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Medicine

使用银纳米颗粒改善小鼠骨关节炎

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65111

Yuan Sang*¹, Junbin Zhang*¹, Chang Liu¹, Kaihua Liu¹, Hui Yao¹, Huiqing Zhao¹, Wenbin Xu¹, Yichun Xu¹, Gang Hou¹

¹Department of Orthopedics, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University

* These authors contributed equally

Summary

这里介绍的是一种利用银纳米颗粒有效改善II型胶原酶诱导的骨关节炎小鼠急性症状的方案，包括滑膜炎症、滑膜增生、血管增生等。

Abstract

膝骨关节炎（KOA）是 45 岁以上人群中最常见的关节退行性疾病之一。目前尚无针对KOA的有效治疗方法，唯一的终点策略是全膝关节置换术（TKA）;因此，KOA与经济负担和社会成本有关。免疫炎症反应与KOA的发生和发展有关。我们之前使用II型胶原建立了KOA的小鼠模型。模型中存在滑膜组织增生，以及大量浸润的炎症细胞。银纳米颗粒具有显著的抗炎作用，已广泛用于肿瘤治疗和手术给药。因此，我们在胶原酶II诱导的KOA模型中评估了银纳米颗粒的治疗效果。实验结果表明，银纳米颗粒显著降低了滑膜增生和滑膜组织中中性粒细胞的浸润。因此，本工作证明了一种新的OA策略的识别，并为阻止KOA的进展提供了理论基础。

Introduction

膝骨关节炎（KOA）是最常见的骨关节炎形式之一，涉及整个滑膜关节的复杂疾病过程¹。随着世界人口逐渐老龄化，KOA的发病率正在大幅增加。膝关节持续疼痛通常会促使 KOA 患者就医。KOA 疼痛的病因可能与炎症反应、滑膜增生和软骨变性有关²。滑膜组织由两种类型的细胞组成：滑膜成纤维细胞和巨噬细胞^3,4,5。滑膜成纤维细胞产生滑液。滑膜巨噬细胞通常处于休眠状态，并被炎症反应激活。滑膜的初始炎症会导致膝关节疼痛⁶.

滑膜组织炎症免疫反应在KOA的发病机制中起着至关重要的作用。既往研究证实，KOA的滑膜组织存在炎症反应，称为滑膜炎，KOA的滑膜炎程度与滑膜组织的炎性细胞浸润密切相关^7,8,9。滑膜炎是滑膜的炎症反应，其病理特征是滑膜细胞增殖，新血管形成和炎症细胞浸润^5,10,11。

KOA治疗的目标是缓解滑膜的炎症反应并延缓疾病的进展。目前，治疗KOA的主要临床药物是非甾体抗炎药（NSAIDs）;然而，它们表现出显着的副作用，例如肾毒性^12,13。关节内注射糖皮质激素是治疗KOA的另一种选择;然而，糖皮质激素扩散迅速，并可能被关节积液迅速代谢。同时，有潜在高血糖症的糖尿病患者应谨慎对待正在进行的类固醇注射¹⁴.总之，目前尚无针对KOA的药物治疗策略。因此，探索治疗KOA的新药极为迫切。

银纳米颗粒的尺寸小于 100 nm。由于其突出的抗炎、抗菌和抗氧化作用，它们已被广泛用于医疗保健和医学的各个方面，例如伤口愈合和烧伤^15,16。它们还用于靶向药物递送、医学成像和分子诊断¹⁷。银（Ag）比其他金属纳米颗粒（如铜（Cu）、锌（Zn）和铁（Fe）^）15 具有更大的抗炎和抗菌作用。银纳米颗粒是一种新型纳米材料，具有广谱和有效的抗菌性能。先前的一项研究发现，在烧伤和腹膜炎模型^18,19中，银纳米颗粒可以有效抑制炎症因子的产生并促进伤口愈合。之前的一项研究还表明，银纳米颗粒通过促进生长因子的合成和胶原沉积来改善糖尿病伤口的愈合²⁰。

基于银纳米颗粒的抗炎作用，我们旨在使用银纳米颗粒治疗小鼠II型胶原诱导的KOA。结果表明，通过这种治疗，小鼠滑膜关节的炎症浸润细胞数量显着减少。研究结果还表明，银纳米颗粒可以显著缓解小鼠KOA的症状。因此，银纳米颗粒的应用可能支持临床KOA新治疗方案的开发。

Protocol

所有动物工作均获得广州永生医学实验动物中心动物伦理与福利委员会（AEWC）的批准（2018-0186）。

1. KOA小鼠模型的建立

将BALB / c小鼠（18-24g;12-14周龄）维持在70%湿度和26°C的环境中，光/暗循环为12小时。在这项实验中，这些动物被饲养在广州永生医学实验动物中心。
如前所述，使用II型胶原建立KOA小鼠模型²¹。如下所述进行关节内注射。
1. 麻醉时使用2%戊巴比妥钠（40mg / kg），镇痛时使用丁丙诺啡（0.05mg / kg，皮下注射）。然后，用胶带固定鼠标四肢，用剃须刀去除毛发，用0.1%碘磷和酒精交替擦洗消毒三次。
2. 戴上无菌手套，并使用无菌剪刀依次暴露皮肤、皮下组织和髌下韧带。将切口区域保持在 0.5 厘米以下。
  注意：在操作过程中使用加热毯来维持小鼠的体温。
3. 使用 1 mL 胰岛素注射器将 10 U 的 30 mg/kg （0.4 mg/mL） II 型胶原酶注射到关节腔（髌下韧带下方）²²。
  注意：针头与皮肤之间的角度应约为 15°;然后，应该改变针的方向，并完全撤回针头。
4. 注射后，先缝合皮下组织，再缝合皮肤。用0.1%碘溶剂对缝合区域进行消毒。将小鼠从麻醉中醒来后，将小鼠分别放入单独通气的笼子（IVC）中。

2. 纳米银颗粒的合成

注：银纳米颗粒的制备在前面已经详细描述^过19。整个配制过程都是在冰上进行的。制备后，将混合物储存在4°C;否则，混合物在室温下很容易凝固。

将总共 400 μL I 型胶原蛋白（4 mg/mL）加入 1.5 mL 微量离心管中，然后放在冰上。
向上述胶原蛋白中加入总共200μL磷酸盐缓冲盐水（PBS），将溶液充分混合，然后放在冰上。
最后，在上述溶液中加入400μL纳米银颗粒，然后充分混合。纳米颗粒溶液的最终浓度为1mM。
注：银纳米颗粒的平均直径范围为 5 nm 至 15 nm²³。电子显微镜证实了这一点。

3. II型胶原酶诱导的KOA小鼠的银纳米颗粒处理

1周后从笼子中取出II型胶原酶诱导的KOA小鼠，并注射银纳米颗粒。每周注射一次银纳米颗粒，并在30天后收集标本。
通过腹腔注射注射总共2%戊巴比妥钠（剂量：2mL / kg）进行麻醉，然后按照步骤1.2所述固定，准备皮肤并消毒。
戴上无菌手套，并使用无菌剪刀依次暴露皮肤、皮下组织和膝关节韧带。
使用 1 mL 胰岛素注射器，与针头成 15° 角进入关节腔。缓慢注入约20μL的银纳米颗粒胶原蛋白混合物，并缓慢抽出针^头24。
依次缝合皮下组织和皮肤，并消毒。将小鼠从麻醉中醒来后分别放入单独通风的笼子（IVC）中。
以每周一次的频率进行银纳米颗粒胶原蛋白混合物（20μL）的注射四次。
注意：用银纳米颗粒胶原蛋白混合物处理的小鼠应保存在单独的笼子中。当它们保持在一起时，可能会发生老鼠打架，这会影响实验结果。在注射过程中，当针头到达关节腔时会有紧张感，注射后膝关节会出现肿胀。这两种方法的结合使研究人员能够确保药物已成功注射到膝关节中。

4.膝关节和滑膜组织的收集

用二氧化碳窒息或相关动物伦理委员会批准的任何其他方案处死小鼠。
依次对皮肤和皮下组织进行消毒和解剖，并充分暴露膝关节。
摘取膝关节，包括股骨和胫骨，并去除肌肉组织。
将膝关节组织（包括股骨、胫骨和周围的软组织（韧带和荚膜））收集在 10% 福尔马林中以保存和固定。

5. 苏木精-伊红染色

固定过夜后，将切片用石蜡包埋，并使用切片机将石蜡包埋的组织切成0.4μm厚。使用准备好的切片进行进一步染色（苏木精-伊红染色、Safranin O/Fast Green 和免疫组织化学（IHC）染色）。
用二甲苯将切片脱蜡两次，依次浸泡在100%、95%、80%和70%乙醇中，每次浸泡5分钟，然后再水化。
用苏木精（0.1g/100mL）染色切片5分钟，然后直接放入1%HCl中10秒，伊红（0.5g/100mL）1分钟。
在显微镜下观察滑膜的组织病理学变化。

6. 番红 O/Fast Green

将组织嵌入石蜡中，并按照步骤5.1中的描述准备组织学切片。
用二甲苯将切片脱蜡两次，并用乙醇系列（如100%、95%、80%和70%乙醇在蒸馏水中，各5分钟）再水化。
用苏木精染色准备好的部分，并用PBS洗涤三次，每次2分钟。
用盐酸醇区分切片，并用PBS洗涤3次，每次2分钟。
将切片浸入0.02%Fast Green染色溶液中5-10分钟，然后用0.1%Safranin O染色1-2分钟。
用1%乙酸区分切片，然后进行PBS洗涤。
检测和分析切片中的纤维软骨形成。

7. 免疫组化（IHC）染色

将组织包埋在石蜡中，并按照步骤5.1中的描述准备组织学切片。
用二甲苯将切片脱蜡两次，并用乙醇系列（如100%、95%、80%和70%乙醇在蒸馏水中，各5分钟）再水化。将切片浸入Tris-EDTA缓冲液（10mM Tris碱，1mM EDTA溶液;pH 9.0）中，并在95°C的微波炉中加热10分钟以进行抗原修复。
将切片暴露于3%过氧化氢溶液中10分钟以除去内源性过氧化物酶。
用 5% 山羊血清处理切片以阻断非特异性结合。
加入针对CD177的稀释一抗（1：1,000稀释度），并在4°C下孵育过夜。然后，用PBS清洗切片三次。
用PBS浸泡切片，并在室温下用适当的二抗（HRP偶联聚合物抗兔系统）孵育切片30分钟。
使用3,3'-二氨基联苯胺（DAB）作为显色剂进行IHC染色的可视化。
在显微镜下查看切片，并分析采集的图像。

Representative Results

使用II型胶原酶诱导KOA小鼠模型。从模型诱导后1周开始，将制备的银纳米颗粒胶原混合物每周注射一次到关节腔中，持续4周（图1）。每天观察并记录每组小鼠的体重。结果显示，KOA小鼠的平均体重显著低于正常对照组小鼠。然而，与KOA小鼠相比，II型胶原酶+ AgNPs组小鼠的平均体重更高，尽管这种差异没有统计学意义（图2）。30天后，收集小鼠膝关节滑膜组织并进行病理检查。分析增生、血管增生、滑膜炎浸润和软骨损伤5,10,11。结果显示，KOA组小鼠滑膜厚度明显高于正常对照组。在用银纳米颗粒胶原混合物处理的组中，与KOA组相比，滑膜厚度减小（图3）。与正常对照组相比，KOA小鼠的滑膜存在血管增生，并且用银纳米颗粒胶原混合物处理的小鼠滑膜中的血管增生显着减少（图4）。Safranin-O染色结果显示，KOA小鼠的软骨基质被破坏，而用银纳米颗粒胶原混合物处理的小鼠显示出明显更好的软骨基质（图5）。如前所述评估每组的形态学特征评分²².结果如下：盐水组为0±0，II型胶原组为7±0.63，II型胶原酶+AgNPs组为4.2±1.17（图6）。CD177 是一种主要的中性粒细胞标志物²⁵。在正常条件下，CD177在40%-60%的中性粒细胞中表达。然而，在急性炎症期间，中性粒细胞中CD177的表达显着增加。IHC染色结果显示，与KOA组相比，AgNPs治疗组滑膜区浸润的中性粒细胞显著减少（图7），这表明AgNPs治疗可以改善KOA的症状。

图 1：注射位置。 （A）II型胶原酶注射的代表性图像。（B）II型胶原酶注射后的代表性图像。（C）KOA小鼠模型中银纳米颗粒胶原混合物注射的代表性图像。（D）KOA模型小鼠注射银纳米颗粒胶原混合物后的代表性图像。红色虚线表示平行于小鼠膝关节韧带的线。黑色箭头表示胰岛素注射器针头与皮肤之间的角度。请点击这里查看此图的较大版本.

图2：每组小鼠的体重变化。该面板显示了每组小鼠在不同时间点的平均体重;x轴表示注射II型胶原酶后的天数，y轴表示体重的倍数变化。生理盐水组（n = 7），II型胶原酶组（n = 5），II型胶原酶+ AgNPs组（n = 5）。*p < 0.05。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3：代表滑膜增生的苏木精-伊红（H&E）染色。 术后30 d收集、固定、切片、H&E染色各组小鼠的滑膜组织。双箭头表示检测到的滑膜厚度。比例尺 = 0.1 毫米。请点击这里查看此图的较大版本.

图4：滑膜周围血管增生的代表性图像。 箭头表示船只。比例尺 = 0.05 毫米。请点击这里查看此图的较大版本.

图5：每组小鼠膝关节的番红素-O染色。比例尺 = 0.2 毫米。请点击这里查看此图的较大版本.

图6：每组的形态特征评分。利用滑膜组织测量每组小鼠的形态特征评分。选取每组5个组织切片，分析滑膜内膜细胞层增生/增大程度、滑膜组织中性粒细胞浸润程度、滑膜基质活化程度（表1）。平均值用作最终分数。**p < 0.01 和 ***p < 0.001，与未经治疗的 KOA 组相比，每个队列都有学生 t 检验。请点击这里查看此图的较大版本.

图7：每组小鼠滑膜组织中中性粒细胞标志物的免疫组织化学染色。免疫组化染色检测中性粒细胞标志物CD177在各组小鼠滑膜组织中的表达。箭头表示中性粒细胞。比例尺 = 100 μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

表1：评分形态特征。请按此下载此表格。

Discussion

银纳米颗粒具有抗炎、抗菌、抗氧化和免疫调节作用，这意味着它们可以通过减少活性氧的产生来保护细胞和组织免受损害²⁶。一些研究人员担心银纳米颗粒的毒性²⁷。银纳米颗粒的毒性与游离银离子的存在直接相关。由于银纳米颗粒的纳米级尺寸，它们很容易干扰生物分子、细胞和人体器官15,28,29。一些研究报告说，银纳米颗粒可以诱导氧化应激并损害人体细胞中的线粒体功能³⁰。此外，使用大量银纳米颗粒后，可以在人体器官中检测到Ag，特别是在肝脏和脾脏中。研究人员还报告说，银纳米颗粒具有通过跨突触运输穿过血脑屏障并在大脑中积累^的能力31。尽管一些研究人员承认银纳米颗粒的安全性，但尚未进行银纳米颗粒生物毒性的系统报告³²。

在这项研究中，我们制备了一种银纳米颗粒胶原蛋白混合物。事实上，银纳米颗粒在人体组织中的持续时间很短，但是当与胶原蛋白混合物一起应用时，银纳米颗粒的持续时间可以延长;这不仅减少了创伤，还减少了药物的剂量。考虑到银纳米颗粒的毒性，本研究中应用的银纳米颗粒剂量为30 mg/kg，与之前的研究^一致33。

实验操作的几个重要考虑因素如下。II型胶原酶在制备后应储存在-20°C，以防止由于酶裂解而降解。银纳米颗粒胶原混合物的制备必须在室温下在冰上连续进行，因为银纳米颗粒胶原混合物会迅速变成半固体凝胶，然后不能用于注射。制备后溶液应储存在4°C。关节内给药应选择针头较小的1 mL胰岛素注射器，这样可以有效防止注射药物的泄漏。针头应以 15° 的角度插入以注射银纳米颗粒胶原蛋白混合物。当针头没有抵抗力时，这表明针头已经到达膝关节腔。注射后应改变注射角度，缓慢抽出针头，避免注射药物泄漏。

在这项研究中，银纳米颗粒有效改善了小鼠II型胶原酶诱导的KOA症状，证明了银纳米颗粒的抗炎作用。几项研究报道了在体外用银纳米颗粒孵育的细胞中存在细胞凋亡 34,35,36。滑膜增生的减少可能是由银纳米颗粒引起的，因为它们参与线粒体功能的损害，或者这些结果可能是由活性氧介导的。在KOA模型组小鼠的滑膜中观察到血管增生。在此过程中，趋化因子可能将中性粒细胞从血管驱赶到滑膜组织，并且炎症的爆发导致细胞消耗更多的氧气，从而导致血管增生。因此，需要进一步的实验来证明这一假设的可靠性。本研究为临床KOA的治疗研究提供了理论上的益处。在未来的研究中，我们的目标是将前交叉韧带（ACL）方法与化学诱导的KOA模型方法相结合，以观察银纳米颗粒的效果。实验结果表明，银纳米颗粒可以显著降低KOA小鼠滑膜中炎症细胞的浸润，但这种作用的机制仍有待进一步研究，这可能揭示KOA的发病机制。

Disclosures

作者没有需要披露的利益冲突。

Acknowledgments

本研究由广东省自然科学基金（编号：2019A1515010209）和广州市科技项目（编号：202102010164）资助。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL insulin syringe	BD	305932	None
CD177 Polyclonal Antibody	ThermoFisher Scientific	PA5-98759	None
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	302-17-0	None
DAB	MCE	HY-15912	None
Eosin	Beyotime Biotechnology	C0109	None
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	None
Hematoxylin	Beyotime Biotechnology	C0107	None
Light Microscopy	Leica	DM500	None
Silver nanoparticle	Wolcacvi	S-10-20	Store product in the dark at 4°C
Safranine O-Fast Green FCF Cartilage Stain Kit	Solarbio	90-15-3	None
Type II collagen	Sigma-Aldrich	C6885-500mg	None