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Biochemistry

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा सूक्ष्मनलिकाएं-प्रोटीन परिसरों का अध्ययन करने के लिए स्तनधारी कोशिकाओं से संशोधित सूक्ष्मनलिकाएं निकालना

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/65126
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Oncode Institute and Division of Biochemistry, Netherlands Cancer Institute

Summary

यहां, हम स्तनधारी कोशिकाओं से अंतर्जात ट्यूबुलिन निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसमें विशिष्ट संशोधन के लिए समृद्ध सूक्ष्मनलिकाएं प्राप्त करने के लिए विशिष्ट सूक्ष्मनलिकाएं-संशोधित एंजाइमों की कमी या शामिल हो सकती है। फिर हम वर्णन करते हैं कि क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए ग्रिड तैयार करने के लिए निकाले गए सूक्ष्मनलिकाएं शुद्ध सूक्ष्मनलिकाएं-बाध्यकारी प्रोटीन से कैसे सजाई जा सकती हैं।

Abstract

सूक्ष्मनलिकाएं साइटोस्केलेटन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा हैं और इंट्रासेल्युलर संगठन, कोशिका विभाजन और प्रवासन में शामिल हैं। पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों के आधार पर, सूक्ष्मनलिकाएं विभिन्न अंतःक्रियात्मक प्रोटीन के साथ कॉम्प्लेक्स बना सकती हैं। ये सूक्ष्मनलिका-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स अक्सर मानव रोगों में फंस जाते हैं। ऐसे परिसरों की संरचना को समझना उनकी क्रिया के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए उपयोगी है और क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) द्वारा अध्ययन किया जा सकता है। संरचनात्मक अध्ययन के लिए ऐसे परिसरों को प्राप्त करने के लिए, विशिष्ट पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों वाले या कमी वाले सूक्ष्मनलिकाएं निकालना महत्वपूर्ण है। यहां, हम आनुवंशिक रूप से संशोधित स्तनधारी कोशिकाओं से अंतर्जात ट्यूबुलिन निकालने के लिए एक सरलीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसमें सूक्ष्मनलिका पोलीमराइजेशन शामिल है, इसके बाद अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके अवसादन होता है। निकाले गए ट्यूबुलिन का उपयोग तब सूक्ष्मनलिकाएं के साथ क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप ग्रिड तैयार करने के लिए किया जा सकता है जो रुचि के शुद्ध सूक्ष्मनलिका-बाध्यकारी प्रोटीन से बंधे होते हैं। एक उदाहरण के रूप में, हम तीन ज्ञात ट्यूबुलिन-डिटायरोसिनिंग एंजाइमों की कमी के लिए इंजीनियर सेल लाइनों से पूरी तरह से टायरोसिनेटेड सूक्ष्मनलिकाएं के निष्कर्षण का प्रदर्शन करते हैं। इन सूक्ष्मनलिकाएं तब क्रायो-ईएम ग्रिड पर एंजाइमेटिक रूप से निष्क्रिय सूक्ष्मनलिका-संबंधित ट्यूबुलिन डेटायरोसिनेस के साथ एक प्रोटीन कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए उपयोग की जाती हैं।

Introduction

सूक्ष्मनलिकाएं साइटोस्केलेटन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा हैं; वे सेल माइग्रेशन और डिवीजन जैसे विभिन्न कार्यों में शामिल हैं, लेकिन इंट्रासेल्युलर संगठन में भी योगदान करते हैं। विभिन्न कार्यात्मक भाग्य के अनुकूल होने के लिए, सूक्ष्मनलिकाएं विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मनलिकासे जुड़े प्रोटीन (एमएपी), एंजाइम और अन्य प्रोटीन के साथ बातचीत करती हैं, जिन्हें हम सामूहिक रूप से "सूक्ष्मनलिका-अंतःक्रियात्मक प्रोटीन" के रूप में संदर्भित करेंगे। इन प्रोटीनों के सूक्ष्मनलिका बंधन को विभिन्न ट्यूबुलिन संशोधनों द्वारा निर्देशित किया जा सकता है, जिसे आमतौर पर "ट्यूबुलिन कोड" कहा जाता है। इस वरीयता के उदाहरण माइटोटिक सेंट्रोमियर से जुड़े किन्सिन (एमसीएके)2 और पी 1503 के डायनेन-डायनेक्टिन सीएपी-ग्लाइ डोमेन हैं, जो अधिमानतः टायरोसिनेटेड ट्यूबुलिन के साथ जुड़ते हैं, जबकि किन्सिन मोटर्स सेंट्रोमियर से जुड़े प्रोटीन ई (सीईएनपी-ई)4 और किन्सिन -2 5 ट्यूबुलिन पसंद करते हैं जिसमें सी-टर्मिनल टायरोसिन की कमी होती है।

जबकि सूक्ष्मनलिका-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए विभिन्न तरीकों को नियोजित किया जा सकता है, क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) का उपयोग अक्सर निकट-परमाणु संकल्प 6,7 पर इन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। हाल के वर्षों में, क्रायो-ईएम संरचनाओं से पता चला है कि कैसे बड़े मोटर प्रोटीन जैसे डायनेन 8,9,10 और किन्सिन11, + टीआईपी प्रोटीन जैसे ईबी 312,13 और एमसीएके 14, अन्य प्रोटीन जैसे ताऊ 15,16, और यहां तक कि छोटे अणु जैसे पैक्लिटैक्सेल, पेलोरुसाइड और ज़म्पानोलाइड 17। सूक्ष्मनलिकाएं के साथ बातचीत करें। सूक्ष्मनलिका-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए, सूक्ष्मनलिकाएं आमतौर पर पोर्सिन मस्तिष्क18 से निकाली जाती हैं। इसके बाद, क्रायो-ईएम सूक्ष्मनलिका संरचनाओं सहित अधिकांश इन विट्रो अध्ययन, पोर्सिन मस्तिष्क ट्यूबुलिन का उपयोग करके किए जाते हैं। इसलिए, इन अध्ययनों के परिणाम, ऊतकों और सेल प्रकारोंके बीच ट्यूबुलिन संशोधनों की विषम प्रकृति के महत्व को अस्पष्ट करते हैं। यह एक प्रोटीन की जांच करते समय एक विशेष समस्या पैदा करता है जिसे सूक्ष्मनलिकाएं बांधने के लिए एक विशिष्ट संशोधन की आवश्यकता होती है या पसंद होती है। इसे टाइरोसिनेटेड ट्यूबुलिन के साथ चित्रित किया जा सकता है, जो सूक्ष्मनलिका डेटायरोसिनेस मैटकैप के लिए सब्सट्रेट है।

डिटायरोसिनेशन एक ट्यूबुलिन संशोधन है जिसमें α-ट्यूबुलिन के सी-टर्मिनल अमीनो एसिड टायरोसिन की कमी होती है, जो माइटोटिक, कार्डियक और न्यूरोनल फ़ंक्शन20 से जुड़ा होता है। जबकि पूरी तरह से टायरोसिनेटेड सूक्ष्मनलिकाएं मैटकैप के लिए आदर्श सब्सट्रेट हैं, यह इस ऊतक22,23,24,25,26 में वैसोहिबिन्स 21,22 और मैटकैप 23 डेटायरोसिनेस के कार्य के कारण पोर्सिन मस्तिष्क से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सूक्ष्मनलिकाएं में काफी हद तक अनुपस्थित है।. यद्यपि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हेला ट्यूबुलिन में ज्यादातर टायरोसिनेटेड सूक्ष्मनलिकाएं होती हैं, डिटायरोसिनेशन हो सकता है, और इसलिए, ट्यूबुलिन का यह स्रोत क्रायो-ईएम विश्लेषण के लिए एक समान नमूना बनाने के लिए कम उपयुक्त है।

सूक्ष्मनलिकाएं के लिए मैटकैप के बंधन को प्रोत्साहित करने और संरचनात्मक विश्लेषण के लिए एक सजातीय नमूना बनाने के लिए, हमने सूक्ष्मनलिकाएं के एक स्रोत की मांग की जो पूरी तरह से टायरोसिनेटेड है। इसके लिए, एक मैटकैप और वासोहिबिन-कमी वाली सेल लाइन बनाई गई थी, जिसका उपयोग पूरी तरह से टायरोसिनेटेड सूक्ष्मनलिकाएं निकालने के लिए किया गया था। निष्कर्षण प्रक्रिया अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल पर आधारित थी जो मस्तिष्क के ऊतकों या कोशिकाओं 18,27,28,29,30 से ट्यूबुलिन निकालने के लिए सूक्ष्मनलिकाएं के पोलीमराइजेशन और डीपोलीमराइजेशन के बार-बार चक्रों का उपयोग करती है, जिसमें ग्लिसरॉल कुशन पर केवल एक पोलीमराइजेशन चरण और सेंट्रीफ्यूजेशन होता है। एक उदाहरण के रूप में मैटकैप का उपयोग करते हुए, हम तब प्रदर्शित करते हैं कि इन सूक्ष्मनलिकाएं क्रायो-ईएम अध्ययनों के लिए कैसे उपयोग की जा सकती हैं। क्रायो-ईएम ग्रिड तैयार करने के लिए, कम नमक एकाग्रता पर दो-चरण यी अनुप्रयोग प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। इस पेपर के तरीके क्रायो-ईएम विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त मात्रा और शुद्धता पर अनुकूलन योग्य सूक्ष्मनलिकाएं के निष्कर्षण का वर्णन करते हैं और क्रायो-ईएम ग्रिड पर प्रोटीन-सूक्ष्मनलिका परिसर बनाने के लिए इन सूक्ष्मनलिकाएं का उपयोग करने के तरीके पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों और उपकरणों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. सेल संस्कृति

नोट: सभी सेल कल्चर को एक बाँझ लामिनर प्रवाह हुड में किया जाना चाहिए।

  1. इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, पहले 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जमे हुए कोशिकाओं की एक शीशी को पिघलाएं। यहां, हम एक आनुवंशिक रूप से संशोधित एचसीटी 116 सेल लाइन का उपयोग करते हैं जिसमें टायरोसिनेटेड ट्यूबुलिन बनाने के लिए तीन ज्ञात डिटायरोसिनेटिंग एंजाइमों, वीएएसएच 1, वीएएसएच 2 और मैटकैप की कमी होती है।
  2. उपयुक्त सेल कल्चर माध्यम के 10 एमएल युक्त एक Ø 10 सेमी प्लेट तैयार करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, डीएमईएम (डलबेकको का संशोधित ईगल माध्यम) आनुवंशिक रूप से संशोधित एचसीटी 116 सेल लाइन के लिए 10% वी / वी एफसीएस (भ्रूण बछड़ा सीरम) और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक (संस्कृति माध्यम) के साथ पूरक किया गया था।
  3. तैयार 10 सेमी प्लेट में कोशिकाओं की गिनती करें, और बीज ~ 2.5 × 106 व्यवहार्य कोशिकाएं (~ 20% संगम) करें। कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए प्लेट को धीरे से हिलाएं। डिश को 37 डिग्री सेल्सियस सेल-कल्चर इनक्यूबेटर में 5% (वी / वी) सीओ2 के साथ इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं 80% -90% संगम तक न पहुंच जाएं।
    नोट: आमतौर पर, एचसीटी 116 कोशिकाओं के लिए इसमें 3 दिन लगते हैं, लेकिन समय विशिष्ट सीडिंग घनत्व और उपयोग की जाने वाली सेल लाइन पर निर्भर हो सकता है।
  4. पिपेट या वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग करके सेल कल्चर माध्यम को छोड़ दें और डिश को 2 x 5 एमएल पीबीएस से धो लें।
    नोट: ध्यान रखें कि पीबीएस को सेल मोनोलेयर पर बहुत बलपूर्वक वितरित न करें क्योंकि यह प्लेट से कोशिकाओं को अलग कर सकता है।
  5. ट्रिप्सिन के 1-2 एमएल जोड़ें, और कोशिकाओं को अलग करने के लिए 2-5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. ट्रिप्सिन को बुझाने के लिए प्लेट में 2 एमएल कल्चर माध्यम जोड़ें।
  7. सेल निलंबन को तीन से पांच बराबर भागों में विभाजित करें और उन्हें संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए फिर से बीज दें जब तक कि 6-12 कंफ्लुएंट 15 सेमी प्लेटें प्राप्त न हो जाएं।

2. कटाई

  1. किसी भी सेल कल्चर माध्यम को हटाने के लिए पीबीएस (1x) के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को धीरे से धोएं।
  2. कोशिकाओं को प्लेटों से अलग करके कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 3 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा पीबीएस के साथ 5 एमएम ईडीटीए (बाँझ / फ़िल्टर ्ड) के साथ पूरक किया जाता है और बाद में, सेल स्क्रैपर का उपयोग करके।
  3. बर्फ पर 50 एमएल ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और नीचे (10 मिनट, 250 × ग्राम) घुमाएं।
    1. 50 एमएल ट्यूब पर वॉल्यूमेट्रिक स्केल के साथ काटी गई कोशिकाओं की मात्रा पर ध्यान दें।
      नोट: अपेक्षित मात्रा ~ 0.5 एमएल और 4 एमएल के बीच कहीं भी हो सकती है। विराम चरण: एलएन 2 में सेल गोली को फ्लैश-फ्रीज करें, और उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। ध्यान दें कि सेल गोली केवल कुछ हफ्तों या महीनों के लिए संग्रहीत की जा सकती है। यदि गोली को लंबे समय तक रखा जाता है, तो इसके परिणामस्वरूप उपज में कमी हो सकती है या कोई सूक्ष्मनलिकाएं नहीं हो सकती हैं।

3. सूक्ष्मनलिका निष्कर्षण।

नोट: बर्फ पर चरण 3.1-3.5 के लिए सब कुछ रखें; चरण 3.6 से आगे सब कुछ गर्म (30-37 डिग्री सेल्सियस) रखा जाना चाहिए।

  1. 10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा लाइसिस बफर तैयार करें जिसमें 100 एमएम पाइप / केओएच (पीएच 6.9), 2 एमएम ईजीटीए / केओएच, 1 एमएम एमजीसीएल2, 1 एमएम पीएमएसएफ, और एक प्रोटीज अवरोधक टैबलेट (मिनी) शामिल हैं।
  2. काटे गए सेल गोली को 1: 1 वी / वी लाइसिस बफर में पुन: निलंबित करें (यदि सटीक मात्रा के बारे में संदेह है, तो अधिक के बजाय कम लाइसिस बफर लें)।
  3. सोनिकेशन द्वारा कोशिकाओं को लाइज़ करें: 15 सेकंड ऑन, 45 सेकंड ऑफ, और 30, चार चक्र (प्रयोगात्मक रूप से स्थितियों का निर्धारण करें, और सोनिकेटर के अनुसार बदलें)।
    1. सोनिकेशन के बाद, एसडीएस-पेज विश्लेषण के लिए एक नमूना एकत्र करें: 2 μL लाइसेट + 18 μL पानी + 5x SDS नमूना बफर का 5 μL।
      नोट: एक मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत जांचें कि क्या कोशिकाएं वास्तव में पूरी तरह से लाइसिस कर चुकी हैं।
  4. लाइसेड कोशिकाओं को एक केन्द्रापसारक ट्यूब में पिपेट करें। लाइसेट को साफ करने के लिए अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 100,000 × ग्राम पर 1 घंटे तक स्पिन करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि सेंट्रीफ्यूज के सही संतुलन को सुनिश्चित करने के लिए रोटर में सभी जेब सूखे और साफ हैं।
  5. साफ किए गए लाइसेट को बाहर निकालने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें। इस बात का ध्यान रखें कि पेलेट के साथ-साथ ऊपर की फ्लोटिंग परत को भी परेशान न करें।
    1. साफ किए गए लाइसेट का एक नमूना एकत्र करें: लाइसेट के 2 μL + 18 μL पानी + 5x SDS नमूना बफर के 5 μL।
    2. गोली को सावधानी से धोएं, और गोली के माध्यम से पी 10 पिपेट टिप को घुमाकर गोली का थोड़ा सा हिस्सा निकालें; 200 μL पानी और 50 μL SDS बफर जोड़ें।
  6. सूक्ष्मनलिकाएं को बहुलक बनाने के लिए 1 एमएम जीटीपी और 20 μM पैक्लिटैक्सेल के साथ पिछले चरण से सतह पर तैरनेवाला को पूरक करें; 1 एमएल की मात्रा के लिए, 2 एमएम पैक्लिटैक्सेल के 10 μL और 100 mM GTP के 10 μL जोड़ें।
    चेतावनी: पैक्लिटैक्सेल त्वचा की जलन, गंभीर आंखों की क्षति, श्वसन जलन, आनुवंशिक दोष, अजन्मे बच्चे को नुकसान और अंगों को नुकसान पहुंचा सकता है। लंबे समय तक या बार-बार संपर्क में आने से अंगों को नुकसान होता है। किसी भी तरह से पदार्थ को सांस न लें, स्प्रे न करें या धूल न दें। त्वचा के संपर्क को रोकने के लिए रबर नाइट्राइल दस्ताने पहनें।
  7. पैक्लिटैक्सेल-पूरक सुपरनैटेंट को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ताकि सूक्ष्मनलिकाएं इकट्ठा हो सकें।
  8. इस इनक्यूबेशन चरण के दौरान, रोटर और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज को 30 डिग्री सेल्सियस तक गर्म होने दें।
  9. कुशन बफर तैयार करें: 0.4 एमएल लाइसिस बफर में 0.6 एमएल ग्लिसरॉल जोड़ें, और मिश्रण को 20 μM पैक्लिटैक्सेल के साथ पूरक करें। कुशन बफर को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  10. एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में कुशन बफर के 800 μL जोड़ें। पैक्लिटैक्सेल-पूरक लाइसेट को कुशन बफर के शीर्ष पर सावधानी पूर्वक पिपेटते हैं।
    नोट: कुशन बफर और लाइसेट के मिश्रण को बहुत धीरे से पाइप िंग करके रोकें।
  11. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज रोटर में 30 डिग्री सेल्सियस पर 100,000 × ग्राम पर 30 मिनट के लिए स्पिन करें। सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब के बाहरी किनारे को चिह्नित करें ताकि आसानी से पहचाना जा सके कि सूक्ष्मनलिका गोली कहां बननी चाहिए।
  12. एक पिपेट का उपयोग करके कुशन बफर को सावधानी से हटा दें, इस बात का ध्यान रखें कि सूक्ष्मनलिका गोली को परेशान न करें।
    1. कुशन बफर का एक नमूना एकत्र करें: 2 μL + 18 μL पानी + 5x SDS नमूना बफर का 5 μL।
  13. ग्लिसरॉल को हटाने के लिए गर्म लाइसिस बफर के साथ गोली को 3 गुना सावधानी से धोएं। धीरे से गोली के बगल में गर्म बफर को वितरित करें (सीधे गोली पर तरल को फ्लश न करें), ट्यूब को गोली और ट्यूब की दीवारों से जितना संभव हो उतना ग्लिसरॉल निकालने के लिए कुछ बार घुमाएं, और फिर एस्पिरेट करें और दोहराएं।
    नोट: यदि ग्लिसरॉल को ठीक से धोया नहीं जाता है, तो ग्रिड इलेक्ट्रॉन रोशनी के तहत बहुत जल्दी पिघल जाएगा। यह उच्च कण आंदोलन से स्पष्ट हो सकता है, जिससे धुंधली छवियां बन सकती हैं।
  14. निम्नलिखित अवयवों के साथ रीसस्पेंशन बफर तैयार करें: 100 एमएम पाइप / केओएच (पीएच 6.9), 2 एमएम ईजीटीए / केओएच, और 1 एमएम एमजीसीएल2, और बफर को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  15. धुले हुए छर्रों को ~ 50 μL प्रीवार्म्ड रिसस्पेंशन बफर में कट टिप के साथ धीरे से पुन: निलंबित करें, और ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    1. पुन: निलंबित गोली अंश का एक नमूना एकत्र करें: 2 μL + 18 μL पानी + 5x SDS नमूना बफर का 5 μL।
      टिप: कट टिप सूक्ष्मनलिकाएं के टूटने को रोकता है। 37 डिग्री सेल्सियस तक एक धातु हीटिंग ब्लॉक तैयार करें, और इसे पॉलीस्टाइनिन बॉक्स में रखें ताकि नमूना ट्यूबों को कमरे के तापमान पर ठंडा किए बिना आसानी से ले जाया जा सके।

4. क्रायो-ईएम ग्रिड तैयारी

  1. ब्लोटिंग पेपर स्थापित करके डुबकी फ्रीजर डिवाइस तैयार करें। 30 डिग्री सेल्सियस तक डुबकी फ्रीजर को गर्म करें, और आर्द्रता को 100% तक सेट करें। तापमान और आर्द्रता को संतुलित करने के लिए ~ 30 मिनट की अनुमति दें।
  2. दो अनुप्रयोगों के लिए डुबकी फ्रीजर की सेटिंग्स तैयार करें, और यह सुनिश्चित करने के लिए एक बार पूरे प्रोग्राम के माध्यम से चलाएं कि सेटिंग्स ठीक से सेट हैं। सुनिश्चित करें कि पहले एप्लिकेशन में 10, 2 एस ब्लॉट टाइम और 0 एस प्रतीक्षा समय का बल है और दूसरे एप्लिकेशन में 10, 6.5 एस ब्लॉट टाइम और 10 सेकंड प्रतीक्षा समय का बल है।
  3. 60 सेकंड के लिए 30 एमए पर क्रायो-ईएम ग्रिड को चमक-डिस्चार्ज करें।
  4. एलएन 2 के साथ पॉलीस्टाइनिन कंटेनर असेंबली को ठंडा करें, और एक ठंडे धातु कप में ईथेन गैस को संघनित करके धातु के कप में तरल ईथेन तैयार करें।
  5. निम्नलिखित घटकों के साथ एक कमजोर पड़ने वाला बफर तैयार करें: 100 mM पाइप / KOH (pH 6.9), 2 mM EGTA / KOH, और 1 mM MgCl2, और इसे 37 °C तक गर्म करें।
  6. नमक की एकाग्रता को कम करने के लिए ग्रिड पर लागू करने से ठीक पहले कमजोर पड़ने वाले बफर के साथ सूक्ष्मनलिका-अंतःक्रियात्मक प्रोटीन 1: 1 वी / वी को पतला करें (हमने 50 एमएम एनएसीएल की अंतिम नमक एकाग्रता का उपयोग किया)। मिश्रण को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  7. डुबकी-चिमटी के साथ एक चमक-डिस्चार्ज ग्रिड पकड़ें और उन्हें डुबकी फ्रीजर में क्लिक करें।
  8. पॉलीस्टाइनिन कंटेनर को प्लांक फ्रीजर में तरल ईथेन के साथ रखें, और तैयार कार्यक्रम के माध्यम से चलाएं: पहले ग्रिड पर 3.5 μL सूक्ष्मनलिका समाधान लागू करें, डुबकी फ्रीजर को ग्रिड पर धब्बा लगाने दें, फिर तुरंत ताजा पतला प्रोटीन के 3.5 μL लागू करें, और अंत में, प्लंजर ब्लॉट को छोड़ दें और तरल ईथेन में ग्रिड को फ्रीज करें।
  9. ग्रिड को ग्रिड स्टोरेज बॉक्स में स्थानांतरित करें, और उन्हें इमेजिंग तक एलएन 2 डेवर में स्टोर करें।

Representative Results

हमने क्रायो-ईएम द्वारा टायरोसिनेटेड सूक्ष्मनलिकाएं से बंधे ट्यूबुलिन डेटायरोसिनेस मैटकैप की जांच की। ऐसा करने के लिए, हमने आनुवंशिक रूप से संशोधित एचसीटी 116 सेल लाइन से पूरी तरह से टायरोसिनेटेड सूक्ष्मनलिकाएं निकालीं, जिसमें सभी तीन ज्ञात डिटायरोसिनेटिंग एंजाइम, वीएएसएच 1/2 और मैटकैप की कमी थी। हमने सेल गोली के लगभग 0.5-4 एमएल से सूक्ष्मनलिकाएं निकालने के लिए 6-12 कंफ्लुएंट 15 सेमी व्यंजनों का उपयोग किया (चित्रा 1)। दूसरे सेंट्रीफ्यूजेशन चरण (चरण 3.11) के बाद, यह एक दृश्यमान लेकिन छोटा और पारदर्शी गोली उत्पन्न करता है (चित्रा 1 आई)। सूक्ष्मनलिका की उपज आमतौर पर ~ 75 μg होती है। यदि गोली दिखाई नहीं दे रही है, तो यह पिछले चरणों में से एक में एक समस्या का संकेत दे सकता है, जैसे कि गलत सूक्ष्मनलिका पोलीमराइजेशन तापमान, उपयोग किए गए जीटीपी या पैक्लिटैक्सेल की गुणवत्ता के साथ समस्याएं, या बहुत अधिक लाइसिस बफर के अतिरिक्त, जिसके परिणामस्वरूप एक ट्यूबुलिन एकाग्रता होती है जो पोलीमराइजेशन के लिए बहुत कम होती है। निकाले गए सूक्ष्मनलिकाएं की गुणवत्ता और एकाग्रता का आकलन करने के लिए, हमने एक कूमासी-दाग वाले एसडीएस जेल (चित्रा 2 ए) पर नमूनों का विश्लेषण किया। इन विश्लेषणों ने संकेत दिया कि निकाले गए सूक्ष्मनलिकाएं अपेक्षाकृत शुद्ध थीं। बीएसए परिमाणीकरण से प्राप्त इंटरपोलेटेड सूक्ष्मनलिका एकाग्रता ~ 1.4 मिलीग्राम / एमएल थी। यह स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (चित्रा 2 बी, सी) के साथ मापी गई संख्या के साथ अच्छी तरह से सहमत है।

ताजा निकाले गए सूक्ष्मनलिकाएं सीधे क्रायो-ईएम के लिए नमूने बनाने के लिए इस्तेमाल की जा सकती हैं। माइक्रोट्यूबुल्स को माइक्रोग्राफ पर बरकरार और प्रचुर मात्रा में दिखना चाहिए। आगे क्रायो-ईएम विश्लेषण के लिए, सूक्ष्मनलिकाएं एक दूसरे पर पार करने से बचने के लिए प्रति माइक्रोग्राफ कम सूक्ष्मनलिका घनत्व होना महत्वपूर्ण है (चित्रा 3 ए)। टूटे हुए सूक्ष्मनलिकाएं या जो दिखाई नहीं दे रहे हैं, वे संकेत दे सकते हैं कि सूक्ष्मनलिकाएं डिपॉलीमराइज्ड हैं (उदाहरण के लिए, कम तापमान या जीटीपी हाइड्रोलिसिस के कारण) या यह कि ब्लोटिंग और प्लांक फ्रीजिंग पैरामीटर सही ढंग से सेट नहीं किए गए थे। सूक्ष्मनलिकाएं के आसपास की पृष्ठभूमि घनी होती है, संभवतः अनपोलीमराइज्ड ट्यूबुलिन के साथ।

मैटकैप का आणविक भार 53 केडीए है, और इसमें ट्यूबुलिन मोनोमर के आकार के ठीक नीचे एक गोलाकार उत्प्रेरक डोमेन है। इसलिए, सूक्ष्मनलिका पर मैटकैप की सजावट का नेत्रहीन रूप से पता लगाया जा सकता है। माइक्रोट्यूबुल्स जो मैटकैप को बांधते नहीं थे, उन्होंने "चिकनी" किनारों को दिखाया, जबकि मैटकैप को बांधने वाले सूक्ष्मनलिकाएं में "खुरदरे" किनारे थे, जो सूक्ष्मनलिका की सतह पर इलेक्ट्रॉन-घने बिंदुओं की विशेषता थी (चित्रा 3 बी)। मैटकैप-बाउंड और मैटकैप-अनबाउंड सूक्ष्मनलिकाएं भी गणना किए गए 2 डी वर्गों में अलग की जा सकती हैं, हालांकि आकार और आकार के कारण, यह अन्य सूक्ष्मनलिकाएं-अंतःक्रियात्मक प्रोटीन (चित्रा 3 सी) के लिए भिन्न हो सकता है। यह पुष्टि करने के लिए कि घनत्व वास्तव में रुचि के प्रोटीन से संबंधित है, कोई प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित या अनुमानित संरचनाओं का लाभ उठा सकता है। हम एक नियंत्रण ग्रिड बनाने का भी सुझाव देते हैं जिसमें केवल तुलना के लिए सूक्ष्मनलिकाएं होती हैं। यह इंगित करता है कि क्या सूक्ष्मनलिकाएं पॉलीमराइज्ड थीं और पर्याप्त रूप से उच्च सांद्रता पर बरकरार थीं और यह कि डुबकी ठंड प्रक्रिया को सही ढंग से निष्पादित किया गया था। हमने देखा कि दूसरे मैटकैप एप्लिकेशन के साथ ग्रिड में सूक्ष्मनलिका की बहुतायत कम हो गई।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक चरणों का दृश्य मार्गदर्शन। (ए) लाइसिस से पहले सेल गोली; (बी) सेंट्रीफ्यूजेशन से पहले एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सोनिकेटेड कोशिकाएं; (सी) सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सोनिकेटेड कोशिकाएं; (डी) साफ किए गए सुपरनैटेंट के साथ सिरिंज; (ई) सतह पर तैरने के बाद अवशिष्ट गोली, जिसमें "सफेद फ्लोटिंग परत" शामिल है; (एफ) एसडीएस कूमासी जेल के लिए सेल मलबे गोली के साथ पी 10 टिप; (छ) जीटीपी/पैक्लिटैक्सेल-पूरक सतह पर तैरनेवाला इनक्यूबेशन से पहले; (एच) एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में ग्लिसरॉल कुशन के शीर्ष पर जीटीपी / पैक्लिटैक्सेल-इनक्यूबेटेड सुपरनैटेंट; (I) दूसरे सेंट्रीफ्यूजेशन चरण के बाद स्वच्छ सूक्ष्मनलिका छर्रनी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सूक्ष्मनलिका शुद्धता और एकाग्रता निर्धारण । (ए) निष्कर्षण प्रोटोकॉल और बीएसए एकाग्रता तुलना के दौरान लिए गए नमूनों को दिखाते हुए कोमासी-सना हुआ एसडीएस पेज जेल। एस 1 और पी 1 क्रमशः पहले सेंट्रीफ्यूजेशन चरण के बाद सतह पर तैरनेवाला और गोली के अनुरूप हैं। एस 2 और पी 2 इसी तरह दूसरे सेंट्रीफ्यूजेशन चरण के अनुरूप हैं। (बी) ए से प्राप्त सापेक्ष बीएसए मात्राओं की एक गैर-रैखिक प्रतिगमन रेखा। पी 2 (सूक्ष्मनलिकाएं) लेन में लगभग 50 केडीए सूक्ष्मनलिका बैंड का प्रक्षेप 1.42 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता को इंगित करता है। (ग) दो व्यक्तियों द्वारा मापे गए पुन: निलंबित सूक्ष्मनलिकाएं (पी2) का स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण और टीयूबीए1ए और टीयूबी3 (0971) के संयुक्त विलोपन गुणांक के लिए सही किया गया विश्लेषण 146 मिग्रा/एमएल ± 0.14 मिग्रा/एमएल की औसत और मानक विचलन सांद्रता को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: उदाहरण माइक्रोग्राफ। (ए) उदाहरण माइक्रोग्राफ मैटकैप से बंधे सूक्ष्मनलिकाएं दिखाते हैं। एक हरे रंग के बॉक्स द्वारा इंगित सूक्ष्मनलिकाएं बरकरार, सजाए गए हैं, और क्रायो-ईएम विश्लेषण के लिए उपयोग किए जा सकते हैं। नारंगी बॉक्स द्वारा इंगित सूक्ष्मनलिका एक बरकरार और सजाए गए सूक्ष्मनलिका है, लेकिन इसके बाईं ओर सूक्ष्मनलिकाएं के करीब स्थित है; इसलिए, क्रायो-ईएम विश्लेषण में शामिल करना कम उपयुक्त है। लाल बॉक्स में सूक्ष्मनलिकाएं पार कर रही हैं और टूट रही हैं। इन्हें क्रायो-ईएम विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए। (बी) बाएं पैनल के हरे घेरे हुए सूक्ष्मनलिका का एक ज़ूम-इन दृश्य। लाल तीर के निशान काले बिंदुओं को इंगित करते हैं जो केवल माइक्रोग्राफ में सूक्ष्मनलिकाएं पर दिखाई देते हैं जिनमें मैटकैप का अनुप्रयोग था और इस प्रकार, संभवतः सूक्ष्मनलिका से बंधे मैटकैप के अनुरूप है। (सी) ए से उठाए गए सूक्ष्मनलिका कणों के उदाहरण 2 डी वर्ग जो उच्च और निम्न सजावट दिखाते हैं और एक अलग डेटासेट से 2 डी वर्ग जिसके लिए हमने मैटकैप (दाएं पैनल) द्वारा कोई सजावट नहीं देखी। स्केल बार = (ए) 50 एनएम, (बी) 25 एनएम, (सी) 10 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: मैटकैप-कमी और वीएएसएच 1/2-कमी ट्रिपल नॉकआउट (टीकेओ) एचसीटी 116 कोशिकाओं, वाणिज्यिक पोर्सिन मस्तिष्क और हेला ट्यूबुलिन से प्राप्त सूक्ष्मनलिकाएं का इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण। संक्षेप: टीकेओ = ट्रिपल नॉकआउट; एमएबी = मोनोक्लोनल एंटीबॉडी; पीएबी = पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह विधि बताती है कि सेल लाइनों से अंतर्जात ट्यूबुलिन को तेजी से कैसे निकाला जाए और बाद में क्रायो-ईएम ग्रिड पर उन सूक्ष्मनलिकाएं सजाएं। सूक्ष्मनलिकाएं तापमान-संवेदनशील होती हैं। वे ठंडे वातावरण में डीपोलीमराइज्ड होते हैं औरगर्म वातावरण में पॉलीमराइजेशन करते हैं। इसलिए, ट्यूबुलिन को घुलनशील करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सोनिकेशन और क्लीयरेंस स्पिन (चरण 1.1-1.5) को निष्पादित करना महत्वपूर्ण है। यदि कोई कारक सूक्ष्मनलिकाएं इतनी अच्छी तरह से स्थिर कर रहे थे कि वे इस चरण में डिपोलीमराइज्ड नहीं होंगे, तो इन सूक्ष्मनलिकाएं और स्थिर कारकों को प्रारंभिक निकासी स्पिन के बाद गोली में छोड़ दिया जाएगा। सूक्ष्मनलिकाएं (पुनः) बहुलक बनाने के बाद, पॉलीमराइज्ड सूक्ष्मनलिकाएं युक्त समाधान को हर समय गर्म रखना महत्वपूर्ण है। हमने एचसीटी 116 कोशिकाओं से सूक्ष्मनलिकाएं निकालीं, जिनमें वीएएसएच 1, वीएएसएच 2 और मैटकैप प्रोटीन की कमी है। अन्य सेल लाइनों, साथ ही ऊतकों का उपयोग सूक्ष्मनलिकाएं निकालने के लिए किया जा सकताहै29, हालांकि दूषित पदार्थ, ट्यूबुलिन आइसोटाइप्स और उपज यहां वर्णित से बहुत अलग हो सकते हैं। प्लास्मिड को ओवरएक्सप्रेस करना जिसमें संशोधित एंजाइम होते हैं, का उपयोग विशिष्ट ट्यूबुलिन संशोधनों को पेश करने के लिए भी किया जा सकता है।

अन्य प्रोटोकॉल 18,27,28,29,30 अन्य अंतःक्रियात्मक प्रोटीनों से शून्य सूक्ष्मनलिकाएं प्राप्त करने के लिए सूक्ष्मनलिकाएं के पोलीमराइजेशन और डीपोलीमराइजेशन के कई चक्रों का उपयोग करते हैं। यहां, हमने इन प्रोटोकॉल को सरल बनाया है और केवल एक बार सूक्ष्मनलिकाएं बहुलक कीरण किया है। यह संभव है कि इस एकल पोलीमराइजेशन के कारण, ये सूक्ष्मनलिकाएं अन्य सूक्ष्मनलिकाएं-अंतःक्रियात्मक प्रोटीन के साथ सह-तलछट हो सकती हैं। हालांकि, हमने पाया है कि यह प्रोटोकॉल क्रायो-ईएम उद्देश्यों के लिए पर्याप्त रूप से शुद्ध सूक्ष्मनलिकाएं देता है। यदि विशिष्ट परख के लिए एक शुद्ध नमूने की आवश्यकता होती है, तो पोलीमराइजेशन और डीपोलीमराइजेशन के अतिरिक्त चक्र एक शुद्ध नमूना दे सकते हैं, हालांकि यह सूक्ष्मनलिका उपज की कीमत पर हो सकता है। इस प्रोटोकॉल में, हमने सूक्ष्मनलिकाएं को बहुलक बनाने के लिए पैक्लिटैक्सेल का उपयोग किया। हालांकि, पैक्लिटैक्सेल सूक्ष्मनलिका जाली को एक निश्चित मोड़ और उदय की ओर पूर्वाग्रह कर सकता है, जो रुचि के प्रोटीन के सूक्ष्मनलिका संबंध में हस्तक्षेप कर सकता है। पैक्लिटैक्सेल अनुपयुक्त होने पर अन्य सूक्ष्मनलिका-स्थिर अभिकर्मकों का उपयोग किया जा सकता है; इन अभिकर्मकों के उदाहरण गैर-टैक्सेन अणु हैं जैसे कि पेलोरुसाइड या गैर-हाइड्रोलिज़ेबल जीटीपी वेरिएंट जैसे जीएमपीसीपीपी 17,32।

संरचनात्मक रूप से प्रोटीन की जांच करने के लिए जो क्रायो-ईएम ग्रिड पर सूक्ष्मनलिकाएं बांधते हैं, किसी को सूक्ष्मनलिकाएं के लिए पर्याप्त मात्रा में प्रोटीन को बांधने की आवश्यकता होती है। आमतौर पर होने वाली समस्या यह है कि प्रोटीन कॉम्प्लेक्स जो समाधान में स्थिर होते हैं, ग्रिड पर अलग हो जाते हैं। ग्रिड पर प्रोटीन कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए, पहले सूक्ष्मनलिकाएं परत करना और फिर सूक्ष्मनलिका-लेपित ग्रिड में कम नमक एकाग्रता के साथ सूक्ष्मनलिका-बाध्यकारी प्रोटीन को लागू करना महत्वपूर्ण था, इस प्रकार प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को सीधे ग्रिड पर इकट्ठा करना। दूसरों ने इसी तरह कम नमक वाले 33,34 प्रोटोकॉल और सफल सूक्ष्मनलिका सजावट के लिए दो-चरणीय अनुप्रयोग34,35,36 प्रोटोकॉल की सूचना दी है। यह संभावना है कि कम नमक एकाग्रता कम इलेक्ट्रोस्टैटिक चार्ज के कारण प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को अधिक स्थिर बातचीत की ओर ले जाती है। हालांकि, कम नमक सांद्रता के कारण, रुचि का प्रोटीन अवक्षेपण के लिए जोखिम में है। इसलिए, ग्रिड को विट्रीफाई करने से कुछ समय पहले तक प्रोटीन को शारीरिक रूप से प्रासंगिक नमक सांद्रता पर या उसके आसपास रखने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। यह दो-चरणीय अनुप्रयोग प्रोटोकॉल संभवतः प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को ब्लोटिंग या प्लांक-फ्रीजिंग चरणों के दौरान गिरने से रोकता है। इस प्रोटोकॉल में, हमने Vitrobot का उपयोग किया। हालांकि, तेजी से विट्रीफिकेशन विधियों (विट्रोजेट) या ब्लोट-फ्री ग्रिड (पफलॉट) या उपकरणों का उपयोग जिनके पास दोनों गुण (गिरगिट) हैं, संभावित रूप से दो-चरणीय अनुप्रयोग को दूर कर सकते हैं, लेकिन ये वर्तमान में परीक्षण के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं हैं।

पुनर्निर्मित क्रायो-ईएम घनत्व का अंतिम संकल्प कई कारकों से प्रभावित हो सकता है, जिसमें सूक्ष्मनलिका के सापेक्ष सूक्ष्मनलिका-बाध्यकारी प्रोटीन की गति और सजावट का स्तर शामिल है जिसे प्राप्त किया जा सकता है। उच्च सूक्ष्मनलिका सजावट 3 डी घनत्व पुनर्निर्माण में प्राप्त अंतिम संकल्प के लिए फायदेमंद है। इसे कुछ कारकों द्वारा सीमित किया जा सकता है, जैसे कि सूक्ष्मनलिका-बाध्यकारी प्रोटीन के शुद्धिकरण के दौरान प्राप्त उच्चतम प्रोटीन एकाग्रता, सबसे कम नमक एकाग्रता जो सूक्ष्मनलिका-अंतःक्रियात्मक प्रोटीन एकत्र किए बिना सामना कर सकती है, और सूक्ष्मनलिका-अंतःक्रियात्मक प्रोटीन का बाध्यकारी मोड (उदाहरण के लिए, प्रोटीन एक से अधिक ट्यूबुलिन डिमर का विस्तार कर सकता है, इस प्रकार 1: 1 बाध्यकारी अनुपात में बाधा डाल सकता है)। यद्यपि क्रायो-ईएम पुनर्निर्माण के समाधान को विरल रूप से सजाए गए सूक्ष्मनलिकाएं द्वारा समझौता किया जा सकता है, कम्प्यूटेशनल विश्लेषण बहुत सारी समस्याओं को दरकिनार कर सकता है, जैसा कि हाल ही में रिपोर्ट किए गए सूक्ष्मनलिका-प्रोटीन जटिल संरचना द्वारा उदाहरण दिया गया था जिसे बेहदकम सजाया गया था।

यहां हम जिस प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, वह क्रायो-ईएम उद्देश्यों के लिए उपयुक्त सूक्ष्मनलिकाएं प्राप्त करने के लिए एक त्वरित, कम लागत वाली विधि प्रस्तुत करता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पोर्सिन मस्तिष्क ट्यूबुलिन के विपरीत, मैटकैप-कमी और वासोहिबिन-कमी वाले एचसीटी 116 कोशिकाओं से प्राप्त सूक्ष्मनलिकाएं पूरी तरह से टायरोसिनेटेड हैं (चित्रा 4)। वाणिज्यिक हेला ट्यूबुलिन, एक महंगा अभिकर्मक, सिद्धांत रूप में, अपेक्षाकृत समान रूप से टायरोसिनेटेड है और इसमें ग्लूटामाइलेशनजैसे कुछ अन्य संशोधन शामिल हैं, लेकिन बैच भिन्न हो सकते हैं, और संशोधन केवल विट्रो में प्राप्त किया जा सकता है। कस्टम-निर्मित सेल लाइनों से सूक्ष्मनलिकाएं निकालने का एक लाभ यह लचीलापन है कि सूक्ष्मनलिकाएं का अधिक सजातीय पूल बनाने के लिए ट्यूबुलिन-संशोधित एंजाइमों, जैसे ट्यूबुलिन डेटायरोसिनेस को ओवरएक्सप्रेस या हटाना पड़ता है। यह क्रायो-ईएम नमूने की सजावट और एकरूपता को लाभ पहुंचा सकता है और अंततः क्रायो-ईएम घनत्व मानचित्रों और इस नमूने से प्राप्त आणविक संरचनाओं की आसानी और गुणवत्ता को लाभान्वित करेगा।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम सिक्समा, ब्रुमेलकैंप और पेराकिस समूहों के सभी सदस्यों को उनकी उपयोगी वैज्ञानिक चर्चाओं और एक सुखद कामकाजी माहौल प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं, और विशेष रूप से, हम चित्रा 3 सी में चित्रित प्रोटीन एकाग्रता को निर्धारित करने में मदद करने के लिए जान सकोल्चिक ("व्यक्ति 2") को धन्यवाद देते हैं। हम एनकेआई क्रायो-ईएम सुविधा और लीडेन विश्वविद्यालय में नीदरलैंड सेंटर फॉर इलेक्ट्रॉन नैनोस्कोपी (एनईसीईएन) को उनके समर्थन के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस कार्य को NWO Vici अनुदान 016.Vici.170.033 द्वारा T.R.B. को सम्मानित किया गया था। एपी और टीआरबी ऑनकोड जांचकर्ता हैं और एनडब्ल्यूओ ईएनडब्ल्यू (ओसीईएनडब्ल्यू) से धन प्राप्त करते हैं। एलएल को ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (एफडब्ल्यूएफ जेबी 4448-बी) से धन प्राप्त हुआ। इस शोध को डच कैंसर सोसाइटी और डच स्वास्थ्य, कल्याण और खेल मंत्रालय के संस्थागत अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
0.05% trypsin-EDTA Gibco 25300-054 Cell culture
10 cm plate Falcon 353003 Cell culture
15 cm plate Thermo FisherScientific 168381 Cell culture
50 mL tubes Sarstedt 62.547255 Cell culture
300 mesh quantifoil holey carbon copper grid R1.2/1.3 Quantifoil Micro Tools N1-C14nCu30-01 Cryo-EM grid preparation
Cell scrapers Falcon 353085 Cell culture
DMEM Gibco 41966-029 Cell culture
EDTA Merck 108418 Cell culture
EGTA Sigma Aldrich E3899 Microtubule extraction
Ethane gas Cryo-EM grid preparation
FCS Serana s-FBS-EU-015 Cell culture
Glycerol VWR 24.397.296 Microtubule extraction
GTP Fisher Scientific G8877-1G Microtubule extraction
HCT116 VASH1 VASH2 MATCAP KO cells self made Wild type HCT116 cells RRID: CVCL_0291 Cell culture
KOH Merck 1.05033 Microtubule extraction
MgCl2 Merck 105833 Microtubule extraction
Microtubule binding protein self made Cryo-EM grid preparation
Needle BD microlance 300600 Microtubule extraction
Paclitaxel Santa Cruz Biotechnology sc-212517 caution toxic, microtubule extraction
PBS Fisher Scientific BP399 Cell culture
Penicillin and streptomycin Sigma Aldrich P0781-100mL Cell culture
PIPES Merck P8203 Microtubule extraction
PMSF (in EtOH) Roche 16837091001 Microtubule extraction
SDS sample buffer self made Quality assessment
Syringe BD plastipak 309658 Microtubule extraction
Ultra protease tables mini Fisher Scientific NC0975224 Microtubule extraction
Whatman blotting paper Whatman 47000-100 Cryo-EM grid preparation
Equipment
Flow hood cell culture
GloQube Quorum Cryo-EM grid preparation
Grid storage box SWISSCI 41018 Cryo-EM grid storage
Heating block, electric or metal to warm the buffers
Incubator, cell culture NUAIR cell culture
LN2 dewar Cryo-EM grid storage
Plunge-tweezers Electron Microscopy Sciences 0508-L5-PS Cryo-EM grid preparation, hole drilled in top to fit the vitrobot
Polystyrene box  to keep the buffers warm
Sonicator Qsonica Q700 Microtubule extraction
Standard light microscope Olympus CKX 41 Quality assessment
TLA 100.3 rotor Beckman Coulter Microtubule extraction
TLA 120.2 rotor Beckman Coulter Microtubule extraction
Tubes for TLA 100.3 rotor Beckman Coulter 326819 Microtubule extraction
Tubes for TLA 120.2 rotor Beckman Coulter 347356 Microtubule extraction
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima MAX-XP Microtubule extraction
Vitrobot FEI, ThermoFischer Scientific mark IV Cryo-EM grid preparation
Vitrobot polystyrene container assembly with metal ethane cup ThermoFisher Scientific 200703 Cryo-EM grid preparation
Water bath cell culture

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References

  1. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  2. Peris, L., et al. Motor-dependent microtubule disassembly driven by tubulin tyrosination. Journal of Cell Biology. 185 (7), 1159-1166 (2009).
  3. McKenney, R. J., Huynh, W., Tanenbaum, M. E., Bhabha, G., Vale, R. D. Activation of cytoplasmic dynein motility by dynactin-cargo adapter complexes. Science. 345 (6194), 337-341 (2014).
  4. Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
  5. Sirajuddin, M., Rice, L. M., Vale, R. D. Regulation of microtubule motors by tubulin isotypes and post-translational modifications. Nature Cell Biology. 16 (4), 335-344 (2014).
  6. Nogales, E., Kellogg, E. H. Challenges and opportunities in the high-resolution cryo-EM visualization of microtubules and their binding partners. Current Opinion in Structural Biology. 46, 65-70 (2017).
  7. Manka, S. W., Moores, C. A. Microtubule structure by cryo-EM: Snapshots of dynamic instability. Essays in Biochemistry. 62 (6), 737-751 (2018).
  8. Chaaban, S., Carter, A. P. Structure of dynein-dynactin on microtubules shows tandem adaptor binding. Nature. 610 (7930), 212-216 (2022).
  9. Lacey, S. E., He, S., Scheres, S. H., Carter, A. P. Cryo-EM of dynein microtubule-binding domains shows how an axonemal dynein distorts the microtubule. eLife. 8, 47145 (2019).
  10. Walton, T., Wu, H., Brown, A. Structure of a microtubule-bound axonemal dynein. Nature Communications. 12, 477 (2021).
  11. Sindelar, C. V., Downing, K. H. An atomic-level mechanism for activation of the kinesin molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4111-4116 (2010).
  12. Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins. Cell. 162 (4), 849-859 (2015).
  13. Maurer, S. P., Fourniol, F. J., Bohner, G., Moores, C. A., Surrey, T. EBs Recognize a nucleotide-dependent structural cap at growing microtubule ends. Cell. 149 (2), 371-382 (2012).
  14. Benoit, M. P. M. H., Asenjo, A. B., Sosa, H. Cryo-EM reveals the structural basis of microtubule depolymerization by kinesin-13s. Nature Communications. 9, 1662 (2018).
  15. Kellogg, E. H., et al. Near-atomic model of microtubule-tau interactions. Science. 360 (6394), 1242-1246 (2018).
  16. Brotzakis, Z. F., et al. A structural ensemble of a Tau-microtubule complex reveals regulatory Tau phosphorylation and acetylation mechanisms. ACS Central Science. 7 (12), 1986-1995 (2021).
  17. Kellogg, E. H., et al. Insights into the distinct mechanisms of action of taxane and non-taxane microtubule stabilizers from cryo-EM structures. Journal of Molecular Biology. 429 (5), 633-646 (2017).
  18. Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
  19. Wloga, D., Joachimiak, E., Louka, P., Gaertig, J. Posttranslational modifications of tubulin and cilia. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), 028159 (2017).
  20. Nieuwenhuis, J., Brummelkamp, T. R. The tubulin detyrosination cycle: Function and enzymes. Trends in Cell Biology. 29 (1), 80-92 (2019).
  21. Nieuwenhuis, J., et al. Vasohibins encode tubulin detyrosinating activity. Science. 358 (6369), 1453-1456 (2017).
  22. Aillaud, C., et al. Vasohibins/SVBP are tubulin carboxypeptidases (TCPs) that regulate neuron differentiation. Science. 358 (6369), 1448-1453 (2017).
  23. Landskron, L., et al. Posttranslational modification of microtubules by the MATCAP detyrosinase. Science. 376 (6595), (2022).
  24. Erck, C., et al. A vital role of tubulin-tyrosine-ligase for neuronal organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (22), 7853-7858 (2005).
  25. Pagnamenta, A. T., et al. Defective tubulin detyrosination causes structural brain abnormalities with cognitive deficiency in humans and mice. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3391-3405 (2019).
  26. Peris, L., et al. Tubulin tyrosination regulates synaptic function and is disrupted in Alzheimer's disease. Brain. 145 (7), 2486-2506 (2022).
  27. Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14 (5), 1634-1660 (2019).
  28. Gell, C., et al. Purification of tubulin from porcine brain. Methods in Molecular Biology. 777, 15-28 (2011).
  29. Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of tubulin with controlled posttranslational modifications and isotypes from limited sources by polymerization-depolymerization cycles. Journal of Visualized Experiments. (165), e61826 (2020).
  30. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  31. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  32. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue. GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
  33. Sindelar, C. V., Downing, K. H. The beginning of kinesin's force-generating cycle visualized at 9-Å resolution. Journal of Cell Biology. 177 (3), 377-385 (2007).
  34. Kellogg, E. H., et al. Near-atomic cryo-EM structure of PRC1 bound to the microtubule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9430-9439 (2016).
  35. Maurer, S. P., Bieling, P., Cope, J., Hoenger, A., Surrey, T. GTPγS microtubules mimic the growing microtubule end structure recognized by end-binding proteins (EBs). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (10), 3988-3993 (2011).
  36. Manka, S. W., Moores, C. A. Pseudo-repeats in doublecortin make distinct mechanistic contributions to microtubule regulation. EMBO Reports. 21 (12), 51534 (2020).

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Bak, J., Landskron, L., Brummelkamp, T. R., Perrakis, A. Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (193), e65126, doi:10.3791/65126 (2023).

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