Summary
通过静脉注射微泡和应用低强度聚焦超声 （LIFU），可以成功实现血脊髓屏障 （BSCB） 的破坏。该协议详细介绍了在啮齿动物模型中使用LIFU打开BSCB，包括设备设置，微气泡注入，目标定位和BSCB破坏可视化。
Abstract
低强度聚焦超声 （LIFU） 使用比超声强度更低的超声脉动，并且正在作为一种可逆和精确的神经调节技术进行测试。尽管已经详细探索了 LIFU 介导的血脑屏障 （BBB） 开放，但迄今为止尚未建立血脊髓屏障 （BSCB） 开放的标准化技术。因此，该协议提出了一种在大鼠模型中使用LIFU超声处理成功破坏BSCB的方法，包括动物制备，微泡给药，靶标选择和定位的描述，以及BSCB破坏的可视化和确认。这里报道的方法对于需要一种快速且具有成本效益的方法的研究人员特别有用，这些研究人员需要一种快速且具有成本效益的方法，以使用聚焦超声换能器测试和确认小动物模型中的靶标定位和精确的BSCB破坏，评估超声处理参数的BSCB功效，或探索LIFU在脊髓中的应用，例如药物递送， 免疫调节和神经调控。建议针对个人使用优化此方案，特别是用于推进未来的临床前、临床和转化工作。
Introduction
与血脑屏障 （BBB） 类似，血脊髓屏障 （BSCB） 调节循环溶质、细胞和血浆成分进入脊髓实质的运动 1。这种保护特征是脊髓毛细血管内衬紧密结合的非开窗内皮细胞的特殊系统的结果2.通常，只有带正电荷的低重量亲脂性分子才能穿过两个屏障3。尽管研究表明 BSCB 的通透性略高于 BBB，但这两种障碍都限制了向中枢神经系统提供治疗药物4.已经开发了几种策略来增加药物在 BSCB 中的运输，包括增加脊髓毛细血管渗透压的技术、开发与缓激肽受体相互作用的药物以及创建功能化纳米颗粒5。
BSCB 破坏也可以通过静脉注射微泡 （MB） 然后进行低强度聚焦超声 （LIFU） 超声处理来实现6。超声换能器产生的声场引起MB振荡，进而对内皮壁施加应力并松动紧密连接7。紧密连接松动在毛细血管中产生短暂的间隙，使治疗药物能够渗透到脊髓实质中（图1）。该过程还可以产生跨内皮开窗，增加转胞吞作用，并下调 ATP 结合盒转运蛋白，例如 P-糖蛋白 8,9。该技术的一个主要优点是能够通过将超声处理的焦点区域引导到脊髓中感兴趣的位置来最大限度地减少脱靶效应。几项临床试验研究了 LIFU 介导的 BBB 开放治疗中枢神经系统病变的疗效，包括神经胶质瘤、肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病和帕金森病。尽管 LIFU 介导的 BSCB 破坏不像 LIFU 介导的 BBB 破坏那样广泛，但一些小组已经报告了在啮齿动物、兔子和猪模型中成功的 BSCB 破坏10、11、12。总体而言，人们对该技术的兴趣正在迅速增长，特别是作为药物递送的可行途径。
在该协议中，描述了一种在大鼠模型中LIFU介导的BSCB破坏的技术。该过程包括动物制备、LIFU 设备设置、MB 管理、靶标定位和脊髓摘除的详细说明。通过埃文斯蓝染料 （EBD） 外渗到脊髓中评估靶定位和 BSCB 破坏的确认。EBD 是一种与血清白蛋白结合的无毒化合物，在显微镜下可以通过其丰富的蓝色和红色自发荧光来识别13。
这里列出的步骤为传统的超声 （US） 或磁共振 （MR） 引导的 LIFU 系统提供了一种快速且廉价的替代方案。因此，这种方法对于有兴趣在获得其他设备和材料或在脊髓中追求LIFU应用（如药物递送，免疫调节和神经调控）之前快速测试和确认其LIFU换能器的靶向和BSCB破坏能力的研究人员非常有用。
Protocol
所有动物研究均根据约翰霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会（IACUC RA20M223）的批准和进行。本研究仅使用成年Sprague-Dawley雌性大鼠（平均体重：250g;年龄：11周）。
1. 低强度聚焦超声组装和设置
- 获得一个聚焦的超声换能器系统，其规格足以在大鼠中实现BSCB开放。文献中建议的参数包括 0.25-4 MHz 之间的中心频率和产生 0.2-2.1 MPa 10、14、15、16、17 之间峰值压力的能力。确保系统包括驱动/控制设备，其中至少包括波/信号发生器、射频 （RF） 驱动器/功率放大器和匹配网络（图 2A）。
注意：此处描述的设置使用市售的多元件换能器，中心频率为 250 kHz，直径为 64 mm（图 2B）。 - 将3D打印的探头支架和水锥固定在换能器上（图2C）。确保锥体和换能器之间的防水密封。
注意：本实验中使用的换能器随附一个定制的锥体和探头支架。锥体和探头支架用螺钉固定在传感器上，螺钉也提供。 - 对 50 μm 厚的透声聚酯膜进行消毒，并使用橡皮筋固定在水锥底部。
- 使用进水管和出水管用脱气和去离子水填充水锥。注意避免锥体内有气泡，因为它们会破坏换能器和目标之间的声耦合。聚酯膜应略微膨胀。
注意： 要去除锥体中的气泡，请将气泡引导到出口阀，同时通过进水阀向锥体注水。如果存在许多小气泡，请关闭所有阀门并旋转锥体，直到留下一个大气泡。将此气泡引导至出口阀并继续填充锥体。 - 将驱动设备（包括波发生器和射频驱动放大器）连接到换能器。换能器电缆将连接到匹配网络的输出侧，信号发生器/功率放大器将连接到匹配网络的输入侧。电缆应连接到相应的通道号（图 2D-G）。
注：在本研究中使用的商业系统中，波发生器和射频驱动放大器是换能器功率输出（TPO）的组成部分（图2D）。 - 将探头支架连接到立体定向臂上。将立体定向臂固定在固定板组件上。这将允许在超声处理过程中将换能器精确定位在啮齿动物上方。
2. 动物准备和手术椎板切除术
- 在连接到木炭过滤罐的诱导室中用异氟醚和医用空气的混合物麻醉大鼠。将气体流速设置为 400 mL/min，将异氟烷汽化器设置为 1.5%-2.5% 之间进行麻醉诱导。在完全镇静之前在腔室中花费的时间是可变的，尽管通常在 3-6 分钟之间。
- 记录镇静大鼠的体重并进行脚趾捏试验。如果观察到对捏合做出反应的抽搐或运动，则将大鼠放回诱导室内再放置1分钟，并重复脚趾捏合试验。必要时重复以确保大鼠处于并保持完全麻醉状态。
- 将加热垫和无菌吸收垫放在固定板上。将大鼠放在吸收垫上，涂抹眼药膏，并放置直肠温度计以监测体温。
注意：在手术过程中，应监测大鼠的体温和心率（理想情况下，心率应在 330-480 bpm 之间，温度应在 35.9-37.5 °C 之间）18,19。相应地调整异氟烷或加热垫，以防止过早死亡。加热垫的温度可以设置为37°C左右，应根据需要打开和关闭，以保持最佳体温。 - 触诊大鼠的最后一根肋骨，该肋骨附着在第13胸 椎（T13）的脊柱上。使用电动剃须刀剃掉最后一根肋骨和颈部之间背部表面的毛发。用蘸有10%碘泊酮的纱布擦拭裸露的皮肤。
- 使用虹膜剪刀创建一个中线切口，并解剖筋膜，直到暴露棘突和椎板。用偏置骨钳和倾斜的刀片虹膜剪刀去除骨头，直到脊髓暴露20.椎板切除术和切口的长度根据要超声处理的不同靶标的数量而变化。在这项研究中，使用 3 cm 切口进行了三节段椎板切除术。
注意： 移除骨头时避免触摸脊髓或对脊髓施加压力，以防止受伤。如果大鼠的后肢在椎板切除术期间抽搐，则对脊髓或神经根施加了过多的力。 - 通过夹紧与椎板切除术相邻的棘突将大鼠固定在固定板上。在锁定夹子之前，轻轻拉紧脊柱以尽量减少曲率。
3. 使用激光制导进行目标定位
- 用立体定向臂调整换能器的位置，直到它位于椎板切除术的正上方（图3A）。该框架允许在 x、y 和 z 轴上移动，以及在垂直平面上旋转 180°，在水平面上旋转 360°。
- 将激光设备固定在水锥底部并降低，直到看到激光点。调整换能器的横向位置，直到激光点高于BSCB破坏目标的位置（图3B，C）。
注意：激光设备的计算机辅助设计 （CAD） 文件包含在补充部分（补充图 1）中。 - 移除激光装置并用脱气超声凝胶填充锥体和脊髓之间的空间（图3D）。为了获得最大的偶联性，请确保凝胶中不存在气泡。
注意：在这项研究中，将带有固定水锥的换能器降低，直到位于绳索上方 1 厘米处。由于水锥的长度为 30 mm，因此从换能器到绳索的总距离为 40 mm。将水锥放置在距离脊髓 1 厘米处，因为切口两侧的大鼠皮肤、筋膜和肌肉组织阻止了锥体尖端和脊髓之间的直接接触。使用立体定向臂 y 轴上的数字可能有助于跟踪锥体与绳索距离 1 cm 的垂直距离，特别是因为凝胶会使视锥体与绳索的距离难以视觉确认。 - 在 TPO 上设置超声处理参数。一系列值可用于实现成功的 BSCB 中断。为了获得最大功率，将超声处理频率设置在靠近换能器中心频率的位置。本研究中使用的值列于 表1中。
注：此处列出的参数改编自 LIFU 之前的工作，中心频率为 500 kHz，音突发持续时间为 500 μs，占空比为 50%，超声处理时间为 5 或 10 分钟，以安全地神经调节啮齿动物脊髓21。根据成功实现 BSCB 破坏的研究，可以使用的其他参数包括 500 kHz-1 MHz 之间的中心频率、0.2-2.1 MPa 的压力、10-25 ms 的突发长度和 2-5 分钟的超声处理时间6、10、11、22。
| 参数 | 价值 |
| 频率 （kHz） | 250 |
| 焦距 （mm） | 40 |
| 声峰值压力（MPa） | 0.47 |
| 占空比 | 40% |
| 突发长度 （ms） | 400 |
| 周期 （s） | 1 |
| 超声处理时间（分钟） | 5 |
表 1：用于 BSCB 破坏的超声处理参数。
4. 微泡管理
- 按照制造商提供的说明准备 MB 溶液。避免将空气引入溶液中。
注意：MB是脆弱的，如果静止几分钟，会在小瓶/注射器顶部附近聚集在一起。定期摇晃小瓶和注射器，以防止MB的不均匀分散。查看制造商指南以确定到期时间。 - 插入 22 G 尾静脉导管并用 0.2 mL 肝素盐水 （500 IU/mL）冲洗23。为了增加尾静脉导管插入术成功的机会，请将尾巴浸入温水中，并在尾巴底部放置止血带以扩大静脉直径。
注意：尾静脉导管插入术可以在动物椎板切除术、定位和靶向之前进行，以节省研究时间。 - 将 1 mL/kg 的 3% EBD 注射到导管中。用 0.2 mL 肝素盐水冲洗。老鼠的四肢和眼睛会变成蓝色。通过检查大鼠脊髓背静脉中的蓝色变化来确认尾静脉导管插入术是否成功（图4）。
注意：EBD 可以在 MB 注射之前注射，并且不会影响超声处理。此外，由于美国食品和药物管理局（FDA）目前尚未批准使用系统中已有的药物进行超声处理，因此也可以在超声处理后进行EBD。这将导致染料吸收减少，但可能更具临床相关性。 - 将 0.2 mL 推注 MB 注射到导管中，并用 0.2 mL 肝素盐水冲洗。注射MB后1-2分钟开始超声处理。此处使用的设置不收集实时超声反馈。
注：BSCB破坏的研究通常使用比诊断成像指示更高的MB浓度。在大鼠模型中用于BBB和BSCB破坏的常见MB品牌的一些浓度包括0.02-0.2mL / kg和200μL推注10,15,24,25。
5. 脊髓摘除和组织处理
- 超声处理完成后，用100mL冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）经心灌注大鼠，直至血液完全清除。由于染料，肝脏呈浓郁的蓝色，应褪色为浅棕蓝色26。
注意：灌注的目的是从脊髓脉管系统中去除多余的血液。由于 EBD 与白蛋白结合，这也去除了多余的 EBD。这确保了在脊髓中通过视觉或荧光显微镜检测到的任何EBD都是由于染料外渗到脊髓实质中。 - 经心灌注 100 mL 冷的 4% 多聚甲醛 （PFA）。如果彻底完成，老鼠的四肢会在这种固定过程中抽搐。这种与PFA的灌注使大鼠安乐死。
- 取出脊髓并将其置于4°C的4%PFA中过夜。第二天用 PBS 替换 PFA。
6. BSCB中断的可视化
- 使用剃须刀片在超声处理位置周围隔离 2 厘米的部分。使用切片机将切片机沿中线向下切片切开，切片切成10μm厚的切片。对于明场可视化，用苏木精-伊红 （H&E） 染色染色。
注：本研究中显示的 H&E 脊髓样本用苏木精染色 3 分钟，用伊红染色 1 分钟27。 - 对于荧光显微镜，用溶解在封固剂（0.5μg/ mL）中的25μL4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对含有脊髓切片的载玻片进行脱蜡。在4°C孵育至少10分钟。避光放置，防止漂白。
注意：脱蜡可以通过使用低温恒温器来获得冷冻切片来代替。 - 使用荧光显微镜对所有载玻片进行成像。EBD自发荧光（激发：470 nm和540 nm;发射：680 nm）在红色通道中可见，而DAPI存在于蓝色通道中。使用光学显微镜对H&E载玻片进行成像。
注意：尽管该协议描述了非存活程序，但它也是使用存活手术技术进行的。对于生存手术，切口前用 3 次交替施用碘聚维酮对皮肤进行消毒，并在手术前皮下注射丁丙诺啡 （0.05 mg/kg）。术后至少3天，每12小时继续皮下注射丁丙诺啡，如果大鼠表现出疼痛迹象，则增加几天。如果发生脊髓损伤，大鼠可能会表现出尿潴留或步态异常。这将表现为后肢或可触及的膀胱扩张的拖曳或延迟运动。如果发生这种情况，用营养强化的水凝胶喂养大鼠以提供食物和水合作用，并每天两次手动挤出膀胱，直到反射性排尿恢复。如果后肢完全瘫痪或顽固性疼痛，则对大鼠实施安乐死。
Representative Results
本文表明，同时应用LIFU超声处理和MB给药是局部BSCB破坏的有效技术。BSCB 的开放是通过 EBD 外渗到脊髓实质中来指示的。这些变化在视觉上和荧光显微镜下都很明显。椎板切除术后可见脊髓脉管系统，并显示脊髓后静脉，多条较小的血管向外侧放射（图4A）。通过尾静脉导管静脉注射EBD导致该脉管系统富含蓝色染料（图4B）。这是验证椎板切除术不会导致任何脊髓血管系统破裂的程序中的一个很好的点，因为这会导致蓝色血液在脊髓上积聚。超声处理后，在目标位置上应可见一个蓝色斑点，表明由于BSCB破坏，EBD外渗到白色实质中（图4C）。该斑点的大小取决于许多因素，包括换能器焦点区域的大小和超声处理后的时间量。为了增加看到 EBD 外渗的机会，应该延长超声处理和脊髓摘除之间的时间。
虽然PFA灌注不是在脐带拔除和随后的组织分析之前进行的必要步骤，但它从样本中去除血液，并增加了白色脊髓实质和蓝色EBD染色区域之间的对比度。所有接受MB给药和LIFU超声处理的大鼠都显示出EBD明显外渗到脊髓中，而接受MB和EBD而没有LIFU超声处理的阴性对照则没有。代表性图像如图 5 所示。矢状面切开组织显示EBD外渗不仅是浅表的，而且延伸到脊髓本身。这是意料之中的，因为本研究中使用的换能器的焦点区域大于大鼠脊髓的直径。有时，矢状切口可见少量出血。这可能是由于椎板切除术或超声检查造成的。如果出血靠近脊髓背侧外缘，则更可能是由于椎板切除术所致。
为了进一步评估EBD外渗，用DAPI（核标志物）对矢状脊髓切片进行染色，并使用荧光显微镜成像。所有接受LIFU超声处理的绳索（n = 3）都显示出比未接受超声处理的绳索明显更高的EBD自发荧光强度（p = 0.016），两者中都存在相似强度的DAPI（图6）。H&E分析进一步显示超声处理位置不存在神经元损伤、出血或空腔病变，支持该手术的安全性。由于手术处理不当和高倍超声处理而导致的脊髓受伤的例子作为比较。标记出血、组织损伤、空腔病变和可能的空泡化。虽然高倍超声检查示例未显示出血，但也有报道称这是超声破坏的影响。
此外，对接受MBs、EBD和LIFU超声处理的大鼠进行了行为分析。虽然这种方法不能完全排除组织损伤，但它确实测试了是否由于该手术而发生了运动缺陷。记录大鼠在5天内每天在笼子里行走5分钟，并根据Basso Beattie Bresnahan运动量表（补充视频文件1）对运动功能进行分级。所有大鼠（n = 5）在超声处理前，超声处理后和存活期的每一天都获得了最高分（图7）。
最后，使用两个 离体 大鼠脊髓样本和一个插入脊髓细尖端的数字温度计探头测量本研究中使用的超声处理参数的热效应。 在超声处理之前、期间和之后跟踪脊髓样本的温度 5 分钟，总共 15 分钟。观察到温度变化很小。事实上，在两个样品中，由于超声处理，温度变化≤1.3°C，降低了超声处理导致热损伤的可能性（图8）。
图 1：低强度聚焦超声介导的血脊髓屏障打开机制。 （A） 大鼠脊髓低强度聚焦超声 （LIFU） 超声检查示意图。（B） 通过静脉微泡 （MB） 的 LIFU 超声处理打开血脊髓屏障 （BSCB） 的机制。MB响应LIFU振荡，导致内皮细胞之间的紧密连接扩大。BSCB的这种破坏允许纳米颗粒、治疗药物或埃文斯蓝染料的外渗。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：低强度聚焦超声台式设置和连接。 （A） 显示典型聚焦超声组件的示意图。（B） 聚焦超声设置的概览图片，包括：1. 换能器功率输出 （TPO），2.匹配网络， 3.LIFU换能器，4。立体定位仪器， 5.移动夹具。（C） 换能器，包括：1.探头支架，2.环形换能器，3.水锥，4.进水管，5.出水管，6.用橡皮筋固定的膜。（D） TPO 正面，包括：1. 射频屏蔽外壳， 2. 带可调菜单的触摸感应前显示面板， 3. 用于参数调整的旋转旋钮， 4. 启动/停止输出开关。（E） TPO 背面，包括：1. 通道输出连接器，2. 接地，3. 用于软件控制的 USB 输入端口，4. 内部触发器，5. 同步输出连接器，6. 电源输入插孔和电源，7. 开/关电源开关。（F） 匹配网络输出，导线匹配通道号。（G） 匹配网络 XDR 输入，导线匹配通道号 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：使用激光制导进行目标定位 。 （A） 立体定向臂，在所有三个轴上都具有运动范围和旋转能力。它贴在下面的固定板上。（B） 用于识别焦点区域的激光设备。激光器位于换能器的尖端，并与焦点区域对齐。（C） 插图显示了暴露脊髓上的激光，表明换能器的焦点区域现在指向该位置。（D） 将换能器降低，直到锥体的尖端位于绳索上方 1 厘米处，并用凝胶填充间隙以确保最大耦合。从换能器到脊髓的距离为 40 mm（焦距）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：超声处理后脊髓中的埃文斯蓝染料外渗 。 （A） T9-T11大鼠椎板切除切口图片，暴露的脊髓和后背静脉清晰可见。（B） 静脉注射埃文斯蓝染料 （EBD） 后，周围组织和脊髓脉管系统变蓝。（C） EBD 在超声处理部位外渗到脊髓实质中，表明 BSCB 已发生破坏。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：灌注后 BSCB 开口的脊髓摘除和可视化。 （A）未经LIFU治疗的对照大鼠切除脊髓。这只大鼠只接受了MB和EBD。嵌入石蜡的脊髓矢状面中段如图所示，未可见 EBD 外渗。（B）用LIFU治疗切除大鼠脊髓。这只大鼠还接受了 MBs 和 EBD。EBD外渗柱是可见的，并位于超声区域。嵌入石蜡的脐带的中矢状切片显示在插图中，箭头指向超声处理位置内可见的 EBD 浓度。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：BSCB 开口的检测和评估。 （A） 用DAPI（核标志物，蓝色）染色的脊髓。可见最小的EBD自发荧光（红色）。这只老鼠没有接受LIFU。（B） 用DAPI（核标志物，蓝色）染色的脊髓。在超声处理的目标位置可见局部EBD自发荧光（红色）。（C）没有LIFU的大鼠的脊髓用苏木精（核酸染色）和伊红（非特异性蛋白染色）（H&E）染色。没有可见的神经元损伤、出血或空腔病变。（D）用H&E染色的LIFU大鼠的脊髓，没有可见的神经元损伤、出血或空腔病变。（E）手术损伤的大鼠的脊髓被H&E染色。 箭头指向大量出血和组织损伤。（F）大鼠的脊髓因H&E染色的高倍超声处理而受损。 箭头指向空腔病变，插图显示可能的空泡化。（G） 条形图显示了有和没有 LIFU 超声处理的大鼠脊髓中 DAPI 和 EBD 的强度。尽管DAPI强度相似（p > 0.05），但与阴性对照组相比，LIFU脊髓中的EBD强度明显更高（p = 0.016）。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7：超声处理前和超声处理后的行为测定 。 （A） Basso、Beattie、Bresnahan 装置设置，其中记录大鼠从下方步行 5 分钟。（B） 录制视频中的静止图像。该视频用于在 Basso、Beattie、Bresnahan 量表上对大鼠的运动协调和步态进行评分。（C） 箱线图 （n = 5） 显示接受 MBs 和 LIFU 治疗的大鼠在超声处理前、超声处理后或 5 天生存期内运动评分没有变化 （p > 0.05）。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 8：使用 离体 脊髓进行温度分析。 图描绘了两个 离体 脊髓样品在超声处理前、超声处理期间和超声处理后持续时间 5 分钟内的温度变化。用于超声处理的参数列于 表1中。对于样品 1，超声处理前、超声处理中和超声处理后的平均温度分别为 21.9 °C ± 0.1 °C、22.1 °C ± 0.1 °C 和 22.0 °C ± 0.1 °C。对于样品2，超声处理前、超声处理中和超声处理后的温度分别为21.9 °C±0.1 °C、22.5 °C±0.3 °C和22.4 °C±0.2 °C。 请点击这里查看此图的较大版本.
附图1：激光瞄准装置的CAD文件。 （A） 从下方查看激光设备。任何激光都可以放置在中间的中心孔内。（B） 激光设备的侧视图。（C） 激光设备的尺寸，单位为英寸。 请点击这里下载此文件。
补充视频文件 1：一只老鼠在 Basso、Beattie、Bresnahan 装置中行走的视频。请点击这里下载此文件。
Discussion
在这里，描述了使用低强度聚焦超声 （LIFU） 结合微泡 （MB） 给药进行有效和有针对性的 BSCB 破坏所需的设备和步骤。该协议非常灵活，可以针对不同规格的传感器进行优化。LIFU 介导的 BSCB 破坏的其他技术依赖于使用磁共振成像 （MRI） 引导系统进行目标定位，这是一种昂贵的资源16。这里介绍的技术的优点在于可以快速实时地目视确认BSCB中断，并且由于程序的开放性而易于定位。此外，该激光设备易于使用和构造，CAD文件包含在补充部分。因此，有兴趣在小动物模型中对其LIFU换能器的靶向能力进行初步测试的研究人员可以使用该协议作为工具，快速确认感兴趣位置的焦点区域定位。该技术也可用于开始研究LIFU临床应用的实验室，例如药物递送，然后再投资于更复杂的引导模式，如超声或MR系统。目前，与MR系统相比，美国引导的模式提出了一种更有前途和更具成本效益的途径，尽管后者在文献中更常见。
此程序中有几个关键步骤必须仔细执行，以确保成功中断 BSCB。在手术椎板切除术期间，必须避免对脊髓施加不必要的压力。对电源线进行过多的物理操作会增加 BSCB 损坏的可能性。由于出血和 EBD 外渗加剧，拔除后，损伤表现为脊髓内的深褐色斑点。此外，必须确保换能器和暴露的脊髓之间实现最大耦合。因此，必须注意去除水锥和超声凝胶中的气泡。水锥底部与绳索之间不应有间隙，以确保声波的充分传输。在尾静脉导管插入术中，应避免空气意外与肝素盐水、EBD 或 MB 溶液一起排出。注入空气大大增加了肺栓塞的机会，导致啮齿动物在手术结束前死亡28.
在此过程中可能遇到的一个常见问题是 EBD 注射成功失败。对于尾静脉导管插入术经验最少的个体，在动物椎板切除术、定位或靶向之前执行此步骤将节省时间。EBD也可以在MB注射之前注射，而不会影响超声处理。利用本协议中建议的止血带和温水浴将有助于扩张尾静脉并提高成功率。此外，大鼠脱水会降低正确放置导管的可能性。在尾静脉导管插入术前 10-15 分钟腹膜内注射生理盐水可能会有所帮助。在导管插入术期间，应从尾部末端上方开始 2 个，并沿尾部至颅方向移动。向相反方向移动会降低由于潜在的静脉塌陷或出血而成功的可能性。
另一个常见的挑战是，尽管进行了超声处理，但仍缺乏EBD外渗。这可能表明用于超声处理的参数不足以破坏 BSCB。例如，如果超声处理频率设置在与换能器中心频率有很大差异的值，则超声处理功率将太低，无法振荡MB并导致紧密的结松动。此外，换能器和绳索之间的界面越多（例如，水锥、膜、凝胶、水/凝胶中的气泡），目标的真实超声处理强度就越低。最小化这些界面，例如使用脱气凝胶和彻底去除锥体内的气泡，将有助于传递超声处理的全部潜力。该方案还鼓励增加超声处理和灌注之间的时间，以便有更多时间让 EBD 外渗到脊髓实质中。尽管 BSCB 中断是一个短暂的过程，但间隙在闭合前会存在几个小时。较长的等待时间会增加异氟醚的暴露，但也会导致更大的 EBD 在脊髓中外渗。或者，尽管没有使用 LIFU 进行超声处理，但仍可能存在 EBD 外渗。要解决此问题，在椎板切除术期间必须小心，以防止对 BSCB 造成任何意外损坏。潜在的解决方案包括在夹紧过程中抬起大鼠脊柱以增加椎板和脐带之间的空间量，以及更短的椎板切除术。彻底的 PFA 灌注还可以通过从脊髓内的脉管系统中去除富含 EBD 的血液来减少背景染色。在心内灌注期间，必须注意防止心脏意外破裂，这可能导致PBS或PFA泄漏。
需要注意的是，这项研究代表了 LIFU 介导的 BSCB 破坏的单一中心经验。此外，该协议不测试或优化各种超声处理能量参数和MB浓度。因此，鼓励研究人员在执行该技术时研究各种参数和浓度，以优化靶标定位和BSCB破坏，以满足其特定的研究需求，特别是当初始结果产生任何不利影响时。例如，希望看到没有温度变化的小组可以测试各种参数，直到他们找到满足此标准的一组参数并实现足够的 BSCB 中断。此外，还可以进行其他实验来确认该技术的安全性。例如，可以增加样本量，延长生存期，并可以进行肌电图/步态分析研究。为了延长生存期，重要的是要记住，一些研究表明高剂量的 EBD 有时会导致慢性全身毒性，因此较低剂量可能是谨慎的29。
该手术的另一个局限性是椎板切除术的侵入性（任何使用 LIFU 进行 BSCB 开口的技术都需要这样做，因为超声无法穿透骨骼）。通过限制椎板切除术的长度，可以减少该手术的侵入性。在更短更薄的上胸椎进行椎板切除术可以将椎板切除术所需的时间减少到 10 分钟以下。由于MB的脆弱性以及其短的半衰期，因此在该协议期间时间有限。MB的注射应在LIFU治疗前1-2分钟进行，如果正在进行多次LIFU处理，则应在每次超声处理之前施用新的MB。对于涉及多只大鼠BSCB破坏的实验，可能需要准备几个MB小瓶。由于微气泡价格昂贵，因此最好改变手术工作流程以尽量减少超声处理之间的时间，以节省使用的 MB 数量。
这里描述的技术主要用作研究方案。尽管激光瞄准装置不会在所有临床环境中取代传统的靶向方式，但它在其他情况下可能有用。对于无创手术，传统的 MRI 模式可以可靠地用于靶向30。对于包括正在进行的椎板切除术在内的侵入性手术，本协议中描述的激光点装置可用于在特定区域（例如，肿瘤或脊髓损伤部位）上快速定位超声处理焦点区域的中心，用于药物递送或免疫调节治疗，同时补充将要发生的任何MR引导。
总体而言，该协议描述了一种有效且成功的 BSCB 中断技术，并包括用于确认 BSCB 开放的多个选项，包括实时和后处理。由于 BSCB 是进入脊髓实质的屏障，因此破坏 BSCB 是改善治疗药物递送的可能方法。例如，Weber-Adrian 等人使用频率为 1.114 MHz、突发长度为 10 ms 的 LIFU 来介导基因传递到颈椎6。同样，Smith 等人表明，频率为 580 kHz、平均声峰值压力约为 0.46 MPa、爆发长度为 10 ms 的 LIFU 有助于在软脑膜转移啮齿动物模型中将单克隆抗体曲妥珠单抗递送至脊髓10。 大多数研究都集中在利用LIFU， 而不是 HIFU，因为 LIFU 能够瞬时透化 BSCB，同时避免对下层组织造成损伤。通常，LIFU 使用的强度在 0.125-3 W/cm 2 之间，而 HIFU 使用的强度在 100-10,000 W/cm2 或更高31。因此，HIFU主要通过加热组织发挥其作用，而LIFU在MB的共同给药下，通过机械空化效应起作用。与 MB 联合给药可导致药物更大程度地外渗到脊髓实质中，以及用药物加载 MB 并用超声裂解 MB 以进行靶向药物递送的潜力。
本研究中使用的超声参数、MB 浓度和换能器类型可以根据实验需要进行更改。例如，具有较小焦区域的换能器可能更适合需要对局部靶向进行更大控制的实验，而具有更高功率的换能器可用于需要在更短的时间内进行强大破坏的实验。由于该协议提供的灵活性，在临床前、临床和转化研究中具有巨大的使用潜力。
Disclosures
作者声明，该研究是在没有任何可被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。Amir Manbachi 为 BK Medical （GE Healthcare）、Neurosonics Medical 任教和咨询，并且是多项正在申请专利的 FUS 技术的发明者。贝蒂·泰勒（Betty Tyler）获得了美国国立卫生研究院（NIH）的研究资助，并且是加速联合疗法（包括股票或期权）的共同所有人。Ashvattha Therapeutics Inc.还授权了她的一项专利，并且是Peabody Pharmaceuticals的股东。Nicholas Theodore从Globus Medical获得特许权使用费并拥有Globus Medical的股票。他是Globus Medical的顾问，并曾在Globus Medical的科学顾问委员会/其他办公室任职。其余作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
由T32GM136577（D.R.）支持;N660012024075 （N.T.， N.V.T.， A.M.， K.K.L.）;R01 HL139158-01A1 和 R01 HL071568-15 （N.V.T.）;约翰霍普金斯大学ICTR临床研究学者计划（KL2）（上午）。用 BioRender.com 创建的几个数字。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Heparinized Sodium Chloride | Baxter | FKB0953G | Flush tail vein catheter with heparinized saline to prevent clotting. |
| 100 mL Luer Lock Tip Syringe (2) | Wilburn Medical | WUSA/120 | One syringe can be used to inject PBS and one for PFA (during transcardial perfusion) |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Scientific | 10010001 | For transcardial perfusion. |
| 22 G catheter | Med Vet International | 50-209-1694 | Use to place a tail vein catheter. |
| 97% Isoflurane | Thermo Scientific Chemicals | 247-897-7 | While rat is under isoflurane, be careful not to administer too much. A high dose can euthanize the rat. |
| Betadine 7.5% | Purdue Products | 4677 | |
| Class A clear threaded glass vial | Fisherbrand | 14-955-314 | Use to store spinal cord extraction. |
| Digital balance scale | Kent Scientific | SCL-4000 | |
| Electric razor | Wahl Home Products | 79449-200 | Shave fur off skin at incision site before surgery |
| Eosin-Y with Phloxine | Epredia | 71304 | |
| Evans blue dye | MP Biomedicals | 02151108-CF | Although it is non-toxic, it will stain skin blue if direct contact occurs. |
| Fixation Plate Assembly with 0.5 mm Forceps | PSI Impactors | 7001-2 | Affix the stereotactic arm to this frame |
| Gauze | Fisherbrand | 13-761-52 | |
| Heating pad | Kent Scientific | RT-0515 | |
| Hematoxylin | Epredia | 7211 | |
| Iris Scissors with Angled Blades | ProDentUSA | 12-15315 | |
| Isoflurane induction system | Kent Scientific | SOMNO-RATKIT | |
| Laser targetting apparatus | NA | custom | CAD design file provided in supplemental section. Simply place a laser inside the apparatus created from the file. |
| Lubricating eye ointment | Systane | N/A | |
| Luer Lock 3-Way Stopcock | Sigma | SAS7521-10EA | Can use to fill water cone through inlet valve |
| Lumason microbubbles kit | Bracco | 0270-7099-16 | |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Microtome | Epredia | 23-900-671 | |
| Mounting medium with 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-2000-2 | |
| Mylar membrane | Chemplex | 3016 | Can cut membrane to appropriate size if too large for cone |
| NeuroFUS 2.52" diameter 250 kHz transducer | Sonic Concepts | CTX-250 | Transducer system includes custom water cone and probe holder |
| NeuroFUS PRO v2.0 system | Sonic Concepts | NFS102v2 | Includes Transducer Power Output, Matching Network and associated cables |
| Offset Bone Nippers | Fine Science Tools | 16101-10 | Use to remove spinous processes and laminae for laminectomy |
| Paraffin | Polysciences | 24364-1 | Can place spinal cord sample in paraffin to slice into thin sections for histology. |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J61899-AK | For transcardial perfusion. |
| Rat Surgical Kit | Kent Scientific | INSRATKIT | Consists of tweezer #5, needle holder, McPherson-Vannas scissors, Iris scissors, ALM self-retaining retractors, Iris forceps, and blunt probe. These products should be sufficient to perform a laminectomy. |
| Razor blade | Fisherbrand | 12-640 | Use to cut spinal cord extraction to desirable length and split section down midline. |
| Rectal thermometer | Kent Scientific | RET-2 | Maintain rat temperature between 35.9–37.5 °C |
| Rubber band | Fisherbrand | 50-205-1983 | |
| Single animal vaporizer unit | Kent Scientific | SF-01 | |
| Stereotactic arm | Kopf Instruments | Model 963 | |
| Sterile absorbent pad | McKesson | 4033-CS150 | Place under rat and above heating pad and fixation plate before laminectomy |
| Ultrasound gel | Aquasonic | PLI 01-34 | Ensure gel is free of bubbles to the best of your ability. |
References
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