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Biology

घोड़े के कंकाल की मांसपेशी की उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरो-श्वसनमिति

Published: February 3, 2023 doi: 10.3791/65075
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physiological Sciences, Oklahoma State University

Summary

घोड़ों में एक असाधारण एरोबिक व्यायाम क्षमता होती है, जिससे घोड़े की कंकाल की मांसपेशी घोड़े के व्यायाम शरीर विज्ञान के साथ-साथ स्तनधारी माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण ऊतक बन जाती है। यह लेख घोड़े के कंकाल की मांसपेशी में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के व्यापक मूल्यांकन के लिए तकनीकों का वर्णन करता है।

Abstract

माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन-ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की पीढ़ी-स्वास्थ्य और बीमारी दोनों में महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, बायोमेडिकल अनुसंधान में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को मापना मौलिक है। कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया का एक मजबूत स्रोत है, विशेष रूप से घोड़ों जैसे बहुत अधिक एरोबिक क्षमता वाले जानवरों में, उन्हें माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए आदर्श विषय बनाते हैं। यह लेख विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल राज्यों के तहत सब्सट्रेट्स को ऑक्सीकरण करने की क्षमता को निर्धारित करने और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के अलग-अलग तत्वों की सापेक्ष क्षमता निर्धारित करने के लिए ताजा कटी हुई कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया के साथ समवर्ती फ्लोरोमेट्री के साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वासरोमिति के उपयोग को प्रदर्शित करता है। टेट्रामेथिलरोडामाइन मिथाइलस्टर का उपयोग सब्सट्रेट ऑक्सीकरण से उत्पन्न माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता के उत्पादन को प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है, जिसमें समवर्ती ऑक्सीजन प्रवाह की प्रति इकाई उत्पन्न सापेक्ष झिल्ली क्षमता की गणना करके माइटोकॉन्ड्रिया की सापेक्ष दक्षता की गणना शामिल है। एडीपी को एटीपी में बदलने से प्रतिक्रिया कक्ष में मैग्नीशियम की एकाग्रता में परिवर्तन होता है, मैग्नीशियम के लिए एडेनिलेट्स की अलग-अलग समानताओं के कारण। इसलिए, मैग्नीशियम ग्रीन का उपयोग एटीपी संश्लेषण की दर को मापने के लिए किया जा सकता है, जिससे ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन दक्षता (ऑक्सीकरण के लिए फॉस्फोराइलेशन का अनुपात [पी / ओ]) की आगे की गणना की अनुमति मिलती है। अंत में, एम्प्लेक्स अल्ट्रारेड का उपयोग, जो हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ संयुक्त होने पर एक फ्लोरोसेंट उत्पाद (रेसोरुफिन) का उत्पादन करता है, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के दौरान प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन की मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देता है, साथ ही आरओएस उत्पादन और समवर्ती श्वसन के बीच संबंध भी। ये तकनीकें विभिन्न सिम्युलेटेड स्थितियों के तहत माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी की मजबूत मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देती हैं, इस प्रकार स्वास्थ्य और बीमारी दोनों के लिए इस महत्वपूर्ण सेलुलर घटक के योगदान पर प्रकाश डालती हैं।

Introduction

यूकेरियोटिक कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रिया कामऔर रखरखाव के लिए कोशिकाओं द्वारा उपयोग किए जाने वाले एटीपी के बहुमत का उत्पादन करते हैं। एटीपी के माइटोकॉन्ड्रियल उत्पादन में एक महत्वपूर्ण कदम ऑक्सीजन का पानी में रूपांतरण है, और इस प्रकार माइटोकॉन्ड्रिया और संबंधित कोशिकाओं की चयापचय क्षमता को अक्सर ऑक्सीजन की खपतके माप के माध्यम से निर्धारित किया जाता है। हालांकि, माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी ऑक्सीजन की खपत की सरल प्रक्रिया की तुलना में अधिक जटिल है, और इस समापन बिंदु पर निर्भरता विशेष रूप से सेलुलर स्वास्थ्य पर माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और शिथिलता के प्रभाव का अधूरा मूल्यांकन प्रदान करती है। माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के पूर्ण लक्षण वर्णन के लिए न केवल ऑक्सीजन की खपत के आकलन की आवश्यकता होती है, बल्कि एटीपी के साथ-साथ प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का उत्पादन भी होता है।

प्रमुख माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों के अतिरिक्त उपायों को विशिष्ट फ्लोरोफोरे के उपयोग के माध्यम से श्वसन के माप के साथ समवर्ती रूप से पूरा किया जा सकता है। टेट्रामिथाइलरोडामाइन मिथाइलस्टर (टीएमआरएम) एक धनिक फ्लोरोफोरे है जो माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसमेम्ब्रेन वोल्टेज क्षमता के अनुपात में माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में जमा होता है, जिसके परिणामस्वरूप इस संचयके कारण फ्लोरोसेंट तीव्रता में कमी आती है। टीएमआरएम का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में सापेक्ष परिवर्तनों के संकेतक के रूप में किया जा सकता है, या इसका उपयोग स्थिरांक निर्धारित करने के लिए अतिरिक्त प्रयोगों के साथ ट्रांसमेम्ब्रेन वोल्टेज में सटीक परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है जो फ्लोरोसेंट सिग्नल को एमवी में बदलने की अनुमति देते हैं। मैग्नीशियम ग्रीन (एमजीजी) एक फ्लोरोफोरे है जो एमजी2 + के साथ बंधे होने पर फ्लोरेसेस होता है, और मैग्नीशियम डिवेलेंट केशन4 के लिए एडीपी और एटीपी के अंतर संबंध के आधार पर एटीपी संश्लेषण के माप के लिए उपयोग किया जाता है। जांचकर्ताओं को विशिष्ट विश्लेषणात्मक परिस्थितियों में एडीपी और एटीपी दोनों के लिए विशिष्ट आत्मीयता / पृथक्करण स्थिरांक (केडी) निर्धारित करना चाहिए ताकि एमजीजी फ्लोरेसेंस में परिवर्तन को एटीपी एकाग्रता में परिवर्तन में परिवर्तित किया जा सके। एम्प्लेक्स अल्ट्रारेड (एएमआर) फ्लोरोफोरे है जिसका उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन5 के दौरान हाइड्रोजन पेरोक्साइड और अन्य आरओएस के उत्पादन को मापने के लिए किया जाता है। एच 2 ओ2और एएमआर (जो हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज द्वारा उत्प्रेरित होता है) के बीच प्रतिक्रिया रेसोरुफिन का उत्पादन करती है, जो 530 एनएम पर प्रतिदीप्ति के माध्यम से पता लगाने योग्य है। माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी के संबंधित पहलुओं के समवर्ती माप प्रदान करने के लिए, इनमें से प्रत्येक परख को वास्तविक समय माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के परख में व्यक्तिगत रूप से जोड़ा जा सकता है, इस प्रकार श्वसन और माइटोकॉन्ड्रियल आउटपुट के बीच एक सीधा लिंक प्रदान करता है।

घोड़े बड़े पैमाने पर विशिष्ट ऑक्सीजन की खपत की बहुत अधिक दर में सक्षम हैं, घोड़े के कंकाल की मांसपेशी की बहुत अधिक माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री के कारण, इस ऊतक को माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए अत्यधिक प्रासंगिक बनाते हैं। उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वास-मिथुमिति के विकास के साथ, इस नई तकनीक का उपयोग करने वाले अध्ययनों ने घोड़ों की उल्लेखनीय व्यायाम क्षमता और कंकाल की मांसपेशी रोगों के पैथोफिज़ियोलॉजी 6,7,8,9,10,11,12,13,14 दोनों के लिए घोड़े की कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया के योगदान को परिभाषित करने में मदद की है।. घोड़े की कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का अध्ययन विशेष रूप से फायदेमंद है, क्योंकि इस ऊतक की बड़ी मात्रा प्राप्त करना गैर-टर्मिनल है। इस प्रकार, घोड़े के विषय न केवल माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के पूर्ण लक्षण वर्णन के लिए पर्याप्त ऊतक प्रदान कर सकते हैं, बल्कि माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी में उच्च गुणवत्ता वाले, यंत्रवत अध्ययन के लिए अनुदैर्ध्य नियंत्रण के रूप में भी काम कर सकते हैं। इस कारण से, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता, एटीपी संश्लेषण, और आरओएस के उत्पादन को मापने के लिए अतिरिक्त परख विकसित की गई है जो इस ऊतक में ऑक्सीजन की खपत के माप के पूरक हैं, ताकि घोड़े के कंकाल की मांसपेशी में माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी का अधिक मजबूत लक्षण वर्णन प्रदान किया जा सके।

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Protocol

इस अध्ययन को ओक्लाहोमा स्टेट यूनिवर्सिटी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। प्रतिनिधि परिणाम उत्पन्न करने के लिए इस अध्ययन में चार थोरब्रेड गेलिंग (17.5 ± 1.3 वर्ष, 593 ± 45 किलोग्राम) का उपयोग किया गया था।

1. कंकाल की मांसपेशी बायोप्सी नमूना प्राप्त करना

  1. 12 जी यूनिवर्सिटी कॉलेज हॉस्पिटल (यूसीएच) बायोप्सी सुई (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके, हल्के बेहोशी के तहत और पहले प्रकाशित रिपोर्ट11 के बाद स्थानीय संज्ञाहरण का उपयोग करके सेमिटेंडिनोस मांसपेशी (या रुचि की अन्य मांसपेशियों) के केंद्र से कंकाल की मांसपेशी बायोप्सी (बाँझ तकनीक का पालन करें) प्राप्त करें।
  2. बायोप्सी नमूनों को बर्फ-ठंडे बायोप्सी परिवहन मीडिया समाधान (2.77 mM CaK 2-EGTA, 7.23 mM K 2-EGTA, 20 mM इमिडाज़ोल, 20 mM टॉरिन, 50 mM K-MES, 0.5 mM dithiothreitol, 6.56 mM MgCl2, 5.77 mM ATP, और 15 mM फॉस्फोक्रिएटिन, pH 7.1 में समायोजित) के साथ शीशियों में तुरंत स्थानांतरित करें। विश्लेषण के लिए प्रयोगशाला में परिवहन।
    नोट: बायोप्सी परिवहन मीडिया तैयार करने पर विशिष्ट निर्देशों के लिए डोएरियर एट अल .15 देखें।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करके बायोप्सी नमूनों से माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करें ( सामग्री की तालिका देखें)। अंतिम भंडारण बफर में एडीपी, एटीपी और सक्सिनेट जैसे सब्सट्रेट नहीं होने चाहिए, जो श्वसनमिति परख का हिस्सा हैं।
  4. माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव के लिए उपयोग की जाने वाली मांसपेशियों के प्रति 100 मिलीग्राम मांसपेशियों में 80 μL निलंबन मीडिया (225 mM मैनिटोल, 75 mM सुक्रोज, और 1 mM EGTA; सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के अंतिम गोली को पुन: निलंबित करें।
  5. बायोप्सी प्रक्रिया के समय से माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव तक के अंतराल को कम करें, और उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनयंत्र में जोड़े जाने तक प्रसंस्करण चरणों के दौरान नमूने को 0-4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: प्रारंभिक अध्ययनों में पाया गया है कि पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के निलंबन लगभग 2 घंटे के बाद कार्यात्मक क्षमता खोना शुरू कर देते हैं जब 0-4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है।

2. उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वासयंत्र की स्थापना

  1. माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और संबंधित प्रक्रियाओं को मापने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वासयंत्र का उपयोग किया जाता है। श्वासयंत्र को नियंत्रित करने, सेंसर को कैलिब्रेट करने और कच्चे डेटा को एकत्र करने के लिए निर्माता द्वारा प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर नियंत्रण कार्यक्रम ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें। प्रत्येक परीक्षण स्थिति के लिए डुप्लिकेट में नमूने का विश्लेषण करें।
    नोट: सभी मामलों में, इस प्रोटोकॉल में वर्णित अनुशंसित अनुमापन और अंतिम अभिकर्मक सांद्रता 2 एमएल श्वास-मिथुमिति कक्ष पर आधारित हैं।
  2. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, डिथियोनाइट के सीरियल अनुमापन के माध्यम से हर 2-4 सप्ताह में ओ 2 सेंसर की पृष्ठभूमि ओ2 फ्लक्स और शून्य बिंदु निर्धारित करें। अंशांकन दोहराए जाने तक इन अंशांकन स्थिरांक को बाद के परख के लिए बनाए रखें।
    नोट: पहले प्रकाशित प्रक्रियाओं के विपरीत परमेबिलाइज्ड मांसपेशी फाइबर11,12,13,16, जिसमें माइटोकॉन्ड्रिया में ओ 2 की प्रसार सीमा से बचने के लिए हाइपरोक्सिया (250-500 μM) आवश्यक है, पृथक माइटोकॉन्ड्रिया का मूल्यांकन 50-200 μM O2 की सीमा का उपयोग करके किया जा सकता है।. यह केवल माइटोकॉन्ड्रियल निलंबन (यानी, दैनिक एकल-बिंदु अंशांकन के बाद) को जोड़ने से पहले श्वसन मीडिया को कमरे की हवा के साथ समानता करने की अनुमति देकर प्राप्त किया जा सकता है। इसी तरह, श्वसन कक्ष का पुन: ऑक्सीकरण केवल कक्ष को खोलकर पूरा किया जा सकता है जब तक कि ऑक्सीजन एकाग्रता को वांछित स्तर तक बढ़ाने के लिए पर्याप्त परिवेश ऑक्सीजन श्वसन मीडिया में घुल न जाए।
  3. मैग्नीशियम मुक्त मीडिया (0.5 एमएम ईजीटीए, 60 एमएम के-लैक्टोबियोनेट, 20 एमएम टॉरिन, 10 एमएम केएच2पीओ4, 20 एमएम एचईपीएस, 110 एमएम सुक्रोज, और 1 ग्राम / एल गोजातीय सीरम एल्बुमिन [बीएसए] अनिवार्य रूप से फैटी एसिड मुक्त, पीएच 7.1 में समायोजित, सामग्री की तालिका देखें) के साथ श्वासयंत्र कक्षों को भरें।
    नोट: श्वसन मीडिया तैयार करने पर विशिष्ट निर्देशों के लिए कोमलोडी एट अल .17 देखें।
    1. घोड़े के कंकाल की मांसपेशी के बेसल तापमान का प्रतिनिधित्व करने के लिए उपकरण को तापमान इनक्यूबेशन 38 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, और श्वासयंत्र कक्ष के तल में चुंबकीय हलचल का उपयोग करके श्वसन मीडिया के मिश्रण को 800 आरपीएम पर सेट करें।
    2. फ्लोरोसेंट सेंसर के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए कक्ष रोशनी बंद करें।
    3. 800 एमवी ध्रुवीकरण वोल्टेज के साथ ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड को सक्रिय करें, और 1 की लाभ सेटिंग के साथ परिणामी संकेत को बढ़ाएं।
    4. हर 2 सेकंड में ऑक्सीजन एकाग्रता रिकॉर्ड करें, पिछले 40 एस (20 डेटा पॉइंट) पर ऑक्सीजन माप के नकारात्मक ढलान के रूप में ऑक्सीजन प्रवाह की गणना करें, और इनक्यूबेशन समाधान के pmol x s-1 x mL के रूप में रिपोर्ट करें।
  4. मीडिया को कमरे की हवा के साथ समानता करने की अनुमति देकर ऑक्सीजन सेंसर को कैलिब्रेट करें। उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वासयंत्र और मानक वायुमंडलीय ऑक्सीजन एकाग्रता द्वारा मापा गया बैरोमेट्रिक दबाव के आधार पर संदर्भ ऑक्सीजन आंशिक दबाव की गणना करें।

3. टीएमआरएम का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता का माप।

  1. श्वसन कक्ष से फ्लोरोसेंट सिग्नल को निर्धारित करने के लिए "ग्रीन" फ्लोरोसेंट सेंसर (530 एनएम प्रमुख तरंग दैर्ध्य) का उपयोग करें। 400-500 एमवी पर सेंसर को सक्रिय करें; परिणामी संकेत 1: 1,000 के लाभ के साथ प्रवर्धित हो जाता है।
    नोट: सेंसर की रैखिक सीमा के भीतर अपेक्षित संकेत को पकड़ने के लिए अलग-अलग उपकरणों के लिए विशिष्ट सेटिंग्स को अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  2. माइटोकॉन्ड्रिया को जोड़ने से पहले TMRM (2 μM की अंतिम एकाग्रता के लिए 1 mM समाधान का 4 μL; सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें।
  3. माइटोकॉन्ड्रिया को जोड़ने से पहले, फ्लोरोसेंट सिग्नल (वोल्टेज) के एक साधारण दो-बिंदु अंशांकन बनाम अतिरिक्त फ्लोरोफोरे (एमएम) की मात्रा का उपयोग करके फ्लोरोसेंट सिग्नल को कैलिब्रेट करें।
    नोट: इस सिग्नल को कैलिब्रेट करने के लिए मशीन नियंत्रण सॉफ्टवेयर में फ्लोरोसेंट सिग्नल कैलिब्रेशन फ़ंक्शन का उपयोग करें। फ्लोरोसेंट जांच से कच्चे संकेत को अंशांकन के दूसरे बिंदु को रिकॉर्ड करने के लिए स्थिर करने के लिए 30 मिनट या उससे अधिक की आवश्यकता हो सकती है।
  4. श्वसनमिति अनुमापन प्रोटोकॉल के पूरा होने के बाद टीएमआरएम सिग्नल का अंतिम अंशांकन अनकपलिंग एजेंट (कार्बोनिल साइनाइड एम-क्लोरोफिनाइल हाइड्राज़ोन; 2 μL प्रति अनुमापन) के कई अनुमापन प्रदान करके करें जब तक कि TMRM फ्लोरोसेंट सिग्नल में कोई और वृद्धि नहीं देखी जाती है, जो माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता के पूर्ण पतन का संकेत देती है (चित्रा 1)।
    नोट: इस फ्लोरोसेंट सिग्नल मान को 0 एमवी ट्रांसमेम्ब्रेन क्षमता के बराबर माना जाता है, और श्वास-मिति अनुमापन प्रोटोकॉल के दौरान दर्ज सापेक्ष झिल्ली संभावित मूल्यों के लिए संदर्भ बिंदु के रूप में उपयोग किया जाता है।

4. मैग्नीशियम ग्रीन (एमजीजी) का उपयोग करके एटीपी उत्पादन का माप

  1. श्वसन कक्ष से फ्लोरोसेंट सिग्नल को मापने के लिए "ब्लू" फ्लोरोसेंट सेंसर (465 एनएम प्रमुख तरंग दैर्ध्य) का उपयोग करें। सेंसर की रैखिक सीमा के भीतर अपेक्षित संकेत को पकड़ने के लिए अलग-अलग उपकरणों के लिए इन सेंसर को सक्रिय करें।
  2. माइटोकॉन्ड्रिया के अतिरिक्त के बाद एमजीजी फ्लोरोसेंट सिग्नल के रासायनिक सेटअप और अंशांकन का प्रदर्शन करें, लेकिन किसी भी सब्सट्रेट को जोड़ने से पहले। श्वसन कक्ष में 2 एमएम एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) के 8 μL जोड़ें ताकि केलेट पिंजरों (विशेष रूप से सीए2 +) को जोड़ा जा सके जो एमजीजी को बांधने के लिए Mg2+ के साथ प्रतिस्पर्धा करेगा, फिर श्वसन कक्ष में 1 mM MgG (1.1 μM) के 4 μL जोड़ें।
  3. 100 mM MgCl 2 के 10 x 2 μL अनुक्रमिक अनुमापन के साथ कच्चे प्रतिदीप्ति संकेत को कैलिब्रेट करें, जिससे फ्लोरोसेंट सिग्नल के स्थिरीकरण के लिए अनुमापन के बीच 1 मिनट की अनुमति मिलती है (चित्रा 2)।
    नोट: यह प्रक्रिया, जो परख के पूरा होने के बाद ऑफ़लाइन पूरी होती है और मशीन और संबंधित सॉफ़्टवेयर के निर्माता द्वारा प्रदान किए गए टेम्पलेट्स का उपयोग करती है, फ्लोरोसेंट सिग्नल (अपेक्षित आर2 > 0.98) के लिए मैग्नीशियम एकाग्रता का एक दूसरा क्रम वक्र पैदा करती है, जिसका उपयोग एटीपी11 की संबंधित एकाग्रता निर्धारित करने के लिए श्वास-मिथुन कक्ष में जोड़े गए एडीपी की ज्ञात मात्रा और पहले से निर्धारितकेडी मानों के साथ किया जाएगा।
  4. एटीपी संश्लेषण की दर निर्धारित करें, जो पूरे प्रोटोकॉल में समय के साथ एटीपी की एकाग्रता का ढलान है (चित्रा 3)।

5. एम्प्लेक्स अल्ट्रारेड (एएमआर) का उपयोग करके आरओएस के माइटोकॉन्ड्रियल उत्पादन का माप।

  1. श्वसन कक्ष से फ्लोरोसेंट सिग्नल को निर्धारित करने के लिए "ग्रीन" फ्लोरोसेंट सेंसर (530 एनएम प्रमुख तरंग दैर्ध्य) का उपयोग करें। 300-400 एमवी पर सेंसर को सक्रिय करें; परिणामी संकेत 1: 1,000 के लाभ के साथ प्रवर्धित हो जाता है। सेंसर की रैखिक सीमा के भीतर अपेक्षित संकेत को पकड़ने के लिए अलग-अलग उपकरणों के लिए विशिष्ट सेटिंग्स का अनुकूलन करें।
    नोट: यदि एमजीसीएल 2 के बिना श्वसन मीडिया का उपयोग कर रहे हैं, तो एएमआर परख के लिए अभिकर्मकों को जोड़ने से पहले इसे जोड़ा जाना चाहिए (1-3 μM MgCl2 का उत्पादन करने के लिए 100 mM MgCl2 का 20-60 μL)।
  2. माइटोकॉन्ड्रिया को जोड़ने से पहले एएमआर परख के रासायनिक सेटअप और प्रारंभिक अंशांकन का प्रदर्शन करें। प्रतिक्रिया में हस्तक्षेप करने वाले केलेट पिंजरों में डीटीपीए के 30 μmoles (5 mM समाधान के 6 μL) जोड़ें, फिर सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन उत्पादन का अधिक व्यापक पता लगाने के लिए सुपरऑक्साइड आयनों को H 2 O 2 में परिवर्तित करने के लिए 5,000 U / mL स्टॉकसमाधान का2 μL), हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (500 U / mL स्टॉक समाधान का 5 μL) जोड़ें। और एम्प्लेक्स अल्ट्रारेड (10 एमएम स्टॉक समाधान का 2 μL) (सामग्री की तालिका देखें) क्रमशः श्वसनमेट्री कक्ष में 5 U / mL, 1 U / mL और 10 μM का उत्पादन करने के लिए।
  3. फ्लोरोसेंट सिग्नल को स्थिर होने दें, फिर हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 0.2 μmoles (दैनिक ताजा बनाए गए 40 μM समाधान का 5 μL) को दो बार जोड़ें, लगभग 5 मिनट अलग।
    नोट: एच 2 ओ 2 के दो अनुमापन से पहले और बाद में फ्लोरोसेंट सिग्नल सिस्टम के तीन-बिंदु रैखिक अंशांकन वक्र (अपेक्षित आर 2 > 0.95) प्रदान करता है, जिसकी ढलान फ्लोरोसेंट सिग्नल और एच 2 ओ 2 के उत्पादन (या जोड़) के बीच संबंधों की रिपोर्ट करने में सिस्टम की समग्र प्रतिक्रिया को दर्शाती है। इस सिग्नल को कैलिब्रेट करने के लिए मशीन नियंत्रण सॉफ्टवेयर में फ्लोरोसेंट सिग्नल कैलिब्रेशन फ़ंक्शन का उपयोग करें।
  4. परख के दौरान अतिरिक्त दो-बिंदु अंशांकन (दैनिक रूप से ताजा किए गए 40 μM समाधान का 5 μL) करें, ताकि परख की प्रतिक्रिया के समायोजन की अनुमति मिल सके क्योंकि श्वसनमिति का रसायन विज्ञान पूरे परख में बदलता है, अन्वेषक के विवेक पर इन अंशांकन बिंदुओं के विशिष्ट समय के साथ (चित्रा 4)।

6. माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का माप

  1. प्रत्येक 2 एमएल इनक्यूबेशन कक्ष में पृथक माइटोकॉन्ड्रिया निलंबन (चरण 1.4) के 15 μL जोड़ें, ताकि परिणाम 18.75 मिलीग्राम मांसपेशियों की माइटोकॉन्ड्रियल उपज का प्रतिनिधित्व करें। इनक्यूबेशन कक्ष को सील करें। नमूने के एक समान निलंबन को बनाए रखने के लिए प्रत्येक अनुमापन के बीच नमूना भंवर।
  2. किसी भी सब्सट्रेट को जोड़ने से पहले अवशिष्ट ऑक्सीजन की खपत (आरओएक्स) को मापें। प्रोटोकॉल के पूरा होने के बाद सब्सट्रेट/अनकपलर/इनहिबिटर अनुमापन (सूट) प्रोटोकॉल11 में प्रत्येक चरण के ऑक्सीजन खपत मूल्यों से इस मान (आमतौर पर 0.2 pmol O2 x s-1 x mL-1 से कम) घटाएं।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि ऑक्सीजन सेंसर और फ्लोरेसेंस सेंसर दोनों से संकेतों को कम से कम 1 मिनट के लिए स्थिर करने की अनुमति दी जाती है (जैसा कि प्राथमिक सेंसर संकेतों के स्थिर गणना ढलान द्वारा मूल्यांकन किया जाता है), क्योंकि विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए श्वसन की समग्र स्थिति अनुमापन द्वारा बदल जाती है। यह सभी अनुमापन चरणों पर लागू होता है।
  3. एक सामान्य-उद्देश्य सूट का उपयोग करें जो घोड़े के कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के प्रारंभिक लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। पाइरूवेट (2 एम जलीय घोल का 5 μL), ग्लूटामेट (2 M जलीय घोल का 10 μL), और मैलेट (0.4 M जलीय घोल का 10 μL) ( सामग्री की तालिका देखें) के अनुक्रमिक अनुमापन के साथ प्रत्येक कक्ष में निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड (एनएडीएच) का उत्पादन करने के लिए शुरू करें और कॉम्प्लेक्स I (एलएन) के माध्यम से ऑक्सीकरण किए गए एनएडीएच द्वारा समर्थित गैर-फॉस्फोराइलिंग (रिसाव) श्वसन को उत्तेजित करें (चित्रा 1)। चित्र 3, और चित्रा 4)।
  4. कॉम्प्लेक्स आई(पीएन) के माध्यम से फॉस्फोरिलिंग श्वसन को प्रोत्साहित करने के लिए एडीपी (500 एमएम जलीय घोल का 20 μL; सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें।
  5. कॉम्प्लेक्स I और कॉम्प्लेक्स II (PN+S) के संयोजन के माध्यम से फॉस्फोरिलिंग श्वसन का उत्पादन करने के लिए सक्सिनेट (1 एम जलीय घोल का 20 μL; सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें।
    नोट: कॉम्प्लेक्स I और कॉम्प्लेक्स II दोनों के माध्यम से श्वसन के संयोजन के साथ, ऑक्सीजन की खपत इनक्यूबेशन मीडिया में घुलने वाली अधिकांश ऑक्सीजन का उपभोग करने के लिए पर्याप्त हो सकती है। यदि O2 सांद्रता 50 μM से कम हो जाती है, तो इनक्यूबेशन कक्ष को अनसील करके इनक्यूबेशन मीडिया को फिर से ऑक्सीजन दें जब तक कि मापा गया O2 एकाग्रता 150 μM से ऊपर न हो जाए। माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के लिए पर्याप्तO2 बनाए रखने के लिए आवश्यक रूप से इस चरण को दोहराएं।
  6. कॉम्प्लेक्स I को ब्लॉक करने के लिए रोटेनोन (0.1 एमएम इथेनॉल समाधान का 2 μL; सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें। परिणामी ऑक्सीजन प्रवाह अकेले सक्सिनेट (पीएस) के ऑक्सीकरण के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत का समर्थन करने के लिए कॉम्प्लेक्स द्वितीय की क्षमता का प्रतिनिधित्वकरता है।
    सावधानी: रोटेनोन एक जहरीला पदार्थ है। मानक प्रयोगशाला सुरक्षा का उपयोग करें और अंतर्ग्रहण या साँस लेने से बचें।
  7. एकल बायोप्सी के एलिकोट युक्त व्यक्तिगत श्वास-चिकित्सा कक्षों में किसी दिए गए प्रयोगात्मक स्थिति के लिए औसत मूल्य की गणना करें।
    नोट: फ्लक्स कंट्रोल अनुपात (एफसीआर) जैसे व्युत्पन्न गणना, विभिन्न मार्गों में सापेक्ष परिवर्तनों की पहचान करने में मूल्यवान हैं, और इसमें एफसीआररिसाव (एल एन / पी एन), एफसीआर एन (पी एन / पी एन + एस), और एफसीआर एस (पी एस / पी एन + एस) शामिल हैं। गणना की गई ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण दक्षता (1-एल एन / पीएन + एस) कुल श्वसन क्षमता के लिए समायोजित रिसाव श्वसन के समग्र प्रभाव का अनुमान प्रदान करती है।

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Representative Results

प्रस्तावित संदर्भ स्थिति एक स्वस्थ गतिहीन थोरब्रेड (अनिवार्य व्यायाम के कारण कोई बढ़ी हुई फिटनेस नहीं) और एक पोस्टुरल मांसपेशी के केंद्र से एकत्र किए गए एक ताजा मांसपेशी नमूने की है, जिसमें माइटोकॉन्ड्रिया-समृद्ध टाइप 1 कंकाल की मांसपेशी फाइबर का उच्च प्रतिशत होता है और चयापचय (यानी, 38 डिग्री सेल्सियस और पीएच 7.0) को पूरा करने वाली स्थितियों के तहत इनक्यूबेट किया जाता है। इन शर्तों के तहत, अन्वेषक 2.71 ± 0.90 के एलएन मान, 62.40 ± 26.22 के पीएन मान, 93.67 ± 34.76 के पीएन + एस मान, और 46.93 ± 14.58 पीएमओएल ओ2 एक्स एस -1 एक्स एमएल -1 (चित्रा 3 और चित्रा 4) के पीएन मानों की उम्मीद कर सकता है। टीएमआरएम के साथ इनक्यूबेट किए गए माइटोकॉन्ड्रिया के श्वसन मूल्य उस फ्लोरोफोरे के निरोधात्मक प्रभाव के कारण कम हैं (चित्रा 1)। एफसीआरलीक, एफसीआरएन और एफसीआरएस क्रमशः 0.05 ± 0.01, 0.66 ± 0.07 और 0.51 ± 0.07 हैं। गणना की गई ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण दक्षता 0.97 ± 0.01 है। इन श्वसन अवस्थाओं के लिए पूर्ण मान व्यक्तिगत विषय और ऊतक ऑक्सीडेटिव क्षमता के कारण भिन्न होते हैं, लेकिन इन मूल्यों का सापेक्ष पैटर्न परमेबिलाइज्ड इक्वाइन कंकाल मांसपेशी फाइबर (यानी, विशिष्ट सब्सट्रेट्स के अतिरिक्त श्वसन में वृद्धि, कॉम्प्लेक्स I और कॉम्प्लेक्स II के माध्यम से श्वसन का संयोजन इलेक्ट्रॉन स्थानांतरण प्रणाली [ईटीएस] की संतृप्ति के कारण व्यक्तिगत रूप से इन इलेक्ट्रॉन स्रोतों में से प्रत्येक से कम होता है) से प्रकाशित परिणामों के अनुरूप होता है। डाउनस्ट्रीम क्षमता)। पृथक घोड़े की कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया की गणना दक्षता परमेबिलाइज्ड इक्वाइन कंकाल मांसपेशी फाइबर11 के लिए रिपोर्ट किए गए संबंधित मूल्यों के अनुरूप है।

एटीपी संश्लेषण की दर पीएन श्वसन के लिए 438.59 ± 397.10 पीएम एक्स एस -1, पीएन + एस श्वसन के लिए 383.18 ± 397.19और पीएस श्वसन के लिए 172.07 ± 125.60 होने की उम्मीद है, प्रति मिलीग्राम माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले स्रोत ऊतक के लिए। सक्सिनेट के अलावा एटीपी संश्लेषण में कमी दो इलेक्ट्रॉन फ़ीड द्वारा ईटीएस के क्विनोन जंक्शन पर प्रतिस्पर्धा के कारण होने की संभावना है, जिसमें कॉम्प्लेक्स II (जो माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में सीधे योगदान नहीं देता है) से फ़ीड कॉम्प्लेक्स I के माध्यम से इलेक्ट्रॉनों के प्रवाह को कम करता है (जो सीधे आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में प्रोटॉन के पंपिंग के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में योगदान देता है)।

एल एन श्वसन केलिए एच 2 ओ2 उत्पादन की दर 0.079 ± 0.095 एनएमओएल.एस -1, पीएन श्वसन के लिए 0.021 ± 0.043, पीएन + एस श्वसन के लिए 0.026 ± 0.056, और पीएस श्वसन के लिए 0.237 ± 0.248, माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले स्रोत ऊतक के प्रति मिलीग्राम होने की उम्मीद है (चित्रा 4)। आरओएस उत्पादन की सापेक्ष दर माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता के अनुमानित परिमाण और उच्च झिल्ली क्षमता और आरओएस उत्पादन के बीच संबंध के अनुरूप है। इस संबंध का अपवाद बहुत अधिक आरओएस उत्पादन है जब श्वसन अकेले कॉम्प्लेक्स II के माध्यम से होता है, क्योंकि क्विनोन जंक्शन से कॉम्प्लेक्स I तक इलेक्ट्रॉनों का पिछड़ा प्रवाह होता है जब यह रोटेनोन द्वारा अवरुद्ध होता है।

Figure 1
चित्रा 1: घोड़े की कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और सापेक्ष झिल्ली क्षमता के प्रतिनिधि उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वास-रोमेट्री ट्रेस। शीर्ष खिड़की समय के साथ कक्ष ऑक्सीजन एकाग्रता (बाएं वाई-अक्ष) और ऑक्सीजन प्रवाह (दाएं वाई-अक्ष) (एक्स-अक्ष) है; नीचे की खिड़की कक्ष टीएमआरएम फ्लोरेसेंस (बाएं वाई-अक्ष) और समय के साथ प्रतिदीप्ति संकेत परिवर्तन (दाएं वाई-अक्ष) की दर (एक्स-अक्ष) है। ऊर्ध्वाधर निशान कक्ष में विशिष्ट सब्सट्रेट ्स के जोड़ का संकेत देते हैं (एमटी: माइटोकॉन्ड्रिया निलंबन; पी: पाइरूवेट; जी: ग्लूटामेट; एम: मैलेट; डी: एडीपी; एस: सक्सिनेट; आर: रोटोनोन; सीसीसीपी: कार्बोनिल साइनाइड एम-क्लोरोफिनाइल हाइड्राज़ोन)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मैग्नीशियम ग्रीन के लिए चैंबर फ्लोरेसेंस सिग्नल के अंशांकन का प्रतिनिधि उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसन मिट्रेस और मैग्नीशियम और एडेनिलेट्स के लिएकेडी का निर्धारण। चैंबर एमजीजी फ्लोरेसेंस (बाएं वाई-अक्ष) और समय के साथ प्रतिदीप्ति संकेत परिवर्तन (दाएं वाई-अक्ष) की दर (एक्स-अक्ष)। प्रारंभिक ऊर्ध्वाधर निशान कक्ष में विशिष्ट सब्सट्रेट ्स के अतिरिक्त का संकेत देते हैं (एमजीजी: मैग्नीशियम हरा; एमटी: माइटोकॉन्ड्रिया निलंबन; पी: पाइरूवेट; जी: ग्लूटामेट; एम: मैलेट; एस: सक्सिनेट; ईडीटीए: एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड)। इसके बाद एक स्वचालित अनुमापन पंप (टीआईपी) का उपयोग करके एमजीसीएल2 का सीरियल अनुमापन होता है जो फ्लोरोसेंट सिग्नल को बढ़ाता है, फिर एक एडेनिलेट (इस मामले में एटीपी) का सीरियल अनुमापन जो फ्लोरोसेंट सिग्नल को कम करता है। एमजीसीएल2 के अनुमापन का उपयोग प्रत्येक परख की शुरुआत में एमजीजी सिग्नल को कैलिब्रेट करने के लिए भी किया जाता है, लेकिन माइटोकॉन्ड्रिया और श्वसन-सबस्ट्रेट्स जैसे पी, जी, एम और एस को जोड़ने से पहले किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: घोड़े की कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और एटीपी संश्लेषण के प्रतिनिधि उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वासरोमिति ट्रेस। शीर्ष खिड़की समय के साथ कक्ष ऑक्सीजन एकाग्रता (बाएं वाई-अक्ष) और ऑक्सीजन प्रवाह (दाएं वाई-अक्ष) (एक्स-अक्ष) है; नीचे की खिड़की कक्ष एमजीजी फ्लोरेसेंस (बाएं वाई-अक्ष) और समय के साथ प्रतिदीप्ति संकेत परिवर्तन (दाएं वाई-अक्ष) की दर (एक्स-अक्ष) है। ऊर्ध्वाधर निशान कक्ष में विशिष्ट सब्सट्रेट ्स के जोड़ का संकेत देते हैं (एमटी: माइटोकॉन्ड्रिया निलंबन; पी: पाइरूवेट; जी: ग्लूटामेट; एम: मैलेट; डी: एडीपी; एस: सक्सिनेट; आर: रोटेनोन)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: घोड़े के कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और एच 2 ओ2के उत्पादन के प्रतिनिधि उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वासरोमिति ट्रेस। शीर्ष खिड़की समय के साथ कक्ष ऑक्सीजन एकाग्रता (बाएं वाई-अक्ष) और ऑक्सीजन प्रवाह (दाएं वाई-अक्ष) (एक्स-अक्ष) है; नीचे की खिड़की कक्ष रेसोरुफिन फ्लोरेसेंस (बाएं वाई-अक्ष) और समय के साथ प्रतिदीप्ति संकेत परिवर्तन (दाएं वाई-अक्ष) की दर (एक्स-अक्ष) है। ऊर्ध्वाधर निशान कक्ष में विशिष्ट सब्सट्रेट ्स के जोड़ का संकेत देते हैं (एमटी: माइटोकॉन्ड्रिया निलंबन; पी: पाइरूवेट; जी: ग्लूटामेट; एम: मैलेट; डी: एडीपी; एस: सक्सिनेट; आर: रोटेनोन)। इसके अलावा एच 2 ओ2का उपयोग करके फ्लोरोसेंट सिग्नल के तीन इंट्रा-परख दो-बिंदु अंशांकन शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वासयंत्र के मानक आउटपुट में फ्लोरोसेंट संकेतों के अलावा माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करता है, लेकिन फ्लोरोसेंट सिग्नल का सावधानीपूर्वक अंशांकन गुणवत्ता डेटा के लिए महत्वपूर्ण है। एमजीजी के उपयोग के लिए मूल प्रोटोकॉल का सुझाव है कि मैग्नीशियम-एडेनिलेट पृथक्करण स्थिरांक की गणना करते समय उत्पन्न अंशांकन वक्रों कोबाद के परखों पर लागू किया जा सकता है। हालांकि, एमजीजी से फ्लोरोसेंट सिग्नल इस दृष्टिकोण के लिए परख से परख तक पर्याप्त रूप से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं हो सकता है। इसलिए, प्रत्येक परख को एक स्वचालित एमजीसीएल2 अनुमापन के साथ कैलिब्रेट किया जाता है, और उस व्यक्तिगत परख के लिए एटीपी संश्लेषण की गणना के लिए परिणामी अंशांकन वक्र। इसके अलावा, मैग्नीशियम और एडीपी और एटीपी दोनों के लिए केडी (पृथक्करण स्थिरांक) की गणना परख की विशिष्ट स्थितियों के लिए की जानी चाहिए, जिसमें विशिष्ट ऊतक, इनक्यूबेशन स्थितियां और फॉस्फोराइलिंग श्वसन का उत्पादन करने वाले सब्सट्रेट शामिल हैं, ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि एटीपी संश्लेषण दर की व्युत्पत्ति सटीक है। एएमआर परख में परिवर्तनशीलता अधिक व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त15,17 है, और प्रोटोकॉल के दौरान जांचकर्ता के विवेक पर प्रोटोकॉल में कई असतत रीकैलिब्रेशन बिंदुओं को सम्मिलित करना आम है। घोड़े के कंकाल की मांसपेशी का उपयोग करने वाले ऐतिहासिक डेटा से संकेत मिलता है कि परख की विशिष्ट प्रतिक्रिया पहले अंशांकन बिंदु (नमूने को जोड़ने से पहले) परएच 2 ओ2 के लगभग 0.646 वी / एमएम है, और परख की अवधि में 8% -15% कम हो सकती है। इस प्रकार, आरओएस के उत्पादन में अपेक्षाकृत छोटे परिवर्तनों का पता लगाने के लिए एएमआर परख का लगातार पुनर्कैलिब्रेशन आवश्यक है, और प्रोटोकॉल के भीतर बिंदु अंशांकन का समय प्रत्येक अनुमापन प्रोटोकॉल के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए।

जांचकर्ताओं को यह निर्धारित करने में परख प्रदर्शन के दौरान सावधानीपूर्वक निर्णय लेना चाहिए कि अगले अनुमापन चरण में कब जाना है। आदर्श रूप से, वास्तविक समय में उत्पन्न होने वाले प्रासंगिक संकेत (ओ2 फ्लक्स, टीएमआरएम की प्रतिदीप्ति, और एमजीजी और रेसोरुफिन फ्लोरोसेंट सिग्नल में परिवर्तन की दर) स्थिर होनी चाहिए, जो कक्ष के भीतर एक स्थिर स्थिति का संकेत देती है, लेकिन यह जांचकर्ता की ओर से एक निर्णय कॉल है कि स्वीकार्य स्थिरता क्या है। इस समय, इस निर्णय के लिए कोई व्यापक रूप से आयोजित मानक नहीं है; हालांकि, जांचकर्ताओं को एक स्थिर स्थिति स्थापित करने के लिए लंबे समय तक इंतजार करने में विफल रहने से होने वाले जोखिमों के बारे में गहराई से पता होना चाहिए (जिसके परिणामस्वरूप डेटा जो अपूर्ण रूप से इच्छित श्वसन स्थिति की विशेषता है) और इतने लंबे समय तक इंतजार करना कि सब्सट्रेट समाप्त हो जाते हैं, और परख अब विश्वसनीय नहीं है। लेखक के अनुभव में, किसी भी सब्सट्रेट अनुमापन के 30 मिनट के भीतर एक स्थिर संकेत प्राप्त करने में विफल रहना एक नमूना (या मशीन) का सबूत है जो गैर-जैविक तरीके से व्यवहार कर रहा है, और परख को त्याग दिया जाना चाहिए।

माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी को मापने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करने वाले परिणाम 30% -40% के भिन्नता के विशिष्ट गुणांक (सीवी) के साथ काफी अंतर-विषय परिवर्तनशीलता प्रदर्शित करते हैं। इसके विपरीत, परमेबिलाइज्ड इक्वाइन कंकाल की मांसपेशी फाइबर के विश्लेषण के परिणामस्वरूप 19% -20% 11 का सीवी होता है, यह सुझाव देते हुए कि माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने की प्रक्रिया चिह्नित अंतर-विषय परिवर्तनशीलता के अलावा बाद के विश्लेषण में पर्याप्त परिवर्तनशीलता लागू करती है। यद्यपि उत्तरार्द्ध के प्रभाव को संभव होने पर अपने स्वयं के नियंत्रण के रूप में विषयों का उपयोग करके कम किया जा सकता है, पूर्व को केवल अलगाव तकनीक पर सावधानीपूर्वक ध्यान देने के माध्यम से कम किया जा सकता है। यदि प्रयोगात्मक डिजाइन एक बायोप्सी से प्रयोगात्मक प्रतिकृति की अनुमति नहीं देता है, तो अन्वेषक एक सुधार कारक के सापेक्ष श्वसनमिति डेटा को व्यक्त करने का चुनाव कर सकता है जो विभिन्न नमूनों में माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री में अंतर को दर्शाता है। सबसे आम सुधार कारक नमूना प्रोटीन सामग्री और नमूने की साइट्रेट सिंथेज़ गतिविधि हैं। हालांकि, जैसा कि इस क्षेत्र में सक्रिय वैज्ञानिकों के हाल के आम सहमति बयान में उल्लिखित है, इस समायोजन को करने के लिए कोई एक विधि नहीं है जो सार्वभौमिक रूप से सहमतहै। प्रोटीन सामग्री और / या साइट्रेट सिंथेज़ गतिविधि के लिए सुधार करना घोड़े के कंकाल की मांसपेशी ऊतक12,13 के लिए उपयोग किए जाने वाले दो सबसे आम दृष्टिकोण हैं, लेकिन दोनों की अपनी कमियां हैं। माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन की व्याख्या करने के लिए आंतरिक (यानी, फ्लक्स कंट्रोल अनुपात) और बाहरी (प्रोटीन, एंजाइम गतिविधि, अन्य माइटोकॉन्ड्रियल मार्कर) दोनों के माध्यम से डेटा व्यक्त करना विभिन्न प्रयोगात्मक डिजाइनों के लिए आवश्यक हो सकता है।

वर्णित प्रोटोकॉल कई महत्वपूर्ण अंतरों के साथ, परमेबिलाइज्ड मांसपेशी फाइबर के उपयोग पर बनाता है। परमेबिलाइज्ड फाइबर परख के लिए छोटी बायोप्सी की आवश्यकता होती है, क्योंकि घोड़े की कंकाल की मांसपेशी परमेबिलाइज्ड फाइबर की उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसन चिकित्सा आमतौर पर प्रत्येक कक्ष 6,7,8,9,10,11 में केवल ~ 2 मिलीग्राम नमूना द्रव्यमान के साथ की जाती है। इसके विपरीत, यहां वर्णित प्रोटोकॉल में प्रत्येक कक्ष में लगभग 10 गुना फाइबर द्रव्यमान के बराबर है। यह अंतर ताजा ऊतक से माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव की अक्षमता पर प्रकाश डालता है। इस अक्षमता का एक संभावित कारण कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया को पुनर्प्राप्त करने में कठिनाई है जो सिकुड़ा हुआ प्रोटीन नेटवर्क के भीतर स्थित हैं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव के लिए वाणिज्यिक किट में एक प्रोटीज के साथ उपचार और सिकुड़ा हुआ फाइबर को तोड़ने में मदद करने के लिए आयनिक मीडिया का उपयोग शामिल है, लेकिन यह संभावना है कि इंटरमायोफिब्रिलर माइटोकॉन्ड्रिया का एक बड़ा हिस्सा बरामद नहीं हुआ है। प्रोटोकॉल की यह विशेषता न केवल आवश्यक बायोप्सी सामग्री की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रासंगिक है, बल्कि परिणामों की व्याख्या के संबंध में भी है। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया ऑक्सीजन निर्भरता के लिए कम संवेदनशील होते हैं, परमेबिलाइज्ड फाइबर15 की तुलना में प्रसार सीमा के कारण; इस प्रकार, पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के साथ हाइपरोक्सिया की आवश्यकता नहीं होती है, और श्वसन मीडिया को कमरे की हवा में कक्ष खोलकर पर्याप्त रूप से ऑक्सीजन युक्त (और परख के दौरान पुन: ऑक्सीजन) किया जा सकता है। ऑक्सीजन वितरण का यह पहलू एच 2 ओ2 और अन्य आरओएस केउत्पादन को मापते समय विशेष रूप से उपयोगी होता है, क्योंकि हाइपरोक्सिक इनक्यूबेशन19 के दौरान आरओएस उत्पादन गैर-शारीरिक तरीके से बढ़ जाता है। अंत में, पृथक माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग एक अधिक स्थिर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य फ्लोरोसेंट संकेत प्रदान करता है, क्योंकि फ्लोरोफोरे के गैर-विशिष्ट प्रोटीन बाइंडिंग में कमी के कारण परमेबिलाइज्ड मांसपेशी फाइबर के साथ फ्लोरोफोर के उपयोग की तुलना में। प्रत्येक नमूना तैयारी के फायदे और नुकसान हैं, और परमेबिलाइज्ड फाइबर और पृथक माइटोकॉन्ड्रिया दोनों के साथ प्रवीणता जांचकर्ता को माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी से संबंधित विभिन्न प्रश्नों को संबोधित करने के लिए परख का एक मजबूत सेट प्रदान करती है।

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Disclosures

लेखकों के पास इस पांडुलिपि से संबंधित हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इक्वाइन स्पोर्ट्स मेडिसिन और ग्रेसन जॉकी क्लब रिसर्च फाउंडेशन के लिए जॉन और डेबी ऑक्सली संपन्न चेयर के उदार समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) A5285
Amplex UltraRed Life Technologies A36006
ATP Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) A2383
BSA Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) A6003
Calcium carbonate Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) C4830
CCCP Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) C2759
DatLab 7.0 Oroboros Inc Software to operate O2K fluororespirometer
Dithiothreitol Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) D0632
DTPA Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) D1133
EGTA Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) E4378
Glutamate Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) G1626
HEPES Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) H7523
Horseradish peroxidase Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) P8250
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) 516813 Must be made fresh daily prior to assay
Imidazole Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) I2399
K-MES Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) M8250
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) M9272
Magnesium Green Thermo Fisher Scientific M3733
Malate Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) M1000
Mannitol Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) M9647
Mitochondrial isolation kit Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) MITOISO1
O2K fluororespirometer Oroboros Inc Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently.
Phosphocreatine Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) P7936
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) P1767
Potassium lactobionate Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) L2398
Potassium phosphate Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) P0662
Pyruvate Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) P2256 Must be made fresh daily prior to assay
Rotenone Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) R8875
Succinate Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) S2378
Sucrose Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) 84097
Superoxide dismutase Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) S8160
Taurine Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) T0625
Titration pump Oroboros Inc
Titration syringes Oroboros Inc
TMRM Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) T5428
UCH biopsy needle Millenium Surgical Corp 72-238067 Available in a range of sizes

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References

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घोड़े के कंकाल की मांसपेशी की उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरो-श्वसनमिति
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Davis, M. S., Barrett, M. R.… More

Davis, M. S., Barrett, M. R. High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (192), e65075, doi:10.3791/65075 (2023).

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