Summary
Лошади обладают исключительной способностью к аэробным упражнениям, что делает скелетные мышцы лошадей важной тканью как для изучения физиологии упражнений лошадей, так и для физиологии митохондрий млекопитающих. В данной статье описываются методики комплексной оценки функции митохондрий в скелетных мышцах лошадей.
Abstract
Функция митохондрий - окислительное фосфорилирование и образование активных форм кислорода - имеет решающее значение как для здоровья, так и для болезней. Таким образом, измерение функции митохондрий имеет основополагающее значение в биомедицинских исследованиях. Скелетные мышцы являются надежным источником митохондрий, особенно у животных с очень высокой аэробной способностью, таких как лошади, что делает их идеальными объектами для изучения физиологии митохондрий. В этой статье демонстрируется использование респирометрии высокого разрешения с одновременной флуорометрией со свежесобранными митохондриями скелетных мышц для количественной оценки способности окислять субстраты при различных митохондриальных состояниях и определения относительных возможностей отдельных элементов митохондриального дыхания. Метиловый эфир тетраметилродамина используется для демонстрации производства митохондриального мембранного потенциала в результате окисления субстрата, включая расчет относительной эффективности митохондрий путем расчета относительного мембранного потенциала, генерируемого на единицу одновременного потока кислорода. Превращение АДФ в АТФ приводит к изменению концентрации магния в реакционной камере из-за различного сродства аденилатов к магнию. Таким образом, зеленый магний может быть использован для измерения скорости синтеза АТФ, что позволяет в дальнейшем рассчитать эффективность окислительного фосфорилирования (отношение фосфорилирования к окислению [P / O]). Наконец, использование Amplex UltraRed, который производит флуоресцентный продукт (ресоруфин) в сочетании с перекисью водорода, позволяет количественно оценить продукцию активных форм кислорода во время митохондриального дыхания, а также взаимосвязь между продукцией АФК и одновременным дыханием. Эти методы позволяют проводить надежную количественную оценку физиологии митохондрий в различных моделируемых условиях, тем самым проливая свет на вклад этого важнейшего клеточного компонента как в здоровье, так и в болезнь.
Introduction
Митохондрии эукариотических клеток продуцируют большую часть АТФ, используемой клетками для работы и поддержания1. Ключевым этапом в митохондриальном производстве АТФ является превращение кислорода в воду, и, таким образом, метаболическая способность митохондрий и связанных с ними клеток часто количественно определяется путем измерения потребления кислорода2. Однако физиология митохондрий более сложна, чем простой процесс потребления кислорода, и опора исключительно на эту конечную точку обеспечивает неполную оценку влияния функции и дисфункции митохондрий на здоровье клеток. Полная характеристика функции митохондрий требует оценки не только потребления кислорода, но и производства АТФ, а также активных форм кислорода (АФК).
Дополнительные измерения ключевых функций митохондрий могут быть выполнены одновременно с измерением дыхания с использованием специальных флуорофоров. Метиловый эфир тетраметилродамина (TMRM) представляет собой катионный флуорофор, который накапливается в митохондриальном матриксе пропорционально потенциалу митохондриального трансмембранного напряжения, что приводит к снижению интенсивности флуоресценции из-за этого накопления3. TMRM может быть использован в качестве индикатора относительных изменений потенциала митохондриальной мембраны или может быть использован для количественной оценки точных изменений трансмембранного напряжения с дополнительными экспериментами для определения констант, которые позволяют преобразовывать флуоресцентный сигнал в мВ. Магниевый зеленый (MgG) представляет собой флуорофор, который флуоресцирует при связывании с Mg2+ и используется для измерений синтеза АТФ на основе дифференциального сродства АДФ и АТФ к двухвалентному катионумагния 4. Исследователи должны определить специфические константы сродства/диссоциации (Kd) как для АДФ, так и для АТФ в определенных аналитических условиях, чтобы преобразовать изменения флуоресценции MgG в изменение концентрации АТФ. Amplex UltraRed (AmR) — это флуорофор, используемый для измерения продукции перекиси водорода и других АФК во время митохондриального дыхания5. Реакция между H 2O2 и AmR (катализируемая пероксидазой хрена) производит резоруфин, который обнаруживается с помощью флуоресценции при 530 нМ. Каждый из этих анализов может быть добавлен индивидуально к анализам митохондриального дыхания в реальном времени, чтобы обеспечить одновременные измерения соответствующих аспектов физиологии митохондрий, тем самым обеспечивая прямую связь между дыханием и митохондриальным выходом.
Лошади способны к очень высоким показателям массового потребления кислорода, отчасти из-за очень высокого содержания митохондрий в скелетных мышцах лошадей, что делает эту ткань очень актуальной для изучения физиологии митохондрий. С развитием респирометрии высокого разрешения исследования с использованием этой новой технологии помогли определить вклад митохондрий скелетных мышц лошадей как в замечательную способность лошадей к физической нагрузке, так и в патофизиологию заболеваний скелетных мышц 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Исследования функции митохондрий скелетных мышц лошадей особенно выгодны, так как получение большого количества этой ткани является нетерминальным. Таким образом, лошади могут не только обеспечить достаточное количество ткани для полной характеристики функции митохондрий, но и служить продольным контролем для высококачественных механистических исследований физиологии митохондрий. По этой причине были разработаны дополнительные анализы для количественной оценки мембранного потенциала митохондрий, синтеза АТФ и производства АФК, которые дополняют измерение потребления кислорода в этой ткани, чтобы обеспечить более надежную характеристику физиологии митохондрий в скелетных мышцах лошадей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета штата Оклахома. Четыре чистокровных мерина (17,5 ± 1,3 года, 593 ± 45 кг) были использованы в этом исследовании для получения репрезентативных результатов.
1. Получение образца биопсии скелетных мышц
- Возьмите биопсию скелетных мышц (следуйте стерильной технике) из центра полусухожильной мышцы (или другой мышцы, представляющей интерес), используя иглу для биопсии 12 G больницы Университетского колледжа (UCH) (см. Таблицу материалов) под легкой седацией и используя местную анестезию в соответствии с ранее опубликованным отчетом11.
- Немедленно перенесите образцы биопсии во флаконы с ледяным раствором для транспортировки биопсии (2,77 мМ CaK 2-EGTA, 7,23 мМ K2-EGTA, 20 мМ имидазола, 20 мМ таурина, 50 мМ K-MES, 0,5 мМ дитиотреитола, 6,56 мМ MgCl2, 5,77 мМ АТФ и 15 мМ фосфокреатина, скорректированного до pH7,1; см. Таблицу материалов). Транспортировка в лабораторию для анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Doerrier et al.15 для получения конкретных инструкций по подготовке среды для биопсии. - Изолируйте митохондрии из образцов биопсии с помощью коммерческого набора в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Окончательный буфер хранения не должен содержать субстратов, таких как АДФ, АТФ и сукцинат, которые являются частью респирометрического анализа.
- Ресуспендируют конечную гранулу изолированных митохондрий, используя 80 мкл суспензионной среды (225 мМ маннита, 75 мМ сахарозы и 1 мМ EGTA; см. Таблицу материалов) на 100 мг мышцы, используемой для выделения митохондрий.
- Сведите к минимуму интервал между моментом процедуры биопсии и выделением митохондрий и храните образцы при температуре 0-4 ° C на протяжении всех этапов обработки до тех пор, пока они не будут добавлены в респирометры с высоким разрешением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительные исследования показали, что суспензии изолированных митохондрий начинают терять функциональную способность примерно через 2 часа при поддержании при температуре 0-4 ° C.
2. Настройка респирометра высокого разрешения
- Респирометры высокого разрешения используются для количественной оценки митохондриального дыхания и связанных с ним процессов. Используйте программную управляющую программу, предоставленную производителем (см. Таблицу материалов), для управления респирометром, калибровки датчиков и сбора необработанных данных. Проанализируйте образцы в двух экземплярах для каждого условия испытания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во всех случаях рекомендуемое титрование и конечная концентрация реагентов, описанные в этом протоколе, основаны на респирометрической камере объемом 2 мл. - Определяйте фоновый поток O 2 и нулевую точку датчика O 2 каждые2-4 недели путем серийного титрования дитионита, следуя инструкциям производителя. Сохраняйте эти калибровочные константы для последующих анализов до тех пор, пока калибровка не будет повторена.
ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от ранее опубликованных процедур с использованием пермеабилизированных мышечных волокон11,12,13,16, в которых гипероксия (250-500 мкМ) необходима, чтобы избежать ограничения диффузии O2 в митохондрии, изолированные митохондрии можно оценить с использованием диапазона 50-200 мкМ O2. Этого можно достичь, просто позволив дыхательной среде уравновеситься с комнатным воздухом перед добавлением митохондриальной суспензии (т.е. после ежедневной одноточечной калибровки). Аналогичным образом, реоксигенация дыхательной камеры может быть выполнена простым открытием камеры до тех пор, пока достаточное количество окружающего кислорода не растворится в респирометрической среде, чтобы поднять концентрацию кислорода до желаемого уровня. - Наполните камеры респирометра средой, не содержащей магния (0,5 мМ EGTA, 60 мМ K-лактобионата, 20 мМ таурина, 10 мМ KH2PO4, 20 мМ HEPES, 110 мМ сахарозы и 1 г / л бычьего сывороточного альбумина [BSA], по существу не содержащего жирных кислот, с доведенным до pH 7,1; см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Komlodi et al.17 для получения конкретных инструкций по подготовке дыхательных сред.- Установите температуру инкубации прибора на 38 °C, чтобы представить базальную температуру скелетных мышц лошади, и установите перемешивание дыхательной среды на 800 об / мин с помощью магнитной мешалки, вращающейся в нижней части камеры респирометра.
- Выключите подсветку камеры, чтобы избежать помех для люминесцентных датчиков.
- Включите кислородный электрод поляризационным напряжением 800 мВ и усильте полученный сигнал с настройкой усиления 1.
- Записывайте концентрацию кислорода каждые 2 с, вычисляйте поток кислорода как отрицательный наклон измерения кислорода за предыдущие 40 с (20 точек данных) и сообщайте в виде пмоль x с-1 x мл инкубационного раствора.
- Откалибруйте датчик кислорода, позволив среде уравновеситься с воздухом в помещении. Рассчитайте эталонное парциальное давление кислорода на основе барометрического давления, измеренного респирометром высокого разрешения, и стандартной концентрации кислорода в атмосфере.
3. Измерение мембранного потенциала митохондрий с помощью TMRM
- Используйте «зеленые» флуоресцентные датчики (доминирующая длина волны 530 нм) для количественной оценки флуоресцентного сигнала из дыхательной камеры. Подача питания на датчики на напряжение 400-500 мВ; Результирующий сигнал усиливается с коэффициентом усиления 1:1,000.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретные настройки должны быть оптимизированы для отдельных приборов, чтобы улавливать ожидаемый сигнал в линейном диапазоне датчика. - Добавьте TMRM (4 мкл раствора 1 мМ для конечной концентрации 2 мкМ; см. Таблицу материалов) перед добавлением митохондрий.
- Откалибруйте флуоресцентный сигнал, используя простую двухточечную калибровку флуоресцентного сигнала (напряжения) по сравнению с количеством добавленного флуорофора (мМ) до добавления митохондрий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте функцию калибровки флуоресцентного сигнала в программном обеспечении управления машиной для калибровки этого сигнала. Для стабилизации необработанного сигнала от флуоресцентного зонда может потребоваться 30 минут или более, чтобы записать вторую точку калибровки. - Выполните окончательную калибровку сигнала TMRM после завершения протокола титрования респирометрии, доставив несколько титрований развязывающего агента (карбонильный цианид м-хлорфенилгидразон; 2 мкл на титрование) до тех пор, пока не будет наблюдаться дальнейшее увеличение флуоресцентного сигнала TMRM, что указывает на полный коллапс мембранного потенциала митохондрий (рис. 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это значение флуоресцентного сигнала считается равным трансмембранному потенциалу 0 мВ и используется в качестве точки отсчета для значений относительного мембранного потенциала, зарегистрированных во время протокола титрования респирометрии.
4. Измерение продукции АТФ с использованием зеленого магния (MgG)
- Используйте «синие» флуоресцентные датчики (доминирующая длина волны 465 нм) для количественной оценки флуоресцентного сигнала из дыхательной камеры. Включите эти датчики для отдельных приборов, чтобы захватить ожидаемый сигнал в линейном диапазоне датчика.
- Выполните химическую настройку и калибровку флуоресцентного сигнала MgG после добавления митохондрий, но до добавления каких-либо субстратов. Добавьте 8 мкл 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в камеру респирометрии для хелатирования катионов (особенно Ca 2+), которые будут конкурировать с Mg2+ за связывание с MgG, затем добавьте 4 мкл 1 мМ MgG (1,1 мкМ) в дыхательную камеру.
- Откалибруйте необработанный флуоресцентный сигнал с помощью последовательного титрования 10 x 2 мкл 100 мМ MgCl 2, что позволяет интервалу между титрованиями составлять 1 минуту для стабилизации флуоресцентного сигнала (рис. 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс, который завершается в автономном режиме после завершения анализа и с использованием шаблонов, предоставленных производителем машины и соответствующего программного обеспечения, создает кривую второго порядка концентрации магния к флуоресцентному сигналу (ожидаемый r2 > 0,98), которая будет использоваться с известным количеством АДФ, добавленным в камеру респирометрии, и ранее определенными значениями Kd для определения соответствующей концентрации АТФ11. - Определите скорость синтеза АТФ, которая представляет собой наклон концентрации АТФ во времени на протяжении всего протокола (рис. 3).
5. Измерение митохондриальной продукции АФК с помощью Amplex UltraRed (AmR)
- Используйте «зеленые» флуоресцентные датчики (доминирующая длина волны 530 нм) для количественной оценки флуоресцентного сигнала из дыхательной камеры. Подача питания на датчики на напряжение 300-400 мВ; Результирующий сигнал усиливается с коэффициентом усиления 1:1,000. Оптимизируйте конкретные настройки для отдельных приборов, чтобы улавливать ожидаемый сигнал в линейном диапазоне датчика.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании дыхательных сред без MgCl 2 следует добавить его (20-60 мкл 100 мМ MgCl 2 для получения 1-3 мкМ MgCl2) перед добавлением реагентов для анализа AmR. - Выполните химическую настройку и первоначальную калибровку анализа AmR перед добавлением митохондрий. Добавьте 30 мкмоль DTPA (6 мкл раствора 5 мМ) к хелатным катионам, которые могут мешать реакции, затем добавьте супероксиддисмутазу (2 мкл исходного раствора 5,000 ЕД / мл для превращения супероксидных анионов в H 2 O2 для более полного обнаружения образования активного кислорода), пероксидазы хрена (5 мкл исходного раствора 500 ЕД / мл), и Amplex UltraRed (2 мкл исходного раствора 10 мМ) (см. Таблицу материалов) для получения 5 ЕД/мл, 1 ЕД/мл и 10 мкМ в респирометрической камере соответственно.
- Дайте флуоресцентному сигналу стабилизироваться, затем добавьте 0,2 мкмоль перекиси водорода (5 мкл раствора 40 мкМ, приготовленного свежим ежедневно) дважды, примерно с интервалом в 5 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентный сигнал до и после двух титрований H 2 O 2 обеспечивает трехточечную линейную калибровочную кривую системы (ожидаемая r 2 > 0,95), наклон которой отражает общую отзывчивость системы при сообщении о взаимосвязи между флуоресцентным сигналом и производством (или добавлением) H 2 O 2. Используйте функцию калибровки флуоресцентного сигнала в программном обеспечении управления машиной для калибровки этого сигнала. - Выполняйте дополнительные двухточечные калибровки (5 мкл раствора 40 мкМ, свежего ежедневно) на протяжении всего анализа, чтобы можно было корректировать чувствительность анализа по мере изменения химического состава респирометрии на протяжении всего анализа, с конкретным временем этих калибровочных точек по усмотрению исследователя (рис. 4).
6. Измерение митохондриального дыхания
- Добавьте 15 мкл изолированной суспензии митохондрий (этап 1.4) в каждую инкубационную камеру объемом 2 мл, чтобы результаты представляли выход митохондрий в 18,75 мг мышц. Герметизируйте инкубационную камеру. Вихревая образец между каждым титрованием, чтобы поддерживать равномерную суспензию образца.
- Измерьте остаточное потребление кислорода (ROX) перед добавлением любых субстратов. Вычтите это значение (обычно менее 0,2 пмоль O2 x s-1 x мл-1) из значений потребления кислорода на каждом этапе в протоколе11 титрования субстрата/разъединителя/ингибитора (SUIT) после завершения протокола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы сигналы как от датчика кислорода, так и от флуоресцентного датчика стабилизировались в течение не менее 1 минуты (по оценке стабильного расчетного наклона сигналов первичного датчика), поскольку общее состояние дыхания изменяется титрованиями для получения надежных результатов. Это относится ко всем этапам титрования. - Используйте универсальный SUIT, который позволяет получить первоначальную характеристику митохондриальной функции скелетных мышц лошадей. Начните с последовательного титрования пирувата (5 мкл 2 М водного раствора), глутамата (10 мкл 2 М водного раствора) и малата (10 мкл 0,4 М водного раствора) в каждую камеру для получения никотинамидадениндинуклеотида (НАДН) и стимуляции нефосфорилирующего (утечки) дыхания при поддержке НАДН, окисленного через комплекс I (LN) (рис. 1, Рисунок 3 и рисунок 4).
- Добавьте АДФ (20 мкл водного раствора 500 мМ; см. Таблицу материалов) для стимуляции фосфорилирующего дыхания через комплекс I (PN).
- Добавьте сукцинат (20 мкл 1 М водного раствора; см. Таблицу материалов) для получения фосфорилирующего дыхания за счет комбинации комплекса I и комплекса II (PN + S).
ПРИМЕЧАНИЕ: При сочетании дыхания через комплекс I и комплекс II потребление кислорода может быть достаточно высоким, чтобы потреблять большую часть кислорода, растворенного в инкубационной среде. Если концентрация O2 снижается ниже 50 мкМ, реоксигенируйте инкубационную среду, распечатывая инкубационную камеру до тех пор, пока измеренная концентрация O2 не увеличится выше 150 мкМ. Повторяйте этот шаг по мере необходимости, чтобы поддерживать достаточное количествоO2 для митохондриального дыхания. - Добавьте ротенон (2 мкл 0,1 мМ раствора этанола; см. Таблицу материалов) для блокировки комплекса I. Результирующий поток кислорода представляет собой способность комплекса II поддерживать потребление кислорода митохондриями за счет окисления только сукцината (P.S.).
ВНИМАНИЕ: Ротенон является ядовитым веществом. Используйте стандартную лабораторную безопасность и избегайте проглатывания или вдыхания. - Рассчитайте среднее значение для данного экспериментального состояния по отдельным респирометрическим камерам, содержащим аликвоты одной биопсии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Производные расчеты, такие как коэффициенты управления потоком (FCR), ценны для выявления относительных изменений в различных путях и включаютутечку FCR (L N / P N), FCR N (P N / P N + S) и FCRS (P S / PN + S). Рассчитанная эффективность окислительного фосфорилирования (1-LN/PN+S) позволяет оценить общее влияние дыхания утечки с поправкой на общую дыхательную способность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Предлагаемое эталонное состояние - это состояние здоровой сидячей чистокровной породы (без повышенной физической подготовки из-за обязательных упражнений) и свежий образец мышц, собранный из центра постуральной мышцы, содержащий высокий процент богатых митохондриями волокон скелетных мышц I типа и инкубированный в условиях, приближающихся к метаболизму в состоянии покоя (т.е. 38 ° C и pH 7,0). В этих условиях исследователь может ожидать значения L N 2,71 ± 0,90, значения PN 62,40 ± 26,22, значения PN + S 93,67 ± 34,76 и значенияP S 46,93 ± 14,58 пмоль O2 x s-1 x мл-1 (рис. 3 и рис. 4). Значения дыхания митохондрий, инкубированных с TMRM, ниже из-за ингибирующего действия этого флуорофора (рис. 1). FCR Leak, FCRN и FCRS составляют 0,05 ± 0,01, 0,66 ± 0,07 и 0,51 ± 0,07 соответственно. Расчетная эффективность окислительного фосфорилирования составляет 0,97 ± 0,01. Абсолютные значения для этих дыхательных состояний варьируются в зависимости от окислительной способности отдельных субъектов и тканей, но относительная картина этих значений согласуется с опубликованными результатами пермеабилизированных волокон скелетных мышц лошадей (т. е. увеличение дыхания с добавлением специфических субстратов, комбинация дыхания через комплекс I и комплекс II меньше, чем у каждого из этих источников электронов по отдельности из-за насыщения системы переноса электронов [ETS] пропускная способность). Расчетная эффективность изолированных митохондрий скелетных мышц лошадей согласуется с соответствующими значениями, зарегистрированными для пермеабилизированных волокон скелетных мышц лошадей11.
Ожидается, что скорость синтеза АТФ составит 438,59 ± 397,10 пМ х с-1 для дыханияPN , 383,18 ± 397,19 для дыхания PN + S и 172,07 ± 125,60 для дыхания PS на мг исходной ткани, используемой для выделения митохондрий. Снижение синтеза АТФ с добавлением сукцината, вероятно, связано с конкуренцией на хинонном переходе ETS двумя электронными потоками, при этом подача из комплекса II (который не вносит непосредственного вклада в митохондриальный мембранный потенциал), уменьшает поток электронов через комплекс I (который непосредственно способствует митохондриальному мембранному потенциалу за счет перекачки протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану).
Ожидается, что скорость производстваH 2 O2 составит 0,079 ± 0,095 нмоль.с-1 длядыхания LN, 0,021 ± 0,043 для дыханияPN, 0,026 ± 0,056 для дыхания PN + S и 0,237 ± 0,248 для дыхания PS на мг исходной ткани, используемой для выделения митохондрий (рис. 4). Относительная скорость продукции АФК согласуется с прогнозируемой величиной потенциала митохондриальной мембраны и связью между высоким мембранным потенциалом и продукцией АФК. Исключением из этого соотношения является очень высокая продукция АФК, когда дыхание происходит только через комплекс II, из-за обратного потока электронов от хинонового перехода к комплексу I, когда он блокируется ротеноном.
Рисунок 1: Репрезентативный след респирометрии с высоким разрешением митохондриального дыхания скелетных мышц лошадей и относительный мембранный потенциал. Верхнее окно - концентрация кислорода в камере (левая ось Y) и поток кислорода (правая ось Y) с течением времени (ось X); нижнее окно представляет собой камеру TMRM флуоресценции (левая ось Y) и скорость изменения сигнала флуоресценции (правая ось Y) с течением времени (ось X). Вертикальные метки указывают на добавление специфических субстратов в камеру (mt: суспензия митохондрий; : пируват; G: глутамат; М: малат; Д: АДФ; S: сукцинат; R: ротенон; CCCP: карбонильный цианид м-хлорфенилгидразон). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативный след респирометрии высокого разрешения калибровки сигнала флуоресценции камеры для зеленого магния и определения Kd для магния и аденилатов. Флуоресценция камеры MgG (левая ось Y) и скорость изменения сигнала флуоресценции (правая ось Y) с течением времени (ось X). Начальные вертикальные отметки указывают на добавление специфических субстратов в камеру (MgG: зеленый магний; mt: суспензия митохондрий; : пируват; G: глутамат; М: малат; S: сукцинат; ЭДТА: этилендиаминтетрауксусная кислота). Затем следует серийное титрование MgCl2 с использованием автоматического титрового насоса (TIP), который увеличивает флуоресцентный сигнал, а затем серийное титрование аденилата (в данном случае АТФ), которое уменьшает флуоресцентный сигнал. Титрование MgCl2 также используется в начале каждого анализа для калибровки сигнала MgG, но проводится до добавления митохондрий и респирометрических субстратов, таких как P, G, M и S. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативный след респирометрии высокого разрешения митохондриального дыхания скелетных мышц лошадей и синтеза АТФ. Верхнее окно - концентрация кислорода в камере (левая ось Y) и поток кислорода (правая ось Y) с течением времени (ось X); нижнее окно - флуоресценция камеры MgG (левая ось Y) и скорость изменения сигнала флуоресценции (правая ось Y) с течением времени (ось X). Вертикальные метки указывают на добавление специфических субстратов в камеру (mt: суспензия митохондрий; : пируват; G: глутамат; М: малат; Д: АДФ; S: сукцинат; R: ротенон). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативный след респирометрии с высоким разрешением митохондриального дыхания скелетных мышц лошадей и продукции H 2 O2. Верхнее окно - концентрация кислорода в камере (левая ось Y) и поток кислорода (правая ось Y) с течением времени (ось X); нижнее окно - камерная резоруфинная флуоресценция (левая ось Y) и скорость изменения сигнала флуоресценции (правая ось Y) с течением времени (ось X). Вертикальные метки указывают на добавление специфических субстратов в камеру (mt: суспензия митохондрий; : пируват; G: глутамат; М: малат; Д: АДФ; S: сукцинат; R: ротенон). Также включены три внутрианалитические двухточечные калибровки флуоресцентного сигнала с использованием H2 O2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Добавление флуоресцентных сигналов к стандартному выходу респирометра высокого разрешения дает ценную информацию о физиологии митохондрий, но тщательная калибровка флуоресцентного сигнала имеет решающее значение для качественных данных. Первоначальные протоколы использования MgG предполагают, что калибровочные кривые, полученные при расчете констант диссоциации магния-аденилат, могут быть применены к последующим анализам4; однако флуоресцентный сигнал от MgG может быть недостаточно воспроизводимым от анализа к анализу для этого подхода. Таким образом, каждый анализ калибруется с помощью автоматического титрования MgCl2 и результирующей калибровочной кривой для расчета синтеза АТФ для этого отдельного анализа. Кроме того,Kd (константы диссоциации) для магния и как АДФ, так и АТФ должны быть рассчитаны для конкретных условий анализа, включая конкретную ткань, условия инкубации и субстраты, вызывающие фосфорилирующее дыхание, чтобы обеспечить точное получение скорости синтеза АТФ. Вариабельность в анализе AmR более широко признана15,17, и обычно во время протокола в протокол по усмотрению исследователя вставляется несколько дискретных точек повторной калибровки. Исторические данные с использованием скелетных мышц лошадей показывают, что типичная чувствительность анализа составляет приблизительно 0,646 В/мМ H 2 O2в первой точке калибровки (до добавления образца) и может снижаться на 8-15% в течение периода анализа. Таким образом, частая повторная калибровка анализа AmR необходима для выявления относительно небольших изменений в продукции АФК, а сроки точечных калибровок в рамках протокола должны определяться для каждого протокола титрования.
Исследователи должны использовать тщательное суждение на протяжении всего анализа, чтобы определить, когда переходить к следующему этапу титрования. В идеале соответствующие сигналы, генерируемые в режиме реального времени (поток O2 , флуоресценция TMRM и скорость изменения MgG и флуоресцентного сигнала резоруфина), должны быть стабильными, указывая на устойчивое состояние в камере, но это суждение со стороны исследователя о том, что представляет собой приемлемая стабильность. В настоящее время не существует общепринятого стандарта для этого решения; Тем не менее, исследователи должны четко осознавать риски, связанные как с тем, что они не могут ждать достаточно долго, пока установится устойчивое состояние (что приводит к данным, которые несовершенно характеризуют предполагаемое состояние дыхания), так и ждать так долго, что субстраты истощаются, и анализ больше не является надежным. По опыту автора, неспособность достичь стабильного сигнала в течение 30 минут после любого титрования субстрата свидетельствует о том, что образец (или машина) ведет себя небиологическим образом, и анализ должен быть отброшен.
Результаты, использующие этот подход для количественной оценки физиологии митохондрий, демонстрируют значительную межсубъектную изменчивость с типичным коэффициентом вариации (CV) 30-40%. Напротив, анализ пермеабилизированных волокон скелетных мышц лошадей приводит к CV 19%-20%11, что позволяет предположить, что процесс выделения митохондрий накладывает существенную вариабельность на последующий анализ в дополнение к выраженной межсубъектной вариабельности. Хотя эффект последнего можно смягчить, используя субъектов в качестве их собственных средств контроля, когда это возможно, первый может быть сведен к минимуму только путем тщательного внимания к методу изоляции. Если экспериментальный дизайн не допускает экспериментальных повторений из одной биопсии, то исследователь может выбрать экспрессию данных респирометрии относительно поправочного фактора, который отражает различия в содержании митохондрий в разных образцах. Наиболее распространенными поправочными факторами являются содержание белка в образце и активность цитратсинтазы в образце. Однако, как указано в недавнем консенсусном заявлении ученых, работающих в этой области, не существует единого метода выполнения этой корректировки, который был бы общепринятым18. Коррекция содержания белка и/или активности цитратсинтазы является двумя наиболее распространенными подходами, используемыми для ткани скелетных мышц лошадей12,13, но оба имеют свои недостатки. Для интерпретации функции митохондрий может потребоваться экспрессия данных как через внутренние (т.е. коэффициенты управления потоком), так и через внешние (белок, активность ферментов, другие митохондриальные маркеры).
Описанный протокол основан на использовании пермеабилизированных мышечных волокон с несколькими важными отличиями. Анализы пермеабилизированных волокон требуют меньших биопсий, так как респирометрия с высоким разрешением проницаемых волокон скелетных мышц лошадей обычно выполняется только с ~ 2 мг массы образца в каждой камере 6,7,8,9,10,11. Напротив, описанный здесь протокол имеет эквивалент почти в 10 раз больше массы волокна в каждой камере. Это различие подчеркивает неэффективность выделения митохондрий из свежей ткани. Возможной причиной такой неэффективности является трудность восстановления митохондрий скелетных мышц, которые расположены в сократительной белковой сети. Коммерческий набор для митохондриальной изоляции, используемый в этом протоколе, включает лечение протеазой и использование ионных сред для разрушения сократительных волокон, но вполне вероятно, что значительная часть межмиофибриллярных митохондрий не восстанавливается. Эта особенность протокола важна не только для определения необходимого количества биопсийного материала, но и для интерпретации результатов. Изолированные митохондрии менее восприимчивы к кислородной зависимости из-за ограничения диффузии по сравнению с пермеабилизированными волокнами15; Таким образом, гипероксия не требуется с изолированными митохондриями, и дыхательная среда может быть достаточно насыщена кислородом (и повторно насыщена кислородом во время анализа), просто открыв камеру для комнатного воздуха. Этот аспект доставки кислорода особенно полезен при измерении продукции H 2 O2и других АФК, поскольку продукция АФК увеличивается нефизиологическим образом во время гипероксической инкубации19. Наконец, использование изолированных митохондрий обеспечивает более стабильный и воспроизводимый флуоресцентный сигнал из-за снижения неспецифического связывания белков флуорофоров по сравнению с использованием флуорофоров с пермеабилизированными мышечными волокнами. Каждая пробоподготовка имеет свои преимущества и недостатки, а владение как пермеабилизированными волокнами, так и изолированными митохондриями предоставляет исследователю надежный набор анализов для решения различных вопросов, связанных с физиологией митохондрий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, связанных с данной рукописью.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность за щедрую поддержку заведующему кафедрой спортивной медицины лошадей Джона и Дебби Оксли и Исследовательскому фонду жокей-клуба Грейсона.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A5285 | |
| Amplex UltraRed | Life Technologies | A36006 | |
| ATP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A2383 | |
| BSA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A6003 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C4830 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C2759 | |
| DatLab 7.0 | Oroboros Inc | Software to operate O2K fluororespirometer | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D0632 | |
| DTPA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D1133 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | E4378 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | G1626 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | H7523 | |
| Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P8250 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 516813 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Imidazole | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | I2399 | |
| K-MES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M8250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9272 | |
| Magnesium Green | Thermo Fisher Scientific | M3733 | |
| Malate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M1000 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9647 | |
| Mitochondrial isolation kit | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | MITOISO1 | |
| O2K fluororespirometer | Oroboros Inc | Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently. | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P7936 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P1767 | |
| Potassium lactobionate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | L2398 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P0662 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P2256 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Rotenone | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | R8875 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 84097 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S8160 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T0625 | |
| Titration pump | Oroboros Inc | ||
| Titration syringes | Oroboros Inc | ||
| TMRM | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T5428 | |
| UCH biopsy needle | Millenium Surgical Corp | 72-238067 | Available in a range of sizes |
References
- Wilson, D. F. Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization. Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th edn. , Oroboros MiPNet Publications. Innsbruck. (2014).
- Ehrenberg, B., Montana, V., Wei, M. D., Wuskell, J. P., Loew, L. M. Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes. Biophysical Journal. 53 (5), 785-794 (1988).
- Chinopoulos, C., Kiss, G., Kawamata, H., Starkov, A. A. Measurement of ADP-ATP exchange in relation to mitochondrial transmembrane potential and oxygen consumption. Methods in Enzymology. 542, 333-348 (2014).
- Krumschnabel, G., et al. Simultaneous high-resolution measurement of mitochondrial respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1264, 245-261 (2015).
- Lemieux, H., et al. Mitochondrial function is altered in horse atypical myopathy. Mitochondrion. 30, 35-41 (2016).
- Houben, R., Leleu, C., Fraipont, A., Serteyn, D., Votion, D. M. Determination of muscle mitochondrial respiratory capacity in Standardbred racehorses as an aid to predicting exertional rhabdomyolysis. Mitochondrion. 24, 99-104 (2015).
- Votion, D. M., Gnaiger, E., Lemieux, H., Mouithys-Mickalad, A., Serteyn, D. Physical fitness and mitochondrial respiratory capacity in horse skeletal muscle. PLoS One. 7 (4), 34890 (2012).
- Votion, D. M., et al. Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing. Equine Veterinary Journal Supplement. (38), 268-274 (2010).
- Tosi, I., et al. Altered mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in horses suffering from polysaccharide storage myopathy. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 50 (5), 379-390 (2018).
- Davis, M. S., Fulton, M. R., Popken, A. A. Effect of hyperthermia and acidosis on equine skeletal muscle mitochondrial oxygen consumption. Comparative Exercise Physiology. 17 (2), 171-179 (2021).
- Latham, C. M., Fenger, C. K., White, S. H. RAPID COMMUNICATION: Differential skeletal muscle mitochondrial characteristics of weanling racing-bred horses1. Journal of Animal Science. , (2019).
- White, S. H., Warren, L. K., Li, C., Wohlgemuth, S. E. Submaximal exercise training improves mitochondrial efficiency in the gluteus medius but not in the triceps brachii of young equine athletes. Scientific Reports. 7 (1), 14389 (2017).
- White, S. H., Wohlgemuth, S., Li, C., Warren, L. K. Rapid communication: Dietary selenium improves skeletal muscle mitochondrial biogenesis in young equine athletes. Journal of Animal Science. 95 (9), 4078-4084 (2017).
- Doerrier, C., et al. High-resolution FluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).
- Li, C., White, S. H., Warren, L. K., Wohlgemuth, S. E. Effects of aging on mitochondrial function in skeletal muscle of American American Quarter Horses. Journal of Applied Physiology. 121 (1), 299-311 (2016).
- Komlodi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
- Gnaiger, E.
- Li Puma, L. C., et al. Experimental oxygen concentration influences rates of mitochondrial hydrogen peroxide release from cardiac and skeletal muscle preparations. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrated, and Comparative Physiology. 318 (5), 972-980 (2020).
