Summary
Her beskriver vi en protokoll for å trekke ut endogent tubulin fra pattedyrceller, som kan mangle eller inneholde spesifikke mikrotubuli-modifiserende enzymer, for å oppnå mikrotubuli beriket for en spesifikk modifikasjon. Vi beskriver deretter hvordan de ekstraherte mikrotubuli kan dekoreres med rensede mikrotubulibindende proteiner for å forberede rister for kryo-elektronmikroskopi.
Abstract
Mikrotubuli er en viktig del av cytoskjelettet og er involvert i intracellulær organisasjon, celledeling og migrasjon. Avhengig av posttranslasjonelle modifikasjoner kan mikrotubuli danne komplekser med forskjellige samvirkende proteiner. Disse mikrotubuli-proteinkompleksene er ofte involvert i menneskelige sykdommer. Å forstå strukturen til slike komplekser er nyttig for å belyse deres virkningsmekanismer og kan studeres ved kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM). For å oppnå slike komplekser for strukturelle studier, er det viktig å trekke ut mikrotubuli som inneholder eller mangler spesifikke posttranslasjonelle modifikasjoner. Her beskriver vi en forenklet protokoll for å ekstrahere endogent tubulin fra genmodifiserte pattedyrceller, som involverer mikrotubuli polymerisasjon, etterfulgt av sedimentering ved hjelp av ultrasentrifugering. Det ekstraherte tubulinet kan deretter brukes til å fremstille kryo-elektronmikroskopgitter med mikrotubuli som er bundet til et renset mikrotubulibindende protein av interesse. Som et eksempel demonstrerer vi ekstraksjonen av fullt tyrosinerte mikrotubuli fra cellelinjer konstruert for å mangle de tre kjente tubulin-detyrosinerende enzymene. Disse mikrotubuli brukes deretter til å lage et proteinkompleks med enzymatisk inaktive mikrotubuli-assosierte tubulindetyrosinase på kryo-EM-gitter.
Introduction
Mikrotubuli er en viktig del av cytoskjelettet; De er involvert i ulike funksjoner som cellemigrasjon og deling, men bidrar også til intracellulær organisasjon. For å tilpasse seg forskjellige funksjonelle skjebner, interagerer mikrotubuli med en rekke mikrotubuli-assosierte proteiner (MAPs), enzymer og andre proteiner, som vi kollektivt vil referere til som "mikrotubuli-interagerende proteiner." Mikrotubulibindingen av disse proteinene kan styres av forskjellige tubulinmodifikasjoner, ofte referert til som "tubulinkoden"1. Eksempler på denne preferansen er den mitotiske sentromerassosierte kinesin (MCAK)2 og dynein-dynaktinet CAP-Gly-domenet til p1503, som fortrinnsvis assosieres med tyrosinert tubulin, mens kinesinmotorene sentromerassosiert protein E (CENP-E)4 og kinesin-25 foretrekker tubulin som mangler det C-terminale tyrosinet.
Mens en rekke metoder kan brukes til å studere mikrotubuli-protein-interaksjoner, brukes kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) ofte til å studere disse interaksjonene ved nær atomoppløsning 6,7. I de senere år har kryo-EM-strukturer avslørt hvor store motorproteiner som dynein 8,9,10 og kinesin 11, +TIP-proteiner som EB3 12,13 og MCAK14, andre proteiner som Tau15,16, og til og med små molekyler som paklitaksel, pelosid og zampanolid 17 samhandle med mikrotubuli. For å studere mikrotubuli-protein-interaksjoner, blir mikrotubuli vanligvis ekstrahert fra svinehjernen18. Etter dette utføres de fleste in vitro-studier, inkludert kryo-EM-mikrotubulistrukturer, ved bruk av svinehjernetubulin. Resultatene av disse studiene tilslører derfor betydningen av den heterogene naturen til tubulinmodifikasjoner19 mellom vev og celletyper. Dette skaper et spesielt problem når man undersøker et protein som krever eller foretrekker en spesifikk modifikasjon for å binde seg til mikrotubuli. Dette kan illustreres med tyrosinert tubulin, substratet for mikrotubuli detyrosinase MATCAP.
Detyrosinering er en tubulinmodifikasjon der den C-terminale aminosyren tyrosin av α-tubulin mangler, som er assosiert med mitotisk, hjerte- og nevronfunksjon20. Mens fullt tyrosinerte mikrotubuli er det ideelle substratet for MATCAP, er dette stort sett fraværende i kommersielt tilgjengelige mikrotubuli fra svinehjernen på grunn av funksjonen til vasohibinene21,22 og MATCAP 23 detyrosinaser i dette vevet 22,23,24,25,26 . Selv om kommersielt tilgjengelig HeLa tubulin for det meste inneholder tyrosinerte mikrotubuli, kan detyrosinering forekomme, og denne kilden til tubulin er derfor mindre egnet til å lage en jevn prøve for kryo-EM-analyse.
For å stimulere bindingen av MATCAP til mikrotubuli og lage en homogen prøve for strukturanalyse, søkte vi en kilde til mikrotubuli som er fullstendig tyrosinert. Til dette formål ble det opprettet en MATCAP og vasohibin-mangelfull cellelinje, som ble brukt til å trekke ut fullt tyrosinerte mikrotubuli. Ekstraksjonsprosedyren var basert på veletablerte protokoller som bruker gjentatte sykluser av polymerisering og depolymerisering av mikrotubuli for å trekke ut tubulin fra hjernevev eller celler 18,27,28,29,30, med bare et enkelt polymerisasjonstrinn og sentrifugering over en glyserolpute. Ved å bruke MATCAP som et eksempel, demonstrerer vi hvordan disse mikrotubuli kan brukes til kryo-EM-studier. For å forberede kryo-EM-nett beskrives en to-trinns applikasjonsprotokoll ved lav saltkonsentrasjon. Metodene i denne artikkelen beskriver ekstraksjonen av tilpassbare mikrotubuli i tilstrekkelige mengder og renhet for å utføre kryo-EM-analyse og gir en detaljert protokoll for hvordan man bruker disse mikrotubuli til å lage protein-mikrotubulikomplekser på kryo-EM-nett.
Protocol
MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer og utstyr som brukes i denne protokollen.
1. Cellekultur
MERK: All cellekultur skal gjøres i en steril laminær hette.
- For å følge denne protokollen må du først tine et hetteglass med frosne celler i et vannbad på 37 °C. Her bruker vi en genmodifisert HCT116-cellelinje som mangler de tre kjente detyrosinerende enzymene, VASH1, VASH2 og MATCAP, for å lage tyrosinert tubulin.
- Klargjør en Ø 10 cm plate inneholdende 10 ml av egnet cellekulturmedium.
MERK: I denne protokollen ble DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagle-medium) supplert med 10% v / v FCS (føtalt kalveserum) og penicillin / streptomycin antibiotika (kulturmedium) brukt for den genetisk modifiserte HCT116-cellelinjen. - Tell cellene og frø ~ 2,5 × 106 levedyktige celler (~ 20% samløp) i den tilberedte 10 cm platen. Rist platen forsiktig for å fordele cellene jevnt. Inkuber parabolen i en 37 ° C cellekulturinkubator gasset med 5% (v / v) CO2 til cellene når 80% -90% samløp.
MERK: Vanligvis tar dette 3 dager for HCT116-celler, men tiden kan avhenge av den spesifikke såtettheten og cellelinjen som brukes. - Kast cellekulturmediet med en pipette eller vakuumaspirator og vask parabolen 2 x 5 ml PBS.
MERK: Pass på at PBS ikke dispenseres for kraftig på cellemonolaget, da dette kan løsne cellene fra platen. - Tilsett 1-2 ml trypsin, og inkuber cellene i inkubatoren i 2-5 minutter for å løsne cellene.
- Tilsett 2 ml av kulturmediet på platen for å slukke trypsinet.
- Del cellesuspensjonen i tre til fem like deler og frø dem på nytt for å utvide cellene i kulturmedium til 6-12 sammenflytende 15 cm plater oppnås.
2. høsting
- Vask cellene forsiktig med 10 ml PBS (1x) for å fjerne cellekulturmedier.
- Løsne cellene fra platene ved å inkubere cellene i 5 minutter ved romtemperatur med 3 ml iskald PBS supplert med 5 mM EDTA (steril / filtrert) og deretter ved hjelp av en celleskraper.
- Samle cellene i et 50 ml rør på is, og spinn ned (10 min, 250 × g).
- Legg merke til volumet av de høstede cellene med volumskalaen på 50 ml røret.
MERK: Det forventede volumet kan være hvor som helst mellom ~ 0,5 ml og 4 ml. PAUSETRINN: Flash-frys cellepelleten i LN2, og oppbevares ved -20 °C til bruk. Merk at cellepelleten bare kan lagres i noen uker eller måneder. Hvis pelleten holdes lenger, kan det føre til redusert utbytte eller ingen mikrotubuli i det hele tatt.
- Legg merke til volumet av de høstede cellene med volumskalaen på 50 ml røret.
3. Ekstraksjon av mikrotubuli
MERK: Hold alt for trinn 3.1-3.5 på is; Alt fra trinn 3.6 og oppover skal holdes varmt (30-37 °C).
- Klargjør 10 ml iskald lysisbuffer inneholdende 100 mM RØR/KOH (pH 6,9), 2 mM EGTA/KOH, 1 mM MgCl2, 1 mM PMSF og én proteasehemmertablett (mini).
- Resuspender den høstede cellepelleten i 1:1 v/v lysisbuffer (hvis du er i tvil om det nøyaktige volumet, ta mindre lysisbuffer i stedet for mer).
- Lyse cellene ved sonikering: 15 s på, 45 s av, amp 30, fire sykluser (bestem forholdene eksperimentelt, og endre i henhold til sonikatoren).
- Etter sonikering, samle en prøve for SDS-PAGE-analyse: 2 μL lysat + 18 μL vann + 5 μL 5x SDS-prøvebuffer.
MERK: Sjekk under et standard lysmikroskop om cellene faktisk har fullt lys.
- Etter sonikering, samle en prøve for SDS-PAGE-analyse: 2 μL lysat + 18 μL vann + 5 μL 5x SDS-prøvebuffer.
- Pipetter de lyserte cellene inn i et sentrifugalrør. Spinn i 1 time ved 100 000 × g ved 4 °C i en ultrasentrifugerrotor for å fjerne lysatet.
MERK: Forsikre deg om at alle lommene i rotoren er tørre og rene for å sikre riktig balansering av sentrifugen. - Bruk en sprøyte for å ta ut det ryddede lysatet. Pass på at du ikke forstyrrer pelleten så vel som det flytende laget på toppen.
- Samle en prøve av det ryddede lysatet: 2 μL lysat + 18 μL vann + 5 μL 5x SDS prøvebuffer.
- Skyll pelleten forsiktig, og øs opp litt av pelleten ved å virvle en P10-pipettespiss gjennom pelleten; tilsett 200 μL vann og 50 μL SDS-buffer.
- Suppler supernatanten fra forrige trinn med 1 mM GTP og 20 μM paklitaksel for å polymerisere mikrotubuli; for et volum på 1 ml, tilsett 10 μL 2 mM paklitaksel og 10 μL 100 mM GTP.
Paklitaksel kan forårsake hudirritasjon, alvorlig øyeskade, luftveisirritasjon, genetiske defekter, skade på det ufødte barnet og skade på organer. Langvarig eller gjentatt eksponering forårsaker skade på organer. Ikke pust, spray eller støv stoffet på noen måte. Bruk gummihansker i nitril for å forhindre hudkontakt. - Inkuber den GTP/paklitaksel-supplerte supernatanten i 30 minutter ved 37 °C for å la mikrotubuli samle seg.
- Under dette inkubasjonstrinnet, la rotoren og ultrasentrifugen varmes opp til 30 ° C.
- Forbered putebufferen: Tilsett 0,6 ml glyserol til 0,4 ml lysisbuffer, og tilsett blandingen med 20 μM paklitaksel. Forvarm putebufferen til 37 °C.
- Tilsett 800 μL putebuffer til et ultrasentrifugerør. Pipetter GTP/paklitaksel-tilsatt lysat forsiktig på toppen av putebufferen.
MERK: Unngå blanding av putebufferen og lysatet ved å pipettere veldig forsiktig. - Spinn i 30 minutter ved 100 000 × g ved 30 °C i en ultrasentrifugerotor. Merk den utovervendte kanten av sentrifugeringsrøret for lett å gjenkjenne hvor mikrotubulipelleten skal dannes.
- Fjern putebufferen forsiktig med en pipette, og pass på at mikrotubulipelleten ikke forstyrres.
- Samle en prøve av putebufferen: 2 μL + 18 μL vann + 5 μL 5x SDS prøvebuffer.
- Vask pelleten forsiktig 3x med varm lysisbuffer for å fjerne glyserolet. Dispenser forsiktig den varme bufferen ved siden av pelleten (ikke skyll væsken direkte over pelleten), roter røret noen ganger for å fjerne så mye glyserol som mulig fra pelleten og rørets vegger, og aspirer deretter og gjenta.
MERK: Hvis glyserol ikke vaskes ordentlig, vil rutenettet smelte veldig raskt under elektronbelysningen. Dette kan bevises av høy partikkelbevegelse, noe som skaper uskarpe bilder. - Forbered resuspendsjonsbuffer med følgende ingredienser: 100 mM RØR/KOH (pH 6,9), 2 mM EGTA/KOH og 1 mM MgCl2, og varm bufferen til 37 °C.
- Løft den vaskede pelleten forsiktig med en kuttspiss i ~50 μL forvarmet opphengsbuffer, og hold tuben ved 37 °C.
- Samle en prøve av den resuspenderte pelletsfraksjonen: 2 μL + 18 μL vann + 5 μL 5x SDS-prøvebuffer.
TIPS: Kuttspissen forhindrer brudd på mikrotubuli. Forbered en metallvarmeblokk til 37 °C, og oppbevar denne i en isoporboks slik at prøverørene enkelt kan transporteres uten å kjøle dem ned til romtemperatur.
- Samle en prøve av den resuspenderte pelletsfraksjonen: 2 μL + 18 μL vann + 5 μL 5x SDS-prøvebuffer.
4. Klargjøring av Cryo-EM-rutenett
- Forbered stupefryserenheten ved å installere blottpapiret. Varm stupefryseren opp til 30 °C, og sett fuktingen til 100 %. La ~30 min balansere temperatur og fuktighet.
- Forbered innstillingene for stupefryseren til to applikasjoner, og kjør gjennom hele programmet en gang for å være sikker på at innstillingene er riktig innstilt. Forsikre deg om at den første applikasjonen har en kraft på 10, 2 s blottid og 0 s ventetid, og at den andre applikasjonen har en kraft på 10, 6,5 s blottid og 10 s ventetid.
- Glødutlad kryo-EM-ristene ved 30 mA i 60 s.
- Avkjøl polystyrenbeholderenheten med LN2, og tilbered flytende etan i en metallkopp ved å kondensere etangass til en kald metallkopp.
- Forbered en fortynningsbuffer med følgende komponenter: 100 mM RØR/KOH (pH 6,9), 2 mM EGTA/KOH og 1 mM MgCl2, og varm den til 37 °C.
- Fortynn det mikrotubuli-interagerende proteinet 1: 1 v / v med fortynningsbuffer like før det påføres ristene for å sikre at saltkonsentrasjonen senkes (vi brukte en endelig saltkonsentrasjon på 50 mM NaCl). Oppbevar blandingen ved 37 °C.
- Ta tak i et glødutladet gitter med pinsett og klikk dem inn i stupefryseren.
- Plasser polystyrenbeholderen med flytende etan i stupefryseren, og kjør gjennom det forberedte programmet: Påfør først 3,5 μL mikrotubulioppløsning på rutenettet, la stupefryseren blett rutenettet, påfør deretter umiddelbart 3,5 μL nyfortynnet protein, og til slutt, la stempelet blot og dypfryse rutenettet i flytende etan.
- Overfør ristene til en grid lagringsboks, og lagre dem i en LN2 dewar til avbildning.
Representative Results
Vi undersøkte tubulin detyrosinase MATCAP bundet til tyrosinerte mikrotubuli av cryo-EM. For å gjøre dette ekstraherte vi fullt tyrosinerte mikrotubuli fra en genetisk modifisert HCT116-cellelinje som manglet alle de tre kjente detyrosinerende enzymene, VASH1/2 og MATCAP. Vi brukte 6-12 konfluente 15 cm fat for å trekke ut mikrotubuli fra ca. 0,5-4 ml cellepellet (figur 1). Etter det andre sentrifugeringstrinnet (trinn 3.11) gir dette en synlig, men liten og gjennomsiktig pellet (figur 1I). Mikrotubuliutbyttet er vanligvis ~ 75 μg. Hvis pelleten ikke er synlig, kan dette indikere et problem i et av de foregående trinnene, for eksempel feil polymerisasjonstemperatur for mikrotubuli, problemer med kvaliteten på den brukte GTP eller paklitaksel, eller tilsetning av for mye lysisbuffer, noe som resulterer i en tubulinkonsentrasjon som er for lav for polymerisering. For å vurdere kvaliteten og konsentrasjonen av de ekstraherte mikrotubuli, analyserte vi prøver på en Coomassie-farget SDS-gel (figur 2A). Disse analysene indikerte at de ekstraherte mikrotubuli var relativt rene. Den interpolerte mikrotubulikonsentrasjonen avledet fra BSA-kvantifisering var ~1,4 mg/ml. Dette stemmer godt overens med tallet målt med et spektrofotometer (figur 2B,C).
De nyekstraherte mikrotubuli kan direkte brukes til å lage prøver for cryo-EM. Mikrotubuli skal se intakt og rikelig ut på mikrografene. For videre kryo-EM-analyse er det viktig å ha en lav mikrotubulitetthet per mikrograf for å unngå at mikrotubuli krysser over hverandre (figur 3A). Brutte mikrotubuli eller de som ikke er synlige, kan indikere at mikrotubuli depolymeriserte (f.eks. på grunn av lav temperatur eller GTP-hydrolyse) eller at blottings- og stupefryseparametrene ikke var riktig innstilt. Bakgrunnen rundt mikrotubuli er tett, antagelig med upolymerisert tubulin.
Molekylvekten til MATCAP er 53 kDa, og den har et kuleformet katalytisk domene like under størrelsen på en tubulinmonomer. Dekorasjonen av MATCAP på mikrotubuli kunne derfor detekteres visuelt. Mikrotubuli som ikke bandt MATCAP viste "glatte" kanter, mens mikrotubuli som bandt MATCAP hadde "grove" kanter, karakterisert ved elektrontette prikker på mikrotubulioverflaten (figur 3B). MATCAP-bundne og MATCAP-ubundne mikrotubuli kunne også skilles i de beregnede 2D-klassene, men på grunn av form og størrelse kan dette variere for andre mikrotubuli-interagerende proteiner (figur 3C). For å bekrefte at tettheten faktisk tilhører proteinet av interesse, kan man dra nytte av eksperimentelt bestemte eller forutsagte strukturer. Vi foreslår også å lage et kontrollnett som bare inneholder mikrotubuli for sammenligning. Dette indikerer om mikrotubuli ble polymerisert og ekstrahert intakt ved en tilstrekkelig høy konsentrasjon, og at stupefryseprosessen ble utført korrekt. Vi la merke til at mikrotubuli overflod redusert i rutenett med en annen MATCAP applikasjon.
Figur 1: Visuell veiledning av eksperimentelle trinn. (A) Cellepellet før lysis; (B) sonikerte celler i et ultrasentrifugerør før sentrifugering; (C) sonikerte celler i et ultrasentrifugerør etter sentrifugering; d) sprøyte med ryddet supernatant, (E) gjenværende pellet etter fjerning av supernatant, inkludert et "hvitt flytende lag"; (F) P10 spiss med en celle rusk pellet for SDS Coomassie gel; (G) GTP/paklitaksel-supplert supernatant før inkubasjon; (H) GTP / paklitaksel-inkubert supernatant på toppen av en glyserolpute i et ultrasentrifugerør; (I) rengjør mikrotubulispellet etter det andre sentrifugeringstrinnet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Mikrotubuli renhet og konsentrasjonsbestemmelse . (A) Coomassie-farget SDS-sidegel som viser prøvene tatt under ekstraksjonsprotokollen og en sammenligning av BSA-konsentrasjon. S1 og P1 tilsvarer henholdsvis supernatanten og pelleten etter det første sentrifugeringstrinnet. S2 og P2 tilsvarer på samme måte det andre sentrifugeringstrinnet. (B) En ikke-lineær regresjonslinje av de relative BSA-mengdene avledet fra A. Interpoleringen av mikrotubulibåndet rundt 50 kDa i P2 (mikrotubuli) lane indikerer en endelig konsentrasjon på 1,42 mg / ml. (C) Den spektrofotometriske analysen av de resuspenderte mikrotubuli (P2) målt av to personer og korrigert for den kombinerte ekstinksjonskoeffisienten til TUBA1A og TUBB3 (0,971) indikerer en gjennomsnittlig og standardavvikskonsentrasjon på 1,46 mg/ml ± 0,14 mg/ml. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempel på mikrografer . (A) Eksempel på mikrografer som viser mikrotubuli bundet til MATCAP. Mikrotubuli indikerer med en grønn boks er intakt, dekorert og kan brukes til kryo-EM-analysen. Mikrotubuli indikert av den oransje boksen er en intakt og dekorert mikrotubuli, men er plassert nær mikrotubuli til venstre for den; Derfor er det mindre egnet å inkludere i kryo-EM-analysen. Mikrotubuli i den røde boksen krysser over og ødelagt. Disse bør utelukkes fra kryo-EM-analysen. (B) Et zoomet inn bilde av den grønne omkransede mikrotubuli på venstre panel. De røde pilspissene indikerer de svarte prikkene som bare dukket opp på mikrotubuli i mikrografene som hadde påføring av MATCAP, og dermed sannsynligvis tilsvarer MATCAP bundet til mikrotubuli. (C) Eksempel på 2D-klasser av mikrotubulepartikler plukket fra A som viste høy og lav dekorasjon og en 2D-klasse fra et annet datasett som vi ikke observerte noen dekorasjon av MATCAP (panelet lengst til høyre). Skalastenger = (A) 50 nm, (B) 25 nm, (C) 10 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Immunoblotanalyse av mikrotubuli utledet fra MATCAP-mangelfulle og VASH1/2-mangelfulle trippelknockout (TKO) HCT116-celler, kommersiell svinehjerne og HeLa tubulin. Forkortelser: TKO = trippel knockout; mAb = monoklonalt antistoff; pAb = polyklonalt antistoff. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne metoden beskriver hvordan man raskt kan trekke ut endogent tubulin fra cellelinjer og deretter dekorere disse mikrotubuli på kryo-EM-gitter. Mikrotubuli er temperaturfølsomme. De depolymeriserer i et kaldt miljø og polymeriserer i et varmt miljø31. Det er derfor viktig å utføre sonikering og clearance spinn (trinn 1,1-1,5) ved 4 ° C for å solubilisere tubulin. Hvis noen faktorer stabiliserte mikrotubuli så godt at de ikke ville depolymerisere i dette trinnet, ville disse mikrotubuli og stabiliserende faktorer bli kassert i pelleten etter det første clearance-spinnet. Etter (re)polymerisering av mikrotubuli, er det viktig å holde løsningen som inneholder polymeriserte mikrotubuli varm til enhver tid. Vi ekstraherte mikrotubuli fra HCT116-celler, som er mangelfull i VASH1-, VASH2- og MATCAP-proteinene. Andre cellelinjer, så vel som vev, kan brukes til å trekke ut mikrotubuli29, selv om forurensningene, tubulinisotypene og utbyttet kan være svært forskjellige fra det som er beskrevet her. Overuttrykkende plasmider som inneholder modifiserende enzymer kan også brukes til å introdusere spesifikke tubulinmodifikasjoner.
Andre protokoller 18,27,28,29,30 bruker flere sykluser av polymerisering og depolymerisering av mikrotubuli for å oppnå mikrotubuli uten andre interagerende proteiner. Her har vi forenklet disse protokollene og polymeriserer bare mikrotubuli en gang. Det er mulig at disse mikrotubuli på grunn av denne enkle polymerisasjonen kan samsedimentere med andre mikrotubuli-interagerende proteiner. Vi har imidlertid funnet ut at denne protokollen gir tilstrekkelig rene mikrotubuli for kryo-EM-formål. Hvis en renere prøve er nødvendig for spesifikke analyser, kan ytterligere sykluser av polymerisering og depolymerisering gi en renere prøve, selv om dette kan være på bekostning av mikrotubuliutbyttet. I denne protokollen brukte vi paklitaksel til å polymerisere mikrotubuli. Paklitaksel kan imidlertid forvrenge mikrotubuligitteret mot en viss vridning og stigning, noe som kan forstyrre mikrotubuliaffiniteten til proteinet av interesse. Andre mikrotubulistabiliserende reagenser kan brukes hvis paklitaksel er uegnet. eksempler på disse reagensene er ikke-taksanmolekyler som pelorusid eller ikke-hydrolyserbare GTP-varianter som GMPCPP17,32.
For å strukturelt undersøke proteiner som binder seg til mikrotubuli på kryo-EM-gitter, må man binde en tilstrekkelig mengde protein av interesse for mikrotubuli. Et vanlig forekommende problem er at proteinkomplekser som er stabile i løsning faller fra hverandre på rutenettet. For å danne proteinkomplekset på rutenettet var det avgjørende å først legge mikrotubuli i lag og deretter påføre det mikrotubulibindende proteinet med lav saltkonsentrasjon på det mikrotubulibelagte rutenettet, og dermed samle proteinkomplekset direkte på rutenettet. Andre har på samme måte rapportert en33,34-protokoll med lite salt og en to-trinns applikasjon34,35,36-protokoll for vellykket mikrotubuli-dekorasjon. Det er sannsynlig at en lavere saltkonsentrasjon forstyrrer proteinkomplekset mot en mer stabil interaksjon på grunn av de reduserte elektrostatiske ladningene. På grunn av den lave saltkonsentrasjonen er imidlertid proteinet av interesse i fare for utfelling. Derfor anbefales det sterkt å holde proteinet på eller rundt fysiologisk relevante saltkonsentrasjoner til kort tid før vitrifisering av ristene. Denne to-trinns applikasjonsprotokollen forhindrer sannsynligvis at proteinkomplekset faller fra hverandre under blotting eller stupfrysing. I denne protokollen brukte vi Vitrobot. Imidlertid kan raskere vitrifikasjonsmetoder (VitroJet) eller bruk av blottfrie rutenett (Puffalot) eller enheter som har begge egenskapene (kameleon) potensielt overvinne to-trinns applikasjonen, men disse er for øyeblikket ikke allment tilgjengelige for testing.
Den endelige oppløsningen av den rekonstruerte kryo-EM-tettheten kan påvirkes av en rekke faktorer, inkludert bevegelsen av det mikrotubulibindende proteinet i forhold til mikrotubuli og dekorasjonsnivået som kan oppnås. Høyere mikrotubuli dekorasjon er sannsynligvis gunstig for den endelige oppløsningen oppnådd i 3D-tetthetsrekonstruksjonen. Dette kan begrenses av noen få faktorer, for eksempel den høyeste proteinkonsentrasjonen som oppnås under rensingen av det mikrotubulibindende proteinet, den laveste saltkonsentrasjonen som det mikrotubuli-interagerende proteinet tåler uten aggregering, og bindingsmodusen til det mikrotubuli-interagerende proteinet (f.eks. Proteinet kan spenne over mer enn en tubulindimer, og dermed hindre et bindingsforhold på 1: 1). Selv om oppløsningen av kryo-EM-rekonstruksjonen kan bli kompromittert av tynt dekorerte mikrotubuli, kan beregningsanalyse omgå mange problemer, som eksemplifisert ved en nylig rapportert mikrotubuli-proteinkompleksstruktur som var ekstremt sparsomt dekorert8.
Protokollen vi beskriver her presenterer en rask, rimelig metode for å oppnå mikrotubuli egnet for kryo-EM-formål. I motsetning til kommersielt tilgjengelig svinehjernetubulin, er mikrotubuli avledet fra MATCAP-mangelfulle og vasohibinfattige HCT116-celler fullstendig tyrosinert (figur 4). Kommersielt HeLa tubulin, et dyrt reagens, er i prinsippet relativt jevnt tyrosinert og inneholder lite andre modifikasjoner4 som glutamylering, men partiene kan variere, og modifikasjon kan bare oppnås in vitro. En fordel med å ekstrahere mikrotubuli fra skreddersydde cellelinjer er fleksibiliteten man har til å overuttrykke eller slette tubulinmodifiserende enzymer, slik som tubulin detyrosinaser, for å skape en mer homogen pool av mikrotubuli. Dette kan være til fordel for dekorasjonen og ensartetheten til kryo-EM-prøven og vil til slutt være til nytte for enkelheten og kvaliteten på kryo-EM-tetthetskartene og molekylære strukturer avledet fra denne prøven.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmene av Sixma-, Brummelkamp- og Perrakis-gruppene for deres fruktbare vitenskapelige diskusjoner og for å gi et hyggelig arbeidsmiljø, og spesielt takker vi Jan Sakoltchik ("person 2") for å hjelpe til med å bestemme proteinkonsentrasjonen som er avbildet i figur 3C. Vi vil også takke NKI kryo-EM-anlegget og Nederland Centre for Electron Nanoscopy (NeCEN) ved Leiden University for deres støtte. Dette arbeidet ble støttet av NWO Vici-stipend 016.Vici.170.033 tildelt T.R.B.. AP og TRB er Oncode-etterforskere og mottar finansiering fra NWO ENW (OCENW. M20.324). L.L. mottok finansiering fra det østerrikske vitenskapsfondet (FWF JB4448-B). Denne forskningen ble støttet av et institusjonelt tilskudd fra den nederlandske kreftforeningen og det nederlandske departementet for helse, velferd og sport.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Cell culture |
| 10 cm plate | Falcon | 353003 | Cell culture |
| 15 cm plate | Thermo FisherScientific | 168381 | Cell culture |
| 50 mL tubes | Sarstedt | 62.547255 | Cell culture |
| 300 mesh quantifoil holey carbon copper grid R1.2/1.3 | Quantifoil Micro Tools | N1-C14nCu30-01 | Cryo-EM grid preparation |
| Cell scrapers | Falcon | 353085 | Cell culture |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | Cell culture |
| EDTA | Merck | 108418 | Cell culture |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3899 | Microtubule extraction |
| Ethane gas | Cryo-EM grid preparation | ||
| FCS | Serana | s-FBS-EU-015 | Cell culture |
| Glycerol | VWR | 24.397.296 | Microtubule extraction |
| GTP | Fisher Scientific | G8877-1G | Microtubule extraction |
| HCT116 VASH1 VASH2 MATCAP KO cells | self made | Wild type HCT116 cells RRID: CVCL_0291 | Cell culture |
| KOH | Merck | 1.05033 | Microtubule extraction |
| MgCl2 | Merck | 105833 | Microtubule extraction |
| Microtubule binding protein | self made | Cryo-EM grid preparation | |
| Needle | BD microlance | 300600 | Microtubule extraction |
| Paclitaxel | Santa Cruz Biotechnology | sc-212517 | caution toxic, microtubule extraction |
| PBS | Fisher Scientific | BP399 | Cell culture |
| Penicillin and streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | Cell culture |
| PIPES | Merck | P8203 | Microtubule extraction |
| PMSF (in EtOH) | Roche | 16837091001 | Microtubule extraction |
| SDS sample buffer | self made | Quality assessment | |
| Syringe | BD plastipak | 309658 | Microtubule extraction |
| Ultra protease tables mini | Fisher Scientific | NC0975224 | Microtubule extraction |
| Whatman blotting paper | Whatman | 47000-100 | Cryo-EM grid preparation |
| Equipment | |||
| Flow hood | cell culture | ||
| GloQube | Quorum | Cryo-EM grid preparation | |
| Grid storage box | SWISSCI | 41018 | Cryo-EM grid storage |
| Heating block, electric or metal | to warm the buffers | ||
| Incubator, cell culture | NUAIR | cell culture | |
| LN2 dewar | Cryo-EM grid storage | ||
| Plunge-tweezers | Electron Microscopy Sciences | 0508-L5-PS | Cryo-EM grid preparation, hole drilled in top to fit the vitrobot |
| Polystyrene box | to keep the buffers warm | ||
| Sonicator | Qsonica | Q700 | Microtubule extraction |
| Standard light microscope | Olympus | CKX 41 | Quality assessment |
| TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
| TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
| Tubes for TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | 326819 | Microtubule extraction |
| Tubes for TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | 347356 | Microtubule extraction |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Microtubule extraction |
| Vitrobot | FEI, ThermoFischer Scientific | mark IV | Cryo-EM grid preparation |
| Vitrobot polystyrene container assembly with metal ethane cup | ThermoFisher Scientific | 200703 | Cryo-EM grid preparation |
| Water bath | cell culture |
References
- Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
- Peris, L., et al. Motor-dependent microtubule disassembly driven by tubulin tyrosination. Journal of Cell Biology. 185 (7), 1159-1166 (2009).
- McKenney, R. J., Huynh, W., Tanenbaum, M. E., Bhabha, G., Vale, R. D. Activation of cytoplasmic dynein motility by dynactin-cargo adapter complexes. Science. 345 (6194), 337-341 (2014).
- Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
- Sirajuddin, M., Rice, L. M., Vale, R. D. Regulation of microtubule motors by tubulin isotypes and post-translational modifications. Nature Cell Biology. 16 (4), 335-344 (2014).
- Nogales, E., Kellogg, E. H. Challenges and opportunities in the high-resolution cryo-EM visualization of microtubules and their binding partners. Current Opinion in Structural Biology. 46, 65-70 (2017).
- Manka, S. W., Moores, C. A. Microtubule structure by cryo-EM: Snapshots of dynamic instability. Essays in Biochemistry. 62 (6), 737-751 (2018).
- Chaaban, S., Carter, A. P. Structure of dynein-dynactin on microtubules shows tandem adaptor binding. Nature. 610 (7930), 212-216 (2022).
- Lacey, S. E., He, S., Scheres, S. H., Carter, A. P. Cryo-EM of dynein microtubule-binding domains shows how an axonemal dynein distorts the microtubule. eLife. 8, 47145 (2019).
- Walton, T., Wu, H., Brown, A. Structure of a microtubule-bound axonemal dynein. Nature Communications. 12, 477 (2021).
- Sindelar, C. V., Downing, K. H. An atomic-level mechanism for activation of the kinesin molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4111-4116 (2010).
- Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins. Cell. 162 (4), 849-859 (2015).
- Maurer, S. P., Fourniol, F. J., Bohner, G., Moores, C. A., Surrey, T. EBs Recognize a nucleotide-dependent structural cap at growing microtubule ends. Cell. 149 (2), 371-382 (2012).
- Benoit, M. P. M. H., Asenjo, A. B., Sosa, H. Cryo-EM reveals the structural basis of microtubule depolymerization by kinesin-13s. Nature Communications. 9, 1662 (2018).
- Kellogg, E. H., et al.
- Brotzakis, Z. F., et al. A structural ensemble of a Tau-microtubule complex reveals regulatory Tau phosphorylation and acetylation mechanisms. ACS Central Science. 7 (12), 1986-1995 (2021).
- Kellogg, E. H., et al. Insights into the distinct mechanisms of action of taxane and non-taxane microtubule stabilizers from cryo-EM structures. Journal of Molecular Biology. 429 (5), 633-646 (2017).
- Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
- Wloga, D., Joachimiak, E., Louka, P., Gaertig, J.
- Nieuwenhuis, J., Brummelkamp, T. R. The tubulin detyrosination cycle: Function and enzymes. Trends in Cell Biology. 29 (1), 80-92 (2019).
- Nieuwenhuis, J., et al.
- Aillaud, C., et al. Vasohibins/SVBP are tubulin carboxypeptidases (TCPs) that regulate neuron differentiation. Science. 358 (6369), 1448-1453 (2017).
- Landskron, L., et al. Posttranslational modification of microtubules by the MATCAP detyrosinase. Science. 376 (6595), (2022).
- Erck, C., et al. A vital role of tubulin-tyrosine-ligase for neuronal organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (22), 7853-7858 (2005).
- Pagnamenta, A. T., et al. Defective tubulin detyrosination causes structural brain abnormalities with cognitive deficiency in humans and mice. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3391-3405 (2019).
- Peris, L., et al. Tubulin tyrosination regulates synaptic function and is disrupted in Alzheimer's disease. Brain. 145 (7), 2486-2506 (2022).
- Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14 (5), 1634-1660 (2019).
- Gell, C., et al.
- Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of tubulin with controlled posttranslational modifications and isotypes from limited sources by polymerization-depolymerization cycles. Journal of Visualized Experiments. (165), e61826 (2020).
- Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
- Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
- Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue. GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
- Sindelar, C. V., Downing, K. H. The beginning of kinesin's force-generating cycle visualized at 9-Å resolution. Journal of Cell Biology. 177 (3), 377-385 (2007).
- Kellogg, E. H., et al. Near-atomic cryo-EM structure of PRC1 bound to the microtubule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9430-9439 (2016).
- Maurer, S. P., Bieling, P., Cope, J., Hoenger, A., Surrey, T. GTPγS microtubules mimic the growing microtubule end structure recognized by end-binding proteins (EBs). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (10), 3988-3993 (2011).
- Manka, S. W., Moores, C. A. Pseudo-repeats in doublecortin make distinct mechanistic contributions to microtubule regulation. EMBO Reports. 21 (12), 51534 (2020).
