Summary
Hier beschreiben wir die Methoden zur Induktion einer allergischen Kontaktdermatitis in Mäuseohren durch 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol (DNFB) und wie der Schweregrad der allergischen Kontaktdermatitis beurteilt werden kann.
Abstract
Die Haut ist die erste Verteidigungslinie des menschlichen Körpers und eines der Organe, die Umweltchemikalien am stärksten ausgesetzt sind. Allergische Kontaktdermatitis (ACD) ist eine häufige Hauterkrankung, die sich als lokaler Hautausschlag, Rötungen und Hautläsionen äußert. Das Auftreten und die Entwicklung von ACD werden sowohl von genetischen als auch von Umweltfaktoren beeinflusst. Obwohl viele Wissenschaftler in den letzten Jahren eine Reihe von Modellen von ACD konstruiert haben, sind die experimentellen Protokolle dieser Modelle alle unterschiedlich, was es für die Leser schwierig macht, sie gut zu etablieren. Daher ist ein stabiles und effizientes Tiermodell von großer Bedeutung, um die Pathogenese der atopischen Dermatitis weiter zu untersuchen. In dieser Studie beschreiben wir eine Modellierungsmethode, bei der 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol (DNFB) verwendet wird, um ACD-ähnliche Symptome in den Ohren von Mäusen zu induzieren, und beschreiben verschiedene Methoden zur Beurteilung des Schweregrads der Dermatitis während der Modellierung. Dieses experimentelle Protokoll wurde in einigen Experimenten erfolgreich angewendet und hat eine gewisse Werberolle im Bereich der ACD-Forschung.
Introduction
Die allergische Kontaktdermatitis (ACD) ist eine häufige Hauterkrankung, die durch ekzemähnliche Symptome an der Kontaktstelle, Ödeme und Rötungen in mittelschweren Fällen und Papeln, Erosion, Exsudation oder sogar massive Narben in schweren Fällen gekennzeichnet ist1. Sie betrifft bis zu 20 % der Bevölkerung und kann Menschen jeden Alters betreffen2. ACD tritt häufig bei Personen auf, die wiederholt Allergenen ausgesetzt waren, und kann durch die Immunantwort der Person auf ein oder mehrere Allergene zu Hause oder am Arbeitsplatz verursacht werden3. Die verzögerte Typ-IV-Überempfindlichkeit gilt als Haupttyp der Immunantwort bei ACD4. In Hautarealen, die wiederholt Allergenen ausgesetzt waren, reichern sich zirkulierende Gedächtnis-T-Zellen in großer Zahl an und induzieren Immun- und Entzündungsreaktionen 3,5,6. Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine zuverlässige Labortechnik für die weitere Untersuchung immunologischer und inflammatorischer Reaktionen bei der Entwicklung von ACD vorzuschlagen.
Das Auftreten von ACD ist in der Regel auf eine Kontaktüberempfindlichkeit zurückzuführen, die durch wiederholte Exposition gegenüber Chemikalien verursacht wird. Zahlreiche Forscher haben in den letzten Jahrzehnten verschiedene ACD-Tiermodelle bei Hausmäusen7,8, Meerschweinchen 9,10 und anderen Tieren entwickelt, um den Ausbruch der Krankheit zu simulieren. Die meisten experimentellen Methoden bestehen aus zwei Stufen: der Sensibilisierung des Abdomens (Induktion) und der Abgabe von Reizen am Rücken oder am Ohrläppchen (Stimulation). Zu den häufig verwendeten chemischen Substanzen gehören hauptsächlich 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol (DNFB)/1-Chlor-2,4-dinitrobenzol (DNCB)8,9,11, Oxazolon 12, Urushiol 13 usw. Unter ihnen sind DNFB und DNCB die am weitesten verbreiteten und wurden erstmals im Oktober 1958 gemeldet10. Häufig werden auch das Nickelsensibilisierungsmodell14 und das photoallergische Kontaktdermatitis Modell15 eingesetzt.
Wir stellen eine experimentelle Methode zur Erstellung des ACD-Modells vor. Diese Methode wird auf der Grundlage früherer Studien und durch den Vergleich mit mehreren Experimenten zusammengefasst und optimiert. Im Vergleich zu anderen ACD-Modellen hat dieses Modell einige Vorteile, wie z.B. kleine individuelle Unterschiede, kurze Versuchszeiträume, eine geringe Menge an chemischer Stimulation usw. Darüber hinaus ist diese Studie auf Mäuse anwendbar, die nicht nur wirtschaftlich sind, sondern auch mehr Möglichkeiten für einen Gen-Knockout oder eine transgene Mäusepräparation bieten16. Wir beschreiben auch die verschiedenen Methoden, die zur Überwachung des ACD-Fortschritts im Experiment verwendet werden, wie z. B. die Messung der Ohrdicke, die Verwendung von Evans-Blaufarbstoff zur Messung der entzündlichen Exsudation usw. Dieses Modell kann nicht nur Ohren, Blut, Milz und andere Proben von Mäusen im Labor analysieren, um die Pathogenese der ACD zu erforschen, sondern ist auch für die präklinische Evaluierung neuer Therapiemethoden geeignet, was eine gewisse werbliche Bedeutung hat.
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Protocol
Die gesamte Pflege und Behandlung der Mäuse erfolgte in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Yangzhou und wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee unter der Projektlizenz SYXK(SU)2022-0044 genehmigt. In dieser Studie wurden männliche und weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen verwendet. Jede Gruppe bestand aus sechs Mäusen (siehe Materialtabelle). Die Käfige wurden in eine temperaturkontrollierte Kammer (22 ± 2 °C, 12 h Hell-Dunkel-Zyklus) mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gestellt. Ein experimentelles Flussdiagramm ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Vorbereitung der Tiere
- Beginnen Sie mit der Modellierung nach 1 Woche der Akklimatisierung an die Umgebung.
- Verwenden Sie eine UV-Lampe und ein Desinfektionsmittel mit 75 % Alkohol, um die Umgebung und die Arbeitsplatten zu reinigen und zu desinfizieren, bevor Sie die Mäuse manipulieren.
HINWEIS: Um den Einfluss äußerer Faktoren zu vermeiden, kann die Markierung der Mäuse zur Identifizierung nicht am Mausohr durchgeführt werden. Alternativ kann auch eine Färbung auf dem Rücken oder am Schwanz verwendet werden. - Verwenden Sie ein kleines Wattestäbchen, um Seifenwasser auf den Bauch der Mäuse aufzutragen (ca. 1-2 cm2 groß). Rasieren Sie den Bereich zu Beginn der Modellierung (Tag 0) mit einer Klinge oder einem Rasierer (siehe Materialtabelle) in Haarwuchsrichtung (Tag 0; Abbildung 2A).
Anmerkungen: Die Verwendung einer Rasierklinge zur Haarentfernung erfordert einen erfahrenen Bediener. Wenn es nicht richtig durchgeführt wird, kann es zu Hautreizungen kommen. Erwägen Sie die Verwendung von Enthaarungscreme, Haarschneidemaschine oder einem Rasierhobel zur Haarentfernung. - Wiegen Sie die Maus und vergleichen Sie die Gewichtsänderungen zwischen den einzelnen Gruppen.
2. Stimulation der Bauchsensibilisierung
- Sorgen Sie für die vollständige Genesung von kleineren Verletzungen der Bauchhaut, die durch die Rasur verursacht wurden. Tragen Sie die Bauchsensibilisierung 2 Tage nach der Rasur (Tag 2) auf.
- Bereiten Sie die 0,5%ige DNFB-Lösung vor: DNFB mit einem Aceton-Olivenöl-Gemisch im Verhältnis 4:1 verdünnen (z. B. 400 μl Aceton gemischt mit 100 μl Olivenöl; siehe Materialtabelle). Verwenden Sie eine Pipettenpistole, um 20 Mal zu blasen und zu mischen, um die DNFB-Lösung gründlich zu mischen. Vor jeder Verabreichung der DNFB-Lösung an die Maus drei- bis fünfmal blasen und mischen.
Anmerkungen: Bereiten Sie die Lösung vor Gebrauch vor und wickeln Sie sie in Alufolie ein, um sie vor direkter Sonneneinstrahlung zu schützen. - Tragen Sie 25 μl der 0,5%igen DNFB-Lösung mit einer Pipette auf die Haut des rasierten Bereichs am Bauch der Mäuse auf (Abbildung 2B).
- Träufeln Sie die DNFB-Lösung über die Mitte des Bauchrasierbereichs und verteilen Sie sie leicht mit der glatten Seite der Pipettenspitze, um sie gleichmäßig zu verteilen.
- Setzen Sie die Mäuse 30 s nach der DNFB-Stimulation in leere Käfige ohne Einstreu, um zu verhindern, dass sie die DNFB-Lösung abreiben. Wenn die DNFB-Lösung vollständig getrocknet ist (ca. 2 Minuten), setzen Sie die Mäuse wieder in ihren ursprünglichen Käfig.
- Tragen Sie beim Umgang mit der DNFB-Lösung Handschuhe, da sie die menschliche Haut stark reizt.
3. Stimulation der Ohrsensibilisierung
- Bereiten Sie eine 0,2%ige DNFB-Lösung wie oben beschrieben, die Vehikellösung (eine 4:1-Mischung aus Aceton und Olivenöl) und reines Wasser vor.
- Richten Sie den Mauskörper aus und zeigen Sie den äußeren Rand der Ohrmuschel während der gesamten Operation nach unten, um zu verhindern, dass die Lösung während der DNFB-Stimulation in den Gehörgang gelangt.
- Tragen Sie an den Tagen 4, 6, 8 und 10 mit einer Pipette 20 μl der 0,2%igen DNFB-Lösung oder der Vehikellösung langsam und gleichmäßig auf die Innenfläche der linken Ohrmuscheln der Mäuse auf. Um zu verhindern, dass DNFB-Lösung in den Gehörgang gelangt, verwenden Sie die glatte Seite der Pipettorspitze, um die DNFB-Lösung während der Verabreichung vorsichtig zu verteilen. Lassen Sie die rechten Ohren unbehandelt (Abbildung 2C).
- Warten Sie, bis die DNFB-Lösung trocken ist, und setzen Sie die Mäuse wieder in den Käfig (ca. 30 s).
- Tragen Sie beim Umgang mit der DNFB-Lösung Handschuhe.
4. Aufzeichnung des Mausgewichts und der ACD-Symptome
- Wiegen Sie die Maus jeden Tag, beginnen Sie mit Tag 1 und vergleichen Sie sie mit dem entsprechenden Gewicht an Tag 0. die Wirkung von ACD auf das Körpergewicht von Mäusen als Gewichtsänderung (g) ± Standardfehler des Mittelwerts (REM) zu bewerten.
- Machen Sie hochauflösende Fotos von den Mäuseohren, um die klinischen Symptome der ACD alle 2 Tage aufzuzeichnen, beginnend mit Tag 1.
5. Messung der Ohrmuscheldicke
- Messen Sie die Ohrmuscheldicke alle 2 Tage, beginnend mit Tag 1. Messen und notieren Sie beide Ohren im Detail.
- Verwenden Sie Messschieber (siehe Materialtabelle), um die Ohrmuscheldicke jeden Tag zur gleichen Zeit zu messen, um genaue Ergebnisse zu erzielen (Abbildung 3A). Verhindern Sie, dass die Messschieber bei einer leichten Verstopfung weiter nach innen geklemmt werden, um Gewebeschäden am Mausohr zu vermeiden. Halten Sie die Position fest und zeichnen Sie die Daten auf.
- Sammeln Sie die Dicke an drei verschiedenen Stellen an jeder Ohrmuschel (Abbildung 3B). Notieren Sie den Durchschnitt der drei Daten als gültigen Wert. Bewerten Sie die Ohrschwellung in Mikrometern (μm) ± Standardfehler des Mittelwerts (REM).
6. Beurteilung des Grades der entzündlichen Schwellung
- Bereiten Sie 0,5%ige Evansblau-Farbstofflösung (siehe Materialtabelle) vor: Verdünnen Sie Evans-Blaufarbstoff an Tag 11 mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Tragen Sie immer einen Laborkittel und Handschuhe, da der blaue Farbstoff Evans für den Menschen leicht giftig ist.
- Immobilisieren Sie die Mäuse mit einem Fixateur: Öffnen Sie den Deckel des Fixateurs (siehe Materialtabelle), halten Sie den Mausschwanz fest, richten Sie den Kopf der Maus auf den Fixateur aus und lassen Sie die Maus instinktiv in den Fixateur klettern. Decken Sie den Deckel ab, lassen Sie den Mausschwanz aus dem Loch auf dem Deckel herausragen, und passen Sie die Länge des Fixateurs so an, dass der gesamte Mausschwanz freigelegt wird.
- Wischen Sie den Schwanz wiederholt mit einem Alkohol-Wattebausch ab oder weichen Sie ihn 30 Sekunden lang in warmem Wasser ein und drücken Sie die Schwanzwurzel vorsichtig zusammen, um die Venen auf beiden Seiten zu füllen und zu erweitern. Führen Sie die Injektion unter der Bestrahlung einer Kaltlichtquelle durch.
- Injizieren Sie die blaue Evans-Farbstofflösung langsam mit einer 1 mm Insulinnadel in die Mausschwanzvene. Warten Sie 15 Minuten und fotografieren Sie dann die Mäuseohren.
HINWEIS: Legen Sie die Maus auf den Tisch und halten Sie sie vorsichtig, um die Ohrregion für die Bildaufnahme freizulegen. Kurz nach der Injektion mit der blauen Farbstofflösung von Evans und unter Beachtung entsprechender Indikationen wird die Maus durch Zervixluxation eingeschläfert.
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Representative Results
Unter wiederholter DNFB-Stimulation zeigten die Mausohren der DNFB-Gruppe offensichtliche klinische Symptome, die mit ACD vergleichbar waren, wobei empfindliche Bereiche die typischen Symptome von Rötung, Trockenheit und sogar Erosion und Exsudation zeigten. Die Verabreichung von reinem Wasser (Kontrollgruppe) oder Lösungsmittelkontrolle (Vehikelgruppe) führte jedoch nicht zu ähnlichen Symptomen (Abbildung 4).
Währenddessen nahm in der DNFB-Gruppe im Vergleich zum unbehandelten rechten Ohr die Dicke des linken Ohrs nach DNFB-Stimulation signifikant zu (Abbildung 5A), während es keinen signifikanten Unterschied in der Kontroll- und der Vehikelgruppe gab (Abbildung 5B). Die linken Ohren der Mäuse der DNFB-Gruppe verfärbten sich offensichtlich nach der Injektion von Evans-Blaufarbstoff am 11. Tag der Modellierung dunkelblau, was sich optisch vom rechten Ohr unterschied. Das linke und das rechte Ohr der Mäuse in der Kontroll- und Fahrzeuggruppe hatten jedoch ungefähr die gleiche Farbe (Abbildung 5C).
Des Weiteren wurden die Körpergewichtsveränderungen von Mäusen analysiert. Die Gewichtszunahme der Maus wurde durch DNFB oder einfache Vehikelstimulation leicht verlangsamt (Abbildung 6A), führte jedoch nicht zu einem signifikanten Gewichtsverlust (Abbildung 6B). Gleichzeitig wurde die Milz unmittelbar nach der Tötung der Mäuse isoliert. Der Milzindex wurde anhand des Mausgewichts und des Milzgewichts berechnet; Die Berechnungsformel lautete wie folgt:
Milzindex = Milzgewicht (g) / Körpergewicht (g) x 100
Das Ergebnis zeigt, dass wiederholte DNFB-Stimulation im Mausohr zu einer Milzvergrößerung (Abbildung 6C) und einem Anstieg des Milzindex (Abbildung 6D) führte, während sich der Milzindex der Mäuse in der Vehikelgruppe nicht signifikant veränderte. Es konnte gezeigt werden, dass unter der Stimulation von DNFB die Immunantwortfunktion von Mäusen in der DNFB-Gruppe hyperaktiv war.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der ACD-Formzeitachse. Die Pfeile zeigen an, was zum entsprechenden Zeitpunkt getan wurde. Zu den damit verbundenen Vorgängen gehören Rasur, Sensibilisierung, Ohrmuschelmessung, Wiegen, Fotografieren und Auftragen von Evans-Blaufarbstoff. Abkürzungen: DNFB = 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Die Funktionsweise der ACD-Modellerstellung . (A) Manipulation der Bauchrasur. (B) Manipulation der sensibilisierenden Stimulation des Abdomens. (C) Manipulation der ohrsensibilisierenden Stimulation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Auswertungsmethode der Ohrschwellung . (A) Manipulation von Ohrdickenmessungen bei Mäusen. (B) Die Orte der Ohrdickenmessung bei Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentatives Bild der Wirkung der DNFB-Verabreichung auf die Ohren von Mäusen im Zeitverlauf . (A) Kontrollgruppe. (B) Fahrzeuggruppe. (C) DNFB-Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Einfluss der DNFB-Verabreichung auf die Ohrschwellung bei Mäusen. (A) Unterschied in der Ohrdicke zwischen dem linken und rechten Ohr von Mäusen während der Modellierung. (B) Vergleich der Dicke des linken und rechten Ohrs von Mäusen in jeder Gruppe am Ende der Modellierung. (C) Wirkung der DNFB-Verabreichung auf die Gefäßpermeabilität der Ohren bei Mäusen. (n = 6. ***p < 0,001, Vergleich zwischen rechtem und linkem Ohr; N.S. = nicht signifikant). Alle Daten wurden als Mittelwert ± REM ausgedrückt. Verschiedene Behandlungsanalysen zwischen den Gruppen wurden mit einem ungepaarten studentischen t-Test oder einer einfaktoriellen Varianzanalyse mit dem Dunnett-Test analysiert. p-Werte unter 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Auswirkungen der DNFB-Gabe auf das Körpergewicht und den Milzindex bei Mäusen . (A) Veränderungen des Körpergewichts von Mäusen in jeder Gruppe während der Modellierung. (B) Vergleich der Veränderungen des Körpergewichts bei Mäusen in jeder Gruppe an Tag 11. (C) Vergleich der Milzgröße in jeder Gruppe von Mäusen. (D) Vergleich des Milzindex zwischen Mäusegruppen. (n = 6. *p < 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe; N.S. = keine signifikante Signifikantität). Alle Daten wurden als Mittelwert ± REM ausgedrückt. Verschiedene Behandlungsanalysen zwischen den Gruppen wurden mit einem ungepaarten studentischen t-Test oder einer einfaktoriellen Varianzanalyse mit dem Dunnett-Test analysiert. p-Werte unter 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Das hier beschriebene Protokoll zur Induktion von ACD-ähnlichen Symptomen in den Ohren von Mäusen kann zur Untersuchung der Pathophysiologie von ACD und als Screening-Tool für die Entwicklung neuer Medikamente verwendet werden.
Es gibt zwei wichtige Schritte, um ein ACD-Modell zu etablieren: die anfängliche Sensibilisierung und die anschließende Stimulation. Das Abdomen ist in der Regel der Ort der Erstsensibilisierung, aber der anschließende Stimulationsort wurde etwas anders gewählt. Frühere Studien haben gezeigt, dass sich die meisten Wissenschaftler dafür entscheiden, chemische Sensibilisatoren wie DNFB/DNCB oder Oxazolon zu verwenden, um ACD-Modelle auf dem Rücken oder Hals von Mäusen zu erstellen, und es ist unvermeidlich, Klingen oder Trimmer zu verwenden, um den Modellierbereich von Mäusen zu enthaaren17,18,19. Dieser Schritt kann jedoch leicht die Hautbarriere zerstören und die nachfolgenden Experimente beeinträchtigen. Darüber hinaus ist das tropfende Medikament aufgrund der großen Fläche im Nacken und des Einflusses der umgebenden Haare schwer gleichmäßig zu verteilen und wird leicht von den umliegenden Haaren aufgenommen.
In diesem experimentellen Protokoll fanden wir heraus, dass die Durchführung der Manipulation für die anschließende Stimulation in der Innenseite der Ohrmuscheln der Maus es uns ermöglichte, einige der oben genannten Probleme zu lindern und ein stabiles und hochgradig reproduzierbares ACD-Modell zu etablieren. In Übereinstimmung mit unseren wiederholten Experimenten20 haben wir auch das Intervall des sensibilisierenden Stimulus und die Versuchsdauer optimiert und angepasst. In Übereinstimmung mit der gegebenen experimentellen Methode kann am 10. Tag ein sehr deutlicher Modellierungseffekt erzielt werden. Da sich der Modellierungsbereich auf der relativ unabhängigen Innenseite der Ohrmuschel befindet, auf der externe Faktoren weniger stören, gibt es außerdem weniger Unterschiede im Schweregrad der ACD bei Mäusen in derselben Versuchsgruppe in diesem Experiment.
Auch dieses Versuchsprotokoll weist einige Mängel auf. Erstens sollte das Auftragen chemischer Sensibilisatoren auf das Ohr mit Vorsicht durchgeführt werden, um zu vermeiden, dass Chemikalien in den Gehörgang gelangen und die Mäuse schädigen. Zweitens werden ACD-Modelle häufig verwendet, um chronischen Juckreiz bei Mäusen zu untersuchen. In dem ACD-Modell, das im Nacken von Mäusen etabliert wurde, konnten die Kratzanfälle bei Mäusen intuitiv beobachtet und die Schwere des Juckreizsymptoms bei Mäusen daran gemessen werden. Obwohl während unseres Experiments auch bei Mäusen ein Kratzverhalten beobachtet wurde, hatten die Mäuse auch spontane Ohrputzgewohnheiten, was es schwierig machte, es von einem krankhaften Kratzverhalten zu unterscheiden. Dies schränkte die Verwendung dieses Modells bei der Beobachtung des ACD-induzierten Kratzverhaltens ein. Ob das Protokoll auf diese Art von Studien anwendbar ist, muss noch experimentell geprüft werden.
Um den pathologischen Verlauf der ACD zu verfolgen, wurden verschiedene Überwachungsmethoden eingesetzt, wie z. B. klinische Ohrsymptome, Ohrdickenmessung und Reflexion der Gefäßpermeabilität. Diese pathologischen Indikatoren sind im Ohr besser sichtbar als in der Nacken- und Rückenhaut. Bei der Messung der Ohrdicke einer Maus treten Messfehler auf, die auf das Kampfverhalten der Maus und die ungleichmäßige Dicke des Ohrs zurückzuführen sind. Um Messfehler zu vermeiden, sollten Messungen an drei verschiedenen Stellen an jedem Ohr durchgeführt werden. Durch die Injektion von Evans-Farbstoff zur Beurteilung der Gefäßpermeabilität des modellierten Bereichs kann der Schweregrad der Dermatitis gesehen werden, dies erfordert jedoch auch eine hohe Erfolgsrate der Schwanzveneninjektion. Wenn weitere vergleichende Analysen erforderlich sind, kann die Absorption des Überstandes des Mausohrgewebehomogenats bestimmt werden.
Erwähnenswert ist auch, dass in unserer früheren Forschung20 die Struktur des Ohrgewebes gut organisiert war und weniger von anderen ungeordneten Gewebestrukturen (z. B. Haarfollikel) beeinflusst wurde als im Nacken- und Rückenhautgewebe, was dazu führte, dass wir diesen Bereich für die Forschung ausgewählt haben.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das in dieser Arbeit beschriebene Modell der ACD eine stabile und effiziente Modellierungsmethode darstellt und es wert ist, in nachfolgenden Studien zur allergischen Kontaktdermatitis gefördert zu werden.
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Disclosures
Die Autoren berichten über keine Interessenkonflikte in dieser Arbeit.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (NSFC) an N.-N. Y. (81904212); Wissenschafts- und Technologieprojekt für traditionelle chinesische Medizin in Jiangsu (YB201995); und das Sonderförderprojekt für Postdoktorandinnen und Postdoktoranden in China (2020T130562).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Merck | 200-734-3 | 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene, ≥99% |
| Acetone | Sinopharm Chemical Reagent Co. LTD | 10000418 | ≥99.5% |
| Aluminum foil | Cleanwrap | CF-2 | |
| Evans blue dye | Solarbio | 314-13-6 | Dye content approx. 80% |
| Mouse fixator | ZHUYANBANG | GEGD-SM1830 | |
| Olive oil | Solarbio | 8001-25-0 | 500 ml |
| Pipet tip | Biofount | FT-200 | 10 - 200 μl |
| Pipettor | Eppendorf AG | 3123000250 | 20 - 200 μl |
| Razor blade | Shanghai Gillette Co. LTD | 74-S | |
| Vernier calipers | Delixi Electric | DECHOTVCS1200 |
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