Summary
ここでは、1-フルオロ-2,4-ジニトロベンゼン(DNFB)によるマウス耳のアレルギー性接触皮膚炎の誘発方法と、アレルギー性接触皮膚炎の重症度を評価する方法について説明します。
Abstract
皮膚は人体の最初の防衛線であり、環境化学物質に最もさらされている臓器の1つです。アレルギー性接触皮膚炎(ACD)は、局所的な発疹、発赤、および皮膚病変として現れる一般的な皮膚疾患です。ACDの発生と発症は、遺伝的要因と環境要因の両方の影響を受けます。近年、多くの学者がACDの一連のモデルを構築していますが、これらのモデルの実験プロトコルはすべて異なるため、読者がそれらをうまく確立することは困難です。したがって、安定した効率的な動物モデルは、アトピー性皮膚炎の病態をさらに研究するために非常に重要です。本研究では、マウスの耳にACD様症状を誘発するための1-フルオロ-2,4-ジニトロベンゼン(DNFB)を用いたモデリング手法を詳述し、モデリング中に皮膚炎の重症度を評価するためのいくつかの方法について説明します。この実験プロトコルは、いくつかの実験でうまく適用されており、ACD研究の分野で一定の促進的役割を果たしています。
Introduction
アレルギー性接触皮膚炎(ACD)は、接触部位の湿疹様症状、中等症の場合は浮腫および紅斑、重症の場合は丘疹、びらん、滲出、さらには大規模な瘢痕を特徴とする一般的な皮膚疾患です1。それは人口の最大20%に影響を及ぼし、あらゆる年齢の人々に影響を与える可能性があります2。ACDは、アレルゲンに繰り返し曝露された個人によく発生し、自宅や職場での1つ以上のアレルゲンに対する個人の免疫応答によって引き起こされる可能性があります3。IV型遅延型過敏症は、ACD4における免疫応答の主なタイプと考えられている。アレルゲンに繰り返しさらされている皮膚の領域では、循環メモリーT細胞が大量に蓄積し、免疫および炎症反応を誘発します3,5,6。この研究の目的は、ACDの発症における免疫学的および炎症反応のさらなる調査のための信頼できる実験室技術を提案することです。
ACDの発症は通常、化学物質への繰り返しの曝露によって引き起こされる接触過敏症によるものです。多くの研究者が、病気の発症をシミュレートするために、過去数十年にわたって、家妃マウス7,8、モルモット9,10、およびその他の動物でさまざまなACD動物モデルを開発しました。実験方法のほとんどは、腹部感作(誘導)と背中または耳たぶへの刺激の提供(刺激)の2つの段階で構成されています。一般的に使用される化学物質には、主に1-フルオロ-2,4-ジニトロベンゼン(DNFB)/ 1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼン(DNCB)8,9,11、オキサゾロン12、ウルシオール13などがあります。その中で、DNFBとDNCBが最も広く使用されており、1958年10月に最初に報告されました10。ニッケル感作モデル14や光アレルギー性接触皮膚炎モデル15も多用される。
ACDモデルを構築するための実験的方法を提示する。この方法は、以前の研究に基づいて、複数の実験と比較して要約および最適化されています。他のACDモデルと比較して、このモデルには、小さな個人差、短い実験期間、少量の化学刺激など、いくつかの利点があります。さらに、この研究は、経済的であるだけでなく、遺伝子ノックアウトまたはトランスジェニックマウスの準備のためのより多くの選択肢があるマウスに適用できます16。また、耳の厚さの測定、炎症性滲出液の測定のためのエバンスブルー染料の使用など、実験でACDの進行状況を監視するために使用されるさまざまな方法についても説明します。このモデルは、マウスの耳、血液、脾臓、およびその他のサンプルを実験室で分析してACDの病因を調査できるだけでなく、特定のプロモーションの重要性を持つ新しい治療法の前臨床評価にも適用できます。
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Protocol
マウスのすべてのケアと治療は、揚州大学の施設動物管理使用委員会によって確立されたガイドラインに従っており、プロジェクトライセンスSYXK(SU)2022-0044の下で施設動物管理および使用委員会によって承認されました。この研究では、6〜8週齢のBALB / cオスおよびメスマウスを使用しました。各グループは6匹のマウスで構成されていました( 材料表を参照)。ケージは、食物と水に自由にアクセスできる温度制御されたチャンバー(22±2°C、12時間の明暗サイクル)に置かれました。実験フロー図を 図1に示します。
1.動物の準備
- 環境に1週間順応した後、モデリングを開始します。
- マウスを操作する前に、紫外線ランプと75%アルコール消毒剤を使用して、環境とカウンタートップを洗浄および消毒します。
注意: 外的要因の影響を避けるために、マウスの耳に識別用のマーキングを行うことはできません。背中や尾の染色を代わりに使用することができます。 - 小さな綿棒を使用して、マウスの腹部に石鹸水を塗布します(サイズは約1〜2 cm2)。モデリングの開始時(0日目;図2A)。
注意: 脱毛にまっすぐなかみそりの刃を使用するには、熟練したオペレーターが必要です。正しく行わないと、皮膚の炎症を引き起こす可能性があります。脱毛には、脱毛クリーム、バリカン、または安全かみそりの使用を検討してください。 - マウスの体重を量り、各グループの体重変化を比較します。
2.腹部感作刺激
- シェービングによって引き起こされる腹部の皮膚への軽微な損傷の完全な回復を確実にする。剃毛の2日後(2日目)に腹部感作を適用します。
- 0.5%DNFB溶液を調製します:DNFBをアセトン:オリーブオイルの混合物で4:1の比率で希釈します(例:400 μLのアセトンと100 μLのオリーブオイルを混合; 材料表を参照)。ピペットガンを使用して20回ブローおよび混合し、DNFB溶液を完全に混合します。マウスへのDNFB溶液の各投与の前に、それを3〜5回吹き付けて混合する。
注意: 使用前に溶液を準備し、直射日光から保護するためにアルミホイルで包みます。 - 25 μLの0.5%DNFB溶液をピペッターでマウスの腹部の剃毛領域の皮膚に塗布します(図2B)。
- DNFB溶液を腹部シェービングエリアの中央に滴下し、ピペッターチップの滑らかな面で軽く広げて均一に分散させます。
- DNFB刺激後30秒で、マウスを寝具のない空のケージに入れて、DNFB溶液がこすれないようにします。DNFB溶液が完全に乾いたら(約2分間)、マウスを元のケージに戻します。
- DNFB溶液は人間の皮膚に強く刺激するため、取り扱うときは手袋を着用してください。
3.耳感作刺激
- 上記のように0.2%DNFB溶液、ビヒクル溶液(アセトンとオリーブオイルの4:1混合物)、および純水を調製します。
- マウスの体の向きを合わせ、DNFB刺激中に溶液が外耳道に入らないように、操作全体を通して耳介の外側の境界を下向きにします。
- 4、6、8、および10日目に、ピペッターを使用して、20 μLの0.2%DNFB溶液またはビヒクル溶液をマウスの左耳介の内面にゆっくりと均一に塗布します。DNFB溶液が外耳道に入るのを防ぐために、ピペッターチップの滑らかな側を使用して、投与中にDNFB溶液を穏やかに分配します。右耳は未治療のままにします(図2C)。
- DNFB溶液が乾くまで待ち、マウスをケージに戻します(約30秒)。
- DNFBソリューションを取り扱うときは手袋を着用してください。
4.マウスの体重とACDの症状を記録する
- マウスの体重を毎日測定し、1日目から開始し、0日目に対応する体重と比較します。マウスの体重に対するACDの効果を体重変化(g)±平均の標準誤差(SEM)として評価する。
- マウスの耳の高解像度写真を撮り、1日目から2日ごとにACDの臨床症状を記録します。
5.耳介の厚さの測定
- 1日目から2日ごとに耳介の厚さを測定します。両耳を詳細に測定して記録します。
- ノギス( 材料表を参照)を使用して、正確な結果を得るために毎日同時に耳介の厚さを測定します(図3A)。バーニアキャリパーが内側へのclを継続するのを止めますampマウスの耳への組織の損傷を防ぐために、わずかな詰まりがある場合。位置を固定し、データを記録します。
- 各耳介の3つの異なる場所から厚さを収集します(図3B)。3 つのデータの平均を有効な値として記録します。耳の腫れをマイクロメートル(μm)±平均の標準誤差(SEM)で評価します。
6.炎症性腫脹の程度の評価
- 0.5%エバンスブルー染料( 材料表を参照)溶液を調製します:11日目にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でエバンスブルー染料を希釈します。エバンスの青い染料は人間にわずかに有毒であるため、常に白衣と手袋を着用してください。
- 固定具でマウスを固定します:固定具の蓋を開け( 材料の表を参照)、マウスの尾を持ち、マウスの頭を固定具に向け、マウスを本能的に固定具に登らせます。蓋を覆い、マウスの尻尾を蓋の穴から出させ、固定具の長さを調整してマウスの尻尾全体を露出させます。
- アルコール綿球で尾を繰り返し拭くか、温水に30秒間浸し、尾の根元をそっとつまんで両側の静脈を満たして拡張します。冷光源の照射下で注入を行う。
- 1 mmのインスリン針を使用して、エバンスブルー染料溶液をマウス尾静脈にゆっくりと注入します。15分待ってから、マウスの耳の写真を撮ります。
注意: マウスをテーブルの上に置き、そっと保持して、画像取得のために耳の領域を露出させます。エバンスブルー染料溶液を注射し、対応する適応症を観察した直後に、頸部脱臼を使用してマウスを安楽死させます。
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Representative Results
DNFB刺激を繰り返すと、DNFB群のマウスの耳はACDに匹敵する明らかな臨床症状を示し、敏感な領域は発赤、乾燥、さらにはびらんや滲出の典型的な症状を示しました。しかし、純水の耳投与(対照群)または溶媒対照(ビヒクル群)は同様の症状を生じさせなかった(図4)。
一方、DNFB群では、未治療の右耳と比較して、DNFB刺激後に左耳の厚さが有意に増加したのに対し(図5A)、対照群と車両群では有意差がなかった(図5B)。DNFB群マウスの左耳は、モデリングの11日目にエバンスブルー染料を注入した後、明らかに紺色に変わり、右耳とは視覚的に異なっていました。しかしながら、対照群およびビヒクル群におけるマウスの左右の耳はほぼ同じ色であった(図5C)。
さらに、マウスの体重変化を解析した。マウスの体重増加は、DNFBまたは単純なビヒクル刺激によってわずかに遅くなったが(図6A)、有意な体重減少はもたらさなかった(図6B)。同時に、マウスを屠殺した直後に脾臓を単離した。脾臓指数は、マウスの体重と脾臓の重量に従って計算されました。計算式は以下の通りである。
脾臓指数=脾臓重量(g)/体重(g)x 100
結果は、マウスの耳でDNFB刺激を繰り返しても、脾臓の肥大(図6C)と脾臓指数の増加(図6D)をもたらしたが、ビヒクル群のマウスの脾臓指数は有意に変化しなかったことを示している。DNFBの刺激下では、DNFB群のマウスの免疫応答機能が亢進していることが証明されました。
図1:ACD成形時間軸の模式図。矢印は、対応する時間に何が行われたかを示します。関連する操作には、シェービング、感作、耳介測定、計量、写真撮影、およびエバンスブルー染料の塗布が含まれます。略語:DNFB = 1-フルオロ-2,4-ジニトロベンゼン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ACDモデル確立の操作方法 。 (A)腹部シェービングの操作。(B)腹部感作刺激の操作。(C)耳感作刺激の操作。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:耳の腫れの評価方法 。 (A)マウスにおける耳の厚さ測定の操作。(B)マウスにおける耳の厚さ測定部位。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:経時的なマウスの耳に対するDNFB投与の効果の代表的な写真 。 (A)対照群。(B)車両グループ。(C)DNFB基。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:マウスの耳の腫れに対するDNFB投与の効果 。 (A)モデリング時のマウスの左耳と右耳の耳の厚さの違い。(B)モデリング終了時の各群のマウスの左右の耳の厚さの比較。(C)マウスの耳血管透過性に対するDNFB投与の効果。(n = 6. ****p < 0.001、右耳と左耳の比較;N.S. = 有意なし)。すべてのデータはSEM±平均値として表した。 グループ間の異なる治療分析は、対応のないスチューデントのt検定またはダネットの検定との一元配置分散分析を使用して分析されました。0.05未満の p 値は統計的に有意であると見なされました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:マウスの体重と脾臓指数に対するDNFB投与の影響 。 (A)モデリング中の各群のマウスの体重変化。(B)11日目の各群のマウスの体重変化の比較。(C)マウスの各群における脾臓サイズの比較。(D)マウス群間の脾臓指数の比較。(n = 6. *p < 0.05、対照群と比較して;N.S. = 有意なし)。すべてのデータはSEM±平均値として表した。 グループ間の異なる治療分析は、対応のないスチューデントのt検定またはダネットの検定との一元配置分散分析を使用して分析されました。0.05未満の p 値は統計的に有意であると見なされました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
マウスの耳にACD様症状を誘発するためのここで説明するプロトコルは、ACDの病態生理学を研究するため、および新薬開発のためのスクリーニングツールとして使用できます。
ACDモデルを確立するには、初期感作とその後の刺激の2つの重要なステップがあります。腹部は通常、最初の感作部位であるが、その後の刺激部位はわずかに異なって選択された。以前の研究では、ほとんどの学者がマウスの背中や首にACDモデルを確立するためにDNFB / DNCBやオキサゾロンなどの化学増感剤を使用することを選択しており、マウスのモデリング領域を脱毛させるためにブレードまたはトリマーを使用することは避けられません17,18,19。ただし、このステップは皮膚バリアを簡単に破壊し、その後の実験に影響を与える可能性があります。さらに、滴下した薬剤は、首筋の面積が広く、周囲の毛の影響により、均一に分布しにくく、近くの毛に吸収されやすくなります。
この実験プロトコルでは、マウス耳介内面でその後の刺激に対する操作を行うことで、上記のトラブルの一部を軽減することができ、安定した再現性の高いACDモデルの確立に役立つことを見出しました。我々の繰り返し実験20に従い、感作刺激の間隔および実験期間も最適化および調整した。与えられた実験方法に従って、非常に明白なモデリング効果が10日目に得ることができる。また、モデリング領域は外的要因の干渉が少ない比較的独立した耳介の内側にあるため、本実験の同じ実験群のマウスではACDの重症度に差が少ない。
この実験プロトコルにはいくつかの欠点もあります。まず、化学物質が外耳道に入ってマウスに害を及ぼさないように、化学増感剤を耳に塗布する場合は注意が必要です。第二に、ACDモデルは、マウスの慢性的なかゆみを研究する手段としてよく使用されます。マウスのうなじに確立したACDモデルでは、マウスの引っ掻き傷の発作を直感的に観察することができ、これによりマウスのかゆみ症状の重症度を測定することができました。実験中、マウスでも引っ掻き行動が観察されましたが、マウスには自発的な耳掃除習慣もあり、病的な引っ掻き行動との区別が困難でした。これにより、ACDによる引っかき行動を観察する際のこのモデルの使用は制限されました。プロトコルがこのタイプの研究に適用できるかどうかは、さらなる実験的検証の対象となります。
ACDの病理学的経過を追跡するために、臨床耳の症状、耳の厚さの測定、血管透過性の反映など、さまざまなモニタリング方法が使用されました。これらの病理学的指標は、首や背中の皮膚よりも耳の方が目立ちます。マウスの耳の厚さを測定する場合、マウスの苦労行動や耳の厚さの不均一により、測定エラーが発生します。測定ミスを減らすために、測定は各耳の3つの異なる場所で実行する必要があります。エバンス色素を注入してモデル領域の血管透過性を評価することにより、皮膚炎の重症度を確認できますが、これも尾静脈注射の高い成功率が必要です。さらなる比較分析が必要な場合は、マウス耳組織ホモジネートの上清の吸光度を決定することができる。
また、以前の研究20では、耳の組織の構造はよく組織化されており、首や背中の皮膚組織よりも他の無秩序な組織構造(毛包など)の影響を受けにくいため、この領域を研究に選択したことにも言及する価値があります。
結論として、この論文に記載されているACDのモデルは、安定した効率的なモデリング方法であり、アレルギー性接触皮膚炎のその後の研究で促進する価値があります。
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Disclosures
著者らは、この研究における利益相反はないと報告している。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(NSFC)からN.-Nの支援を受けました。(81904212);江蘇省漢方薬科学技術プロジェクト(YB201995);中国ポスドク特別助成事業(2020T130562)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Merck | 200-734-3 | 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene, ≥99% |
| Acetone | Sinopharm Chemical Reagent Co. LTD | 10000418 | ≥99.5% |
| Aluminum foil | Cleanwrap | CF-2 | |
| Evans blue dye | Solarbio | 314-13-6 | Dye content approx. 80% |
| Mouse fixator | ZHUYANBANG | GEGD-SM1830 | |
| Olive oil | Solarbio | 8001-25-0 | 500 ml |
| Pipet tip | Biofount | FT-200 | 10 - 200 μl |
| Pipettor | Eppendorf AG | 3123000250 | 20 - 200 μl |
| Razor blade | Shanghai Gillette Co. LTD | 74-S | |
| Vernier calipers | Delixi Electric | DECHOTVCS1200 |
References
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