馬は並外れた有酸素運動能力を持っているため、馬の骨格筋は、馬の運動生理学と哺乳類のミトコンドリア生理学の両方の研究にとって重要な組織となっています。この記事では、馬の骨格筋におけるミトコンドリア機能の包括的な評価のための技術について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
ミトコンドリアの機能(酸化的リン酸化と活性酸素種の生成)は、健康と病気の両方において重要です。したがって、ミトコンドリア機能の測定は生物医学研究の基本です。骨格筋は、特に馬などの非常に高い有酸素能力を持つ動物において、ミトコンドリアの強力な供給源であり、ミトコンドリア生理学を研究するための理想的な対象となっています。この記事では、採取したばかりの骨格筋ミトコンドリアを使用した同時蛍光測定を伴う高分解能呼吸留置法を使用して、さまざまなミトコンドリア状態下で基質を酸化する能力を定量化し、ミトコンドリア呼吸の異なる要素の相対容量を決定する方法を示します。テトラメチルローダミンメチルエステルは、同時酸素フラックスの単位あたりに生成される相対膜電位を計算することによるミトコンドリアの相対効率の計算を含む、基質酸化に起因するミトコンドリア膜電位の生成を実証するために使用されます。ADPからATPへの変換は、マグネシウムに対するアデニル酸塩の親和性が異なるため、反応チャンバー内のマグネシウム濃度の変化をもたらします。したがって、マグネシウムグリーンを使用してATP合成速度を測定することができ、酸化的リン酸化効率(リン酸化と酸化の比率[P / O])をさらに計算できます。最後に、過酸化水素と組み合わせると蛍光生成物(レゾルフィン)を生成するAmplex UltraRedを使用することで、ミトコンドリア呼吸中の活性酸素種の産生、およびROS産生と同時呼吸の関係を定量化できます。これらの技術は、さまざまな異なるシミュレート条件下でのミトコンドリア生理機能の堅牢な定量を可能にし、健康と病気の両方に対するこの重要な細胞成分の寄与に光を当てます。
概要
真核細胞のミトコンドリアは、細胞が仕事と維持に使用するATPの大部分を産生します1。ATPのミトコンドリア産生における重要なステップは、酸素から水への変換であり、したがって、ミトコンドリアおよび関連細胞の代謝能力は、酸素消費量の測定を通じて頻繁に定量化されます2。しかし、ミトコンドリア生理学は酸素消費の単純なプロセスよりも複雑であり、このエンドポイントへの依存は、ミトコンドリア機能と機能障害が細胞の健康に与える影響の不完全な評価のみを提供します。ミトコンドリア機能の完全な特性評価には、酸素消費量だけでなく、ATPおよび活性酸素種(ROS)の産生も評価する必要があります。
重要なミトコンドリア機能の追加測定は、特定の蛍光色素を使用して呼吸の測定と同時に達成することができます。テトラメチルローダミンメチルエステル(TMRM)は、ミトコンドリア膜貫通電位に比例してミトコンドリアマトリックスに蓄積するカチオン性蛍光団であり、この蓄積により蛍光強度が低下します3。TMRMは、ミトコンドリア膜電位の相対的変化の指標として使用することも、蛍光シグナルをmVに変換することを可能にする定数を決定するための追加の実験により膜貫通電圧の正確な変化を定量化するために使用することもできます。マグネシウムグリーン(MgG)は、Mg2+と結合....
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プロトコル
この研究は、オクラホマ州立大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。この研究では、4頭のサラブレッド騸馬(17.5±1.3年、593±45 kg)を使用して、代表的な結果を生成しました。
1. 骨格筋生検標本の採取
- 半腱様筋(または他の関心のある筋肉)の中心から骨格筋生検(滅菌技術に従う)を取得し、軽い鎮静下で12 Gユニバーシティカレッジ病院(UCH)生検針( 資料表を参照)を使用し、以前に発表されたレポート11に従って局所麻酔を使用します。
- 生検標本を、氷冷生検輸送培地溶液(2.77 mM CaK 2-EGTA、7.23 mM K 2-EGTA、20 mM イミダゾール、20 mMタウリン、50 mM K-MES、0.5 mM ジチオスレイトール、6.56 mM MgCl2、5.77 mM ATP、および15 mMホスホクレアチン、pH 7.1に調整したバイアルに移します;材料表を参照)。分析のために実験室に輸送する。
注:生検輸送培地の調製に関する具体的な手順については、Doerrierら15を参照してください。 - 製造元の指示に従....
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結果
提案された基準状態は、健康な座りがちなサラブレッド(強制運動によるフィットネスの増加なし)と、ミトコンドリアに富むI型骨格筋繊維を高い割合で含み、安静時代謝に近い条件(すなわち、38°CおよびpH 7.0)でインキュベートされた姿勢筋の中心から収集された新鮮な筋肉サンプルです。これらの条件下で、研究者はL N値が2.71±0.90、PN 値が62.40 ± 26.22、PN + S値が93.67 ± 34.76、およびP S 値が46.93 ± 14.58 pmol O2 x s-1 x mL-1(図3および図4)。TMRMでインキュベートしたミトコンドリアの呼吸値は、その蛍光色素の阻害効果により低くなっています(図1)。FCRリーク、FCRN、および FCR
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ディスカッション
高分解能呼吸計の標準出力に蛍光信号を追加することで、ミトコンドリア生理学に関する貴重な情報が得られますが、高品質のデータには蛍光信号の綿密な校正が不可欠です。MgGを使用するための元のプロトコルは、マグネシウム-アデニル酸解離定数の計算中に生成された検量線が後続のアッセイに適用できることを示唆しています4。しかしながら、MgGからの蛍光シグナルは、このアプローチのためのアッセイからアッセイへの十分に再現性がない可能性がある。したがって、各アッセイは、自動MgCl2滴定で較正され、得られた検量線は、その個々のアッセイについてのATP合成を計算するためのものである。さらに、ATP合成速度の導出が正確であることを保証するために、マグネシウムおよびADPおよびATPの両方についてのKd(解離定数)は、特定の組織、インキュベーション条件、およびリン酸化呼吸を生じる基質を含むアッセイの特定の条件について計算されなければならない。AmRアッセイの変動性はより広く認識されており15,17
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開示事項
著者は、この原稿に関連する利益相反はありません。
謝辞
著者は、馬のスポーツ医学のためのジョンとデビーオクスリー寄付講座とグレイソンジョッキークラブ研究財団の寛大な支援に感謝したいと思います。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A5285 | |
| Amplex UltraRed | Life Technologies | A36006 | |
| ATP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A2383 | |
| BSA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A6003 | |
| 炭酸カルシウム | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C4830 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C2759 | |
| DatLab 7.0 | Oroboros Inc | O2K fluororespirometer | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D0632 | |
| DTPA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D1133 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | E4378 | |
| グルタミン酸 | Sigma-Aldrich(MilliporeSigma) | G1626 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich(MilliporeSigma) | H7523 | |
| ワサビペルオキシダーゼ | Sigma-Aldrich(MilliporeSigma) | P8250 | |
| 過酸化水素 | Sigma-Aldrich(MilliporeSigma) | 516813 | アッセイイ |
| ミダゾール | Sigma-Aldrich(MilliporeSigma) | I2399 | |
| K-MES | Sigma-Aldrich(MilliporeSigma) | M8250 | |
| マグネシウム六水和物 | Sigma-Aldrich(MilliporeSigma) | M9272 | |
| グリーン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | M3733 | |
| リンゴ酸 | Sigma-Aldrich(MilliporeSigma) | M1000 | |
| マンニトール | Sigma-Aldrich(MilliporeSigma) | M9647 | |
| ミトコンドリアアイソレーションキット | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | MITOISO1 | |
| O2K fluororespirometer | Oroboros Inc | フルスペクトルのアッセイを同時に実行するために必要な複数のユニット。 | |
| ホスホクレアチン | Sigma-Aldrich(MilliporeSigma) | P7936 | |
| 酸化カリウム | Sigma-Aldrich(MilliporeSigma) | P1767 | |
| クトビオネートカリウム | Sigma-Aldrich(MilliporeSigma) | L2398 | |
| リン酸カリウム | Sigma-Aldrich(MilliporeSigma) | P0662 | |
| ピルビン酸 | Sigma-Aldrich(MilliporeSigma) | P2256 | アッセイ前に毎日新鮮にする必要があります |
| ロテノン | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | R8875 | |
| コハク酸 | シグマ-アルドリッチ (MilliporeSigma) | S2378 | |
| ショ糖 | Sigma-アルドリッチ (MilliporeSigma) | 84097 | |
| スーパーオキシドジスムターゼ | Sigma-アルドリッチ (MilliporeSigma) | S8160 | |
| タウリン | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T0625 | |
| 滴定ポンプ | Oroboros Inc | ||
| 滴定シリンジ | Oroboros Inc | ||
| TMRM | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T5428 | |
| UCH 生検針 | Millenium Surgical Corp | 72-238067 | さまざまなサイズで利用可能 |
参考文献
- Wilson, D. F. Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization. Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introdu....
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