Summary
Os cavalos têm uma excepcional capacidade de exercício aeróbio, tornando o músculo esquelético equino um tecido importante tanto para o estudo da fisiologia do exercício equino quanto para a fisiologia mitocondrial de mamíferos. Este artigo descreve técnicas para a avaliação abrangente da função mitocondrial no músculo esquelético equino.
Abstract
A função mitocondrial - fosforilação oxidativa e geração de espécies reativas de oxigênio - é crítica tanto na saúde quanto na doença. Assim, a mensuração da função mitocondrial é fundamental na pesquisa biomédica. O músculo esquelético é uma fonte robusta de mitocôndrias, particularmente em animais com uma capacidade aeróbica muito alta, como cavalos, tornando-os sujeitos ideais para o estudo da fisiologia mitocondrial. Este artigo demonstra o uso da respirometria de alta resolução com fluorometria concorrente, com mitocôndrias de músculo esquelético recém-colhidas, para quantificar a capacidade de oxidar substratos sob diferentes estados mitocondriais e determinar as capacidades relativas de distintos elementos da respiração mitocondrial. O éster metílico de tetrametilrodamina é usado para demonstrar a produção de potencial de membrana mitocondrial resultante da oxidação do substrato, incluindo o cálculo da eficiência relativa da mitocôndria através do cálculo do potencial de membrana relativo gerado por unidade de fluxo simultâneo de oxigênio. A conversão de ADP em ATP resulta em uma mudança na concentração de magnésio na câmara de reação, devido às diferentes afinidades dos adenilatos pelo magnésio. Portanto, o verde de magnésio pode ser usado para medir a taxa de síntese de ATP, permitindo o cálculo adicional da eficiência de fosforilação oxidativa (razão entre fosforilação e oxidação [P/O]). Finalmente, o uso do Amplex UltraRed, que produz um produto fluorescente (resorufina) quando combinado com peróxido de hidrogênio, permite a quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio durante a respiração mitocondrial, bem como a relação entre a produção de ERO e a respiração concomitante. Essas técnicas permitem a quantificação robusta da fisiologia mitocondrial sob uma variedade de diferentes condições simuladas, esclarecendo a contribuição deste componente celular crítico para a saúde e a doença.
Introduction
As mitocôndrias das células eucarióticas produzem a maior parte do ATP utilizado pelas células para trabalho e manutenção1. Um passo fundamental na produção mitocondrial de ATP é a conversão de oxigênio em água e, assim, a capacidade metabólica das mitocôndrias e das células associadas é frequentemente quantificada através da medida do consumo de oxigênio2. No entanto, a fisiologia mitocondrial é mais complexa do que o simples processo de consumo de oxigênio, e a confiança nesse desfecho fornece exclusivamente uma avaliação incompleta do impacto da função e disfunção mitocondrial na saúde celular. A caracterização completa da função mitocondrial requer a avaliação não só do consumo de oxigênio, mas também da produção de ATP, bem como de espécies reativas de oxigênio (EROs).
Medidas adicionais das principais funções mitocondriais podem ser realizadas simultaneamente com a medição da respiração através do uso de fluoróforos específicos. O éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM) é um fluoróforo catiônico que se acumula na matriz mitocondrial em proporção ao potencial de tensão transmembrana mitocondrial, resultando em diminuição da intensidade fluorescente devido a esse acúmulo3. O TMRM pode ser usado como um indicador de mudanças relativas no potencial de membrana mitocondrial, ou pode ser usado para quantificar mudanças precisas na tensão transmembrana com experimentos adicionais para determinar constantes que permitem a conversão do sinal fluorescente em mV. O verde de magnésio (MgG) é um fluoróforo que fluoresce quando ligado ao Mg2+, e é usado para medidas de síntese de ATP com base na afinidade diferencial de ADP e ATP para cátion divalente de magnésio4. Os investigadores devem determinar as constantes específicas de afinidade/dissociação (Kd) para ADP e ATP sob condições analíticas específicas para converter as mudanças na fluorescência de MgG em uma mudança na concentração de ATP. O Amplex UltraRed (AmR) é o fluoróforo utilizado para medir a produção de peróxido de hidrogênio e outras ERO durante a respiração mitocondrial5. A reação entre H 2O2 e AmR (que é catalisada pela peroxidase de raiz forte) produz resorufina, que é detectável através de fluorescência a 530 nM. Cada um desses ensaios pode ser adicionado individualmente a ensaios de respiração mitocondrial em tempo real, para fornecer medidas simultâneas dos respectivos aspectos da fisiologia mitocondrial, fornecendo assim uma ligação direta entre a respiração e a produção mitocondrial.
Os cavalos são capazes de taxas muito altas de consumo de oxigênio específico em massa, devido, em parte, ao conteúdo mitocondrial muito alto do músculo esquelético equino, tornando este tecido altamente relevante para o estudo da fisiologia mitocondrial. Com o desenvolvimento da respirometria de alta resolução, estudos utilizando essa nova tecnologia têm ajudado a definir as contribuições das mitocôndrias do músculo esquelético equino tanto para a notável capacidade de exercício de equinos quanto para a fisiopatologia das doenças do músculo esquelético 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Estudos da função mitocondrial do músculo esquelético equino são particularmente vantajosos, uma vez que a obtenção de grandes quantidades desse tecido é não-terminal. Assim, indivíduos equinos podem não apenas fornecer tecido suficiente para a caracterização completa da função mitocondrial, mas também servir como controles longitudinais para estudos mecanísticos de alta qualidade sobre a fisiologia mitocondrial. Por esta razão, ensaios adicionais para quantificar o potencial de membrana mitocondrial, a síntese de ATP e a produção de ERO que complementam a medida do consumo de oxigênio neste tecido têm sido desenvolvidos, a fim de fornecer uma caracterização mais robusta da fisiologia mitocondrial no músculo esquelético equino.
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Protocol
Este estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Oklahoma. Quatro geldings Puro-Sangue (17,5 ± 1,3 anos, 593 ± 45 kg) foram utilizados neste estudo para gerar os resultados representativos.
1. Obtenção de espécime de biópsia de músculo esquelético
- Obter biópsias de músculo esquelético (seguir técnica estéril) a partir do centro do músculo semitendíneo (ou outro músculo de interesse), usando uma agulha de biópsia 12G University College Hospital (UCH) (ver Tabela de Materiais) sob sedação leve e usando anestesia local após um relato publicado anteriormente11.
- Transferir os espécimes de biópsia imediatamente para frascos com solução de meio de transporte de biópsia gelada (2,77 mM CaK 2-EGTA, 7,23 mM K 2-EGTA, 20 mM imidazol, 20 mM taurina, 50 mM K-MES, 0,5 mM ditiotreitol, 6,56 mM MgCl2, 5,77 mM ATP e 15 mM fosfocreatina, ajustado para pH 7,1; ver Tabela de Materiais). Transporte ao laboratório para análise.
NOTA: Consulte Doerrier et al.15 para obter instruções específicas sobre o preparo do meio de transporte da biópsia. - Isolar as mitocôndrias das amostras de biópsia usando um kit comercial, de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). O tampão de armazenamento final não deve conter substratos como ADP, ATP e succinato, que fazem parte do ensaio de respirometria.
- Ressuspender o pellet final da mitocôndria isolada usando 80 μL de meio de suspensão (manitol 225 mM, sacarose 75 mM e EGTA 1 mM; ver Tabela de Materiais) por 100 mg de músculo usado para isolamento mitocondrial.
- Minimizar o intervalo entre o momento do procedimento de biópsia e o isolamento das mitocôndrias e manter as amostras a 0-4 °C durante as etapas de processamento até serem adicionadas aos respirômetros de alta resolução.
NOTA: Estudos preliminares descobriram que as suspensões de mitocôndrias isoladas começam a perder a capacidade funcional após aproximadamente 2 h quando mantidas a 0-4 °C.
2. Configuração do respirómetro de alta resolução
- Respirômetros de alta resolução são usados para quantificar a respiração mitocondrial e processos associados. Use o programa de controle de software fornecido pelo fabricante (consulte a Tabela de Materiais) para controlar o respirômetro, calibrar os sensores e coletar dados brutos. Analisar as amostras em duplicata para cada condição de ensaio.
NOTA: Em todos os casos, as titulações recomendadas e as concentrações finais de reagentes descritas neste protocolo são baseadas em uma câmara de respirometria de 2 mL. - Determine o fluxo de fundo do O 2 e o ponto zero do sensor O 2 a cada2-4 semanas através da titulação em série da ditionita, seguindo as instruções do fabricante. Retenha essas constantes de calibração para ensaios subsequentes até que a calibração seja repetida.
OBS: Ao contrário de procedimentos publicados anteriormente utilizando fibras musculares permeabilizadas11,12,13,16, nos quais a hiperóxia (250-500 μM) é necessária para evitar a limitação da difusão do O 2 para a mitocôndria, mitocôndrias isoladas podem ser avaliadas usando uma faixa de 50-200 μM O 2. Isso pode ser obtido simplesmente permitindo que o meio de respiração se equilibre com o ar ambiente antes de adicionar a suspensão mitocondrial (ou seja, seguindo a calibração diária de ponto único). Da mesma forma, a reoxigenação da câmara de respiração pode ser realizada simplesmente abrindo a câmara até que oxigênio ambiente suficiente tenha se dissolvido no meio da respirometria para elevar a concentração de oxigênio ao nível desejado. - Encher as câmaras do respirómetro com meios isentos de magnésio (0,5 mM EGTA, 60 mM K-lactobionato, 20 mM taurina, 10 mMKH 2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM sacarose e 1 g/L de albumina de soro bovino [BSA] essencialmente isenta de ácidos gordos, ajustada para pH 7,1; ver Tabela de Materiais).
NOTA: Consulte Komlodi et al.17 para obter instruções específicas sobre o preparo do meio respiratório.- Ajuste a temperatura de incubação do instrumento para 38 °C para representar a temperatura basal do músculo esquelético equino e ajuste a mistura do meio de respiração para 800 rpm usando um agitador magnético girando no fundo da câmara do respirômetro.
- Desligue a iluminação da câmara para evitar interferência com sensores fluorescentes.
- Energize o eletrodo de oxigênio com uma tensão de polarização de 800 mV e amplifice o sinal resultante com uma configuração de ganho de 1.
- Registrar a concentração de oxigênio a cada 2 s, calcular o fluxo de oxigênio como a inclinação negativa da medição de oxigênio nos 40 s anteriores (20 pontos de dados) e relatar como pmol x s-1 x mL de solução de incubação.
- Calibre o sensor de oxigênio permitindo que a mídia se equilibre com o ar ambiente. Calcular a pressão parcial de oxigênio de referência, com base na pressão barométrica medida pelo respirômetro de alta resolução e na concentração padrão de oxigênio atmosférico.
3. Mensuração do potencial de membrana mitocondrial utilizando TMRM
- Use sensores fluorescentes "verdes" (comprimento de onda dominante de 530 nm) para quantificar o sinal fluorescente da câmara de respiração. Energize os sensores em 400-500 mV; O sinal resultante é amplificado com um ganho de 1:1.000.
NOTA: Configurações específicas devem ser otimizadas para instrumentos individuais para capturar o sinal esperado dentro da faixa linear do sensor. - Adicionar TMRM (4 μL de solução de 1 mM para uma concentração final de 2 μM; ver Tabela de Materiais) antes da adição de mitocôndrias.
- Calibrar o sinal fluorescente usando uma calibração simples de dois pontos do sinal fluorescente (tensão) versus a quantidade de fluoróforo adicionado (mM), antes da adição da mitocôndria.
NOTA: Use a função de calibração de sinal fluorescente no software de controle da máquina para calibrar esse sinal. O sinal bruto da sonda fluorescente pode exigir 30 min ou mais para estabilizar a fim de registrar o segundo ponto da calibração. - Realizar a calibração final do sinal TMRM após a conclusão do protocolo de titulação da respirometria, fornecendo várias titulações de agente desacoplador (cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona; 2 μL por titulação) até que não sejam observados novos aumentos no sinal fluorescente de TMRM, indicando o colapso completo do potencial de membrana mitocondrial (Figura 1).
NOTA: Este valor de sinal fluorescente é considerado igual a 0 mV potencial transmembrana e usado como ponto de referência para valores de potencial de membrana relativo registrados durante o protocolo de titulação da respirometria.
4. Medição da produção de ATP utilizando verde de magnésio (MgG)
- Use sensores fluorescentes "azuis" (comprimento de onda dominante de 465 nm) para quantificar o sinal fluorescente da câmara de respiração. Energize esses sensores para instrumentos individuais para capturar o sinal esperado dentro da faixa linear do sensor.
- Realizar a configuração química e calibração do sinal fluorescente MgG após a adição da mitocôndria, mas antes da adição de quaisquer substratos. Adicionar 8 μL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 2 mM à câmara de respirometria para quelar cátions (particularmente Ca 2+) que competiriam com Mg2+ para ligação ao MgG e, em seguida, adicionar 4 μL de 1 mM MgG (1,1 μM) à câmara de respiração.
- Calibrar o sinal bruto de fluorescência com titulações sequenciais de 10 x 2 μL de 100 mM MgCl 2, permitindo 1 min entre as titulações para estabilização do sinal fluorescente (Figura 2).
NOTA: Este processo, que é concluído off-line após a conclusão do ensaio e usando modelos fornecidos pelo fabricante da máquina e software associado, produz uma curva de segunda ordem de concentração de magnésio para sinal fluorescente (esperado r2 > 0,98), que será usado com uma quantidade conhecida de ADP adicionado à câmara de respirometria e os valores de Kd previamente determinados para determinar a concentração correspondente de ATP11. - Determinar a taxa de síntese de ATP, que é a inclinação da concentração de ATP ao longo do tempo ao longo do protocolo (Figura 3).
5. Medição da produção mitocondrial de ROS usando Amplex UltraRed (AmR)
- Use sensores fluorescentes "verdes" (comprimento de onda dominante de 530 nm) para quantificar o sinal fluorescente da câmara de respiração. Energize os sensores em 300-400 mV; O sinal resultante é amplificado com um ganho de 1:1.000. Otimize configurações específicas para instrumentos individuais para capturar o sinal esperado dentro da faixa linear do sensor.
NOTA: Se usar meios respiratórios sem MgCl 2, então isso deve ser adicionado (20-60 μL de 100 mM MgCl 2 para produzir 1-3 μM MgCl2) antes de adicionar reagentes para o ensaio de AmR. - Realizar a configuração química e calibração inicial do ensaio de AmR antes da adição da mitocôndria. Adicionar 30 μmoles de DTPA (6 μL de solução de 5 mM) a cátions quelados que possam interferir com a reação, em seguida, adicionar superóxido dismutase (2 μL de uma solução-estoque de 5.000 U/mL para converter ânions superóxido em H 2 O2para uma detecção mais abrangente da geração reativa de oxigênio), peroxidase de raiz forte (5 μL de uma solução-mãe de 500 U/mL), e Amplex UltraRed (2 μL de uma solução-mãe de 10 mM) (ver Tabela de Materiais) para produzir 5 U/mL, 1 U/mL e 10 μM na câmara de respirometria, respectivamente.
- Deixe o sinal fluorescente estabilizar e, em seguida, adicione 0,2 μmoles de peróxido de hidrogênio (5 μL de uma solução de 40 μM feita fresca diariamente) duas vezes, com aproximadamente 5 min de intervalo.
NOTA: O sinal fluorescente antes e depois das duas titulações de H 2 O 2 fornece uma curva de calibração linear de três pontos do sistema (esperado r 2 > 0,95), cuja inclinação reflete a capacidade de resposta geral do sistema em relatar a relação entre o sinal fluorescente e a produção (ou adição) de H 2 O 2. Use a função de calibração de sinal fluorescente no software de controle da máquina para calibrar esse sinal. - Realizar calibrações adicionais de dois pontos (5 μL de uma solução de 40 μM feita fresca diariamente) durante todo o ensaio, para permitir o ajuste da responsividade do ensaio à medida que a química da respirometria muda ao longo do ensaio, com o tempo específico desses pontos de calibração a critério do investigador (Figura 4).
6. Medição da respiração mitocondrial
- Adicionar 15 μL de suspensão mitocondrial isolada (passo 1.4) a cada 2 ml de câmara de incubação, de modo a que os resultados representem o rendimento mitocondrial de 18,75 mg de músculo. Sele a câmara de incubação. Vórtice a amostra entre cada titulação para manter uma suspensão uniforme da amostra.
- Medir o consumo residual de oxigénio (ROX) antes da adição de quaisquer substratos. Subtrair esse valor (tipicamente menor que 0,2 pmol O2 x s-1 x mL-1) dos valores de consumo de oxigênio de cada etapa do protocolo de titulação substrato/desacoplador/inibidor (SUIT)11 após a conclusão do protocolo.
NOTA: É fundamental que os sinais do sensor de oxigênio e do sensor de fluorescência se estabilizem por pelo menos 1 min (conforme avaliado pela inclinação estável calculada dos sinais do sensor primário), pois o estado geral da respiração é alterado pelas titulações, a fim de obter resultados confiáveis. Isso se aplica a todas as etapas de titulação. - Use um SUIT de uso geral que permita a caracterização inicial da função mitocondrial do músculo esquelético equino. Comece com titulações sequenciais de piruvato (5 μL de solução aquosa 2 M), glutamato (10 μL de solução aquosa 2 M) e malato (10 μL de solução aquosa 0,4 M) (ver Tabela de Materiais) em cada câmara para produzir dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NADH) e estimular a respiração não fosforilante (vazamento) suportada por NADH oxidado através do Complexo I (LN) (Figura 1, Figura 3 e Figura 4).
- Adicionar ADP (20 μL de solução aquosa de 500 mM; ver Tabela de Materiais) para estimular a respiração fosforilante através do Complexo I (PN).
- Adicionar succinato (20 μL de solução aquosa de 1 M; ver Tabela de Materiais) para produzir respiração fosforilante através da combinação do Complexo I e do Complexo II (PN+S).
NOTA: Com a combinação da respiração através do Complexo I e do Complexo II, o consumo de oxigênio pode ser alto o suficiente para consumir a maior parte do oxigênio dissolvido no meio de incubação. Se a concentração de O 2 diminuir abaixo de 50 μM, reoxigenar o meio de incubação desselando a câmara de incubação até que a concentração de O 2 medida tenha aumentado acima de 150 μM. Repita esta etapa conforme necessário para manter o O2 suficiente para a respiração mitocondrial. - Adicionar rotenona (2 μL de solução de etanol 0,1 mM; ver Tabela de Materiais) para bloquear o Complexo I. O fluxo de oxigênio resultante representa a capacidade do Complexo II de suportar o consumo de oxigênio mitocondrial via oxidação isolada do succinato (PS).
CUIDADO: A rotenona é uma substância venenosa. Use segurança laboratorial padrão e evite ingestão ou inalação. - Calcular o valor médio para uma dada condição experimental em câmaras de respirometria individuais contendo alíquotas de uma única biópsia.
NOTA: Cálculos derivados, como razões de controle de fluxo (FCRs), são valiosos para identificar mudanças relativas em diferentes vias e incluem vazamento de FCR (L N/P N), FCR N (P N/P N+S) eFCR S (P S/PN+S). A eficiência de fosforilação oxidativa calculada (1-L,N/P,N+S) fornece uma estimativa do impacto global da respiração de fuga ajustada para a capacidade respiratória total.
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Representative Results
O estado de referência proposto é o de um puro-sangue sedentário saudável (sem aumento da aptidão devido ao exercício obrigatório) e uma amostra de músculo fresco coletada do centro de um músculo postural, contendo uma alta porcentagem de fibras musculares esqueléticas tipo I ricas em mitocôndrias e incubadas em condições próximas ao metabolismo de repouso (i.e., 38 °C e pH 7,0). Nessas condições, o examinador pode esperar valores de L N de 2,71 ± 0,90, valores deP N de 62,40 ± 26,22, valores de PN+S de 93,67 ± 34,76 e valores de PS de 46,93 ± 14,58 pmol O2 x s-1 x mL-1 (Figura 3 e Figura 4). Os valores respiratórios das mitocôndrias incubadas com TMRM são menores devido ao efeito inibitório desse fluoróforo (Figura 1). FCRLeak, FCRN e FCRS são 0,05 ± 0,01, 0,66 ± 0,07 e 0,51 ± 0,07, respectivamente. A eficiência de fosforilação oxidativa calculada é de 0,97 ± 0,01. Os valores absolutos para esses estados respiratórios variam de acordo com o indivíduo e a capacidade oxidativa tecidual, mas o padrão relativo desses valores é consistente com os resultados publicados de fibras musculares esqueléticas equinas permeabilizadas (isto é, aumentos na respiração com a adição de substratos específicos, sendo a combinação da respiração através do Complexo I e do Complexo II menor do que cada uma dessas fontes de elétrons individualmente devido à saturação do sistema de transferência de elétrons [ETS] capacidade a jusante). A eficiência calculada das mitocôndrias isoladas do músculo esquelético equino é consistente com os valores correspondentes relatados para as fibras musculares esqueléticas permeabilizadas11.
A taxa de síntese de ATP é esperada para 438,59 ± 397,10 pM x s-1 para respiraçãoP N , 383,18 ± 397,19 para respiração PN+ S e 172,07 ± 125,60 para respiração PS , por mg de tecido fonte usado para isolar mitocôndrias. A diminuição na síntese de ATP com a adição de succinato é provavelmente devido à competição na junção quinona do ETS pelos dois feeds de elétrons, com a alimentação do Complexo II (que não contribui diretamente para o potencial de membrana mitocondrial) reduzindo o fluxo de elétrons através do Complexo I (que contribui diretamente para o potencial de membrana mitocondrial através do bombeamento de prótons através da membrana mitocondrial interna).
Espera-se que ataxa de produção de H 2 O2 seja de 0,079 ± 0,095 nmol.s-1 para respiração de L N, 0,021 ± 0,043 para respiração de PN, 0,026 ± 0,056 para respiração de PN+S e 0,237 ± 0,248 para respiração de PS, por mg de tecido fonte usado para isolar mitocôndrias (Figura 4). A taxa relativa de produção de ROS é consistente com a magnitude prevista do potencial de membrana mitocondrial e a associação entre alto potencial de membrana e produção de ROS. A exceção a essa relação é a produção muito alta de ERO quando a respiração ocorre apenas através do Complexo II, devido ao fluxo retrógrado de elétrons da junção quinona para o Complexo I quando este é bloqueado pela rotenona.
Figura 1: Traçado representativo da respirometria de alta resolução da respiração mitocondrial do músculo esquelético equino e do potencial de membrana relativo. A janela superior é a concentração de oxigênio da câmara (eixo Y esquerdo) e o fluxo de oxigênio (eixo Y direito) ao longo do tempo (eixo X); a janela inferior é a fluorescência TMRM da câmara (eixo Y esquerdo) e a taxa de mudança do sinal de fluorescência (eixo Y direito) ao longo do tempo (eixo X). As marcas verticais indicam a adição de substratos específicos à câmara (mt: suspensão mitocondrial; P: piruvato; G: glutamato; M: malato; D: ADP; S: succinato; R: rotenona; CCCP: cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Vestígio respiratório representativo de alta resolução da calibração do sinal de fluorescência da câmara para o verde de magnésio e determinação de Kd para magnésio e adenilatos. Fluorescência MgG da câmara (eixo Y esquerdo) e taxa de mudança do sinal de fluorescência (eixo Y direito) ao longo do tempo (eixo X). As marcas verticais iniciais indicam a adição de substratos específicos à câmara (MgG: verde de magnésio; mt: suspensão mitocondrial; P: piruvato; G: glutamato; M: malato; S: succinato; EDTA: ácido etilenodiaminotetracético). Isto é seguido pela titulação seriada de MgCl2 usando uma bomba de titulação automatizada (TIP) que aumenta o sinal fluorescente, em seguida, titulação em série de um adenilato (neste caso ATP) que diminui o sinal fluorescente. A titulação de MgCl2 também é usada no início de cada ensaio para calibrar o sinal de MgG, mas é realizada antes da adição de mitocôndrias e substratos de respirometria, como P, G, M e S. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Traçado representativo da respirometria de alta resolução da respiração mitocondrial do músculo esquelético equino e síntese de ATP. A janela superior é a concentração de oxigênio da câmara (eixo Y esquerdo) e o fluxo de oxigênio (eixo Y direito) ao longo do tempo (eixo X); a janela inferior é a fluorescência MgG da câmara (eixo Y esquerdo) e a taxa de mudança do sinal de fluorescência (eixo Y direito) ao longo do tempo (eixo X). As marcas verticais indicam a adição de substratos específicos à câmara (mt: suspensão mitocondrial; P: piruvato; G: glutamato; M: malato; D: ADP; S: succinato; R: rotenona). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Traçado representativo da respirometria de alta resolução da respiração mitocondrial do músculo esquelético equino e produção de H 2O2. A janela superior é a concentração de oxigênio da câmara (eixo Y esquerdo) e o fluxo de oxigênio (eixo Y direito) ao longo do tempo (eixo X); a janela inferior é a fluorescência da câmara de resorufina (eixo Y esquerdo) e a taxa de mudança do sinal de fluorescência (eixo Y direito) ao longo do tempo (eixo X). As marcas verticais indicam a adição de substratos específicos à câmara (mt: suspensão mitocondrial; P: piruvato; G: glutamato; M: malato; D: ADP; S: succinato; R: rotenona). Também estão incluídas três calibrações intra-ensaio de dois pontos do sinal fluorescente usando H 2 O2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A adição de sinais fluorescentes à saída padrão do respirômetro de alta resolução fornece informações valiosas sobre a fisiologia mitocondrial, mas a calibração meticulosa do sinal fluorescente é crítica para dados de qualidade. Os protocolos originais para o uso de MgG sugerem que as curvas de calibração geradas durante o cálculo das constantes de dissociação magnésio-adenilato poderiam ser aplicadas a ensaios subsequentes4; no entanto, o sinal fluorescente do MgG pode não ser suficientemente reprodutível de ensaio para ensaio para esta abordagem. Portanto, cada ensaio é calibrado com uma titulação automatizada de MgCl2 e a curva de calibração resultante para calcular a síntese de ATP para aquele ensaio individual. Além disso, as Kd (constantes de dissociação) para magnésio e ADP e ATP devem ser calculadas para as condições específicas do ensaio, incluindo o tecido específico, condições de incubação e substratos que produzem respiração fosforilante, a fim de garantir que a derivação da taxa de síntese de ATP seja precisa. A variabilidade no ensaio de RamA é mais amplamente reconhecida15,17, e é comum inserir vários pontos de recalibração discreta no protocolo a critério do examinador durante o protocolo. Dados históricos usando músculo esquelético equino indicam que a responsividade típica do ensaio é de aproximadamente 0,646 V/mM de H 2 O2no primeiro ponto de calibração (antes da adição da amostra), podendo diminuir 8%-15% ao longo do período de ensaio. Assim, a recalibração frequente do ensaio de AmR é necessária para a detecção de alterações relativamente pequenas na produção de ROS, e o tempo das calibrações pontuais dentro do protocolo deve ser determinado para cada protocolo de titulação.
Os investigadores devem empregar um julgamento cuidadoso durante todo o desempenho do ensaio para determinar quando passar para a próxima etapa de titulação. Idealmente, os sinais relevantes que estão sendo gerados em tempo real (fluxo de O2 , fluorescência de TMRM e taxa de mudança no sinal fluorescente de MgG e resorifina) devem ser estáveis, indicando um estado estacionário dentro da câmara, mas é uma chamada de julgamento por parte do investigador sobre o que constitui estabilidade aceitável. Neste momento, não há um padrão amplamente difundido para essa decisão; No entanto, os investigadores devem estar cientes dos riscos de não esperar tempo suficiente para que um estado estacionário seja estabelecido (resultando em dados que caracterizam imperfeitamente o estado respiratório pretendido) e esperar tanto tempo que os substratos se esgotem e o ensaio não seja mais confiável. Na experiência do autor, deixar de atingir um sinal estável dentro de 30 min de qualquer titulação do substrato é evidência de uma amostra (ou máquina) que está se comportando de maneira não biológica, e o ensaio deve ser descartado.
Os resultados utilizando esta abordagem para quantificar a fisiologia mitocondrial demonstram considerável variabilidade intersujeitos, com um coeficiente de variação típico (CV) de 30%-40%. Por outro lado, a análise das fibras musculares esqueléticas permeabilizadas resulta em um CV de 19%-20%11, sugerindo que o processo de isolamento mitocondrial impõe variabilidade substancial à análise subsequente, além da marcante variabilidade intersujeitos. Embora o efeito do segundo possa ser atenuado usando os sujeitos como seus próprios controles, quando possível, o primeiro só pode ser minimizado através de uma atenção cuidadosa à técnica de isolamento. Se o desenho experimental não permitir réplicas experimentais de uma única biópsia, o investigador pode optar por expressar os dados da respirometria relativos a um fator de correção que reflita diferenças no conteúdo mitocondrial em diferentes amostras. Os fatores de correção mais comuns são o teor de proteína da amostra e a atividade da citrato sintase da amostra. No entanto, como delineado em uma recente declaração de consenso de cientistas ativos nesse campo, não há um método único para realizar esse ajuste que seja universalmente aceito18. A correção do conteúdo proteico e/ou da atividade da citrato sintase são as duas abordagens mais utilizadas para o tecido muscular esquelético equino12,13, mas ambas apresentam suas deficiências. Pode ser necessário que diferentes desenhos experimentais expressem dados tanto internos (i.e., razões de controle de fluxo) quanto externos (proteínas, atividade enzimática, outros marcadores mitocondriais) para interpretar a função mitocondrial.
O protocolo descrito baseia-se no uso de fibras musculares permeabilizadas, com várias diferenças importantes. Os ensaios com fibras permeabilizadas requerem biópsias menores, pois a respirometria de alta resolução das fibras permeabilizadas do músculo esquelético equino é tipicamente realizada com apenas ~2 mg de massa da amostra em cada câmara 6,7,8,9,10,11. Em contraste, o protocolo descrito aqui tem o equivalente a quase 10x essa massa de fibra em cada câmara. Essa diferença evidencia a ineficiência do isolamento mitocondrial do tecido fresco. Uma possível razão para essa ineficiência é a dificuldade em recuperar as mitocôndrias do músculo esquelético que estão localizadas dentro da rede proteica contrátil. O kit comercial para isolamento mitocondrial utilizado neste protocolo inclui tratamento com protease e uso de meios iônicos para ajudar a quebrar as fibras contráteis, mas é provável que uma porção substancial das mitocôndrias intermiofibrilares não seja recuperada. Essa característica do protocolo é relevante não só para determinar a quantidade de material de biópsia necessária, mas também para a interpretação dos resultados. As mitocôndrias isoladas são menos suscetíveis à dependência de oxigênio, devido à limitação da difusão quando comparadas às fibras permeabilizadas15; Assim, a hiperóxia não é necessária com mitocôndrias isoladas, e o meio respiratório pode ser suficientemente oxigenado (e reoxigenado durante o ensaio) simplesmente abrindo a câmara para o ar ambiente. Esse aspecto da oferta de oxigênio é particularmente útil para medir a produção de H2 O2 e outras EROs, uma vez que a produção de ERO é aumentada de forma não fisiológica durante a incubação da hiperóxia19. Finalmente, o uso de mitocôndrias isoladas proporciona um sinal fluorescente mais estável e reprodutível, devido à diminuição da ligação proteica inespecífica dos fluoróforos em comparação com o uso de fluoróforos com fibras musculares permeabilizadas. Cada preparação de amostra tem vantagens e desvantagens, e a proficiência com fibras permeabilizadas e mitocôndrias isoladas fornece ao investigador um conjunto robusto de ensaios para abordar uma variedade de questões relacionadas à fisiologia mitocondrial.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse relacionados a este manuscrito.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer o generoso apoio da John and Debbie Oxley Endowed Chair for Equine Sports Medicine e da Grayson Jockey Club Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A5285 | |
| Amplex UltraRed | Life Technologies | A36006 | |
| ATP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A2383 | |
| BSA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A6003 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C4830 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C2759 | |
| DatLab 7.0 | Oroboros Inc | Software to operate O2K fluororespirometer | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D0632 | |
| DTPA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D1133 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | E4378 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | G1626 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | H7523 | |
| Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P8250 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 516813 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Imidazole | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | I2399 | |
| K-MES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M8250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9272 | |
| Magnesium Green | Thermo Fisher Scientific | M3733 | |
| Malate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M1000 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9647 | |
| Mitochondrial isolation kit | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | MITOISO1 | |
| O2K fluororespirometer | Oroboros Inc | Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently. | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P7936 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P1767 | |
| Potassium lactobionate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | L2398 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P0662 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P2256 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Rotenone | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | R8875 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 84097 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S8160 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T0625 | |
| Titration pump | Oroboros Inc | ||
| Titration syringes | Oroboros Inc | ||
| TMRM | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T5428 | |
| UCH biopsy needle | Millenium Surgical Corp | 72-238067 | Available in a range of sizes |
References
- Wilson, D. F. Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization. Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th edn. , Oroboros MiPNet Publications. Innsbruck. (2014).
- Ehrenberg, B., Montana, V., Wei, M. D., Wuskell, J. P., Loew, L. M. Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes. Biophysical Journal. 53 (5), 785-794 (1988).
- Chinopoulos, C., Kiss, G., Kawamata, H., Starkov, A. A. Measurement of ADP-ATP exchange in relation to mitochondrial transmembrane potential and oxygen consumption. Methods in Enzymology. 542, 333-348 (2014).
- Krumschnabel, G., et al. Simultaneous high-resolution measurement of mitochondrial respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1264, 245-261 (2015).
- Lemieux, H., et al. Mitochondrial function is altered in horse atypical myopathy. Mitochondrion. 30, 35-41 (2016).
- Houben, R., Leleu, C., Fraipont, A., Serteyn, D., Votion, D. M. Determination of muscle mitochondrial respiratory capacity in Standardbred racehorses as an aid to predicting exertional rhabdomyolysis. Mitochondrion. 24, 99-104 (2015).
- Votion, D. M., Gnaiger, E., Lemieux, H., Mouithys-Mickalad, A., Serteyn, D. Physical fitness and mitochondrial respiratory capacity in horse skeletal muscle. PLoS One. 7 (4), 34890 (2012).
- Votion, D. M., et al. Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing. Equine Veterinary Journal Supplement. (38), 268-274 (2010).
- Tosi, I., et al. Altered mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in horses suffering from polysaccharide storage myopathy. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 50 (5), 379-390 (2018).
- Davis, M. S., Fulton, M. R., Popken, A. A. Effect of hyperthermia and acidosis on equine skeletal muscle mitochondrial oxygen consumption. Comparative Exercise Physiology. 17 (2), 171-179 (2021).
- Latham, C. M., Fenger, C. K., White, S. H. RAPID COMMUNICATION: Differential skeletal muscle mitochondrial characteristics of weanling racing-bred horses1. Journal of Animal Science. , (2019).
- White, S. H., Warren, L. K., Li, C., Wohlgemuth, S. E. Submaximal exercise training improves mitochondrial efficiency in the gluteus medius but not in the triceps brachii of young equine athletes. Scientific Reports. 7 (1), 14389 (2017).
- White, S. H., Wohlgemuth, S., Li, C., Warren, L. K. Rapid communication: Dietary selenium improves skeletal muscle mitochondrial biogenesis in young equine athletes. Journal of Animal Science. 95 (9), 4078-4084 (2017).
- Doerrier, C., et al. High-resolution FluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).
- Li, C., White, S. H., Warren, L. K., Wohlgemuth, S. E. Effects of aging on mitochondrial function in skeletal muscle of American American Quarter Horses. Journal of Applied Physiology. 121 (1), 299-311 (2016).
- Komlodi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
- Gnaiger, E.
- Li Puma, L. C., et al. Experimental oxygen concentration influences rates of mitochondrial hydrogen peroxide release from cardiac and skeletal muscle preparations. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrated, and Comparative Physiology. 318 (5), 972-980 (2020).
