Summary
Qui, descriviamo i metodi per indurre la dermatite allergica da contatto nelle orecchie di topo da 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) e come valutare la gravità della dermatite allergica da contatto.
Abstract
La pelle è la prima linea di difesa del corpo umano e uno degli organi più esposti alle sostanze chimiche ambientali. La dermatite allergica da contatto (ACD) è una malattia della pelle comune che si manifesta come eruzione cutanea locale, arrossamento e lesioni cutanee. La presenza e lo sviluppo di ACD sono influenzati da fattori sia genetici che ambientali. Sebbene molti studiosi abbiano costruito una serie di modelli di ACD negli ultimi anni, i protocolli sperimentali di questi modelli sono tutti diversi, il che rende difficile per i lettori stabilirli bene. Pertanto, un modello animale stabile ed efficiente è di grande importanza per studiare ulteriormente la patogenesi della dermatite atopica. In questo studio, descriviamo in dettaglio un metodo di modellazione che utilizza 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) per indurre sintomi simili ad ACD nelle orecchie dei topi e descriviamo diversi metodi per valutare la gravità della dermatite durante la modellazione. Questo protocollo sperimentale è stato applicato con successo in alcuni esperimenti e ha un certo ruolo promozionale nel campo della ricerca ACD.
Introduction
La dermatite allergica da contatto (ACD) è una malattia della pelle comune caratterizzata da sintomi simili all'eczema nel sito di contatto, edema ed eritema nei casi moderati e papule, erosione, essudazione o anche cicatrici massicce nei casi più gravi1. Colpisce fino al 20% della popolazione e può colpire persone di qualsiasi età2. L'ACD si verifica spesso in individui che sono stati esposti ripetutamente agli allergeni e può essere causata dalla risposta immunitaria dell'individuo a uno o più allergeni nella loro casa o sul posto di lavoro3. L'ipersensibilità ritardata di tipo IV è considerata il principale tipo di risposta immunitaria nell'ACD4. Nelle aree della pelle che sono state ripetutamente esposte agli allergeni, le cellule T della memoria circolante si accumulano in gran numero e inducono risposte immunitarie e infiammatorie 3,5,6. Lo scopo di questo lavoro è quello di proporre una tecnica di laboratorio affidabile per ulteriori indagini sulle risposte immunologiche e infiammatorie nello sviluppo di ACD.
L'insorgenza di ACD è solitamente dovuta all'ipersensibilità da contatto causata da ripetute esposizioni a sostanze chimiche. Numerosi ricercatori hanno sviluppato vari modelli animali ACD in topi domestici7,8, porcellini d'India9,10 e altri animali nel corso degli ultimi decenni, al fine di simulare l'insorgenza della malattia. La maggior parte dei metodi sperimentali consiste in due fasi: sensibilizzazione addominale (induzione) e fornitura di stimoli sulla schiena o sul lobo dell'orecchio (stimolazione). Le sostanze chimiche comunemente usate includono principalmente 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) / 1-cloro-2,4-dinitrobenzene (DNCB) 8,9,11, ossazolone12, urushiol13, ecc. Tra questi, DNFB e DNCB sono i più utilizzati, segnalati per la prima volta nell'ottobre 195810. Anche la sensibilizzazione al nichel modello14 e la dermatite fotoallergica da contatto modello15 sono frequentemente utilizzate.
Presentiamo un metodo sperimentale per la costruzione del modello ACD. Questo metodo è riassunto e ottimizzato sulla base di studi precedenti e sul confronto con più esperimenti. Rispetto ad altri modelli ACD, questo modello presenta alcuni vantaggi, come piccole differenze individuali, brevi periodi sperimentali, una piccola quantità di stimolazione chimica, ecc. Inoltre, questo studio è applicabile ai topi, che non sono solo economici, ma hanno anche più opzioni per il knockout genico o la preparazione di topi transgenici16. Descriviamo anche i vari metodi utilizzati per monitorare i progressi dell'ACD nell'esperimento, come la misurazione dello spessore dell'orecchio, l'uso del colorante blu di Evans per misurare l'essudazione infiammatoria, ecc. Questo modello non solo può analizzare orecchie di topo, sangue, milza e altri campioni con mezzi di laboratorio per esplorare la patogenesi dell'ACD, ma è anche applicabile per la valutazione preclinica di nuovi metodi terapeutici, che ha un certo significato promozionale.
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Protocol
Tutte le cure e il trattamento dei topi erano conformi alle linee guida stabilite dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Yangzhou e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali con la licenza del progetto SYXK (SU) 2022-0044. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi e femmine BALB/c di età compresa tra 6 e 8 settimane. Ogni gruppo era composto da sei topi (vedi Tabella dei materiali). Le gabbie sono state collocate in una camera a temperatura controllata (22 ± 2 °C, ciclo luce/buio 12 ore) con libero accesso al cibo e all'acqua. Un diagramma di flusso sperimentale è mostrato nella Figura 1.
1. Preparazione degli animali
- Iniziare la modellazione dopo 1 settimana di acclimatazione all'ambiente.
- Utilizzare una lampada a raggi ultravioletti e un disinfettante alcolico al 75% per pulire e disinfettare l'ambiente e i controsoffitti prima di manipolare i topi.
NOTA: Al fine di evitare l'influenza di fattori esterni, la marcatura dei topi per l'identificazione non può essere eseguita sull'orecchio del mouse; La colorazione sul retro o sulla coda può essere utilizzata come alternativa. - Utilizzare un piccolo batuffolo di cotone per applicare acqua saponata all'addome dei topi (circa 1-2 cm2 di dimensione). Rasare l'area nella direzione della crescita dei peli con una lama o un rasoio (vedi Tabella dei materiali) all'inizio della modellazione (giorno 0; Figura 2A).
NOTA: L'uso di una lametta dritta per la depilazione richiede un operatore esperto. Se non eseguita correttamente, potrebbe causare irritazione della pelle. Prendi in considerazione l'uso di crema depilatoria, tosatrici o un rasoio di sicurezza per la depilazione. - Pesare il mouse e confrontare le variazioni di peso tra ciascun gruppo.
2. Stimolazione della sensibilizzazione addominale
- Garantire il pieno recupero di eventuali lesioni minori alla pelle dell'addome indotte dalla rasatura. Applicare la sensibilizzazione addominale 2 giorni dopo la rasatura (giorno 2).
- Preparare la soluzione di DNFB allo 0,5%: diluire DNFB con una miscela acetone:olio d'oliva in rapporto 4:1 (ad esempio, 400 μL di acetone miscelati con 100 μL di olio d'oliva; vedere Tabella dei materiali). Utilizzare una pistola per pipette per soffiare e miscelare 20 volte per miscelare accuratamente la soluzione DNFB. Prima di ogni somministrazione di soluzione DNFB al mouse, soffiare e mescolare da tre a cinque volte.
NOTA: preparare la soluzione prima dell'uso e avvolgerla in un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce solare diretta. - Applicare 25 μL della soluzione di DNFB allo 0,5% sulla pelle dell'area rasata sull'addome dei topi con un pipettor (Figura 2B).
- Gocciolare la soluzione di DNFB al centro dell'area di rasatura addominale e distribuire leggermente con il lato liscio della punta del pipettor per disperderla uniformemente.
- A 30 secondi dopo la stimolazione con DNFB, posizionare i topi in gabbie vuote senza lettiera per evitare che si stampino dalla soluzione di DNFB. Quando la soluzione di DNFB è completamente asciutta (circa 2 minuti), riportare i topi nella loro gabbia originale.
- Indossare guanti quando si maneggia la soluzione DNFB in quanto è fortemente irritante per la pelle umana.
3. Stimolazione della sensibilizzazione dell'orecchio
- Preparare una soluzione di DNFB allo 0,2% come sopra, la soluzione del veicolo (una miscela 4: 1 di acetone e olio d'oliva) e acqua pura.
- Orientare il corpo del topo e posizionare il bordo esterno del padiglione auricolare rivolto verso il basso durante l'intera operazione per evitare che la soluzione entri nel condotto uditivo durante la stimolazione DNFB.
- Nei giorni 4, 6, 8 e 10, utilizzare un pipettor per applicare 20 μL della soluzione di DNFB allo 0,2% o della soluzione del veicolo lentamente e uniformemente sulla superficie interna dei padiglioni auricolari sinistri dei topi. Per evitare che la soluzione di DNFB entri nel condotto uditivo, utilizzare il lato liscio della punta del pipettor per distribuire delicatamente la soluzione di DNFB durante la somministrazione. Lasciare le orecchie destre non trattate (Figura 2C).
- Attendere che la soluzione di DNFB sia asciutta e riposizionare i topi nella gabbia (circa 30 s).
- Indossare guanti quando si maneggia la soluzione DNFB.
4. Registrazione del peso del topo e dei sintomi ACD
- Pesare il mouse ogni giorno, iniziare il giorno 1 e confrontarlo con il peso corrispondente il giorno 0; valutare l'effetto dell'ACD sul peso corporeo dei topi come variazione di peso (g) ± errore standard della media (SEM).
- Scatta foto ad alta risoluzione delle orecchie del topo per registrare i sintomi clinici dell'ACD ogni 2 giorni, a partire dal giorno 1.
5. Misurazione dello spessore del padiglione auricolare
- Misurare lo spessore del padiglione auricolare ogni 2 giorni, a partire dal giorno 1. Misurare e registrare entrambe le orecchie in dettaglio.
- Utilizzare pinze vernier (vedi Tabella dei materiali) per misurare lo spessore del padiglione auricolare alla stessa ora ogni giorno per risultati accurati (Figura 3A). Impedire alle pinze vernier di continuare il serraggio verso l'interno quando c'è un leggero blocco, per evitare danni ai tessuti all'orecchio del topo. Mantieni fissa la posizione e registra i dati.
- Raccogliete lo spessore da tre diverse posizioni su ciascun padiglione auricolare (Figura 3B). Registrare la media dei tre dati come valore valido. Valutare il gonfiore dell'orecchio in micrometri (μm) ± errore standard della media (SEM).
6. Valutazione del grado di gonfiore infiammatorio
- Preparare la soluzione di colorante blu Evans allo 0,5% (vedi tabella dei materiali): diluire il colorante blu di Evans con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) il giorno 11. Indossare un camice da laboratorio e guanti in ogni momento, poiché la tintura blu Evans è leggermente tossica per l'uomo.
- Immobilizzare i topi con un fissatore: aprire il coperchio del fissatore (vedere Tabella dei materiali), tenere la coda del mouse, fare in modo che la testa del topo sia rivolta verso il fissatore e far sì che il topo si arrampichi istintivamente sul fissatore. Coprire il coperchio, far uscire la coda del mouse dal foro sul coperchio e regolare la lunghezza del fissatore per esporre l'intera coda del mouse.
- Pulire ripetutamente la coda con un batuffolo di cotone alcolico o immergerla in acqua tiepida per 30 secondi e pizzicare delicatamente la radice della coda per riempire ed espandere le vene su entrambi i lati. Eseguire l'iniezione sotto l'irradiazione di una fonte di luce fredda.
- Iniettare lentamente la soluzione di colorante blu Evans nella vena della coda del topo usando un ago da insulina da 1 mm. Attendere 15 minuti e poi scattare foto delle orecchie del mouse.
NOTA: Posizionare il mouse sul tavolo e tenerlo delicatamente premuto per esporre la regione dell'orecchio per l'acquisizione dell'immagine. Poco dopo l'iniezione con la soluzione di colorante blu Evans e osservando le indicazioni corrispondenti, utilizzare la dislocazione cervicale per eutanasia del topo.
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Representative Results
Sotto ripetuta stimolazione DNFB, le orecchie di topo del gruppo DNFB hanno mostrato evidenti sintomi clinici paragonabili all'ACD, con aree sensibili che mostrano i sintomi tipici di arrossamento, secchezza e persino erosione ed essudazione. Tuttavia, la somministrazione auricolare di acqua pura (gruppo di controllo) o di controllo del solvente (gruppo veicolo) non ha prodotto sintomi simili (Figura 4).
Nel frattempo, nel gruppo DNFB, rispetto all'orecchio destro non trattato, lo spessore dell'orecchio sinistro è aumentato significativamente dopo la stimolazione DNFB (Figura 5A), mentre non vi era alcuna differenza significativa nei gruppi di controllo e veicolo (Figura 5B). Le orecchie sinistre dei topi del gruppo DNFB sono ovviamente diventate blu scuro dopo l'iniezione del colorante blu Evans l'11 ° giorno di modellazione, che era visivamente diverso dall'orecchio destro. Tuttavia, le orecchie sinistra e destra dei topi nei gruppi di controllo e veicolo erano approssimativamente dello stesso colore (Figura 5C).
Inoltre, sono stati analizzati i cambiamenti di peso corporeo dei topi. L'aumento di peso del topo è stato leggermente rallentato dal DNFB o dalla semplice stimolazione del veicolo (Figura 6A), ma non ha comportato una significativa perdita di peso (Figura 6B). Allo stesso tempo, la milza è stata isolata immediatamente dopo che i topi sono stati sacrificati. L'indice della milza è stato calcolato in base al peso del topo e al peso della milza; La formula di calcolo era la seguente:
Indice di milza = peso della milza (g) / peso corporeo (g) x 100
Il risultato mostra che la stimolazione ripetuta del DNFB nell'orecchio del topo ha provocato l'allargamento della milza (Figura 6C) e un aumento dell'indice della milza (Figura 6D), mentre l'indice della milza dei topi nel gruppo di veicoli non è cambiato in modo significativo. È stato dimostrato che sotto la stimolazione del DNFB, la funzione di risposta immunitaria dei topi nel gruppo DNFB era iperattiva.
Figura 1: Diagramma schematico dell'asse temporale di stampaggio ACD. Le frecce indicano cosa è stato fatto nel momento corrispondente. Le operazioni correlate includono rasatura, sensibilizzazione, misurazione del padiglione auricolare, pesatura, scatto fotografico e applicazione della tintura blu Evans. Abbreviazioni: DNFB = 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Metodo operativo dello stabilimento del modello ACD . (A) Manipolazione della rasatura addominale. (B) Manipolazione della stimolazione sensibilizzante addominale. (C) Manipolazione della stimolazione sensibilizzante dell'orecchio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Metodo di valutazione del gonfiore dell'orecchio . (A) Manipolazione delle misurazioni dello spessore dell'orecchio nei topi. (B) I siti di misurazione dello spessore dell'orecchio nei topi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Quadro rappresentativo dell'effetto della somministrazione di DNFB sulle orecchie dei topi nel tempo . (A) Gruppo di controllo. (B) Gruppo di veicoli. (C) Gruppo DNFB. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Effetto della somministrazione di DNFB sul gonfiore dell'orecchio nei topi . (A) Differenza nello spessore dell'orecchio tra l'orecchio sinistro e quello destro dei topi durante la modellazione. (B) Confronto dello spessore dell'orecchio sinistro e destro dei topi in ciascun gruppo alla fine della modellazione. (C) Effetto della somministrazione di DNFB sulla permeabilità vascolare dell'orecchio nei topi. (n = 6. ***p < 0,001, confronto tra orecchie destre e orecchie sinistre; N.S. = Nessun significativo). Tutti i dati sono stati espressi come media ± SEM. Diverse analisi di trattamento tra i gruppi sono state analizzate utilizzando il test t di uno studente spaiato o l'analisi unidirezionale della varianza con il test di Dunnett. Valori di p inferiori a 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Effetti della somministrazione di DNFB sul peso corporeo e sull'indice della milza nei topi . (A) Variazioni del peso corporeo dei topi in ciascun gruppo durante la modellazione. (B) Confronto delle variazioni di peso corporeo nei topi in ciascun gruppo il giorno 11. (C) Confronto delle dimensioni della milza in ciascun gruppo di topi. (D) Confronto dell'indice di milza tra gruppi di topi. (n = 6. *p < 0,05, rispetto al gruppo di controllo; N.S. = Nessun significativo). Tutti i dati sono stati espressi come media ± SEM. Diverse analisi di trattamento tra i gruppi sono state analizzate utilizzando il test t di uno studente spaiato o l'analisi unidirezionale della varianza con il test di Dunnett. Valori di p inferiori a 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui descritto per indurre sintomi simili all'ACD nelle orecchie dei topi può essere utilizzato per studiare la fisiopatologia dell'ACD e come strumento di screening per lo sviluppo di nuovi farmaci.
Ci sono due passaggi chiave per stabilire un modello ACD: sensibilizzazione iniziale e successiva stimolazione. L'addome è di solito il sito di sensibilizzazione iniziale, ma il sito di stimolazione successivo è stato scelto in modo leggermente diverso. Studi precedenti hanno dimostrato che la maggior parte degli studiosi sceglie di utilizzare sensibilizzanti chimici come DNFB / DNCB o oxazolone per stabilire modelli ACD sulla schiena o sul collo dei topi, ed è inevitabile usare lame o trimmer per depilare l'area di modellazione dei topi17,18,19. Tuttavia, questo passaggio può facilmente distruggere la barriera cutanea e influenzare gli esperimenti successivi. Inoltre, il farmaco gocciolante è difficile da distribuire uniformemente ed è facilmente assorbito dai capelli vicini, a causa della vasta area sulla nuca e dell'influenza dei capelli circostanti.
In questo protocollo sperimentale, abbiamo scoperto che eseguire la manipolazione per la successiva stimolazione nella superficie interna dei padiglioni auricolari del topo ci ha permesso di alleviare alcuni dei problemi di cui sopra, contribuendo a stabilire un modello ACD stabile e altamente riproducibile. In accordo con i nostri esperimenti ripetuti20, abbiamo anche ottimizzato e regolato l'intervallo dello stimolo sensibilizzante e il periodo sperimentale. In conformità con il metodo sperimentale dato, un effetto di modellazione molto evidente può essere ottenuto il 10 ° giorno. Inoltre, poiché l'area di modellazione si trova sul lato interno relativamente indipendente del padiglione auricolare, su cui i fattori esterni hanno meno interferenze, c'è meno differenza nella gravità dell'ACD nei topi nello stesso gruppo sperimentale in questo esperimento.
Questo protocollo sperimentale ha anche alcune carenze. In primo luogo, l'applicazione di sensibilizzanti chimici all'orecchio deve essere eseguita con cautela per evitare che le sostanze chimiche entrino nel condotto uditivo e danneggino i topi. In secondo luogo, i modelli ACD sono spesso usati come mezzo per studiare il prurito cronico nei topi. Nel modello ACD stabilito sulla nuca dei topi, gli attacchi di graffio nei topi potrebbero essere osservati intuitivamente e la gravità del sintomo prurito nei topi potrebbe essere misurata da questo. Sebbene il comportamento di graffio sia stato osservato anche nei topi durante il nostro esperimento, i topi avevano anche abitudini spontanee di pulizia dell'orecchio, rendendo difficile distinguere dal comportamento patologico di graffio. Ciò ha limitato l'uso di questo modello nell'osservazione del comportamento di graffio indotto da ACD. Se il protocollo è applicabile a questo tipo di studio è soggetto a ulteriori verifiche sperimentali.
Per tracciare il decorso patologico dell'ACD, sono stati utilizzati una varietà di metodi di monitoraggio, come i sintomi clinici dell'orecchio, la misurazione dello spessore dell'orecchio e la riflessione della permeabilità vascolare. Questi indicatori patologici sono più visibili nell'orecchio che nella pelle del collo e della schiena. Quando si misura lo spessore dell'orecchio di un topo, si verificano errori di misurazione a causa del comportamento in difficoltà del topo e dello spessore irregolare dell'orecchio. Per ridurre gli errori di misurazione, le misurazioni devono essere eseguite in tre punti diversi su ciascun orecchio. Iniettando il colorante Evans per valutare la permeabilità vascolare dell'area modellata, è possibile vedere la gravità della dermatite, tuttavia, ciò richiede anche un alto tasso di successo dell'iniezione della vena caudale. Se è necessaria un'ulteriore analisi comparativa, è possibile determinare l'assorbanza del surnatante dell'omogenato del tessuto auricolare del topo.
Vale anche la pena ricordare che, nella nostra precedente ricerca20, la struttura del tessuto dell'orecchio era ben organizzata e meno influenzata da altre strutture tissutali disordinate (ad esempio, follicoli piliferi), rispetto al tessuto cutaneo del collo e della schiena, il che ha portato a scegliere quest'area per la ricerca.
In conclusione, il modello di ACD descritto in questo articolo è un metodo di modellazione stabile ed efficiente ed è degno di promozione negli studi successivi sulla dermatite allergica da contatto.
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Disclosures
Gli autori non segnalano conflitti di interesse in questo lavoro.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (NSFC) a N.-N. Y. (81904212); Progetto di scienza e tecnologia della medicina tradizionale cinese di Jiangsu (YB201995); e il progetto di finanziamento speciale per i ricercatori post-dottorato in Cina (2020T130562).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Merck | 200-734-3 | 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene, ≥99% |
| Acetone | Sinopharm Chemical Reagent Co. LTD | 10000418 | ≥99.5% |
| Aluminum foil | Cleanwrap | CF-2 | |
| Evans blue dye | Solarbio | 314-13-6 | Dye content approx. 80% |
| Mouse fixator | ZHUYANBANG | GEGD-SM1830 | |
| Olive oil | Solarbio | 8001-25-0 | 500 ml |
| Pipet tip | Biofount | FT-200 | 10 - 200 μl |
| Pipettor | Eppendorf AG | 3123000250 | 20 - 200 μl |
| Razor blade | Shanghai Gillette Co. LTD | 74-S | |
| Vernier calipers | Delixi Electric | DECHOTVCS1200 |
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