Summary
In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Extraktion von endogenem Tubulin aus Säugetierzellen, denen spezifische Mikrotubuli-modifizierende Enzyme fehlen oder diese enthalten können, um Mikrotubuli zu erhalten, die für eine bestimmte Modifikation angereichert sind. Anschließend beschreiben wir, wie die extrahierten Mikrotubuli mit gereinigten Mikrotubuli-bindenden Proteinen dekoriert werden können, um Gitter für die Kryo-Elektronenmikroskopie herzustellen.
Abstract
Mikrotubuli sind ein wichtiger Teil des Zytoskeletts und an der intrazellulären Organisation, Zellteilung und Migration beteiligt. Abhängig von den posttranslationalen Modifikationen können Mikrotubuli Komplexe mit verschiedenen interagierenden Proteinen bilden. Diese Mikrotubuli-Protein-Komplexe werden häufig mit menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Das Verständnis der Struktur solcher Komplexe ist hilfreich für die Aufklärung ihrer Wirkmechanismen und kann mittels Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) untersucht werden. Um solche Komplexe für strukturelle Studien zu erhalten, ist es wichtig, Mikrotubuli zu extrahieren, die spezifische posttranslationale Modifikationen enthalten oder fehlen. In dieser Arbeit beschreiben wir ein vereinfachtes Protokoll zur Extraktion von endogenem Tubulin aus genetisch veränderten Säugetierzellen, bei dem Mikrotubuli-Polymerisation und anschließende Sedimentation mittels Ultrazentrifugation durchgeführt werden. Das extrahierte Tubulin kann dann zur Herstellung von Kryo-Elektronenmikroskop-Gittern mit Mikrotubuli verwendet werden, die an ein gereinigtes Mikrotubuli-bindendes Protein von Interesse gebunden sind. Als Beispiel demonstrieren wir die Extraktion von vollständig tyrosinierten Mikrotubuli aus Zelllinien, denen die drei bekannten Tubulin-detyrosinierenden Enzyme fehlen. Diese Mikrotubuli werden dann verwendet, um einen Proteinkomplex mit enzymatisch inaktiver Mikrotubuli-assoziierter Tubulin-Detyrosinase auf Kryo-EM-Gittern herzustellen.
Introduction
Mikrotubuli sind ein wichtiger Teil des Zytoskeletts. Sie sind an verschiedenen Funktionen wie der Zellmigration und -teilung beteiligt, tragen aber auch zur intrazellulären Organisation bei. Um sich an unterschiedliche funktionelle Schicksale anzupassen, interagieren Mikrotubuli mit einer Vielzahl von Mikrotubuli-assoziierten Proteinen (MAPs), Enzymen und anderen Proteinen, die wir zusammenfassend als "Mikrotubuli-interagierende Proteine" bezeichnen werden. Die Mikrotubuli-Bindung dieser Proteine kann durch verschiedene Tubulin-Modifikationen gesteuert werden, die gemeinhin als "Tubulin-Code"1 bezeichnet werden. Beispiele für diese Präferenz sind das mitotische Zentromer-assoziierte Kinesin (MCAK)2 und die Dynein-Dynactin-CAP-Gly-Domäne von p1503, die bevorzugt mit tyrosiniertem Tubulin assoziieren, während die Kinesinmotoren-Zentromer-assoziierten Proteine E (CENP-E)4 und Kinesin-25 Tubulin bevorzugen, dem das C-terminale Tyrosin fehlt.
Während eine Vielzahl von Methoden eingesetzt werden kann, um Mikrotubuli-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, wird häufig die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) verwendet, um diese Wechselwirkungen mit nahezu atomarer Auflösung zu untersuchen 6,7. In den letzten Jahren haben Kryo-EM-Strukturen gezeigt, wie große Motorproteine wie Dynein 8,9,10 und Kinesin11, +TIP-Proteine wie EB312,13 und MCAK14, andere Proteine wie Tau15,16 und sogar kleine Moleküle wie Paclitaxel, Pelorusid und Zampanolid 17 interagieren mit Mikrotubuli. Um Mikrotubuli-Protein-Interaktionen zu untersuchen, werden Mikrotubuli typischerweise aus dem Schweinegehirn extrahiert18. Im Anschluss daran werden die meisten In-vitro-Studien, einschließlich Kryo-EM-Mikrotubuli-Strukturen, mit porcinem Hirntubulin durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Studien verschleiern daher die Bedeutung der heterogenen Natur von Tubulinmodifikationen19 zwischen Geweben und Zelltypen. Dies stellt ein besonderes Problem dar, wenn ein Protein untersucht wird, das eine bestimmte Modifikation benötigt, um an Mikrotubuli zu binden. Dies lässt sich mit tyrosiniertem Tubulin, dem Substrat für die Mikrotubuli-Detyrosinase MATCAP, veranschaulichen.
Bei der Detyrosinierung handelt es sich um eine Tubulin-Modifikation, bei der die C-terminale Aminosäure Tyrosin von α-Tubulin fehlt, die mit der mitotischen, kardialen und neuronalen Funktion assoziiert ist20. Während vollständig tyrosinierte Mikrotubuli das ideale Substrat für MATCAP sind, fehlt dies in kommerziell erhältlichen Mikrotubuli aus dem Schweinehirn aufgrund der Funktion der Vasohibine 21,22 und MATCAP 23 Detyrosinasen in diesem Gewebe weitgehend 22,23,24,25,26. Obwohl kommerziell erhältliches HeLa-Tubulin hauptsächlich tyrosinierte Mikrotubuli enthält, kann es zu einer Detyrosinierung kommen, und diese Tubulinquelle ist daher weniger geeignet, um eine einheitliche Probe für die Kryo-EM-Analyse zu erstellen.
Um die Bindung von MATCAP an Mikrotubuli zu stimulieren und eine homogene Probe für die Strukturanalyse zu erzeugen, suchten wir nach einer Quelle von Mikrotubuli, die vollständig tyrosiniert ist. Zu diesem Zweck wurde eine MATCAP- und Vasohibin-defiziente Zelllinie hergestellt, mit der vollständig tyrosinierte Mikrotubuli extrahiert wurden. Das Extraktionsverfahren basierte auf etablierten Protokollen, die wiederholte Zyklen der Polymerisation und Depolymerisation der Mikrotubuli verwenden, um Tubulin aus Hirngewebe oder Zellen zu extrahieren 18,27,28,29,30, mit nur einem einzigen Polymerisationsschritt und Zentrifugation über einem Glycerinkissen. Am Beispiel von MATCAP zeigen wir dann, wie diese Mikrotubuli für Kryo-EM-Studien genutzt werden können. Zur Herstellung von Kryo-EM-Gittern wird ein zweistufiges Applikationsprotokoll bei niedriger Salzkonzentration beschrieben. Die Methoden in diesem Artikel beschreiben die Extraktion von anpassbaren Mikrotubuli in ausreichender Menge und Reinheit, um Kryo-EM-Analysen durchzuführen, und bieten ein detailliertes Protokoll zur Verwendung dieser Mikrotubuli zur Herstellung von Protein-Mikrotubuli-Komplexen auf Kryo-EM-Gittern.
Protocol
HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Zellkultur
HINWEIS: Alle Zellkulturen sollten in einer sterilen Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.
- Um diesem Protokoll zu folgen, tauen Sie zunächst eine Durchstechflasche mit gefrorenen Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad auf. Hier verwenden wir eine genetisch veränderte HCT116-Zelllinie, der die drei bekannten detyrosinierenden Enzyme VASH1, VASH2 und MATCAP fehlen, um tyrosiniertes Tubulin herzustellen.
- Bereiten Sie eine Platte mit einem Durchmesser von 10 cm vor, die 10 ml des entsprechenden Zellkulturmediums enthält.
HINWEIS: In diesem Protokoll wurde für die genetisch veränderte HCT116-Zelllinie DMEM (modifiziertes Eagle-Medium) verwendet, das mit 10 % v/v FCS (fetales Kälberserum) und Penicillin/Streptomycin-Antibiotikum (Nährmedium) ergänzt wurde. - Zählen Sie die Zellen und säen Sie ~2,5 × 106 lebensfähige Zellen (~20% Konfluenz) in die vorbereitete 10-cm-Platte. Schütteln Sie den Teller vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Inkubieren Sie die Schale in einem 37 °C heißen Zellkultur-Inkubator, der mit 5 % (v/v) CO2 begast wird, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreicht haben.
HINWEIS: In der Regel dauert dies 3 Tage für HCT116-Zellen, aber die Zeit kann von der spezifischen Seeding-Dichte und der verwendeten Zelllinie abhängen. - Entsorgen Sie das Zellkulturmedium mit einer Pipette oder einem Vakuumsauger und waschen Sie die Schale mit 2 x 5 ml PBS.
Anmerkungen: Achten Sie darauf, das PBS nicht zu stark auf die Zellmonolage abzugeben, da sich dadurch die Zellen von der Platte lösen könnten. - Fügen Sie 1-2 ml Trypsin hinzu und inkubieren Sie die Zellen 2-5 Minuten lang im Inkubator, um die Zellen abzulösen.
- Geben Sie 2 ml des Nährmediums auf die Platte, um das Trypsin abzuschrecken.
- Teilen Sie die Zellsuspension in drei bis fünf gleiche Teile auf und säen Sie sie neu, um die Zellen in Nährmedium zu expandieren, bis 6-12 konfluierende 15-cm-Platten erhalten werden.
2. Ernte
- Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 10 ml PBS (1x), um jegliches Zellkulturmedium zu entfernen.
- Lösen Sie die Zellen von den Platten, indem Sie die Zellen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 3 ml eiskaltem PBS inkubieren, ergänzt mit 5 mM EDTA (steril/gefiltert) und anschließend einen Zellschaber verwenden.
- Sammeln Sie die Zellen in einem 50-ml-Röhrchen auf Eis und drehen Sie sie herunter (10 min, 250 × g).
- Notieren Sie das Volumen der entnommenen Zellen mit der volumetrischen Skala auf dem 50-ml-Röhrchen.
Anmerkungen: Das erwartete Volumen kann zwischen ~0,5 ml und 4 ml liegen. PAUSENSCHRITT: Das Zellpellet in LN2 schockgefrieren und bis zur Verwendung bei −20 °C lagern. Beachten Sie, dass das Zellpellet nur wenige Wochen oder Monate gelagert werden kann. Wenn das Pellet länger aufbewahrt wird, kann dies zu einer geringeren Ausbeute oder gar keinen Mikrotubuli führen.
- Notieren Sie das Volumen der entnommenen Zellen mit der volumetrischen Skala auf dem 50-ml-Röhrchen.
3. Mikrotubuli-Extraktion
Anmerkungen: Bewahren Sie alles für die Schritte 3.1-3.5 auf Eis auf. alles ab Schritt 3.6 sollte warm gehalten werden (30-37 °C).
- Bereiten Sie 10 ml eiskalten Lysepuffer vor, der 100 mM PIPES/KOH (pH 6,9), 2 mM EGTA/KOH, 1 mM MgCl2, 1 mM PMSF und eine Proteasehemmertablette (mini) enthält.
- Resuspendieren Sie das geerntete Zellpellet in 1:1 v/v Lysepuffer (wenn Sie Zweifel über das genaue Volumen haben, nehmen Sie lieber weniger als mehr Lysepuffer).
- Lysieren Sie die Zellen durch Beschallung: 15 s an, 45 s aus, Verstärker 30, vier Zyklen (die Bedingungen experimentell bestimmen und je nach Ultraschallgerät ändern).
- Entnehmen Sie nach der Beschallung eine Probe für die SDS-PAGE-Analyse: 2 μl Lysat + 18 μl Wasser + 5 μl 5x SDS-Probenpuffer.
Anmerkungen: Überprüfen Sie unter einem Standard-Lichtmikroskop, ob die Zellen tatsächlich vollständig lysiert sind.
- Entnehmen Sie nach der Beschallung eine Probe für die SDS-PAGE-Analyse: 2 μl Lysat + 18 μl Wasser + 5 μl 5x SDS-Probenpuffer.
- Pipettieren Sie die lysierten Zellen in ein Zentrifugalröhrchen. 1 h bei 100.000 × g bei 4 °C in einem Ultrazentrifugenrotor schleudern, um das Lysat zu reinigen.
Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass alle Taschen im Rotor trocken und sauber sind, um das korrekte Auswuchten der Zentrifuge zu gewährleisten. - Verwenden Sie eine Spritze, um das gereinigte Lysat herauszunehmen. Achten Sie darauf, das Pellet sowie die schwimmende Schicht auf der Oberseite nicht zu stören.
- Entnahme einer Probe des geklärten Lysats: 2 μl Lysat + 18 μl Wasser + 5 μl 5x SDS-Probenpuffer.
- Spülen Sie das Pellet vorsichtig ab und schöpfen Sie ein wenig von dem Pellet auf, indem Sie eine P10-Pipettenspitze durch das Pellet schwenken. Fügen Sie 200 μl Wasser und 50 μl SDS-Puffer hinzu.
- Ergänzen Sie den Überstand aus dem vorherigen Schritt mit 1 mM GTP und 20 μM Paclitaxel, um die Mikrotubuli zu polymerisieren. Für ein Volumen von 1 ml fügen Sie 10 μl 2 mM Paclitaxel und 10 μl 100 mM GTP hinzu.
VORSICHT: Paclitaxel kann Hautreizungen, schwere Augenschäden, Atemwegsreizungen, genetische Defekte, Schäden am ungeborenen Kind und Schäden an Organen verursachen. Eine längere oder wiederholte Exposition führt zu einer Schädigung der Organe. Atmen Sie die Substanz nicht ein, sprühen Sie sie nicht und stauben Sie sie in keiner Weise ab. Tragen Sie Nitrilhandschuhe aus Gummi, um Hautkontakt zu vermeiden. - Der GTP/Paclitaxel-supplementierte Überstand wird 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, damit sich die Mikrotubuli zusammensetzen können.
- Lassen Sie den Rotor und die Ultrazentrifuge während dieses Inkubationsschritts auf bis zu 30 °C erwärmen.
- Bereiten Sie den Polsterpuffer vor: Fügen Sie 0,6 ml Glycerin zu 0,4 ml Lysepuffer hinzu und ergänzen Sie die Mischung mit 20 μM Paclitaxel. Polsterpuffer auf 37 °C vorwärmen.
- Geben Sie 800 μl Kissenpuffer in ein Ultrazentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie das GTP/Paclitaxel-supplementierte Lysat vorsichtig auf den Kissenpuffer.
Anmerkungen: Verhindern Sie die Vermischung des Kissenpuffers und des Lysats, indem Sie sehr vorsichtig pipettieren. - 30 min bei 100.000 × g bei 30 °C in einem Ultrazentrifugenrotor schleudern. Markieren Sie den nach außen gerichteten Rand des Zentrifugationsröhrchens, um leicht zu erkennen, wo sich das Mikrotubuli-Pellet bilden soll.
- Entfernen Sie den Polsterpuffer vorsichtig mit einer Pipette und achten Sie darauf, das Mikrotubuli-Pellet nicht zu stören.
- Entnehmen Sie eine Probe des Kissenpuffers: 2 μL + 18 μL Wasser + 5 μL 5x SDS-Probenpuffer.
- Waschen Sie das Pellet 3x vorsichtig mit warmem Lysepuffer, um das Glycerin zu entfernen. Geben Sie den warmen Puffer vorsichtig neben das Pellet (spülen Sie die Flüssigkeit nicht direkt über das Pellet), drehen Sie das Röhrchen einige Male, um so viel Glycerin wie möglich aus dem Pellet und den Wänden des Röhrchens zu entfernen, und saugen Sie dann ab und wiederholen Sie den Vorgang.
Anmerkungen: Wenn das Glycerin nicht richtig abgewaschen wird, schmilzt das Gitter unter der Elektronenbeleuchtung sehr schnell. Dies kann durch eine hohe Partikelbewegung belegt werden, die zu verschwommenen Bildern führt. - Resuspensionspuffer mit folgenden Zutaten zubereiten: 100 mM PIPES/KOH (PH 6,9), 2 mM EGTA/KOH und 1 mMMgCl2 und erwärmen Sie den Puffer auf 37 °C.
- Resuspendieren Sie das gewaschene Pellet vorsichtig mit einer abgeschnittenen Spitze in ~50 μl vorgewärmtem Resuspensionspuffer und halten Sie das Röhrchen bei 37 °C.
- Entnahme einer Probe der resuspendierten Pelletfraktion: 2 μL + 18 μL Wasser + 5 μL 5x SDS-Probenpuffer.
TIPP: Die abgeschnittene Spitze verhindert das Brechen der Mikrotubuli. Bereiten Sie einen Heizblock aus Metall auf 37 °C vor und bewahren Sie diesen in einer Styroporbox auf, damit die Probenröhrchen leicht transportiert werden können, ohne sie auf Raumtemperatur abzukühlen.
- Entnahme einer Probe der resuspendierten Pelletfraktion: 2 μL + 18 μL Wasser + 5 μL 5x SDS-Probenpuffer.
4. Kryo-EM-Gittervorbereitung
- Bereiten Sie das Tauchgefriergerät vor, indem Sie das Löschpapier einlegen. Erwärmen Sie den Tauchgefrierschrank auf 30 °C und stellen Sie die Befeuchtung auf 100 % ein. Warten Sie ~30 Minuten, um Temperatur und Luftfeuchtigkeit auszugleichen.
- Bereiten Sie die Einstellungen des Tauchgefrierschranks auf zwei Anwendungen vor und führen Sie das gesamte Programm einmal durch, um sicherzustellen, dass die Einstellungen richtig eingestellt sind. Stellen Sie sicher, dass die erste Anwendung eine Kraft von 10, eine Blot-Zeit von 2 s und eine Wartezeit von 0 s hat und dass die zweite Anwendung eine Kraft von 10, eine Blot-Zeit von 6,5 s und eine Wartezeit von 10 s hat.
- Glimmentladung der Kryo-EM-Gitter bei 30 mA für 60 s.
- Kühlen Sie die Styroporbehälterbaugruppe mit LN2 ab und bereiten Sie flüssiges Ethan in einem Metallbecher zu, indem Sie Ethangas zu einem kalten Metallbecher kondensieren.
- Bereiten Sie einen Verdünnungspuffer mit folgenden Komponenten vor: 100 mM PIPES/KOH (PH 6,9), 2 mM EGTA/KOH und 1 mM MgCl2 und erwärmen Sie ihn auf 37 °C.
- Verdünnen Sie das Mikrotubuli-interagierende Protein 1:1 v/v mit Verdünnungspuffer, kurz bevor Sie es auf die Gitter auftragen, um sicherzustellen, dass die Salzkonzentration gesenkt wird (wir verwendeten eine endgültige Salzkonzentration von 50 mM NaCl). Halten Sie die Mischung bei 37 °C.
- Schnappen Sie sich ein glühendes Gitter mit einer Tauchpinzette und klicken Sie sie in den Tauchgefrierschrank.
- Stellen Sie den Styroporbehälter mit flüssigem Ethan in den Tauchgefrierschrank und führen Sie das vorbereitete Programm durch: Tragen Sie zuerst 3,5 μl Mikrotubuli-Lösung auf das Gitter auf, lassen Sie den Tauchgefrierschrank das Gitter abtupfen, tragen Sie dann sofort 3,5 μl frisch verdünntes Protein auf und lassen Sie den Kolben das Gitter in flüssigem Ethan abtupfen und einfrieren.
- Übertragen Sie die Gitter in eine Gitteraufbewahrungsbox und bewahren Sie sie bis zur Bildgebung in einem LN2-Dewar auf.
Representative Results
Wir untersuchten die Tubulin-Detyrosinase MATCAP, die an tyrosinierte Mikrotubuli gebunden ist, mittels Kryo-EM. Dazu extrahierten wir vollständig tyrosinierte Mikrotubuli aus einer genetisch veränderten HCT116-Zelllinie, der alle drei bekannten detyrosinierenden Enzyme, VASH1/2 und MATCAP, fehlen. Wir verwendeten 6-12 konfluente 15-cm-Schalen, um die Mikrotubuli aus etwa 0,5-4 ml Zellpellets zu extrahieren (Abbildung 1). Nach dem zweiten Zentrifugationsschritt (Schritt 3.11) ergibt sich ein sichtbares, aber kleines und transparentes Pellet (Abbildung 1I). Die Mikrotubuli-Ausbeute beträgt typischerweise ~75 μg. Wenn das Pellet nicht sichtbar ist, kann dies auf ein Problem in einem der vorherigen Schritte hindeuten, wie z. B. eine falsche Mikrotubuli-Polymerisationstemperatur, Probleme mit der Qualität des verwendeten GTP oder Paclitaxels oder die Zugabe von zu viel Lysepuffer, was zu einer Tubulinkonzentration führt, die für die Polymerisation zu niedrig ist. Um die Qualität und Konzentration der extrahierten Mikrotubuli zu beurteilen, analysierten wir Proben auf einem Coomassie-gefärbten SDS-Gel (Abbildung 2A). Diese Analysen zeigten, dass die extrahierten Mikrotubuli relativ rein waren. Die interpolierte Mikrotubuli-Konzentration, die aus der BSA-Quantifizierung abgeleitet wurde, betrug ~1,4 mg/ml. Dies stimmt gut mit der mit einem Spektralphotometer gemessenen Zahl überein (Abbildung 2B,C).
Die frisch extrahierten Mikrotubuli können direkt zur Herstellung von Proben für die Kryo-EM verwendet werden. Die Mikrotubuli sollten auf den Schliffbildern intakt und reichlich vorhanden sein. Für die weitere Kryo-EM-Analyse ist es wichtig, eine niedrige Mikrotubuli-Dichte pro Schliffbild zu haben, um zu vermeiden, dass sich die Mikrotubuli überkreuzen (Abbildung 3A). Gebrochene oder nicht sichtbare Mikrotubuli können darauf hindeuten, dass die Mikrotubuli depolymerisiert sind (z. B. aufgrund einer niedrigen Temperatur oder GTP-Hydrolyse) oder dass die Blotting- und Tauchgefrierparameter nicht korrekt eingestellt wurden. Der Hintergrund um die Mikrotubuli ist dicht, vermutlich mit unpolymerisiertem Tubulin.
Das Molekulargewicht von MATCAP beträgt 53 kDa und es hat eine globuläre katalytische Domäne, die knapp unter der Größe eines Tubulinmonomers liegt. Die Verzierung von MATCAP auf den Mikrotubuli konnte somit visuell nachgewiesen werden. Mikrotubuli, die MATCAP nicht binden, wiesen "glatte" Kanten auf, während Mikrotubuli, die MATCAP banden, "raue" Kanten aufwiesen, die durch elektronendichte Punkte auf der Mikrotubuli-Oberfläche gekennzeichnet waren (Abbildung 3B). MATCAP-gebundene und MATCAP-ungebundene Mikrotubuli konnten ebenfalls in den berechneten 2D-Klassen unterschieden werden, obwohl dies aufgrund von Form und Größe für andere Mikrotubuli-interagierende Proteine unterschiedlich sein könnte (Abbildung 3C). Um zu bestätigen, dass die Dichte tatsächlich zu dem interessierenden Protein gehört, kann man sich experimentell bestimmte oder vorhergesagte Strukturen zunutze machen. Wir schlagen auch vor, ein Kontrollgitter zu erstellen, das Mikrotubuli nur zum Vergleich enthält. Dies gibt Aufschluss darüber, ob die Mikrotubuli in einer ausreichend hohen Konzentration polymerisiert und intakt extrahiert wurden und ob der Tauchgefrierprozess korrekt durchgeführt wurde. Wir stellten fest, dass die Mikrotubuli-Abundanz in Gittern mit einer zweiten MATCAP-Anwendung abnahm.
Abbildung 1: Visuelle Führung der Versuchsschritte. (A) Zellpellet vor der Lyse; (B) beschallte Zellen in einem Ultrazentrifugenröhrchen vor der Zentrifugation; (C) beschallte Zellen in einem Ultrazentrifugenröhrchen nach der Zentrifugation; (D) Spritze mit dem freigegebenen Überstand; (E) Restpellet nach Entfernung des Überstands, einschließlich einer "weißen Schwimmschicht"; (F) P10-Spitze mit einem Zelltrümmer-Pellet für das SDS-Coomassie-Gel; (G) GTP/Paclitaxel-supplementierter Überstand vor der Inkubation; (H) GTP/Paclitaxel-inkubierter Überstand auf einem Glycerinkissen in einem Ultrazentrifugenröhrchen; (I) Mikrotubuli-Pellet nach dem zweiten Zentrifugationsschritt reinigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Bestimmung der Reinheit und Konzentration der Mikrotubuli . (A) Coomassie-gefärbtes SDS-Seitengel mit den Proben, die während des Extraktionsprotokolls entnommen wurden, und einem BSA-Konzentrationsvergleich. S1 und P1 entsprechen dem Überstand bzw. dem Pellet nach dem ersten Zentrifugationsschritt. S2 und P2 entsprechen in ähnlicher Weise dem zweiten Zentrifugationsschritt. (B) Eine nichtlineare Regressionsgerade der relativen BSA-Größen, die von A abgeleitet sind. Die Interpolation des Mikrotubuli-Bandes um 50 kDa in der P2-Spur (Mikrotubuli) ergibt eine Endkonzentration von 1,42 mg/ml. (C) Die spektrophotometrische Analyse der resuspendierten Mikrotubuli (P2), die von zwei Personen gemessen und um den kombinierten Extinktionskoeffizienten von TUBA1A und TUBB3 (0,971) korrigiert wurde, ergab eine mittlere Konzentration und eine Standardabweichung von 1,46 mg/ml ± 0,14 mg/ml. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Beispiel-Schliffbilder. (A) Beispiel-Schliffbilder, die Mikrotubuli zeigen, die an MATCAP gebunden sind. Die Mikrotubuli, die durch ein grünes Kästchen gekennzeichnet sind, sind intakt, verziert und können für die Kryo-EM-Analyse verwendet werden. Der Mikrotubuli, der durch das orangefarbene Kästchen gekennzeichnet ist, ist ein intakter und dekorierter Mikrotubuli, befindet sich jedoch in der Nähe der Mikrotubuli links davon. daher ist es weniger geeignet, es in die Kryo-EM-Analyse einzubeziehen. Die Mikrotubuli im roten Kasten kreuzen sich und sind gebrochen. Diese sollten von der Kryo-EM-Analyse ausgeschlossen werden. (B) Eine vergrößerte Ansicht des grün umrandeten Mikrotubuli des linken Bildes. Die roten Pfeilspitzen zeigen die schwarzen Punkte an, die nur auf den Mikrotubuli in den Schliffbildern auftraten, die eine Anwendung von MATCAP aufwiesen und daher wahrscheinlich MATCAP entsprechen, das an die Mikrotubuli gebunden ist. (C) Beispiel 2D-Klassen von Mikrotubuli-Partikeln, die aus A ausgewählt wurden und eine hohe und niedrige Dekoration, und eine 2D-Klasse aus einem anderen Datensatz, für die wir keine Dekorationen durch MATCAP beobachtet haben (Bild ganz rechts). Maßstabsbalken = (A) 50 nm, (B) 25 nm, (C) 10 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Immunoblot-Analyse von Mikrotubuli, die aus MATCAP-defizienten und VASH1/2-defizienten Triple-Knockout-HCT116-Zellen, kommerziellem Schweinegehirn und HeLa-Tubulin stammen. Abkürzungen: TKO = Triple Knockout; mAb = monoklonaler Antikörper; pAb = polyklonaler Antikörper. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Discussion
Diese Methode beschreibt, wie man schnell endogenes Tubulin aus Zelllinien extrahieren und diese Mikrotubuli anschließend auf Kryo-EM-Gittern dekorieren kann. Mikrotubuli sind temperaturempfindlich. Sie depolymerisieren in einer kalten Umgebung und polymerisieren in einer warmen Umgebung31. Es ist daher von entscheidender Bedeutung, die Beschallung und den Clearance-Spin (Schritte 1,1-1,5) bei 4 °C auszuführen, um das Tubulin zu solubilisieren. Wenn irgendwelche Faktoren die Mikrotubuli so gut stabilisieren würden, dass sie in diesem Schritt nicht depolymerisieren würden, würden diese Mikrotubuli und die stabilisierenden Faktoren nach dem anfänglichen Clearance-Spin im Pellet verworfen werden. Nach der (Re-)Polymerisation der Mikrotubuli ist es wichtig, die Lösung mit den polymerisierten Mikrotubuli immer warm zu halten. Wir extrahierten die Mikrotubuli aus HCT116-Zellen, denen die Proteine VASH1, VASH2 und MATCAP fehlen. Andere Zelllinien sowie Gewebe können verwendet werden, um Mikrotubuli29 zu extrahieren, obwohl sich die Verunreinigungen, Tubulin-Isotypen und die Ausbeute stark von dem unterscheiden können, was hier beschrieben wird. Die Überexpression von Plasmiden, die modifizierende Enzyme enthalten, kann auch verwendet werden, um spezifische Tubulin-Modifikationen einzuführen.
Andere Protokolle 18,27,28,29,30 verwenden mehrere Zyklen der Polymerisation und Depolymerisation der Mikrotubuli, um Mikrotubuli zu erhalten, die frei von anderen interagierenden Proteinen sind. Hier haben wir diese Protokolle vereinfacht und polymerisieren die Mikrotubuli nur einmal. Es ist möglich, dass diese Mikrotubuli aufgrund dieser einzelnen Polymerisation mit anderen Mikrotubuli-interagierenden Proteinen co-sedimentieren. Wir haben jedoch festgestellt, dass dieses Protokoll ausreichend reine Mikrotubuli für Kryo-EM-Zwecke liefert. Wenn für bestimmte Assays eine reinere Probe benötigt wird, könnten zusätzliche Polymerisations- und Depolymerisationszyklen zu einer reineren Probe führen, obwohl dies auf Kosten der Mikrotubuli-Ausbeute gehen kann. In diesem Protokoll haben wir Paclitaxel verwendet, um die Mikrotubuli zu polymerisieren. Paclitaxel könnte jedoch das Mikrotubuli-Gitter in Richtung einer bestimmten Drehung und eines Anstiegs verzerren, was die Mikrotubuli-Affinität des interessierenden Proteins beeinträchtigen könnte. Andere Mikrotubuli-stabilisierende Reagenzien könnten verwendet werden, wenn Paclitaxel ungeeignet ist; Beispiele für diese Reagenzien sind nicht-taxanische Moleküle wie Pelorusid oder nicht-hydrolysierbare GTP-Varianten wie GMPCPP17,32.
Um Proteine, die an Mikrotubuli auf Kryo-EM-Gittern binden, strukturell zu untersuchen, muss eine ausreichende Menge des interessierenden Proteins an die Mikrotubuli gebunden werden. Ein häufig auftretendes Problem ist, dass Proteinkomplexe, die in Lösung stabil sind, auf dem Gitter auseinanderfallen. Für die Bildung des Proteinkomplexes auf dem Gitter war es entscheidend, zunächst die Mikrotubuli zu schichten und dann das Mikrotubuli-bindende Protein mit geringer Salzkonzentration auf das Mikrotubuli-beschichtete Gitter aufzubringen und so den Proteinkomplex direkt auf dem Gitter zusammenzusetzen. Andere haben in ähnlicher Weise über ein salzarmes 33,34-Protokoll und ein zweistufiges Anwendungsprotokoll 34,35,36 für eine erfolgreiche Mikrotubuli-Dekoration berichtet. Es ist wahrscheinlich, dass eine niedrigere Salzkonzentration den Proteinkomplex aufgrund der geringeren elektrostatischen Aufladung in Richtung einer stabileren Wechselwirkung verzerrt. Aufgrund der geringen Salzkonzentration besteht jedoch die Gefahr, dass das interessierende Protein ausfällt. Daher wird dringend empfohlen, das Protein bis kurz vor der Verglasung der Gitter auf oder in der Nähe physiologisch relevanter Salzkonzentrationen zu halten. Dieses zweistufige Applikationsprotokoll verhindert wahrscheinlich, dass der Proteinkomplex während der Blotting- oder Tauchgefrierschritte auseinanderfällt. In diesem Protokoll haben wir den Vitrobot verwendet. Schnellere Vitrifikationsmethoden (VitroJet) oder die Verwendung von Blot-freien Gittern (Puffalot) oder Geräten, die beide Eigenschaften aufweisen (Chamäleon), könnten die zweistufige Anwendung jedoch möglicherweise überwinden, aber diese sind derzeit nicht allgemein für Tests verfügbar.
Die endgültige Auflösung der rekonstruierten Kryo-EM-Dichte kann von einer Reihe von Faktoren beeinflusst werden, einschließlich der Bewegung des Mikrotubuli-bindenden Proteins relativ zum Mikrotubuli und dem Grad der Dekoration, der erreicht werden kann. Eine höhere Mikrotubuli-Dekoration ist wahrscheinlich vorteilhaft für die endgültige Auflösung, die in der 3D-Dichterekonstruktion erzielt wird. Dies kann durch einige Faktoren begrenzt werden, wie z. B. die höchste Proteinkonzentration, die während der Reinigung des Mikrotubuli-bindenden Proteins erzielt wird, die niedrigste Salzkonzentration, die das Mikrotubuli-interagierende Protein ohne Aggregation aushalten kann, und den Bindungsmodus des Mikrotubuli-interagierenden Proteins (z. B. könnte das Protein mehr als ein Tubulin-Dimer umfassen, wodurch ein Bindungsverhältnis von 1:1 verhindert wird). Obwohl die Auflösung der Kryo-EM-Rekonstruktion durch spärlich dekorierte Mikrotubuli beeinträchtigt werden könnte, können computergestützte Analysen viele Probleme umgehen, wie ein kürzlich beschriebenes Mikrotubuli-Protein-Komplex zeigt, das extrem spärlich dekoriert war8.
Das Protokoll, das wir hier beschreiben, stellt eine schnelle und kostengünstige Methode dar, um Mikrotubuli zu erhalten, die für Kryo-EM-Zwecke geeignet sind. Im Gegensatz zu kommerziell erhältlichem porcinem Hirntubulin sind die Mikrotubuli, die von MATCAP- und Vasohibin-defizienten HCT116-Zellen stammen, vollständig tyrosiniert (Abbildung 4). Kommerzielles HeLa-Tubulin, ein teures Reagenz, ist im Prinzip relativ gleichmäßig tyrosiniert und enthält kaum andere Modifikationen4 wie Glutamylierung, aber die Chargen können variieren, und eine Modifikation konnte nur in vitro erreicht werden. Ein Vorteil der Extraktion von Mikrotubuli aus maßgeschneiderten Zelllinien ist die Flexibilität, Tubulin-modifizierende Enzyme, wie z. B. Tubulin-Detyrosinasen, zu überexprimieren oder zu löschen, um einen homogeneren Pool von Mikrotubuli zu schaffen. Dies kann der Dekoration und Gleichmäßigkeit der Kryo-EM-Probe zugute kommen und wird letztendlich der Einfachheit und Qualität der aus dieser Probe abgeleiteten Kryo-EM-Dichtekarten und molekularen Strukturen zugute kommen.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken allen Mitgliedern der Gruppen Sixma, Brummelkamp und Perrakis für ihre fruchtbaren wissenschaftlichen Diskussionen und für die Bereitstellung eines angenehmen Arbeitsumfelds, insbesondere Jan Sakoltchik ("Person 2") für die Hilfe bei der Bestimmung der in Abbildung 3C dargestellten Proteinkonzentration. Wir möchten uns auch bei der Kryo-EM-Einrichtung des NKI und dem Niederländischen Zentrum für Elektronennanoskopie (NeCEN) an der Universität Leiden für ihre Unterstützung bedanken. Diese Arbeit wurde durch das NWO-Vici-Stipendium 016.Vici.170.033 unterstützt, das an T.R.B. vergeben wurde. A.P. und T.R.B. sind Oncode-Ermittler und werden von NWO ENW (OCENW. M20.324). L.L. wurde vom Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung gefördert (FWF JB4448-B). Diese Forschung wurde durch einen institutionellen Zuschuss der Niederländischen Krebsgesellschaft und des niederländischen Ministeriums für Gesundheit, Wohlfahrt und Sport unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Cell culture |
| 10 cm plate | Falcon | 353003 | Cell culture |
| 15 cm plate | Thermo FisherScientific | 168381 | Cell culture |
| 50 mL tubes | Sarstedt | 62.547255 | Cell culture |
| 300 mesh quantifoil holey carbon copper grid R1.2/1.3 | Quantifoil Micro Tools | N1-C14nCu30-01 | Cryo-EM grid preparation |
| Cell scrapers | Falcon | 353085 | Cell culture |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | Cell culture |
| EDTA | Merck | 108418 | Cell culture |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3899 | Microtubule extraction |
| Ethane gas | Cryo-EM grid preparation | ||
| FCS | Serana | s-FBS-EU-015 | Cell culture |
| Glycerol | VWR | 24.397.296 | Microtubule extraction |
| GTP | Fisher Scientific | G8877-1G | Microtubule extraction |
| HCT116 VASH1 VASH2 MATCAP KO cells | self made | Wild type HCT116 cells RRID: CVCL_0291 | Cell culture |
| KOH | Merck | 1.05033 | Microtubule extraction |
| MgCl2 | Merck | 105833 | Microtubule extraction |
| Microtubule binding protein | self made | Cryo-EM grid preparation | |
| Needle | BD microlance | 300600 | Microtubule extraction |
| Paclitaxel | Santa Cruz Biotechnology | sc-212517 | caution toxic, microtubule extraction |
| PBS | Fisher Scientific | BP399 | Cell culture |
| Penicillin and streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | Cell culture |
| PIPES | Merck | P8203 | Microtubule extraction |
| PMSF (in EtOH) | Roche | 16837091001 | Microtubule extraction |
| SDS sample buffer | self made | Quality assessment | |
| Syringe | BD plastipak | 309658 | Microtubule extraction |
| Ultra protease tables mini | Fisher Scientific | NC0975224 | Microtubule extraction |
| Whatman blotting paper | Whatman | 47000-100 | Cryo-EM grid preparation |
| Equipment | |||
| Flow hood | cell culture | ||
| GloQube | Quorum | Cryo-EM grid preparation | |
| Grid storage box | SWISSCI | 41018 | Cryo-EM grid storage |
| Heating block, electric or metal | to warm the buffers | ||
| Incubator, cell culture | NUAIR | cell culture | |
| LN2 dewar | Cryo-EM grid storage | ||
| Plunge-tweezers | Electron Microscopy Sciences | 0508-L5-PS | Cryo-EM grid preparation, hole drilled in top to fit the vitrobot |
| Polystyrene box | to keep the buffers warm | ||
| Sonicator | Qsonica | Q700 | Microtubule extraction |
| Standard light microscope | Olympus | CKX 41 | Quality assessment |
| TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
| TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
| Tubes for TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | 326819 | Microtubule extraction |
| Tubes for TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | 347356 | Microtubule extraction |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Microtubule extraction |
| Vitrobot | FEI, ThermoFischer Scientific | mark IV | Cryo-EM grid preparation |
| Vitrobot polystyrene container assembly with metal ethane cup | ThermoFisher Scientific | 200703 | Cryo-EM grid preparation |
| Water bath | cell culture |
References
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