Summary
Mevcut protokol, Drosophila'nın lokomotor aktivitesini, hız, mesafe vb. parametreleri hesaplamak için yüksek tanımlı video kaydına dayalı olarak her karenin piksellerini segmentlere ayırmak için eklentilerle uyumlu açık kaynaklı yazılım Fiji'yi kullanarak el yapımı bir arenada sineklerin hareketini izleyerek ve analiz ederek değerlendirir.
Abstract
Drosophila melanogaster , gelişmiş genetik manipülasyon tekniklerinin bolluğu ve çeşitli davranışsal özellikleri nedeniyle çeşitli hastalıkları incelemek için ideal bir model organizmadır. Hayvan modellerinde davranışsal eksikliğin belirlenmesi, örneğin hastaların sıklıkla motor fonksiyonlarında bozulmalar yaşadığı nörodejeneratif hastalıklarda, hastalık şiddetinin çok önemli bir ölçüsüdür. Bununla birlikte, ilaçla tedavi edilen veya transgenik bireyler gibi sinek modellerinde motor açıklarını izlemek ve değerlendirmek için çeşitli sistemlerin mevcudiyeti ile, birden fazla açıdan hassas değerlendirme için ekonomik ve kullanıcı dostu bir sistem hala eksiktir. Burada, hem yetişkin hem de larva bireylerinin hareket aktivitelerini kayıtlı videodan sistematik olarak değerlendirmek ve böylece izleme davranışlarının analizine izin vermek için Fiji görüntü işleme programı ile uyumlu olan AnimalTracker uygulama programlama arayüzüne (API) dayanan bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntem, davranışı kaydetmek ve analiz etmek için yalnızca yüksek çözünürlüklü bir kamera ve bir bilgisayar çevre birimi donanım entegrasyonu gerektirir, bu da onu transgenik veya çevresel davranış eksiklikleri olan sinek modellerini taramak için uygun fiyatlı ve etkili bir yaklaşım haline getirir. Farmakolojik olarak tedavi edilen sinekleri kullanan davranış testlerine örnekler, tekniklerin hem yetişkin sineklerde hem de larvalarda davranış değişikliklerini oldukça tekrarlanabilir bir şekilde nasıl tespit edebileceğini göstermek için verilmiştir.
Introduction
Drosophila melanogaster, gen modifikasyonu1, ilaç tedavisi2 ve yaşlanma3 tarafından oluşturulan nöronal hastalık modellerinde hücresel ve moleküler fonksiyonları araştırmak için mükemmel bir model organizma sağlar. İnsanlar ve Drosophila arasındaki biyolojik yolakların, fiziksel özelliklerin ve hastalıkla ilişkili homolog genlerin yüksek korunumu, meyve sineğini molekülden davranışsal seviye4'e ideal bir taklit haline getirir. Birçok hastalık modelinde, davranış eksikliği çeşitli insan nöropatileri için yararlı bir model sağlayan önemli bir indekstir 5,6. Drosophila şimdi çoklu insan hastalıklarını, nörogelişimi ve Parkinson hastalığı ve amiyotrofik lateral skleroz 7,8 gibi nörodejeneratif hastalıkları incelemek için kullanılmaktadır. Hastalık modellerinin motor yeteneğini saptamak, patojenik ilerlemeyi anlamak için çok önemlidir ve hastalık sürecinin altında yatan moleküler mekanizmalarla fenotipik bir korelasyon sağlayabilir.
Son zamanlarda, Drosophila lokomotor algılama stratejileri için, gruplandırılmışsineklerde yüksek verim testi 9,10 ve gerçek zamanlı 11,12'de hareket ölçümü gibi ticari olarak temin edilebilen yazılım araçları ve uygun maliyetli programlar geliştirilmiştir. Böyle bir geleneksel yaklaşım, aynı cinsiyet ve yaşa sahip büyük bir sinek popülasyonunun kapsanmasına izin veren ve 9,13 veri toplarken çeşitliliği azaltan birden fazla kanal içeren tırmanma testi olarak da adlandırılan hızlı etkileşimli negatif jeotaksistir (RING). Lokomotor davranışı analiz etmek için bir başka ön test yöntemi, ince bir cam tüp14 içindeki sinek aktivitesi hareketini tespit etmek için birden fazla ışın kullanan bir cihaz olan TriKinetics Drosophila aktivite monitörüdür (DAM). Cihaz, daha uzun bir süre boyunca sineklerin aktivitesini ve sirkadiyen ritmini incelemek için ışın geçişlerini hesaplayarak otomatik hareketi temsil eden konumu sürekli olarak kaydeder15. Bu yöntemler, davranışsal hareketteki değişiklikleri belirlemek için meyve sineklerindeki davranışsal kusurların analizinde yaygın olarak kullanılmasına rağmen, her zaman özel test ekipmanı veya karmaşık analiz süreçleri gerektirir ve bazı modellerde uygulamalarını sınırlı, basit bir cihazla kısıtlar. FlyGrAM11 ve Drosophila adası tahlil10 gibi yetişkin Drosophila'yı test etmek için hayvan izleme grubu tabanlı stratejiler, önceden tanımlanmış bir alanda sosyal işe alım ve bireysel izleme uygular. Bununla birlikte, meydan okunan alanlardaki sosyal bireysel kısıtlama, sineklerin çarpışması veya üst üste binmesinden kaynaklanan görüntülerdeki tanımlamalar üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olabilir. TRex16, MARGO12 ve FlyPi17 gibi bazı açık kaynaklı materyal tabanlı yöntemlerin acil bir durumu olsa da, davranış testlerinde esnek kullanımla sinekleri hızlı bir şekilde izleyebilirler. Bu test yaklaşımları, ayrıntılı deneysel cihaz kurulumları, özel yazılım gereksinimleri veya profesyonel bilgisayar dilleri ile ilişkilidir. Larvalar için, birimzaman 18 başına ızgara sınır çizgilerinin sayısı boyunca kat edilen toplam mesafeyi ölçmek veya bireyler için vücut duvarı kasılmalarını manuel olarak19 olarak kabaca saymak, lokomotor yeteneklerini değerlendirmek için baskın yöntemlerdir. Ekipman veya cihazlarda ve analiz yöntemlerinde hassasiyet eksikliği nedeniyle, larvaların bazı davranışsal hareketleri tespit edilmekten kaçabilir ve davranışsal hareketin, özellikle de ince hareketin doğru bir şekilde değerlendirilmesini zorlaştırabilir15.
Mevcut geliştirilen yöntem, Fiji (ImageJ) görüntü işleme programı ile uyumlu AnimalTracker uygulama programlama arayüzünü (API) kullanarak, hem yetişkin hem de larva sineklerinin lokomotor aktivitesini, yüksek çözünürlüklü (HD) videolardan izleme davranışlarını analiz ederek sistematik olarak değerlendirmek için kullanmaktadır. Fiji, sağlam yazılım kütüphanelerini çok sayıda komut dosyası dili ile birleştirebilen, görüntü işleme algoritmalarının hızlı prototiplenmesiyle sonuçlanan ve görüntü analiz yetenekleri20 için biyologlar arasında popüler hale getiren açık kaynaklı bir yazılım ImageJ dağıtımıdır. Mevcut yaklaşımda, Fiji'nin AnimalTracker API'sine entegrasyonu, kişiselleştirilmiş algoritma ekleme ile benzersiz bir Drosophila davranış testi geliştirmek için kullanılmaktadır ve lokomotor davranışın sağlam analitik yeteneklerini desteklemek için ayrıntılı dokümantasyon ve öğreticiler için yararlı bir adım sağlar (Şekil 1). Sineklerin çarpışması veya üst üste binmesinin neden olduğu görüntülerdeki nesnel tanımlamaların karmaşıklığını atlatmak için, her arena yalnızca bir sineğe ev sahipliği yapmakla sınırlıdır. Yaklaşımın izleme hassasiyetini değerlendirdikten sonra, genellikle Parkinson hastalığının hayvan modelleri için kullanılan toksik ilaç rotenon ile uygulanan Drosophila'nın lokomotor hareketlerini izlemek ve ölçmek için uygulandı ve sonuçta ilaç tedavisinde hareket bozukluğu keşfetti21. Açık kaynaklı ve özgür yazılım kullanan bu metodoloji, yüksek maliyetli enstrümantasyon gerektirmez ve Drosophila davranışsal hareketini hassas ve tekrarlanabilir bir şekilde analiz edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada W1118 yetişkin sinek ve üçüncü instar larvaları kullanılmıştır.
1. Deneysel hazırlık
NOT: Drosophila hareket takibi için açık alan arenası, renksiz ve kokusuz silika jel ile yapılır.
- Reaktif A ve reaktif B'yi, üreticinin silika kiti için talimatlarına göre 1:10 oranında karıştırın ( bkz. Renk beyaza dönene kadar karıştırarak karışıma sodyum bikarbonat eklendiğinden emin olun. Karışımı temiz bir Petri kabına aktarın ve 48 saat kuruması için 40 ° C'de bir fırına koyun.
- HD kamerayı (bkz. Malzeme Tablosu) bir tripod üzerine yerleştirin ve kamera lensi silika arenanın yüzeyine dik olacak şekilde ayarlayın. Odak uzaklığını ve kameranın diyafram açıklıklarını ayarlayarak, kameranın silika yüzeyine odaklandığından ve ekranın yeterince aydınlatıldığından emin olun. Deney düzeneği Şekil 1'de gösterilmiştir.
- En az 61 saniyelik sürekli bir video kaydetmek için açık alan arenasına bir sinek aktarın.
NOT: Larvaların halsiz doğası göz önüne alındığında, 10 dakikadan fazla bir video kayıt süresi önerilir.- Videoyu Fiji ile açın, ilerleme çubuğunu ilk kareye sürükleyin ve zımnen onaylayın. "Serbest el seçimi" aracını kullanarak sineğin tüm vücudunu seçin (Şekil 2B, C).
- Seçilen alanın gri değeri geniş arka plana yaklaşana kadar beyaz dengesini ayarlamak için parlaklığı ve kontrast>ı ayarlamak > görüntüyü tıklatın (Şekil 2D-F).
NOT: İlk karenin arka plan homojenizasyonu, yazılımın arka planı herhangi bir nesne olmadan ayırt etmesini ve bir sinek olduğunda bir kontrast oluşturmasını sağlar, böylece yazılımın onu izlemesine izin verir.
- Tüm deneyi 25 °C ve %60 bağıl nem olarak ayarlanmış bir test ortamında, sessiz ve parlak ışığa maruz kalmayan bir alanda gerçekleştirin.
2. Video kaydı ve ön işleme
- % 95 karbondioksit (CO2) kullanarak kısa bir anestezi süresinden sonra, açık dosyalanmış arenaya bir sinek aktarın ve video kaydını başlatmak için kamera uygulamasındaki kayıt düğmesine basın.
NOT: Anestezinin hareket üzerindeki etkisini en aza indirmek için, video kaydına başlamadan önce sineklerin 10 dakika boyunca iyileşmesine izin verin. Soğutma yoluyla serin anestezi yapılması da önerilir.- Sinekler anesteziden kurtulduktan sonra, sineği içeren arena tabağını kameranın altına koyun ve kayıt başladığında sineğin hareket halinde olduğundan emin olmak için plakayı bir yandan diğer yana hızlıca sallayın.
- Kaydın tamamlanmasının ardından, video kaydını sonlandırmak için durdur düğmesine basın.
NOT: Video kayıt süresinin hedef izleme süresini küçük bir farkla biraz aştığından emin olun. Ek olarak, deneysel verimliliği artırmak için, birden fazla sineği kendiliğinden izlemek mümkündür. Bu, yüksek kaliteli bir video kırpma sağlamak için kameranın çözünürlüğüne bağlıdır. - Kaydedilen videoları MJPEG kodlama ile AVI formatına dönüştürün, böylece Fiji kullanılarak açılabilir ve analiz edilebilirler. Bu arada, videonun saniyedeki kare sayısı (fps) hızını yetişkin sinekler için 15 fps ve larvalar için 12 fps olarak ayarlayın.
3. Video analizi
- Videoyu Fiji ile açarken açılır pencerede iki seçenek olan "sanal yığın kullan" ve "gri tonlamaya dönüştür" ile dönüştürülen videoyu açın (Şekil 2A).
- Yukarıda belirtildiği gibi boş bir ilk kare yapın.
- AnimalTracker eklentisinin "etkin görüntüyü ayarla" aracını kullanarak bir işleme penceresi edinin ve "oval" aracını kullanarak orijinal video penceresindeki arenayı çevreleyen bir izleme alanı oluşturun (Şekil 3A).
- İşleme penceresindeki ilk boş çerçeve için filtreleri (Şekil 3A,3) ve iki filtrenin parametrelerini (Şekil 4A-G) ayarlayın. Ardından, orijinal video penceresinde bir sonraki kareyi seçin ve işleme penceresinin filtrelenmiş yüzeyini seçin (Şekil 5A-C).
NOT: Filtreleme adımı, görüntü gürültüsünü azaltmaya ve/veya arka planı kaldırmaya yarar, böylece çerçevelerin ikilileştirilmesinde ön planın arka plandan ayrılmasını kolaylaştırır. - Filtrelenmiş bir işleme penceresi seçildikten sonra, "eşik ayarla" aracını kullanarak izlenen sineği işleme penceresinde kaplı kırmızı bir profille çevirin (Şekil 3A,4, Şekil 5D-E ve Şekil 6A).
- Bilgisayarın işleme penceresinde kırmızı bir profille sineği tanımasını sağlamak için "blob algılayıcısını ayarla" yı kullanın (Şekil 3A,5 ve Şekil 6B).
- 901 karesini, videonun kayıt süresi ve fps ile hesaplanan yetişkin sineği için son kare olarak ayarlayın (Şekil 3A,6, Şekil 6C).
NOT: Larvalarla yapılan aşağıdaki deney 10 dakika boyunca izlenmiştir, bu nedenle 7200 karesi son kare olarak ayarlanmıştır. - Orijinal video penceresinde bir izleme dikdörtgeni sunmak için "blobları göster" aracını kullanın (Şekil 3A,7 ve Şekil 6D,E). Ardından, izlemeyi başlatın ve izleme tamamlandıktan sonra izleme dosyasını dışa aktarın (Şekil 3A,8,9 ve Şekil 7A,B).
4. İzleme dosyası analizi
- Hayvan izleyici > İzleme analizörü eklentisini kullanarak parça ve bölge dosyalarını yükleyin (Şekil 8A).
- Bölge ayarlarını kullanarak istediğiniz dizini seçin ve parametre ayarlarını değiştirin (Şekil 8). Kare hızını kullanarak kare aralığının süresini hesaplayın.
NOT: Bu durumda, kare hızı 15 fps'dir ve kare aralığı varsayılan ayar olan yaklaşık 0,067 sn'dir (Şekil 8D). - İzleme analizöründe analiz edildikten sonra elektronik tablo yazılımını ve GraphPad Prizma'yı kullanarak nicel analiz çizelgeleri oluşturun (Şekil 9).
5. Kare başına analiz
- Kare aralığı başına hız analizi gerçekleştirin. Daha ayrıntılı araştırmaya ihtiyaç duyulursa, Fiji olmadan parça dosyasını analiz edin.
- İzleme dosyasını açın, tüm koordinatları Microsoft Office Excel'e kopyalayın ve boşluk tuşunu kullanarak hücreleri bölün.
NOT: Örneğin, dosya "C" ve "D" sütunlarına bölündükten sonra, Drosophila'nın kare aralığı başına hızı, "E" sütununda gösterilen SQRT(( C5-C4)^2+(D5-D4)^2) formülüyle hesaplanır (Şekil 10A). "E" sütunundaki veriler, sineğin iki kare arasında hareket ettiği piksel sayısını gösterir ve ilk kare dikkate alınmaz. Hesaplanan tüm sonuçları seçin ve kare aralığı başına sezgisel bir sinek hareketi hızı sergilemek için çizgi grafikte bir tepe noktası olacak şekilde bir çizgi grafik ekleyin (Şekil 10B).
- İzleme dosyasını açın, tüm koordinatları Microsoft Office Excel'e kopyalayın ve boşluk tuşunu kullanarak hücreleri bölün.
- Kare aralığı başına hareketsizlik süresini hesaplayın. Dosya "C" ve "D" sütunlarına bölündükten sonra, "E" sütununda gösterilen IF(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1) formülünü kullanarak Drosophila'nın kare aralığı başına hareketsizlik durumunu hesaplayın. (Şekil 10C).
NOT: Hız analizinden farklı olarak, ilk karenin sonuçları tanımlanmıştır. 20 pikselden daha az hareket eden sinekler hareketsiz olarak kabul edildi ve "E" sütununa "0" olarak kaydedildi.- Hesaplanan tüm sonuçları seçin ve hareketsizlik süresini tüm sütun grafiğinin kenar boşluğuna göre görsel olarak görüntülemek için bir sütun grafiği ekleyin (Şekil 10D).
- Yön açısının değiştiğinden emin olun.
NOT: Yön değişim açısı analizi, sineklerin yön seçimini temsil eder. Dosya "C" ve "D" sütunlarına bölündükten sonra, yön değişikliği açısı ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*(SQRT((C7-C6)^ 2+(D7-D6)^2)))*180/PI())*180/PI())*180/PI()), "E" sütununda (Şekil 10E) sunulan formülle hesaplanır. Hesaplanan sonuçlar üç koordinat arasındaki açıyı gösterir.- Hesaplanan tüm sonuçları seçin ve sineklerin hareketinin yön değişim açısını göstermek için bir dağılım diyagramı ekleyin (Şekil 10F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, yetişkin sineklerde ve rotenon ile tedavi edilen üçüncü instar larvalarında lokomotor eksiklikler incelenmiş ve motor aktivitelerinde ilaç çözücü dimetil sülfoksit (DMSO) ile beslenen bir kontrol sineğininkiyle karşılaştırılmıştır. Drosophila'da rotenon ile tedavinin beyinde dopaminerjik nöron kaybına neden olduğu gösterilmiştir22 ve önemli lokomotor defisitlere yol açmaktadır23. Şekil 11 ve Şekil 12'de gösterildiği gibi, rotenon ile tedavi edilen yetişkin sinekler ve üçüncü instar larvaları, DMSO ile beslenen kontrol sineklerine kıyasla önemli lokomotor eksikliklere sahiptir. Şekil 11 ve Şekil 12B-E, rotenon ile veya rotenon olmadan tedavi edilen sinekler arasındaki hareket parametreleri için mesafe, hız ve hareketsizlik süresindeki göreceli değişiklikleri göstermektedir. Şekil 11 ve Şekil 12F-K, yetişkinlerde ve larvalarda rotenon tedavisi olsun veya olmasın, hız, hareketsizlik süresi ve yön seçimi parametrelerinin temsili bir analizini göstermektedir. İlaçla beslenen grupların yetişkin sineklerinde (Şekil 11) ve üçüncü instar larvalarında (Şekil 12) Fiji yazılımı kullanılarak mesafe, hareketsizlik süresi ve hız parametrelerinin kantitatif analizi, rotenon ile tedavinin, nörodejeneratif koşullar da dahil olmak üzere insan hastalıklarında lokomotor eksiklikleri araştırmak ve insanlarda ve memelilerde gözlenen bazı davranışsal özellikleri çoğaltmak için kullanılabileceğini doğrulamaktadır.
Şekil 1: Drosophila hareket izleme analizi için ekipman kurulumunu ve deneysel prosedürü özetleyen akış şeması. Lokomotor izleme arenası, bir bilgisayara dahil edilen ve bir bilgisayar tarafından kontrol edilen bir tepegöz HD kamera ile görüntülenir. Drosophila'nın hareketini analiz etme prosedürü video kaydı, hareket izleme, izleme dosyası analizi, veri işleme ve parametrik analizden oluşur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İlk karenin arka plan homojenizasyonu. (A) Videoyu gri tonlamaya dönüştürmek ve renk parazitini önlemek için dönüştürülen videoyu açarken "gri tonlamaya dönüştür" seçeneğini işaretleyin. (B) Kırmızı kutuda gösterilen "serbest seçim" aracını kullanarak Drosophila'nın ana hatlarını çizin. (C) Analiz seçimi olarak, sineklerin ana hatlarını tanımlamak için sarı bir çizgi kullanılmıştır. Sarı çizgiyi sineğin konturlarına yakın tutmak, sinek tarafından işgal edilmeyen bir bölge seçme olasılığını azaltır. Ölçek çubuğu = 1 cm. (D) Sarı kutulu alan arka planla aynı gri tonlamaya geçene kadar ilk karenin parlaklığını ve karşıtlığını ayarlayın. (E) "Yığın" penceresindeki "Hayır"a tıklayarak ilk kare için parlaklık ve kontrast ayarını tamamlayın, ancak tüm kareler için değil. (F) Sonuçta, ilk kare tek tip ve lekesiz bir arka plan oluşturacak şekilde ayarlanır. Ölçek çubuğu = 1 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İzleme penceresi ve izleme bölgesi ayarları. (A) İzleyici eklentilerine Hayvan izleme penceresinde işaretlenen sırayla tıklayarak izleme analizini tamamlayın. (B) Şekil A,1'deki etkin görüntüyü ayarladıktan sonra, yalnızca geçerli kareyi gösteren bir işleme penceresi sunulur. Birincil video penceresi ve işleme penceresi açıkça ayırt edilir ve farklı durumlarda kullanılır. Geçerli kareyi değiştirmek için, değişikliğin birincil video penceresinde yürütüldüğünden emin olun; Değişiklik her iki pencerede de görülebilir. Ölçek çubuğu = 1 cm. (C) Bilgisayar tanıma için "oval" aracını kullanarak arenayı çevreleyen bir izleme alanı oluşturun. İzleme bölgesi seçimi, işleme penceresi yerine açık bir video penceresinde daire içine alınmış bir arenada olmalıdır. (D) Dış ışığın bozulmasını en aza indirmek için arenaya en geniş ölçüde uyacak şekilde sarı çizgilerle bir izleme alanı çizin. Ölçek çubuğu = 1 cm. (E) İzleme alanında ilgi alanını (YG ) ayarlamak için, "bölge tasarımcısı" penceresinde gösterilen sayılarla işaretlenmiş sırayı izleyen düğmeleri tıklayın. Bu adımda, seçilen video penceresi açıldıktan sonra tüm işlemin tamamlanması gerekir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İlk kare için filtre ayarı. (A) İzleme alanı için YG ayarını tamamladığınızda, arenayı çevreleyen sarı çizgi hem açılan video penceresinde hem de işleme penceresinde yeşile döner. Ölçek çubuğu = 1 cm. (B) Filtrelerin amacının eklenmesi, hedef nesneyi işleme penceresindeki ilk kare için daha belirgin hale getirmek üzere siyah bir arka plan ayarlar. Tüm işlem, açık bir video penceresi yerine bir işleme penceresi içinde gerçekleştirilmelidir. (C,D) "Filtre ayarları" penceresine "arka plan alt traktörü" ve "Gauss bulanıklığı" filtrelerinin eklenmesi, işleme penceresindeki ilk kareyi siyah yapar. Tüm filtre ayarlama işlemi ilk karede tamamlanmalıdır. (E) Parametreler, "arka plan alt traktörü" penceresinde bir sayı ve kırmızı bir dikdörtgenle işaretlenmiş düğmeler tıklatılarak adım adım ayarlanır. "Görüntü ayarla" adımı, işleme penceresi seçildikten sonra çalıştırılmalıdır. (F) Ölçek çubuğu = 1 cm. "Medyan görüntü" penceresi, "E4" teki "filtreyi göster" düğmesine tıklandıktan ve herhangi bir işlem yapmadan pencereyi doğrudan kapattıktan sonra sunulacaktır. (G) Gauss bulanıklığının parametresi varsayılan sigma değeri 2.0 olacak şekilde ayarlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: İkinci karenin eşik ayarları. (A) Alt ilerleme çubuğunu tıklatarak video penceresinin ikinci kareye ilerlemesini sağlayın. Sinek ekranın ortasında tekrarlanır ve Fiji tarafından tanımlanır. Ölçek çubuğu = 1 cm. (B,C) İşleme penceresini filtrelemeden önce ve sonra görüntüleyin. (B) Kırmızı bir dikdörtgenle işaretlenmiş modu seçerek filtrelenmiş işleme penceresini gösterin. (C) "Filtrelenmiş" mod seçildikten sonra kırmızı dikdörtgenli bir işleme penceresi örneği. Ölçek çubuğu = 1 cm. (D) Şekil 3A,4'teki "eşik ayarla" aracını seçtikten sonra, "eşikler" penceresinde gösterilen varsayılan eşik yöntemi olan "gri tonlamalı eşik" i seçerek eşiği ayarlayın. (E) İzleme sineği görülene ve kırmızı profille kaplanana kadar ortadaki ilerleme çubuğu kutusunu kaydırarak parametreleri ayarlayın. Aşağıdaki kırmızı dikdörtgende kutulu parametreler için varsayılan ayarların değiştirilmesi önerilmez. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Blob algılayıcısı, son kare ayarı ve hayvan izleme seçimi. (A) Şekil 5E'de belirtilen eşiğe ulaşıldığında, işleme penceresi ikinci karedeki sineği takip eden oldukça büyük kırmızı bir profil ortaya çıkarır. Sineği kaplayan kırmızı profili sineği izlemek için uygun hale getirin. Ölçek çubuğu = 1 cm. (B) Varsayılan blob algılayıcısı yöntemi olan "temel blob algılayıcısı"nı seçerek kırmızı profil kaplı sineği izleme hedefi olarak tanımlayın. (C) Şekil 3A,6'daki "son kareyi ayarla" aracını kullanarak 901 numaralı kareyi son kare olarak ayarlayın. Toplam kare numarası "kare numarası = fps * kayıt süresi" formülüyle hesaplanır. (D) İzleme, açılan video penceresinde (sol panel bölümü) blobları gösterdikten sonra kutulanmış sarı bir dikdörtgenle uçar. Genişletilmiş sol panelde, meyve sinekleri kırmızı renkte tutturulmuştur (sağ panel bölümü). Ölçek çubuğu = 1 cm. (E) İzleme "D" deki (üst panel bölümü) kırmızı dikdörtgeni seçmek için tıkladıktan sonra kutulu kırmızı bir dikdörtgenle uçar. Üst panel büyütmede, meyve sinekleri kırmızı renkte tutturulmuştur (alt panel bölümü). Açılan video penceresinde izleme sineğinin etrafındaki sarı dikdörtgen seçiminin tamamlandığından emin olun. Açılan video penceresindeki seçimi tamamlayın ve sinek tüm karelerde Fiji tarafından tanımlanacaktır. Ölçek çubuğu = 1 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: İzleme izlemenin sonuçları. İzleme izleme, açılan video penceresinde ( A ) ve işleme penceresinde (B) ayrı ayrı gösterilir. İzleme izleme profilini almak için, orijinal video penceresindeki ilerleme çubuğuna tıklayın ve izlemenin sürekliliğini kontrol etmek için ilerleme çubuğunu kaydırın. İzleme izi, sineklerin tarama mesafesini sezgisel olarak sunar. Ölçek çubuğu = 1 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: AnimalTracker eklentilerini kullanarak dosya analizini izleme. (A) İzleme analizörü, izleme dosyasının ayrıntılı bir analizini kolaylaştırır; Kırmızı dikdörtgenle işaretlenmiş her adım bir sayı ile gösterilir. (B) A,4'teki "bölge ayarları" parametrelerini ayarlayın. Dört parametre, zaman, mesafe, hareketsizlik süresi ve hız vektörü kırmızı dikdörtgende gösterilir. Parametre, istenen sonuca göre seçilir. (C-G) Yapılandırma parametrelerini A,5'in "parametreleri ayarla" penceresinde ayrı ayrı ayarlayın. (C) "Yapılandırma parametreleri ayarları" penceresinde, sırasıyla "zaman ayarları", "hareketsizlik zaman ayarı", "mesafe ayarları" ve "hız vektörü ayarı" pencerelerini gösteren dört ayarlanabilir parametre gösterilmiştir. Parametre ayarları için varsayılan değerin değiştirilmesi önerilmez. Ancak, "kare aralığı" için, videonun fps'si değiştirildiğinde parametre "kare aralığı = 1/fps" formülü kullanılarak hesaplanmalıdır. Ek olarak, bir sineğin izlenmesiyle kaydedilen pikselleri somut bir değerle ilişkilendirerek gerçek mesafeyi ve hızı tespit etmek için bilinen bir ölçek kullanmak mümkündür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: İzleme dosyası analizini gösteren sonuç. (A) Şekil 8A,6'nın ayarlanması. Verileri görüntülemenin iki modu mevcuttur: "bölgelere göre gruplandırılmış" ve "parametrelere göre gruplandırılmış". (B) İzleme dosyası analizinin sonuçları "A,6.1"de "bölgelere göre gruplandırılmış" olarak gösterilir. (C-F) İzleme dosyası analizinin sonuçları A,6.2'de "parametrelere göre gruplanmış" olarak gösterilir ve "hareketsizlik süresi" (C), "hız vektörü" (D), "zaman" (E) ve "mesafe" (F) ayrı ayrı gösterilir. Hareketsizlik süresi ve mesafesinin sonuçları "s" ve "piksel" olarak ölçülür. Hız vektörünün birimi "piksel/s" olarak tanımlanmalı ve "uzunluk" ek açıklamasıyla çıktı alınmalıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Fps başına hız için veri analizinin sonuçları. (A, C ve E) Dışa aktarma verileri, yatay ("C" sütunu) ve dikey ("D" sütunu) bölümlerdeki piksellerin koordinatlarının yanı sıra piksellerin hareketini, hareketsizliğini ve iki kare aralıkları arasındaki yön değişim açısını (sırasıyla A, C ve E'de "E" sütunu) içerir ve bu da bağlamda açıklanan formülle otomatik olarak hesaplanır. Fiji'den dışa aktarılan sonuçlar metin belgeleri olduğundan, dosyayı Microsoft Office Excel ile açmanız ve aralarına boşluk ekleyerek verileri üç sütuna bölmeniz önerilir. (B, D ve F) Çizgi grafik, piksellerin (B) hareketinin veri kümesinden hesaplanan sonuçları görüntüler. Global tepe değeri, hareket algılama yeteneklerinin göstergesi olan hızı temsil eder; sütun grafiği, hareketsizlik (D) veri kümesinden hesaplanan sonuçları görüntüler. Sütun grafiğindeki seyreklik derecesi, sineklerin motor yetenek kusurunu sergileyen hareketsizliği temsil eder; bir dağılım diyagramı, yön değişim açısının (F) veri kümesinden hesaplanan sonuçları görüntüler. Dağılım diyagramında gösterilen sıçramaların zenginleşmesi, sinek tarafından seçilen yönü temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 11: Rotenon ile veya rotenon olmadan tedavi edilen sinekler arasındaki hareketin karşılaştırmalı bir analizi. (A) 500 μM rotenon veya kontrol için DMSO içeren standart gıda ile beslenen W1118 yetişkin sineklerinin izleme izinin temsili grafikleri gösterilir. W1118 sinekler toplandı ve daha sonra 500 μM rotenon veya DMSO, 25 ° C ve% 60 nem içeren standart gıdalardan oluşan kontrollü bir ortama yerleştirildi. 48 saat sonra her gruptan analiz için altı sinek kullanıldı. Sonuç, rotenon ile beslenen izleme sineklerinin hareket mesafesinin, kontrolünkine kıyasla önemli ölçüde azaldığını ortaya koymaktadır. Sonuç, rotenon ile beslenen sineklerde kusurlu bir motor yeteneği gösterdi. (B-E) Rotenon tedavisinin kat edilen ortalama mesafe, hareketsizlik süresi, ortalama hız ve maksimum hız üzerindeki kantitatif analizi Fiji kullanılarak gerçekleştirilir. Rotenon tedavisinin sonuçları, kat edilen mesafe ve ortalama hızda anlamlı bir azalma ve hareketsizlik süresinde anlamlı bir artış göstermiştir. (F-K) Rotenon (G,I,K) veya DMSO (F,H,J) ile muamele edilen sinekler arasında kare başına piksel (F,G), kare başına hareketsizlik süresi (H,I) ve yön açısı değişikliklerinin (J,K) analizi. Rotenonun hareket hızı üzerindeki etkilerini gösteren örnek grafikler, rotenon (G) ile beslenen sineklerde kare aralığı başına hareket hızını temsil eden daha az tepe noktası gösterir ve kontroldekilere (F) kıyasla lokomotor aktivite kusurunun (F, G) ciddiyetini gösterir. Kare başına hareket eden piksellerin sezgisel hareketsizlik sütunu daha düşüktür ve kontrol sineklerine (H) kıyasla rotenon ile beslenen sinekler (I) için 1 dakika içinde önemli ölçüde daha az hareket gösterir. Rotenon ile beslenen (K) ve kontrol (J) hayvanlarındaki hareket açısı yön değişikliklerinin örnek grafikleri, sinekler tarafından seçilen yöndeki değişiklikleri ortaya koymaktadır. Veriler, 1 dakika boyunca izlenen altı erkek sineğin ortalama ± SEM'idir. Yıldız işaretleri gruplar arasında anlamlı farklılıklar gösterir (***p < 0.001; eşlenmemiş t-testi, p = 0.05). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 12: Rotenon ile veya rotenon olmadan tedavi edilen larvalar arasındaki hareketin karşılaştırmalı bir analizi. (A) Rotenon veya DMSO ile beslenen W1118 üçüncü instar larvalarının izini izleyerek lokomotor aktivitenin karşılaştırılmasının temsili sonuçları. Kısaca, W1118 üçüncü instar larvaları,% 10 sakaroz veya% 10 sakarozda 500 μM rotenon içeren% 10 sakarozda,% 60 nem oranına sahip 25 ° C'lik bir ortamda toplandı ve kültürlendi. Analiz için grup başına altı larva kullanıldı. Larvaların yavaş hareketi dikkate alındığında, rotenonun hareket üzerindeki etkilerini değerlendirmek için 5 dakikalık bir süre boyunca veri kaydı ölçülmüş ve analiz edilmiştir. (B-E) Fiji'de analiz edilen iki grubun ortalama mesafesi, hareketsizlik süresi, ortalama hızı ve maksimum hızı nicel olarak analiz edilmiştir. Kantitatif sonuçlar, rotenon ile beslenen larvalarda hareket mesafesinin, ortalama hızın ve maksimum hızın önemli ölçüde azaldığını ve rotenon ile beslenen larvalarda hareketsizlik süresinin önemli ölçüde arttığını göstermektedir. (F-K) Yetişkin sineklere benzer şekilde, kare başına piksellerin, hareketsizlik süresinin ve rotenon (G, I, K) ile tedavi edilen ve rotenon içermeyen (F , H , J) sinekler arasındaki yön açılarının analizi, rotenon ile tedavi edilen larvaların daha düşük hareket hızına, daha fazla hareketsizlik süresine sahip olduğunu ve yönlerini değiştirdiğini göstermiştir. Sonuçlar, rotenon ile beslenen larvaların izlenmesinin davranışsal hareketinin kontrole kıyasla önemli ölçüde bozulduğunu ortaya koymaktadır. Sonuçlar, rotenon ile beslenen sineklerin kusurlu bir lokomotor aktivitesini göstermektedir. Veriler, 5 dakika boyunca izlenen altı adet 3 günlük larvanın ortalama ± SEM'idir. Yıldız işaretleri gruplar arasında anlamlı bir fark olduğunu gösterir (*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; eşleşmemiş t-testi, p = 0.05). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Drosophila'daki lokomotor aktivitenin ölçülmesi için hayvan izlemeye dayalı metodolojilerin karşılaştırılması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fiji görüntü işleme programı ile uyumlu açık kaynaklı materyal AnimalTracker API'sine dayanarak, araştırmacıların hem yetişkin hem de bireysel larva sineklerini izleyerek lokomotor aktivitesini sistematik olarak değerlendirmelerini sağlayabilecek bir yöntem tasarladık. AnimalTracke , uygulama tarafından tasarlanan hayvan izleme davranışının analizini kolaylaştırmak için mevcut veritabanlarına veya diğer araçlara kolayca entegre edilebilen Java ile yazılmış bir araçtır24. Yetişkinlerin ve larvaların lokomotor aktivitesini ölçen bir yazılım hesaplama formülü ile kare kare analiz üzerine, hareket hızı, kat edilen mesafe, hareketsizlik ve yön açısı değişiklikleri dahil olmak üzere çeşitli parametreler esnek bir şekilde analiz edilebilir. Davranışsal hareketin farklı yönlerini temsil eden bu parametreler, zaman içindeki lokomotor değişiklikleri göstermek için çizilebilir. Ek olarak, grafiksel bir kullanıcı arayüzü oluşturarak, kullanımı hakkında ayrıntılı dokümantasyon sağlayarak ve bir uygulama programlama arayüzü sağlayarak, bu yöntemi programlama deneyimi olmayan araştırmacılar ve özel deneysel paradigmalar oluşturan deneyimli kullanıcılar için erişilebilir hale getirmeyi amaçlıyoruz.
Yöntemin davranışı doğru bir şekilde izleyebildiğini doğrulamak için, rotenon ile tedavi edilen yetişkin sineklerin ve larvaların lokomotor testinin yanı sıra, motor aktivitelerinin ilacın çözücüsü ile beslenen kontrol sineklerininkiyle karşılaştırılması gerçekleştirilmiştir. Fiji yazılımı, eklentileri ile birlikte, hareketin video kaydındaki her karenin piksel koordinatlarını analiz etmek için kullanılır ve deneysel sineklerin hızının, mesafesinin ve diğer parametrelerinin hesaplanmasına izin verir. Rotenon uygulamasında zaman içinde kat edilen mesafelerde anlamlı bir azalma gözlemledik (Şekil 11), bu da bildirilen sonuçlarla tutarlıdır23. Bu arada, yükselen hareket hızı ve seçilen anormal yön, sineklerdeki davranışsal eksikliğin daha fazla ayrıntısını göstermeye yardımcı olmak için ilaçla beslenen gruplarda gözlemlenmiştir. Yetişkin sineklerin lokomotor aktivitesini tespit etmedeki başarı göz önüne alındığında, larvaların hareketliliğini değerlendirmeye çalıştık (Şekil 12). Kontrol ile karşılaştırıldığında, rotenon ile beslenen izleme larvalarının sonuçları, ilaçlarla beslenen yetişkin sineklerinkine paralel olarak, önemli ölçüde bozulmuştur. Rotenon ile beslenen yetişkinler ve larvalarla yapılan deneyler, bu yöntemin kontrollere kıyasla lokomotor eksiklikler üreten sineklerin azalmasını doğru bir şekilde kaydedebileceğini düşündürmektedir. Bu rapor, meyve sineklerinin lokomotor yeteneklerini ve davranış kusurlarının diğer yönlerini ölçmede ve analiz etmede mevcut yöntemin test modellerinde veya hayvanlarda farmakolojik araştırmalarda başarılı bir şekilde uygulandığını göstermiştir.
Video ve izleme analizinin başarılı ve tekrarlanabilir sonuçlar vermesini sağlamak için aşağıdaki yönergelere uyulması önerilir. İlk olarak, video kare hızı seçimi için, kaydedilen videoyu saniyede 15 kare (fps) formatına dönüştürmenizi öneririz. Bu sadece iyi hareket izlemeyi korumakla kalmaz, aynı zamanda büyük miktarda verinin neden olduğu bilgisayar analizinin yavaşlığını da önler. Video kare hızını artırarak, hareket yörüngesi analizi daha ayrıntılı hale gelir. İkincisi, formüldeki parametreler, her iki kare arasındaki statik hareketi analiz ederken ilgili deneysel şemaya uyacak şekilde de ayarlanabilir. Larva lokomotor izlemesi için, katılaşmış silika jel sıkı olduğundan ve larvalar içine giremediğinden, agar yerine silika jel kullanmak esastır. Dahası, silika jel şeffaftır ve optimum arka plan oluşturmak için renk maddesi eklenerek boyanabilir, bu da görüntü kalitesini artıran istenen optik efektleri kolaylaştırır.
Hayvan izleme sistemleri, etiyoloji, sinirbilim ve davranışsal genetik toplulukları için kapsamlı çözümler sunmak üzere geliştirilmektedir. Tablo 1, şu anda mevcut olan birden çok izleme programının özelliklerinin bir karşılaştırmasını sağlar: 10,11,12,16,17,25,26. Bu yaklaşım son derece uygun maliyetlidir, öğrenmesi kolaydır ve maliyetli yazılım ve ekipman gerektirmeden lokomotor davranışını ölçmede hassastır. Hiç şüphe yok ki, bu yöntem diğer Drosophila benzeri hayvan modellerine ve hatta sıçanlar ve fareler gibi daha büyük hayvanlara bile uygun bir şekilde genişletilebilir. AnimalTracker API'sinin yapısı, bağımsız ImageJ uygulamaları veya eklentileri aracılığıyla kolaylıkla genişletilebilir ve özel davranış araştırması ve analizi için çok çeşitli kullanışlı araç setleri sunar24. Bununla birlikte, bu çalışmanın bazı kısıtlamaları vardır. Görüntü kaydı için açık alan arenasına tek bir sinek yerleştirildiğinden ve video izleme ayrı ayrı yapıldığından, bu yöntem verimsiz ve zaman alıcıdır. Aynı anda birden fazla arenayı kaydetme kapasitesini genişletmeye çalıştık ve altı adede kadar bireysel kayda izin verdik. Aynı anda daha fazla sayıda Drosophila'yı kaydetmek teorik olarak mümkündür; Bu, arenanın boyutuna ve kameranın yapılandırmasına bağlıdır. Alternatif olarak, kullanıcılar gruplandırılmış Drosophila kaydına genişletmek isterlerse, sınırlı sayıda tek kaydı ve sinekler arasındaki çarpışmaları ve örtüşmeleri tanımlamak için yeterli kalitede bir yapılandırmayı göz önünde bulundurmaları önerilir. Makine öğrenimi ile test verimliliğindeki iyileştirmeler çalışmada dikkate alınmamıştır, çünkü kimlikleri görsel olarak ayırt etmek ve modelleri doğru bir şekilde izlemek için mevcut sistemle entegre edilebilecek uygun fiyatlı ve uyumlu bir yaklaşım bulunamamıştır.
Özetle, burada açıklanan yöntem, zaman tüketimini azaltmak ve larva ve yetişkin aşamalarında Drosophila hareketini nicel olarak göstermek ve analiz etmek için deneysel teknikleri rafine etmek için tasarlanmış ücretsiz, açık kaynaklı yazılıma dayanan verimli ve basit bir yaklaşım geliştirir ve doğrular. Sistematik analiz yoluyla, bu yöntem, hayvanın hızının hareket sırasında zaman içinde nasıl değiştiğini ve yön seçiminin özelliklerini anlamamıza yardımcı olabilir. Bu nedenle, açık kaynaklı yazılımın yaygın olarak kullanılan dijital cihazlara dahil edilmesi, çeşitli sinek modellerinde lokomotor aktivitesini test etmek için güvenilir bir yol sağlar. Bu, Drosophila'da ve diğer hayvanlarda farmakolojik tedavi ve transgenik modifikasyondan türetilen nörodejeneratif hastalık modellerinin test edilmesinde fizyolojik ve patolojik lokomotor çıktıların değerlendirilmesinde yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Soochow Üniversitesi ve Çin Ulusal Bilim Vakfı'ndan (NSFC) (82171414) özel bir lansman fonu tarafından desteklendi. Prof. Chunfeng Liu'nun laboratuvar üyelerine tartışmaları ve yorumları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal tracker | Hungarian Brain Research Program | version: 1.7 | pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads |
| Camera software | Microsoft | version: 2021.105.10.0 | built-in windows 10 system |
| Computer | DELL | Vostro-14-5480 | a comupter running win 10 system is available |
| Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation | Wu han Yihong technology | #YHDFPCO2-018 | official website: http://www.yhkjwh.com/ |
| Fiji software | Fiji team | version: 1.53v | official website: https://fiji.sc/ |
| Format factory software | Pcfreetime | version: X64 5.4.5 | official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html |
| Graph pad prism | GraphPad Software | version: 8.0.2 | official website: https://www.graphpad-prism.cn |
| Hight definition camera | TTQ | Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) | official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35 |
| Office software | Microsoft | version: office 2019 | official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office |
| Petri dish | Bkman | 110301003 | size: 60 mm |
| Silica gel | DOW | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Mix well according to the instructions |
| Sodium bicarbonate | Macklin | #144-55-8 | Mix well with silica gel |
References
- Ham, S. J., et al. Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson's disease by suppressing glycolysis. Science Advances. 7 (28), (2021).
- Algarve, T. D., Assmann, C. E., Aigaki, T., da Cruz, I. B. M. Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster. Drug and Chemical Toxicology. 43 (3), 255-265 (2020).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Gerontology. 46 (5), 320-325 (2011).
- Yamaguchi, M., Yoshida, H. Drosophila as a model organism. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 1-10 (2018).
- Rothenfluh, A., Heberlein, U. Drugs, files, and videotape: the effects of ethanol and cocaine on Drosophila locomotion. Current Opinion in Neurobiology. 12 (6), 639-645 (2002).
- Tsuda, L., Lim, Y. M. Alzheimer's disease model system using Drosophila. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 25-40 (2018).
- Dung, V. M., Thao, D. T. P.
- Liguori, F., Amadio, S., Volonte, C. Fly for ALS: Drosophila modeling on the route to amyotrophic lateral sclerosis modifiers. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (17-18), 6143-6160 (2021).
- Cao, W., et al. An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (127), 56507 (2017).
- Eidhof, I., et al. High-throughput analysis of locomotor behavior in the Drosophila island assay. Journal of Visualized Experiments. (129), 55892 (2017).
- Scaplen, K. M., et al. Automated real-time quantification of group locomotor activity in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 9 (1), 4427 (2019).
- Werkhoven, Z., Rohrsen, C., Qin, C., Brembs, B., de Bivort, B. MARGO (Massively Automated Real-time GUI for Object-tracking), a platform for high-throughput ethology. PLoS One. 14 (11), e0224243 (2019).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
- Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).
- McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor. Journal of Visualized Experiments. 98, e52684 (2015).
- Walter, T., Couzin, I. D. TRex, a fast multi-animal tracking system with markerless identification, and 2D estimation of posture and visual fields. eLife. 10, (2021).
- Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 15 (7), e2002702 (2017).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Xiao, G. Methods to assay the behavior of Drosophila melanogaster for toxicity study. Methods in Molecular Biology. 2326, 47-54 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Johnson, M. E., Bobrovskaya, L. An update on the rotenone models of Parkinson's disease: their ability to reproduce the features of clinical disease and model gene-environment interactions. Neurotoxicology. 46, 101-116 (2015).
- Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. The Journal of Neuroscience. 24 (48), 10993-10998 (2004).
- Kumar, P. P., Bawani, S. S., Anandhi, D. U., Prashanth, K. V. H. Rotenone mediated developmental toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Toxicology and Pharmacology. 93, 103892 (2022).
- Gulyas, M., Bencsik, N., Pusztai, S., Liliom, H., Schlett, K. AnimalTracker: an ImageJ-based tracking API to create a customized behaviour analyser program. Neuroinformatics. 14 (4), 479-481 (2016).
- Qu, S. EasyFlyTracker: a simple video tracking Python package for analyzing adult Drosophila locomotor and sleep activity to facilitate revealing the effect of psychiatric drugs. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 15, 809665 (2022).
- Yarwais, Z. H., Najmalddin, H. O., Omar, Z. J., Mohammed, S. A. Automated data collection of Drosophila movement behaviour assays using computer vision in Python. International Journal of Innovative Approaches in Science Research. 4 (1), 15-22 (2020).
