Summary
Los caballos tienen una capacidad excepcional de ejercicio aeróbico, lo que hace que el músculo esquelético equino sea un tejido importante tanto para el estudio de la fisiología del ejercicio equino como para la fisiología mitocondrial de los mamíferos. Este artículo describe técnicas para la evaluación integral de la función mitocondrial en el músculo esquelético equino.
Abstract
La función mitocondrial (fosforilación oxidativa y generación de especies reactivas de oxígeno) es crítica tanto en la salud como en la enfermedad. Por lo tanto, la medición de la función mitocondrial es fundamental en la investigación biomédica. El músculo esquelético es una fuente robusta de mitocondrias, particularmente en animales con una capacidad aeróbica muy alta, como los caballos, lo que los convierte en sujetos ideales para estudiar la fisiología mitocondrial. Este artículo demuestra el uso de respirometría de alta resolución con fluorometría concurrente, con mitocondrias del músculo esquelético recién cosechadas, para cuantificar la capacidad de oxidar sustratos bajo diferentes estados mitocondriales y determinar las capacidades relativas de distintos elementos de la respiración mitocondrial. El éster metílico de tetrametilrodamina se utiliza para demostrar la producción del potencial de membrana mitocondrial resultante de la oxidación del sustrato, incluido el cálculo de la eficiencia relativa de las mitocondrias mediante el cálculo del potencial relativo de membrana generado por unidad de flujo de oxígeno concurrente. La conversión de ADP a ATP resulta en un cambio en la concentración de magnesio en la cámara de reacción, debido a las diferentes afinidades de los adenilatos para el magnesio. Por lo tanto, el verde de magnesio se puede utilizar para medir la tasa de síntesis de ATP, lo que permite el cálculo adicional de la eficiencia de la fosforilación oxidativa (relación entre la fosforilación y la oxidación [P / O]). Finalmente, el uso de Amplex UltraRed, que produce un producto fluorescente (resorufina) cuando se combina con peróxido de hidrógeno, permite la cuantificación de la producción de especies reactivas de oxígeno durante la respiración mitocondrial, así como la relación entre la producción de ROS y la respiración concurrente. Estas técnicas permiten la cuantificación robusta de la fisiología mitocondrial bajo una variedad de diferentes condiciones simuladas, arrojando así luz sobre la contribución de este componente celular crítico tanto a la salud como a la enfermedad.
Introduction
Las mitocondrias de las células eucariotas producen la mayor parte del ATP utilizado por las células para el trabajo y el mantenimiento1. Un paso clave en la producción mitocondrial de ATP es la conversión de oxígeno en agua, y por lo tanto la capacidad metabólica de las mitocondrias y las células asociadas se cuantifica con frecuencia a través de la medición del consumo de oxígeno2. Sin embargo, la fisiología mitocondrial es más compleja que el simple proceso de consumo de oxígeno, y la dependencia de este criterio de valoración proporciona exclusivamente una evaluación incompleta del impacto de la función mitocondrial y la disfunción en la salud celular. La caracterización completa de la función mitocondrial requiere la evaluación no solo del consumo de oxígeno, sino también de la producción de ATP y de especies reactivas de oxígeno (ROS).
Se pueden lograr medidas adicionales de las funciones mitocondriales clave simultáneamente con la medición de la respiración mediante el uso de fluoróforos específicos. El éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM) es un fluoróforo catiónico que se acumula en la matriz mitocondrial en proporción al potencial de voltaje transmembrana mitocondrial, lo que resulta en una disminución de la intensidad fluorescente debido a esta acumulación3. TMRM se puede utilizar como un indicador de cambios relativos en el potencial de la membrana mitocondrial, o se puede utilizar para cuantificar cambios precisos en el voltaje transmembrana con experimentos adicionales para determinar constantes que permiten la conversión de la señal fluorescente a mV. El verde de magnesio (MgG) es un fluoróforo que emite fluorescencia cuando se une a Mg2+, y se utiliza para mediciones de la síntesis de ATP basadas en la afinidad diferencial de ADP y ATP para el catión divalente de magnesio4. Los investigadores deben determinar las constantes específicas de afinidad/disociación (Kd) tanto para ADP como para ATP bajo condiciones analíticas específicas para convertir los cambios en la fluorescencia de MgG en un cambio en la concentración de ATP. Amplex UltraRed (AmR) es el fluoróforo utilizado para medir la producción de peróxido de hidrógeno y otras ROS durante la respiración mitocondrial5. La reacción entreH2O2y AmR (que es catalizada por la peroxidasa de rábano picante) produce resorufina, que es detectable a través de la fluorescencia a 530 nM. Cada uno de estos ensayos se puede agregar individualmente a los ensayos de respiración mitocondrial en tiempo real, para proporcionar mediciones concurrentes de los aspectos respectivos de la fisiología mitocondrial, proporcionando así un vínculo directo entre la respiración y la producción mitocondrial.
Los caballos son capaces de tasas muy altas de consumo de oxígeno específico de masa, debido en parte al alto contenido mitocondrial del músculo esquelético equino, lo que hace que este tejido sea muy relevante para estudiar la fisiología mitocondrial. Con el desarrollo de la respirometría de alta resolución, los estudios que utilizan esta nueva tecnología han ayudado a definir las contribuciones de las mitocondrias del músculo esquelético equino tanto a la notable capacidad de ejercicio de los caballos como a la fisiopatología de las enfermedades del músculo esquelético 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Los estudios de la función mitocondrial del músculo esquelético equino son particularmente ventajosos, ya que la obtención de grandes cantidades de este tejido no es terminal. Por lo tanto, los sujetos equinos no solo pueden proporcionar suficiente tejido para la caracterización completa de la función mitocondrial, sino que también sirven como controles longitudinales para estudios mecanicistas de alta calidad sobre la fisiología mitocondrial. Por esta razón, se han desarrollado ensayos adicionales para cuantificar el potencial de membrana mitocondrial, la síntesis de ATP y la producción de ROS que complementan la medición del consumo de oxígeno en este tejido, con el fin de proporcionar una caracterización más robusta de la fisiología mitocondrial en el músculo esquelético equino.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Oklahoma. En este estudio se utilizaron cuatro pura sangre (17,5 ± 1,3 años, 593 ± 45 kg) para generar los resultados representativos.
1. Obtención de una muestra de biopsia del músculo esquelético
- Obtener biopsias del músculo esquelético (seguir la técnica estéril) del centro del músculo semitendinoso (u otro músculo de interés), utilizando una aguja de biopsia de 12 G University College Hospital (UCH) (ver Tabla de materiales) mientras está bajo sedación ligera, y usando anestesia local después de un informe previamente publicado11.
- Transfiera las muestras de biopsia inmediatamente a viales con una solución de medios de transporte de biopsia helada (2,77 mM CaK 2-EGTA, 7,23 mM K 2-EGTA, 20 mM imidazol, 20 mM taurina, 50 mM K-MES, 0,5 mM ditiotritol, 6,56 mM MgCl 2, 5,77 mM ATP y 15 mM fosfocreatina, ajustados a pH 7,1; ver Tabla de materiales). Transporte al laboratorio para su análisis.
NOTA: Consulte Doerrier et al.15 para obtener instrucciones específicas sobre la preparación de los medios de transporte de biopsia. - Aísle las mitocondrias de las muestras de biopsia usando un kit comercial, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). El tampón de almacenamiento final no debe contener sustratos como ADP, ATP y succinato, que forman parte del ensayo de respirometría.
- Resuspender el pellet final de las mitocondrias aisladas utilizando 80 μL de medios de suspensión (225 mM de manitol, 75 mM de sacarosa y 1 mM de EGTA; ver Tabla de materiales) por 100 mg de músculo utilizado para el aislamiento de las mitocondrias.
- Minimice el intervalo desde el momento del procedimiento de biopsia hasta el aislamiento de las mitocondrias, y mantenga las muestras a 0-4 °C durante los pasos de procesamiento hasta que se agreguen a los respirómetros de alta resolución.
NOTA: Los estudios preliminares han encontrado que las suspensiones de mitocondrias aisladas comienzan a perder capacidad funcional después de aproximadamente 2 h cuando se mantienen a 0-4 ° C.
2. Configuración del respirómetro de alta resolución
- Los respirómetros de alta resolución se utilizan para cuantificar la respiración mitocondrial y los procesos asociados. Utilice el programa de control de software proporcionado por el fabricante (consulte la Tabla de materiales) para controlar el respirómetro, calibrar los sensores y recopilar datos sin procesar. Analice las muestras por duplicado para cada condición de prueba.
NOTA: En todos los casos, las titulaciones recomendadas y las concentraciones finales de reactivos descritas en este protocolo se basan en una cámara de respirometría de 2 ml. - Determine el flujo de O2 de fondo y el punto cero del sensor deO2 cada 2-4 semanas a través de la valoración en serie de ditionita, siguiendo las instrucciones del fabricante. Conserve estas constantes de calibración para ensayos posteriores hasta que se repita la calibración.
NOTA: A diferencia de los procedimientos publicados anteriormente utilizando fibras musculares permeabilizadas11,12,13,16, en los que la hiperoxia (250-500 μM) es necesaria para evitar la limitación de la difusión de O2 a las mitocondrias, las mitocondrias aisladas pueden evaluarse utilizando un rango de 50-200 μM O2. Esto se puede lograr simplemente permitiendo que el medio respiratorio se equilibre con el aire ambiente antes de agregar la suspensión mitocondrial (es decir, después de la calibración diaria de un solo punto). Del mismo modo, la reoxigenación de la cámara de respiración se puede lograr simplemente abriendo la cámara hasta que se haya disuelto suficiente oxígeno ambiental en el medio de respirometría para elevar la concentración de oxígeno al nivel deseado. - Llene las cámaras del respirómetro con medios libres de magnesio (0,5 mM EGTA, 60 mM K-lactobionato, 20 mM taurina, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM sacarosa y 1 g/L de albúmina sérica bovina [BSA] esencialmente libre de ácidos grasos, ajustado a pH 7.1; ver Tabla de materiales).
NOTA: Consulte Komlodi et al.17 para obtener instrucciones específicas sobre la preparación de los medios respiratorios.- Ajuste la temperatura de incubación del instrumento a 38 °C para representar la temperatura basal del músculo esquelético equino, y ajuste la mezcla de los medios respiratorios a 800 rpm utilizando un agitador magnético girando en la parte inferior de la cámara del respirómetro.
- Apague la iluminación de la cámara para evitar interferencias con los sensores fluorescentes.
- Energize el electrodo de oxígeno con un voltaje de polarización de 800 mV y amplifique la señal resultante con un ajuste de ganancia de 1.
- Registre la concentración de oxígeno cada 2 s, calcule el flujo de oxígeno como la pendiente negativa de la medición de oxígeno durante los 40 s anteriores (20 puntos de datos) e informe como pmol x s-1 x ml de solución de incubación.
- Calibre el sensor de oxígeno permitiendo que el medio se equilibre con el aire ambiente. Calcule la presión parcial de oxígeno de referencia, basándose en la presión barométrica medida por el respirómetro de alta resolución y la concentración estándar de oxígeno atmosférico.
3. Medición del potencial de membrana mitocondrial mediante TMRM
- Utilice sensores fluorescentes "verdes" (longitud de onda dominante de 530 nm) para cuantificar la señal fluorescente de la cámara de respiración. Energizar los sensores a 400-500 mV; La señal resultante se amplifica con una ganancia de 1:1.000.
NOTA: Los ajustes específicos deben optimizarse para instrumentos individuales para capturar la señal esperada dentro del rango lineal del sensor. - Añadir TMRM (4 μL de solución de 1 mM para una concentración final de 2 μM; ver Tabla de materiales) antes de la adición de mitocondrias.
- Calibre la señal fluorescente utilizando una calibración simple de dos puntos de la señal fluorescente (voltaje) frente a la cantidad de fluoróforo agregado (mM), antes de la adición de las mitocondrias.
NOTA: Utilice la función de calibración de señal fluorescente en el software de control de la máquina para calibrar esta señal. La señal bruta de la sonda fluorescente puede requerir 30 minutos o más para estabilizarse con el fin de registrar el segundo punto de la calibración. - Realizar la calibración final de la señal TMRM después de completar el protocolo de titulación de respirometría mediante la entrega de varias valoraciones de agente de desacoplamiento (cianuro de carbonilo m-clorofenil hidrazona; 2 μL por titulación) hasta que no se observen aumentos adicionales en la señal fluorescente TMRM, lo que indica el colapso completo del potencial de la membrana mitocondrial (Figura 1).
NOTA: Este valor de señal fluorescente se considera igual al potencial transmembrana de 0 mV y se utiliza como punto de referencia para los valores de potencial de membrana relativos registrados durante el protocolo de titulación de respirometría.
4. Medición de la producción de ATP utilizando verde de magnesio (MgG)
- Utilice sensores fluorescentes "azules" (longitud de onda dominante de 465 nm) para cuantificar la señal fluorescente de la cámara de respiración. Energize estos sensores para instrumentos individuales para capturar la señal esperada dentro del rango lineal del sensor.
- Realice la configuración química y la calibración de la señal fluorescente de MgG después de la adición de las mitocondrias, pero antes de la adición de cualquier sustrato. Agregue 8 μL de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de 2 mM a la cámara de respirometría para quelar cationes (particularmente Ca 2+) que competirían con Mg2+ para unirse a MgG, luego agregue 4 μL de 1 mM MgG (1.1 μM) a la cámara de respiración.
- Calibrar la señal de fluorescencia bruta con valoraciones secuenciales de 10 x 2 μL de 100 mM MgCl 2, permitiendo 1 min entre valoraciones para la estabilización de la señal fluorescente (Figura 2).
NOTA: Este proceso, que se completa fuera de línea después de completar el ensayo y utilizando plantillas proporcionadas por el fabricante de la máquina y el software asociado, produce una curva de segundo orden de concentración de magnesio a señal fluorescente (se espera r2 > 0.98), que se utilizará con una cantidad conocida de ADP agregada a la cámara de respirometría y los valores de Kd previamente determinados para determinar la concentración correspondiente de ATP11. - Determine la tasa de síntesis de ATP, que es la pendiente de la concentración de ATP a lo largo del tiempo a lo largo del protocolo (Figura 3).
5. Medición de la producción mitocondrial de ROS utilizando Amplex UltraRed (AmR)
- Utilice sensores fluorescentes "verdes" (longitud de onda dominante de 530 nm) para cuantificar la señal fluorescente de la cámara de respiración. Energizar los sensores a 300-400 mV; La señal resultante se amplifica con una ganancia de 1:1.000. Optimice los ajustes específicos de instrumentos individuales para capturar la señal esperada dentro del rango lineal del sensor.
NOTA: Si se utilizan medios respiratorios sin MgCl 2, se debe agregar (20-60 μL de 100 mM de MgCl 2 para producir 1-3 μM MgCl2) antes de agregar reactivos para el ensayo AmR. - Realice la configuración química y la calibración inicial del ensayo AmR antes de la adición de las mitocondrias. Añadir 30 μmoles de DTPA (6 μL de solución de 5 mM) a los cationes quelatos que puedan interferir con la reacción, añadir superóxido dismutasa (2 μL de una solución madre de 5.000 U/ml para convertir aniones superóxido enH2O2para una detección más completa de la generación reactiva de oxígeno), peroxidasa de rábano picante (5 μL de una solución madre de 500 U/ml), y Amplex UltraRed (2 μL de una solución madre de 10 mM) (consulte la Tabla de materiales) para producir 5 U/mL, 1 U/ml y 10 μM en la cámara de respirometría, respectivamente.
- Deje que la señal fluorescente se estabilice, luego agregue 0.2 μmoles de peróxido de hidrógeno (5 μL de una solución de 40 μM hecha fresca diariamente) dos veces, aproximadamente con 5 minutos de diferencia.
NOTA: La señal fluorescente antes y después de las dos valoraciones de H2O2 proporciona una curva de calibración lineal de tres puntos del sistema (se espera r2 > 0,95), cuya pendiente refleja la capacidad de respuesta general del sistema al informar de la relación entre la señal fluorescente y la producción (o adición) deH2O2. Utilice la función de calibración de señal fluorescente en el software de control de la máquina para calibrar esta señal. - Realizar calibraciones adicionales de dos puntos (5 μL de una solución de 40 μM hecha fresca diariamente) a lo largo del ensayo, para permitir el ajuste de la capacidad de respuesta del ensayo a medida que la química de la respirometría cambia a lo largo del ensayo, con el momento específico de estos puntos de calibración a discreción del investigador (Figura 4).
6. Medición de la respiración mitocondrial
- Añadir 15 μL de suspensión mitocondrial aislada (paso 1.4) a cada cámara de incubación de 2 ml, de modo que los resultados representen el rendimiento mitocondrial de 18,75 mg de músculo. Selle la cámara de incubación. Vortex la muestra entre cada valoración para mantener una suspensión uniforme de la muestra.
- Mida el consumo de oxígeno residual (ROX) antes de la adición de cualquier sustrato. Reste este valor (típicamente menos de 0,2 pmol O2 x s-1 x mL-1) de los valores de consumo de oxígeno de cada paso en el protocolo de titulación de sustrato/desacoplador/inhibidor (SUIT)11 después de completar el protocolo.
NOTA: Es fundamental que las señales tanto del sensor de oxígeno como del sensor de fluorescencia se estabilicen durante al menos 1 minuto (según lo evaluado por la pendiente calculada estable de las señales del sensor primario), ya que el estado general de la respiración cambia por las valoraciones para obtener resultados fiables. Esto se aplica a todos los pasos de valoración. - Utilice un SUIT de propósito general que permita la caracterización inicial de la función mitocondrial del músculo esquelético equino. Comience con titulaciones secuenciales de piruvato (5 μL de solución acuosa 2 M), glutamato (10 μL de solución acuosa 2 M) y malato (10 μL de solución acuosa 0,4 M) (consulte la Tabla de materiales) en cada cámara para producir nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y estimular la respiración no fosforilante (fuga) apoyada por NADH oxidado a través del Complejo I (LN) (Figura 1, Figura 3 y Figura 4).
- Añadir ADP (20 μL de solución acuosa de 500 mM; ver Tabla de materiales) para estimular la respiración fosforilante a través del Complejo I (PN).
- Añadir succinato (20 μL de solución acuosa 1 M; ver Tabla de materiales) para producir respiración fosforilante a través de la combinación del Complejo I y el Complejo II (PN+S).
NOTA: Con la combinación de respiración a través del Complejo I y el Complejo II, el consumo de oxígeno puede ser lo suficientemente alto como para consumir la mayor parte del oxígeno disuelto en los medios de incubación. Si la concentración de O2 disminuye por debajo de 50 μM, reoxigenar los medios de incubación desprecintando la cámara de incubación hasta que la concentración de O2 medida haya aumentado por encima de 150 μM. Repita este paso según sea necesario para mantener suficienteO2 para la respiración mitocondrial. - Agregue rotenona (2 μL de solución de etanol 0.1 mM; consulte la Tabla de materiales) para bloquear el Complejo I. El flujo de oxígeno resultante representa la capacidad del Complejo II para apoyar el consumo de oxígeno mitocondrial a través de la oxidación del succinato solo (PS).
PRECAUCIÓN: La rotenona es una sustancia venenosa. Use seguridad estándar de laboratorio y evite la ingestión o inhalación. - Calcular el valor medio para una condición experimental dada a través de cámaras de respirometría individuales que contienen alícuotas de una sola biopsia.
NOTA: Los cálculos derivados, como las relaciones de control de flujo (FCR), son valiosos para identificar cambios relativos en diferentes vías, e incluyen fuga de FCR (L N / P N), FCR N (P N / P N + S) yFCR S (P S / PN + S). La eficiencia de fosforilación oxidativa calculada (1-LN/PN+S) proporciona una estimación del impacto general de la respiración con fugas ajustada por la capacidad respiratoria total.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El estado de referencia propuesto es el de un pura sangre sedentario sano (sin aumento de la condición física debido al ejercicio obligatorio) y una muestra de músculo fresco recolectada del centro de un músculo postural, que contiene un alto porcentaje de fibras musculares esqueléticas tipo I ricas en mitocondrias e incubadas en condiciones que se aproximan al metabolismo en reposo (es decir, 38 ° C y pH 7.0). En estas condiciones, el investigador puede esperar valores de L N de 2.71 ± 0.90, valores de P N de 62.40 ± 26.22, valores de PN + S de 93.67 ± 34.76 y valores de PS de 46.93 ± 14.58 pmol O2 x s-1 x mL-1 (Figura 3 y Figura 4). Los valores respiratorios de las mitocondrias incubadas con TMRM son menores debido a un efecto inhibitorio de ese fluoróforo (Figura 1). FCR Leak, FCRN y FCRS son 0.05 ± 0.01, 0.66 ± 0.07 y 0.51 ± 0.07, respectivamente. La eficiencia de fosforilación oxidativa calculada es 0.97 ± 0.01. Los valores absolutos para estos estados respiratorios varían debido al sujeto individual y la capacidad oxidativa del tejido, pero el patrón relativo de estos valores es consistente con los resultados publicados de las fibras musculares esqueléticas equinas permeabilizadas (es decir, aumentos en la respiración con la adición de sustratos específicos, la combinación de respiración a través del Complejo I y el Complejo II es menor que cada una de estas fuentes de electrones individualmente debido a la saturación del sistema de transferencia de electrones [ETS] capacidad descendente). La eficiencia calculada de las mitocondrias aisladas del músculo esquelético equino es consistente con los valores correspondientes reportados para las fibras musculares esqueléticas equinas permeabilizadas11.
Se espera que la tasa de síntesis de ATP sea de 438,59 ± 397,10 pM x s-1 para la respiración de PN , 383,18 ± 397,19 para la respiración de PN + S, y 172,07 ± 125,60 para la respiración de PS , por mg de tejido fuente utilizado para aislar las mitocondrias. La disminución en la síntesis de ATP con la adición de succinato es probablemente debido a la competencia en la unión de quinonas del ETS por las dos alimentaciones de electrones, con la alimentación del Complejo II (que no contribuye directamente al potencial de membrana mitocondrial) reduciendo el flujo de electrones a través del Complejo I (que contribuye directamente al potencial de la membrana mitocondrial a través del bombeo de protones a través de la membrana mitocondrial interna).
Se espera que la tasa de producción de H2O2 sea de 0,079 ± 0,095 nmol.s-1 para la respiración L N, 0,021 ± 0,043 para la respiración PN, 0,026 ± 0,056 para la respiración PN+S y 0,237 ± 0,248 para la respiración PS, por mg de tejido fuente utilizado para aislar las mitocondrias (Figura 4). La tasa relativa de producción de ROS es consistente con la magnitud prevista del potencial de membrana mitocondrial y la asociación entre el alto potencial de membrana y la producción de ROS. La excepción a esta relación es la muy alta producción de ROS cuando la respiración ocurre solo a través del Complejo II, debido al flujo hacia atrás de electrones desde la unión de quinona al Complejo I cuando está bloqueada por rotenona.
Figura 1: Traza respiratoria representativa de alta resolución de la respiración mitocondrial del músculo esquelético equino y potencial relativo de membrana. La ventana superior es la concentración de oxígeno de la cámara (eje Y izquierdo) y el flujo de oxígeno (eje Y derecho) a lo largo del tiempo (eje X); la ventana inferior es la fluorescencia TMRM de la cámara (eje Y izquierdo) y la velocidad de cambio de la señal de fluorescencia (eje Y derecho) a lo largo del tiempo (eje X). Las marcas verticales indican la adición de sustratos específicos a la cámara (mt: suspensión mitocondria; P: piruvato; G: glutamato; M: malato; D: ADP; S: succinato; R: rotenona; CCCP: cianuro de carbonilo m-clorofenil hidrazona). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Traza respiratoria representativa de alta resolución de calibración de la señal de fluorescencia de cámara para verde magnesio y determinación de Kd para magnesio y adenilatos. Fluorescencia de MgG de la cámara (eje Y izquierdo) y tasa de cambio de señal de fluorescencia (eje Y derecho) a lo largo del tiempo (eje X). Las marcas verticales iniciales indican la adición de sustratos específicos a la cámara (MgG: verde magnesio; mt: suspensión mitocondria; P: piruvato; G: glutamato; M: malato; S: succinato; EDTA: ácido etilendiaminotetraacético). Esto es seguido por la titulación en serie de MgCl2 utilizando una bomba de valoración automatizada (TIP) que aumenta la señal fluorescente, luego la titulación en serie de un adenilato (en este caso ATP) que disminuye la señal fluorescente. La titulación de MgCl2 también se utiliza al comienzo de cada ensayo para calibrar la señal de MgG, pero se lleva a cabo antes de la adición de mitocondrias y sustratos de respirometría como P, G, M y S. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Traza respiratoria representativa de alta resolución de la respiración mitocondrial del músculo esquelético equino y la síntesis de ATP. La ventana superior es la concentración de oxígeno de la cámara (eje Y izquierdo) y el flujo de oxígeno (eje Y derecho) a lo largo del tiempo (eje X); la ventana inferior es la fluorescencia MgG de la cámara (eje Y izquierdo) y la tasa de cambio de la señal de fluorescencia (eje Y derecho) a lo largo del tiempo (eje X). Las marcas verticales indican la adición de sustratos específicos a la cámara (mt: suspensión mitocondria; P: piruvato; G: glutamato; M: malato; D: ADP; S: succinato; R: rotenona). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Traza respiratoria representativa de alta resolución de la respiración mitocondrial del músculo esquelético equino y producción deH2O2. La ventana superior es la concentración de oxígeno de la cámara (eje Y izquierdo) y el flujo de oxígeno (eje Y derecho) a lo largo del tiempo (eje X); la ventana inferior es la fluorescencia de la resorufina de la cámara (eje Y izquierdo) y la tasa de cambio de la señal de fluorescencia (eje Y derecho) a lo largo del tiempo (eje X). Las marcas verticales indican la adición de sustratos específicos a la cámara (mt: suspensión mitocondria; P: piruvato; G: glutamato; M: malato; D: ADP; S: succinato; R: rotenona). También se incluyen tres calibraciones intraensayo de dos puntos de la señal fluorescente utilizandoH2O2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La adición de señales fluorescentes a la salida estándar del respirómetro de alta resolución proporciona información valiosa sobre la fisiología mitocondrial, pero la calibración meticulosa de la señal fluorescente es fundamental para los datos de calidad. Los protocolos originales para el uso de MgG sugieren que las curvas de calibración generadas al calcular las constantes de disociación magnesio-adenilato podrían aplicarse a ensayos posteriores4; sin embargo, la señal fluorescente de la MgG puede no ser suficientemente reproducible de un ensayo a otro para este enfoque. Por lo tanto, cada ensayo se calibra con una titulación automatizada de MgCl2 y la curva de calibración resultante para calcular la síntesis de ATP para ese ensayo individual. Además, el Kd (constantes de disociación) para el magnesio y tanto el ADP como el ATP deben calcularse para las condiciones específicas del ensayo, incluido el tejido específico, las condiciones de incubación y los sustratos que producen la respiración fosforilante, a fin de garantizar que la derivación de la tasa de síntesis de ATP sea precisa. La variabilidad en el ensayo AmR es más ampliamente reconocida15,17, y es común insertar varios puntos de recalibración discretos en el protocolo a discreción del investigador durante el protocolo. Los datos históricos que utilizan músculo esquelético equino indican que la capacidad de respuesta típica del ensayo es de aproximadamente 0,646 V/mM deH2O2en el primer punto de calibración (antes de la adición de la muestra), y puede disminuir entre un 8% y un 15% durante el período del ensayo. Por lo tanto, la recalibración frecuente del ensayo AmR es necesaria para la detección de cambios relativamente pequeños en la producción de ROS, y el momento de las calibraciones puntuales dentro del protocolo debe determinarse para cada protocolo de titulación.
Los investigadores deben emplear un juicio cuidadoso durante todo el rendimiento del ensayo para determinar cuándo pasar al siguiente paso de titulación. Idealmente, las señales relevantes que se generan en tiempo real (flujo deO2 , fluorescencia de TMRM y la tasa de cambio en la señal fluorescente de MgG y resorufina) deben ser estables, lo que indica un estado estacionario dentro de la cámara, pero es un juicio por parte del investigador en cuanto a lo que constituye una estabilidad aceptable. En este momento, no existe un estándar ampliamente aceptado para esta decisión; Sin embargo, los investigadores deben ser muy conscientes de los riesgos de no esperar el tiempo suficiente para que se establezca un estado estacionario (lo que resulta en datos que caracterizan imperfectamente el estado respiratorio previsto) y esperar tanto tiempo que los sustratos se agotan y el ensayo ya no es confiable. En la experiencia del autor, no lograr una señal estable dentro de los 30 minutos de cualquier titulación del sustrato es evidencia de una muestra (o máquina) que se comporta de manera no biológica, y el ensayo debe descartarse.
Los resultados que utilizan este enfoque para cuantificar la fisiología mitocondrial demuestran una considerable variabilidad entre sujetos, con un coeficiente de variación típico (CV) del 30% al 40%. Por el contrario, el análisis de las fibras musculares esqueléticas equinas permeabilizadas da como resultado un CV del 19%-20%11, lo que sugiere que el proceso de aislamiento de las mitocondrias impone una variabilidad sustancial al análisis posterior, además de la marcada variabilidad intersujeto. Aunque el efecto de este último puede mitigarse mediante el uso de sujetos como sus propios controles cuando sea posible, el primero solo puede minimizarse mediante una cuidadosa atención a la técnica de aislamiento. Si el diseño experimental no permite réplicas experimentales de una sola biopsia, entonces el investigador puede optar por expresar los datos de respirometría relativos a un factor de corrección que refleja las diferencias en el contenido mitocondrial en diferentes muestras. Los factores de corrección más comunes son el contenido de proteína de la muestra y la actividad de la citrato sintasa de la muestra. Sin embargo, como se describe en una reciente declaración de consenso de científicos activos en este campo, no existe un método único para realizar este ajuste que sea universalmente acordado18. La corrección del contenido de proteínas y/o la actividad de la citrato sintasa son los dos enfoques más comunes utilizados para el tejido muscular esquelético equino12,13, pero ambos tienen sus deficiencias. Puede ser necesario que diferentes diseños experimentales expresen datos a través de relaciones internas (es decir, de control de flujo) y externas (proteínas, actividad enzimática, otros marcadores mitocondriales) para interpretar la función mitocondrial.
El protocolo descrito se basa en el uso de fibras musculares permeabilizadas, con varias diferencias importantes. Los ensayos de fibras permeabilizadas requieren biopsias más pequeñas, ya que la respirometría de alta resolución de las fibras permeabilizadas del músculo esquelético equino se realiza típicamente con solo ~ 2 mg de masa de muestra en cada cámara 6,7,8,9,10,11. En contraste, el protocolo descrito aquí tiene el equivalente a casi 10 veces esa masa de fibra en cada cámara. Esta diferencia resalta la ineficiencia del aislamiento mitocondrial del tejido fresco. Una posible razón de esta ineficiencia es la dificultad para recuperar las mitocondrias del músculo esquelético que se encuentran dentro de la red de proteínas contráctiles. El kit comercial para el aislamiento mitocondrial utilizado en este protocolo incluye el tratamiento con una proteasa y el uso de medios iónicos para ayudar a descomponer las fibras contráctiles, pero es probable que una parte sustancial de las mitocondrias intermiofibrilares no se recupere. Esta característica del protocolo no solo es relevante para determinar la cantidad de material de biopsia necesario, sino también con respecto a la interpretación de los resultados. Las mitocondrias aisladas son menos susceptibles a la dependencia del oxígeno, debido a la limitación de la difusión en comparación con las fibras permeabilizadas15; Por lo tanto, la hiperoxia no es necesaria con mitocondrias aisladas, y los medios respiratorios pueden oxigenarse suficientemente (y reoxigenarse durante el ensayo) simplemente abriendo la cámara al aire ambiente. Este aspecto del suministro de oxígeno es particularmente útil cuando se mide la producción deH2O2y otras ROS, ya que la producción de ROS aumenta de manera no fisiológica durante la incubación hiperóxica 19. Finalmente, el uso de mitocondrias aisladas proporciona una señal fluorescente más estable y reproducible, debido a la disminución de la unión de proteínas no específicas de los fluoróforos en comparación con el uso de fluoróforos con fibras musculares permeabilizadas. Cada preparación de muestra tiene ventajas y desventajas, y la competencia tanto con fibras permeabilizadas como con mitocondrias aisladas proporciona al investigador un conjunto sólido de ensayos para abordar una variedad de preguntas relacionadas con la fisiología mitocondrial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses relacionados con este manuscrito.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer el generoso apoyo de la Cátedra John y Debbie Oxley para Medicina Deportiva Equina y la Fundación de Investigación del Jockey Club Grayson.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A5285 | |
| Amplex UltraRed | Life Technologies | A36006 | |
| ATP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A2383 | |
| BSA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A6003 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C4830 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C2759 | |
| DatLab 7.0 | Oroboros Inc | Software to operate O2K fluororespirometer | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D0632 | |
| DTPA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D1133 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | E4378 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | G1626 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | H7523 | |
| Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P8250 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 516813 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Imidazole | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | I2399 | |
| K-MES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M8250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9272 | |
| Magnesium Green | Thermo Fisher Scientific | M3733 | |
| Malate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M1000 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9647 | |
| Mitochondrial isolation kit | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | MITOISO1 | |
| O2K fluororespirometer | Oroboros Inc | Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently. | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P7936 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P1767 | |
| Potassium lactobionate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | L2398 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P0662 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P2256 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Rotenone | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | R8875 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 84097 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S8160 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T0625 | |
| Titration pump | Oroboros Inc | ||
| Titration syringes | Oroboros Inc | ||
| TMRM | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T5428 | |
| UCH biopsy needle | Millenium Surgical Corp | 72-238067 | Available in a range of sizes |
References
- Wilson, D. F. Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization. Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th edn. , Oroboros MiPNet Publications. Innsbruck. (2014).
- Ehrenberg, B., Montana, V., Wei, M. D., Wuskell, J. P., Loew, L. M. Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes. Biophysical Journal. 53 (5), 785-794 (1988).
- Chinopoulos, C., Kiss, G., Kawamata, H., Starkov, A. A. Measurement of ADP-ATP exchange in relation to mitochondrial transmembrane potential and oxygen consumption. Methods in Enzymology. 542, 333-348 (2014).
- Krumschnabel, G., et al. Simultaneous high-resolution measurement of mitochondrial respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1264, 245-261 (2015).
- Lemieux, H., et al. Mitochondrial function is altered in horse atypical myopathy. Mitochondrion. 30, 35-41 (2016).
- Houben, R., Leleu, C., Fraipont, A., Serteyn, D., Votion, D. M. Determination of muscle mitochondrial respiratory capacity in Standardbred racehorses as an aid to predicting exertional rhabdomyolysis. Mitochondrion. 24, 99-104 (2015).
- Votion, D. M., Gnaiger, E., Lemieux, H., Mouithys-Mickalad, A., Serteyn, D. Physical fitness and mitochondrial respiratory capacity in horse skeletal muscle. PLoS One. 7 (4), 34890 (2012).
- Votion, D. M., et al. Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing. Equine Veterinary Journal Supplement. (38), 268-274 (2010).
- Tosi, I., et al. Altered mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in horses suffering from polysaccharide storage myopathy. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 50 (5), 379-390 (2018).
- Davis, M. S., Fulton, M. R., Popken, A. A. Effect of hyperthermia and acidosis on equine skeletal muscle mitochondrial oxygen consumption. Comparative Exercise Physiology. 17 (2), 171-179 (2021).
- Latham, C. M., Fenger, C. K., White, S. H. RAPID COMMUNICATION: Differential skeletal muscle mitochondrial characteristics of weanling racing-bred horses1. Journal of Animal Science. , (2019).
- White, S. H., Warren, L. K., Li, C., Wohlgemuth, S. E. Submaximal exercise training improves mitochondrial efficiency in the gluteus medius but not in the triceps brachii of young equine athletes. Scientific Reports. 7 (1), 14389 (2017).
- White, S. H., Wohlgemuth, S., Li, C., Warren, L. K. Rapid communication: Dietary selenium improves skeletal muscle mitochondrial biogenesis in young equine athletes. Journal of Animal Science. 95 (9), 4078-4084 (2017).
- Doerrier, C., et al. High-resolution FluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).
- Li, C., White, S. H., Warren, L. K., Wohlgemuth, S. E. Effects of aging on mitochondrial function in skeletal muscle of American American Quarter Horses. Journal of Applied Physiology. 121 (1), 299-311 (2016).
- Komlodi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
- Gnaiger, E.
- Li Puma, L. C., et al. Experimental oxygen concentration influences rates of mitochondrial hydrogen peroxide release from cardiac and skeletal muscle preparations. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrated, and Comparative Physiology. 318 (5), 972-980 (2020).
