Fluoro-respirometría de alta resolución del músculo esquelético equino

Michael Scott Davis; Montana Renae Barrett

doi:10.3791/65075

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Artículo de método

Fluoro-respirometría de alta resolución del músculo esquelético equino

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DOI:

10.3791/65075

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3 de febrero de 2023

Michael Scott Davis¹ , Montana Renae Barrett¹

¹Department of Physiological Sciences, Oklahoma State University

En este artículo

Resumen

Los caballos tienen una capacidad excepcional de ejercicio aeróbico, lo que hace que el músculo esquelético equino sea un tejido importante tanto para el estudio de la fisiología del ejercicio equino como para la fisiología mitocondrial de los mamíferos. Este artículo describe técnicas para la evaluación integral de la función mitocondrial en el músculo esquelético equino.

Resumen

La función mitocondrial (fosforilación oxidativa y generación de especies reactivas de oxígeno) es crítica tanto en la salud como en la enfermedad. Por lo tanto, la medición de la función mitocondrial es fundamental en la investigación biomédica. El músculo esquelético es una fuente robusta de mitocondrias, particularmente en animales con una capacidad aeróbica muy alta, como los caballos, lo que los convierte en sujetos ideales para estudiar la fisiología mitocondrial. Este artículo demuestra el uso de respirometría de alta resolución con fluorometría concurrente, con mitocondrias del músculo esquelético recién cosechadas, para cuantificar la capacidad de oxidar sustratos bajo diferentes estados mitocondriales y determinar las capacidades relativas de distintos elementos de la respiración mitocondrial. El éster metílico de tetrametilrodamina se utiliza para demostrar la producción del potencial de membrana mitocondrial resultante de la oxidación del sustrato, incluido el cálculo de la eficiencia relativa de las mitocondrias mediante el cálculo del potencial relativo de membrana generado por unidad de flujo de oxígeno concurrente. La conversión de ADP a ATP resulta en un cambio en la concentración de magnesio en la cámara de reacción, debido a las diferentes afinidades de los adenilatos para el magnesio. Por lo tanto, el verde de magnesio se puede utilizar para medir la tasa de síntesis de ATP, lo que permite el cálculo adicional de la eficiencia de la fosforilación oxidativa (relación entre la fosforilación y la oxidación [P / O]). Finalmente, el uso de Amplex UltraRed, que produce un producto fluorescente (resorufina) cuando se combina con peróxido de hidrógeno, permite la cuantificación de la producción de especies reactivas de oxígeno durante la respiración mitocondrial, así como la relación entre la producción de ROS y la respiración concurrente. Estas técnicas permiten la cuantificación robusta de la fisiología mitocondrial bajo una variedad de diferentes condiciones simuladas, arrojando así luz sobre la contribución de este componente celular crítico tanto a la salud como a la enfermedad.

Introducción

Las mitocondrias de las células eucariotas producen la mayor parte del ATP utilizado por las células para el trabajo y el mantenimiento¹. Un paso clave en la producción mitocondrial de ATP es la conversión de oxígeno en agua, y por lo tanto la capacidad metabólica de las mitocondrias y las células asociadas se cuantifica con frecuencia a través de la medición del consumo de oxígeno². Sin embargo, la fisiología mitocondrial es más compleja que el simple proceso de consumo de oxígeno, y la dependencia de este criterio de valoración proporciona exclusivamente una evaluación incompleta del impacto de la función mitocondrial ....