المتوقع لإمكانات غشاء الميتوكوندريا والعلاقة بين إمكانات الغشاء العالية وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية. الاستثناء من هذه العلاقة هو إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المرتفع للغاية عندما يحدث التنفس من خلال المركب الثاني وحده ، بسبب التدفق العكسي للإلكترونات من تقاطع الكينون إلى المركب الأول عندما يتم حظره بواسطة الروتينون.
الشكل 1: تتبع قياس التنفس التمثيلي عالي الدقة لتنفس الميتوكوندريا في عضلات هيكل الخيول وجهد الغشاء النسبي. النافذة العلوية هي تركيز الأكسجين في الغرفة (المحور Y الأيسر) وتدفق الأكسجين (المحور Y الأيمن) بمرور الوقت (المحور X) ؛ النافذة السفلية هي غرفة TMRM مضان (المحور Y الأيسر) ومعدل تغير إشارة التألق (المحور Y الأيمن) بمرور الوقت (المحور X). تشير العلامات الرأسية إلى إضافة ركائز محددة إلى الغرفة (mt: تعليق الميتوكوندريا. P: البيروفات. G: الغلوتامات. م: مالات. د: ADP ؛ S: سكسينات. R: روتينون. CCCP: سيانيد الكربونيل م-كلوروفينيل هيدرازون). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تتبع قياس التنفس التمثيلي عالي الدقة لمعايرة إشارة مضان الغرفة للأخضر المغنيسيوم وتحديد Kd للمغنيسيوم والأدينيلات. غرفة MgG مضان (المحور Y الأيسر) ومعدل تغير إشارة التألق (المحور Y الأيمن) بمرور الوقت (المحور X). تشير العلامات الرأسية الأولية إلى إضافة ركائز محددة إلى الغرفة (MgG: المغنيسيوم الأخضر ؛ mt: تعليق الميتوكوندريا. P: البيروفات. G: الغلوتامات. م: مالات. S: سكسينات. EDTA: حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك). يتبع ذلك المعايرة التسلسلية ل MgCl2 باستخدام مضخة معايرة آلية (TIP) تزيد من إشارة الفلورسنت ، ثم المعايرة التسلسلية لأدينيلات (في هذه الحالة ATP) التي تقلل من إشارة الفلورسنت. يتم استخدام معايرة MgCl2 أيضا في بداية كل اختبار لمعايرة إشارة MgG ، ولكن يتم إجراؤها قبل إضافة ركائز الميتوكوندريا وقياس التنفس مثل P و G و M و S. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تتبع قياس التنفس التمثيلي عالي الدقة لتنفس الميتوكوندريا في عضلات هيكل الخيول وتخليق ATP . النافذة العلوية هي تركيز الأكسجين في الغرفة (المحور Y الأيسر) وتدفق الأكسجين (المحور Y الأيمن) بمرور الوقت (المحور X) ؛ النافذة السفلية هي غرفة مضان MgG (المحور Y الأيسر) ومعدل تغير إشارة التألق (المحور Y الأيمن) بمرور الوقت (المحور X). تشير العلامات الرأسية إلى إضافة ركائز محددة إلى الغرفة (mt: تعليق الميتوكوندريا. P: البيروفات. G: الغلوتامات. م: مالات. د: ADP ؛ S: سكسينات. R: روتينون). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تتبع تنفس تنفسي تمثيلي عالي الدقة لتنفس الميتوكوندريا في عضلات هيكل الخيول وإنتاج H 2 O2. النافذة العلوية هي تركيز الأكسجين في الغرفة (المحور Y الأيسر) وتدفق الأكسجين (المحور Y الأيمن) بمرور الوقت (المحور X) ؛ النافذة السفلية هي مضان غرفة resorufin (المحور Y الأيسر) ومعدل تغير إشارة التألق (المحور Y الأيمن) بمرور الوقت (المحور X). تشير العلامات الرأسية إلى إضافة ركائز محددة إلى الغرفة (mt: تعليق الميتوكوندريا. P: البيروفات. G: الغلوتامات. م: مالات. د: ADP ؛ S: سكسينات. R: روتينون). كما تم تضمين ثلاث معايرات داخل الفحص من نقطتين لإشارة الفلورسنت باستخدام H 2 O2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توفر إضافة إشارات الفلورسنت إلى الإخراج القياسي لمقياس التنفس عالي الدقة معلومات قيمة فيما يتعلق بفسيولوجيا الميتوكوندريا ، ولكن المعايرة الدقيقة لإشارة الفلورسنت أمر بالغ الأهمية لبيانات الجودة. تشير البروتوكولات الأصلية لاستخدام MgG إلى أن منحنيات المعايرة المتولدة أثناء حساب ثوابت تفكك المغنيسيوم - أدينيلات يمكن تطبيقها على المقايسات اللاحقة4 ؛ ومع ذلك ، قد لا تكون إشارة الفلورسنت من MgG قابلة للتكرار بشكل كاف من الفحص إلى الفحص لهذا النهج. لذلك ، تتم معايرة كل اختبار باستخدام معايرة MgCl2 الآلية ، ومنحنى المعايرة الناتج لحساب تخليق ATP لهذا الفحص الفردي. علاوة على ذلك ، يجب حساب Kd (ثوابت التفكك) للمغنيسيوم وكل من ADP و ATP للظروف المحددة للفحص ، بما في ذلك الأنسجة المحددة ، وظروف الحضانة ، والركائز التي تنتج التنفس الفسفرة ، من أجل ضمان دقة اشتقاق معدل تخليق ATP. يتم التعرف على التباين في مقايسة AmR على نطاق واسع15,17 ، ومن الشائع إدخال العديد من نقاط إعادة المعايرة المنفصلة في البروتوكول وفقا لتقدير المحقق أثناء البروتوكول. تشير البيانات التاريخية باستخدام العضلات الهيكلية للخيول إلى أن الاستجابة النموذجية للفحص تبلغ حوالي 0.646 فولت / مللي متر من H 2 O2 عند نقطة المعايرة الأولى(قبل إضافة العينة) ، وقد تنخفض بنسبة 8٪ -15٪ خلال فترة الفحص. وبالتالي ، فإن إعادة المعايرة المتكررة لمقايسة AmR ضرورية للكشف عن التغييرات الصغيرة نسبيا في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، ويجب تحديد توقيت معايرة النقاط داخل البروتوكول لكل بروتوكول معايرة.
يجب على المحققين استخدام حكم دقيق طوال أداء الفحص في تحديد وقت الانتقال إلى خطوة المعايرة التالية. من الناحية المثالية ، يجب أن تكون الإشارات ذات الصلة التي يتم إنشاؤها في الوقت الفعلي (تدفق O2 ، ومضان TMRM ، ومعدل التغيير في إشارة MgG و resorufin fluorescent) مستقرة ، مما يشير إلى حالة مستقرة داخل الغرفة ، ولكنها دعوة للحكم من جانب المحقق فيما يتعلق بما يشكل استقرارا مقبولا. في هذا الوقت ، لا يوجد معيار واسع النطاق لهذا القرار. ومع ذلك ، يجب أن يكون المحققون مدركين تماما للمخاطر الناجمة عن الفشل في الانتظار لفترة كافية لإنشاء حالة مستقرة (مما يؤدي إلى بيانات تميز الحالة التنفسية المقصودة بشكل غير كامل) والانتظار لفترة طويلة حتى تصبح الركائز مستنفدة ، ولم يعد الفحص موثوقا به. في تجربة المؤلف ، فإن الفشل في الحصول على إشارة مستقرة في غضون 30 دقيقة من أي معايرة للركيزة هو دليل على عينة (أو آلة) تتصرف بطريقة غير بيولوجية ، ويجب التخلص من الفحص.
تظهر النتائج التي تستخدم هذا النهج لتحديد فسيولوجيا الميتوكوندريا تباينا كبيرا بين الموضوعات ، مع معامل تباين نموذجي (CV) يتراوح بين 30٪ -40٪. على النقيض من ذلك ، يؤدي تحليل ألياف العضلات الهيكلية للخيول المتداخلة إلى سيرة ذاتية بنسبة 19٪ -20٪ 11 ، مما يشير إلى أن عملية عزل الميتوكوندريا تفرض تباينا كبيرا في التحليل اللاحق بالإضافة إلى التباين الملحوظ بين الموضوعات. على الرغم من أنه يمكن التخفيف من تأثير هذا الأخير باستخدام الموضوعات كعناصر تحكم خاصة بهم عندما يكون ذلك ممكنا ، إلا أنه لا يمكن تقليل الأول إلا من خلال الاهتمام الدقيق بتقنية العزل. إذا كان التصميم التجريبي لا يسمح بالنسخ التجريبية من خزعة واحدة ، فقد يختار الباحث التعبير عن بيانات قياس التنفس بالنسبة لعامل تصحيح يعكس الاختلافات في محتوى الميتوكوندريا في عينات مختلفة. عوامل التصحيح الأكثر شيوعا هي محتوى بروتين العينة ونشاط سينسيز السيترات للعينة. ومع ذلك ، كما هو موضح في بيان إجماع حديث للعلماء النشطين في هذا المجال ، لا توجد طريقة واحدة لإجراء هذا التعديل متفق عليها عالميا18. تصحيح محتوى البروتين و / أو نشاط سينسيز سيترات هما النهجان الأكثر شيوعا المستخدمان للأنسجة العضلية الهيكلية للخيول12,13 ، ولكن كلاهما له عيوبه. قد يكون من الضروري للتصميمات التجريبية المختلفة التعبير عن البيانات من خلال كل من الداخلية (أي نسب التحكم في التدفق) والخارجية (البروتين ، نشاط الإنزيم ، علامات الميتوكوندريا الأخرى) من أجل تفسير وظيفة الميتوكوندريا.
يعتمد البروتوكول الموصوف على استخدام ألياف العضلات المتداخلة ، مع العديد من الاختلافات المهمة. تتطلب فحوصات الألياف النفاذية خزعات أصغر ، حيث يتم إجراء قياس التنفس عالي الدقة للألياف النفاذية لعضلات الهيكل العظمي للخيول عادة باستخدام ~ 2 مجم فقط من كتلة العينة في كل غرفة6،7،8،9،10،11. في المقابل ، يحتوي البروتوكول الموصوف هنا على ما يعادل ما يقرب من 10 أضعاف كتلة الألياف في كل غرفة. يسلط هذا الاختلاف الضوء على عدم كفاءة عزل الميتوكوندريا عن الأنسجة الطازجة. أحد الأسباب المحتملة لعدم الكفاءة هذا هو صعوبة استعادة الميتوكوندريا العضلية الهيكلية الموجودة داخل شبكة البروتين المقلص. تتضمن المجموعة التجارية لعزل الميتوكوندريا المستخدمة في هذا البروتوكول العلاج بالبروتياز واستخدام الوسائط الأيونية للمساعدة في تكسير الألياف المقلصة ، ولكن من المحتمل ألا يتم استرداد جزء كبير من الميتوكوندريا بين اللييف. هذه الميزة من البروتوكول ليست ذات صلة فقط لتحديد كمية مواد الخزعة اللازمة ، ولكن أيضا فيما يتعلق بتفسير النتائج. الميتوكوندريا المعزولة أقل عرضة للاعتماد على الأكسجين ، بسبب قيود الانتشار مقارنة بالألياف النفاذية15 ؛ وبالتالي ، ليست هناك حاجة إلى فرط التأكسج مع الميتوكوندريا المعزولة ، ويمكن أكسجة وسائط التنفس بشكل كاف (وإعادة أكسجتها أثناء الفحص) ببساطة عن طريق فتح الغرفة لهواء الغرفة. هذا الجانب من توصيل الأكسجين مفيد بشكل خاص عند قياس إنتاج H 2 O2وأنواع الأكسجين التفاعلية الأخرى ، حيث يتم زيادة إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية بطريقة غير فسيولوجية أثناء حضانة فرط التأكسج19. أخيرا ، يوفر استخدام الميتوكوندريا المعزولة إشارة فلورية أكثر استقرارا وقابلة للتكرار ، بسبب انخفاض ارتباط البروتين غير المحدد للفلوروفورات مقارنة باستخدام الفلوروفورات مع ألياف العضلات النفاذية. كل إعداد عينة له مزايا وعيوب ، والكفاءة مع كل من الألياف النفاذية والميتوكوندريا المعزولة توفر للباحث مجموعة قوية من المقايسات لمعالجة مجموعة متنوعة من الأسئلة المتعلقة بفسيولوجيا الميتوكوندريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح يتعلق بهذه المخطوطة.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يعربوا عن تقديرهم للدعم السخي من كرسي جون وديبي أوكسلي الممنوح للطب الرياضي للخيول ومؤسسة أبحاث نادي غرايسون جوكي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A5285 | |
| Amplex UltraRed | Life Technologies | A36006 | |
| ATP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A2383 | |
| BSA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A6003 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C4830 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C2759 | |
| DatLab 7.0 | Oroboros Inc | Software to operate O2K fluororespirometer | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D0632 | |
| DTPA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D1133 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | E4378 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | G1626 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | H7523 | |
| Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P8250 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 516813 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Imidazole | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | I2399 | |
| K-MES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M8250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9272 | |
| Magnesium Green | Thermo Fisher Scientific | M3733 | |
| Malate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M1000 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9647 | |
| Mitochondrial isolation kit | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | MITOISO1 | |
| O2K fluororespirometer | Oroboros Inc | Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently. | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P7936 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P1767 | |
| Potassium lactobionate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | L2398 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P0662 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P2256 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Rotenone | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | R8875 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 84097 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S8160 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T0625 | |
| Titration pump | Oroboros Inc | ||
| Titration syringes | Oroboros Inc | ||
| TMRM | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T5428 | |
| UCH biopsy needle | Millenium Surgical Corp | 72-238067 | Available in a range of sizes |
References
- Wilson, D. F. Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization. Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th edn. , Oroboros MiPNet Publications. Innsbruck. (2014).
- Ehrenberg, B., Montana, V., Wei, M. D., Wuskell, J. P., Loew, L. M. Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes. Biophysical Journal. 53 (5), 785-794 (1988).
- Chinopoulos, C., Kiss, G., Kawamata, H., Starkov, A. A. Measurement of ADP-ATP exchange in relation to mitochondrial transmembrane potential and oxygen consumption. Methods in Enzymology. 542, 333-348 (2014).
- Krumschnabel, G., et al. Simultaneous high-resolution measurement of mitochondrial respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1264, 245-261 (2015).
- Lemieux, H., et al. Mitochondrial function is altered in horse atypical myopathy. Mitochondrion. 30, 35-41 (2016).
- Houben, R., Leleu, C., Fraipont, A., Serteyn, D., Votion, D. M. Determination of muscle mitochondrial respiratory capacity in Standardbred racehorses as an aid to predicting exertional rhabdomyolysis. Mitochondrion. 24, 99-104 (2015).
- Votion, D. M., Gnaiger, E., Lemieux, H., Mouithys-Mickalad, A., Serteyn, D. Physical fitness and mitochondrial respiratory capacity in horse skeletal muscle. PLoS One. 7 (4), 34890 (2012).
- Votion, D. M., et al. Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing. Equine Veterinary Journal Supplement. (38), 268-274 (2010).
- Tosi, I., et al. Altered mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in horses suffering from polysaccharide storage myopathy. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 50 (5), 379-390 (2018).
- Davis, M. S., Fulton, M. R., Popken, A. A. Effect of hyperthermia and acidosis on equine skeletal muscle mitochondrial oxygen consumption. Comparative Exercise Physiology. 17 (2), 171-179 (2021).
- Latham, C. M., Fenger, C. K., White, S. H. RAPID COMMUNICATION: Differential skeletal muscle mitochondrial characteristics of weanling racing-bred horses1. Journal of Animal Science. , (2019).
- White, S. H., Warren, L. K., Li, C., Wohlgemuth, S. E. Submaximal exercise training improves mitochondrial efficiency in the gluteus medius but not in the triceps brachii of young equine athletes. Scientific Reports. 7 (1), 14389 (2017).
- White, S. H., Wohlgemuth, S., Li, C., Warren, L. K. Rapid communication: Dietary selenium improves skeletal muscle mitochondrial biogenesis in young equine athletes. Journal of Animal Science. 95 (9), 4078-4084 (2017).
- Doerrier, C., et al. High-resolution FluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).
- Li, C., White, S. H., Warren, L. K., Wohlgemuth, S. E. Effects of aging on mitochondrial function in skeletal muscle of American American Quarter Horses. Journal of Applied Physiology. 121 (1), 299-311 (2016).
- Komlodi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
- Gnaiger, E.
- Li Puma, L. C., et al. Experimental oxygen concentration influences rates of mitochondrial hydrogen peroxide release from cardiac and skeletal muscle preparations. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrated, and Comparative Physiology. 318 (5), 972-980 (2020).
