Summary
Hier beschrijven we een protocol om endogene tubuline te extraheren uit zoogdiercellen, die specifieke microtubuli-modificerende enzymen kunnen missen of bevatten, om microtubuli te verkrijgen die zijn verrijkt voor een specifieke modificatie. Vervolgens beschrijven we hoe de geëxtraheerde microtubuli kunnen worden versierd met gezuiverde microtubule-bindende eiwitten om rasters voor cryo-elektronenmicroscopie voor te bereiden.
Abstract
Microtubuli zijn een belangrijk onderdeel van het cytoskelet en zijn betrokken bij intracellulaire organisatie, celdeling en migratie. Afhankelijk van de posttranslationele modificaties kunnen microtubuli complexen vormen met verschillende interagerende eiwitten. Deze microtubuli-eiwitcomplexen zijn vaak betrokken bij menselijke ziekten. Het begrijpen van de structuur van dergelijke complexen is nuttig voor het ophelderen van hun werkingsmechanismen en kan worden bestudeerd door cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM). Om dergelijke complexen voor structurele studies te verkrijgen, is het belangrijk om microtubuli te extraheren die specifieke posttranslationele modificaties bevatten of missen. Hier beschrijven we een vereenvoudigd protocol om endogene tubuline te extraheren uit genetisch gemodificeerde zoogdiercellen, met microtubulepolymerisatie, gevolgd door sedimentatie met behulp van ultracentrifugatie. De geëxtraheerde tubuline kan vervolgens worden gebruikt om cryo-elektronenmicroscooproosters te bereiden met microtubuli die zijn gebonden aan een gezuiverd microtubule-bindend eiwit van belang. Als voorbeeld demonstreren we de extractie van volledig getyrosineerde microtubuli uit cellijnen die zijn ontworpen om de drie bekende tubuline-detyrosinerende enzymen te missen. Deze microtubuli worden vervolgens gebruikt om een eiwitcomplex te maken met enzymatisch inactieve microtubuli-geassocieerde tubuline-detyrosinase op cryo-EM-roosters.
Introduction
Microtubuli zijn een cruciaal onderdeel van het cytoskelet; Ze zijn betrokken bij verschillende functies zoals celmigratie en -deling, maar dragen ook bij aan intracellulaire organisatie. Om zich aan te passen aan verschillende functionele lotgevallen, interageren microtubuli met een verscheidenheid aan microtubule-geassocieerde eiwitten (MAPs), enzymen en andere eiwitten, die we gezamenlijk zullen aanduiden als "microtubule-interagerende eiwitten." De microtubulibinding van deze eiwitten kan worden geleid door verschillende tubulinemodificaties, gewoonlijk de "tubulinecode" genoemd1. Voorbeelden van deze voorkeur zijn het mitotische centromeer-geassocieerde kinesine (MCAK)2 en het dyneïne-dynactine CAP-Gly domein van p1503, die bij voorkeur associëren met getyrosineerd tubuline, terwijl de kinesinemotoren centromeer-geassocieerd eiwit E (CENP-E)4 en kinesine-25 de voorkeur geven aan tubuline dat de C-terminale tyrosine mist.
Hoewel verschillende methoden kunnen worden gebruikt om microtubuli-eiwitinteracties te bestuderen, wordt cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) vaak gebruikt om deze interacties te bestuderen met een bijna-atomaire resolutie 6,7. In de afgelopen jaren hebben cryo-EM-structuren onthuld hoe grote motoreiwitten zoals dyneïne 8,9,10 en kinesine 11, +TIP-eiwitten zoals EB312,13 en MCAK 14, andere eiwitten zoals Tau 15,16 en zelfs kleine moleculen zoals paclitaxel, pelorusside en zampanolide 17 interactie met microtubuli. Om microtubule-eiwitinteracties te bestuderen, worden microtubuli meestal geëxtraheerd uit het varkensbrein18. Hierna worden de meeste in vitro studies, waaronder cryo-EM microtubulistructuren, uitgevoerd met behulp van varkens hersentubuline. De resultaten van deze studies verdoezelen daarom het belang van de heterogene aard van tubulinemodificaties19 tussen weefsels en celtypen. Dit creëert een bijzonder probleem bij het onderzoeken van een eiwit dat een specifieke modificatie vereist of verkiest om te binden aan microtubuli. Dit kan worden geïllustreerd met getyrosineerde tubuline, het substraat voor microtubule detyrosinase MATCAP.
Detyrosinatie is een tubulinemodificatie waarbij het C-terminale aminozuur tyrosine van α-tubuline ontbreekt, wat geassocieerd is met mitotische, cardiale en neuronale functie20. Hoewel volledig getyrosineerde microtubuli het ideale substraat zijn voor MATCAP, is dit grotendeels afwezig in commercieel verkrijgbare microtubuli uit het varkensbrein vanwege de functie van de vasohibinen 21,22 en MATCAP 23 detyrosinases in dit weefsel 22,23,24,25,26. Hoewel in de handel verkrijgbare HeLa-tubuline meestal getyrosineerde microtubuli bevat, kan detyrosinatie optreden en deze bron van tubuline is daarom minder geschikt voor het maken van een uniform monster voor cryo-EM-analyse.
Om de binding van MATCAP aan microtubuli te stimuleren en een homogeen monster te creëren voor structurele analyse, zochten we naar een bron van microtubuli die volledig getyrosineerd is. Hiertoe werd een MATCAP- en vasohibine-deficiënte cellijn gemaakt, die werd gebruikt om volledig getyrosineerde microtubuli te extraheren. De extractieprocedure was gebaseerd op gevestigde protocollen die herhaalde cycli van polymerisatie en depolymerisatie van de microtubuli gebruiken om tubuline uit hersenweefsel of cellen te extraheren 18,27,28,29,30, met slechts een enkele polymerisatiestap en centrifugatie over een glycerolkussen. Aan de hand van MATCAP als voorbeeld laten we vervolgens zien hoe deze microtubuli kunnen worden gebruikt voor cryo-EM-studies. Om cryo-EM-roosters voor te bereiden, wordt een tweestapstoepassingsprotocol bij een lage zoutconcentratie beschreven. De methoden in dit artikel beschrijven de extractie van aanpasbare microtubuli met voldoende hoeveelheden en zuiverheid om cryo-EM-analyse uit te voeren en bieden een gedetailleerd protocol over hoe deze microtubuli kunnen worden gebruikt om eiwit-microtubulicomplexen op cryo-EM-rasters te maken.
Protocol
OPMERKING: Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt.
1. Celkweek
OPMERKING: Alle celkweek moet worden gedaan in een steriele laminaire stroomkap.
- Om dit protocol te volgen, ontdooi u eerst een injectieflacon met bevroren cellen in een waterbad van 37 °C. Hier gebruiken we een genetisch gemodificeerde HCT116-cellijn die de drie bekende detyrosinerende enzymen, VASH1, VASH2 en MATCAP, mist om getyrosineerde tubuline te maken.
- Bereid een plaat van Ø 10 cm met 10 ml van het juiste celkweekmedium.
OPMERKING: In dit protocol werd DMEM (Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium) aangevuld met 10% v/v FCS (foetaal kalfsserum) en penicilline/streptomycine antibioticum (kweekmedium) gebruikt voor de genetisch gemodificeerde HCT116 cellijn. - Tel de cellen en zaai ~2,5 × 106 levensvatbare cellen (~20% samenvloeiing) in de voorbereide plaat van 10 cm. Schud de plaat voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verdelen. Incubeer de schaal in een 37 °C celkweekincubator vergast met 5% (v/v) CO2 totdat de cellen 80%-90% samenvloeiing bereiken.
OPMERKING: Meestal duurt dit 3 dagen voor HCT116-cellen, maar de tijd kan afhangen van de specifieke zaaidichtheid en de gebruikte cellijn. - Gooi het celkweekmedium weg met een pipet of vacuümaspirator en was de schaal 2 x 5 ml PBS.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de PBS niet te krachtig op de monolaag van de cel doseert, omdat dit de cellen van de plaat kan losmaken. - Voeg 1-2 ml trypsine toe en incuber de cellen in de couveuse gedurende 2-5 minuten om de cellen los te maken.
- Voeg 2 ml van het kweekmedium toe aan de plaat om de trypsine te blussen.
- Splits de celsuspensie in drie tot vijf gelijke delen en zaai ze opnieuw in om de cellen in kweekmedium uit te breiden totdat 6-12 confluente platen van 15 cm zijn verkregen.
2. Oogsten
- Was de cellen voorzichtig met 10 ml PBS (1x) om elk celkweekmedium te verwijderen.
- Maak de cellen los van de platen door de cellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te incuberen met 3 ml ijskoude PBS aangevuld met 5 mM EDTA (steriel/gefilterd) en vervolgens met behulp van een celschraper.
- Verzamel de cellen in een buis van 50 ml op ijs en draai naar beneden (10 min, 250 × g).
- Let op het volume van de geoogste cellen met de volumetrische schaal op de buis van 50 ml.
OPMERKING: Het verwachte volume kan ergens tussen ~ 0,5 ml en 4 ml liggen. PAUZEERSTAP: Vries de celpellet in LN2 in en bewaar bij −20 °C tot gebruik. Merk op dat de celpellet slechts enkele weken of maanden kan worden bewaard. Als de pellet langer wordt bewaard, kan dit resulteren in een verminderde opbrengst of helemaal geen microtubuli.
- Let op het volume van de geoogste cellen met de volumetrische schaal op de buis van 50 ml.
3. Microtubule extractie
OPMERKING: Bewaar alles voor stap 3.1-3.5 op ijs; alles vanaf stap 3.6 moet warm worden gehouden (30-37 °C).
- Bereid 10 ml ijskoude lysisbuffer met 100 mM PIPES/KOH (pH 6,9), 2 mM EGTA/KOH, 1 mM MgCl2, 1 mM PMSF en één proteaseremmertablet (mini).
- Resuspendeer de geoogste celpellet in 1:1 v/v lysisbuffer (neem bij twijfel over het exacte volume minder lysisbuffer in plaats van meer).
- Lyse de cellen door ultrasoonapparaat: 15 s aan, 45 s uit, ampère 30, vier cycli (bepaal de omstandigheden experimenteel en verander volgens de sonicator).
- Verzamel na sonicatie een monster voor SDS-PAGE-analyse: 2 μL lysaat + 18 μL water + 5 μL 5x SDS-monsterbuffer.
OPMERKING: Controleer onder een standaard lichtmicroscoop of de cellen inderdaad volledig gelyseerd zijn.
- Verzamel na sonicatie een monster voor SDS-PAGE-analyse: 2 μL lysaat + 18 μL water + 5 μL 5x SDS-monsterbuffer.
- Pipetteer de gelyseerde cellen in een centrifugaalbuis. Draai gedurende 1 uur bij 100.000 × g bij 4 °C in een ultracentrifugerotor om het lysaat te verwijderen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat alle zakken in de rotor droog en schoon zijn om de juiste balans van de centrifuge te garanderen. - Gebruik een spuit om het geklaarde lysaat eruit te halen. Zorg ervoor dat u de pellet en de drijvende laag bovenop niet verstoort.
- Verzamel een monster van het geklaarde lysaat: 2 μL lysaat + 18 μL water + 5 μL 5x SDS-monsterbuffer.
- Spoel de pellet voorzichtig af en schep een klein beetje van de pellet op door een P10-pipetpunt door de pellet te draaien; voeg 200 μL water en 50 μL SDS-buffer toe.
- Vul het supernatant uit de vorige stap aan met 1 mM GTP en 20 μM paclitaxel om de microtubuli te polymeriseren; voeg voor een volume van 1 ml 10 μl paclitaxel en 10 μl 100 mM GTP toe.
LET OP: Paclitaxel kan huidirritatie, ernstig oogletsel, irritatie van de luchtwegen, genetische defecten, schade aan een ongeboren kind en schade aan organen veroorzaken. Langdurige of herhaalde blootstelling veroorzaakt schade aan organen. Adem, spuit of stof de stof op geen enkele manier. Draag rubberen nitrilhandschoenen om huidcontact te voorkomen. - Incubeer het met GTP/paclitaxel aangevulde supernatant gedurende 30 minuten bij 37 °C om de microtubuli te laten assembleren.
- Laat tijdens deze incubatiestap de rotor en de ultracentrifuge opwarmen tot 30 °C.
- Bereid de kussenbuffer voor: Voeg 0,6 ml glycerol toe aan 0,4 ml lysisbuffer en vul het mengsel aan met 20 μM paclitaxel. Verwarm de kussenbuffer voor op 37 °C.
- Voeg 800 μL kussenbuffer toe aan een ultracentrifugebuis. Pipetteer het GTP/paclitaxel-aangevulde lysaat voorzichtig bovenop de kussenbuffer.
OPMERKING: Voorkom het mengen van de kussenbuffer en het lysaat door heel voorzichtig te pipetteren. - Draai gedurende 30 minuten bij 100.000 × g bij 30 °C in een ultracentrifugerotor. Markeer de naar buiten gerichte rand van de centrifugeerbuis om gemakkelijk te herkennen waar de microtubule-pellet zich moet vormen.
- Verwijder de kussenbuffer voorzichtig met een pipet en zorg ervoor dat de microtubulekorrel niet wordt verstoord.
- Verzamel een monster van de kussenbuffer: 2 μL + 18 μL water + 5 μL 5x SDS-monsterbuffer.
- Was de pellet voorzichtig 3x met warme lysisbuffer om de glycerol te verwijderen. Doseer voorzichtig de warme buffer naast de pellet (spoel de vloeistof niet direct over de pellet), draai de buis een paar keer om zoveel mogelijk glycerol uit de pellet en de wanden van de buis te verwijderen en zuig en herhaal vervolgens.
OPMERKING: Als de glycerol niet goed wordt afgewassen, zal het rooster zeer snel smelten onder de elektronenverlichting. Dit kan blijken uit hoge deeltjesbewegingen, waardoor wazige beelden ontstaan. - Bereid de resuspensiebuffer met de volgende ingrediënten: 100 mM PIPES/KOH (pH 6,9), 2 mM EGTA/KOH en 1 mM MgCl2 en verwarm de buffer tot 37 °C.
- Resuspensie van de gewassen pellet voorzichtig met een gesneden punt in ~50 μL voorverwarmde resuspensiebuffer en houd de buis op 37 °C.
- Verzamel een monster van de geresuspendeerde pelletfractie: 2 μL + 18 μL water + 5 μL 5x SDS-monsterbuffer.
TIP: De snijpunt voorkomt het breken van de microtubuli. Bereid een metalen verwarmingsblok voor tot 37 °C en bewaar dit in een polystyreendoos, zodat de monsterbuizen gemakkelijk kunnen worden getransporteerd zonder ze af te koelen tot kamertemperatuur.
- Verzamel een monster van de geresuspendeerde pelletfractie: 2 μL + 18 μL water + 5 μL 5x SDS-monsterbuffer.
4. Cryo-EM grid voorbereiding
- Bereid het dompelvriezerapparaat voor door het vloeipapier te installeren. Verwarm de diepvries tot 30 °C en stel de bevochtiging in op 100%. Laat ~30 minuten om de temperatuur en luchtvochtigheid in evenwicht te brengen.
- Bereid de instellingen van de dompelvriezer voor op twee toepassingen en doorloop het hele programma één keer om er zeker van te zijn dat de instellingen correct zijn ingesteld. Zorg ervoor dat de eerste toepassing een kracht van 10, 2 s vlektijd en 0 s wachttijd heeft en dat de tweede toepassing een kracht van 10, 6,5 s vlekkentijd en 10 s wachttijd heeft.
- Gloei-ontlaad de cryo-EM roosters op 30 mA gedurende 60 s.
- Koel de polystyreencontainer af met LN2 en bereid vloeibaar ethaan voor in een metalen beker door ethaangas te condenseren in een koude metalen beker.
- Bereid een verdunningsbuffer met de volgende componenten: 100 mM PIPES/KOH (pH 6,9), 2 mM EGTA/KOH en 1 mM MgCl2 en verwarm deze tot 37 °C.
- Verdun het microtubule-interagerende eiwit 1:1 v/v met verdunningsbuffer vlak voordat u het op de roosters aanbrengt om ervoor te zorgen dat de zoutconcentratie wordt verlaagd (we gebruikten een uiteindelijke zoutconcentratie van 50 mM NaCl). Houd het mengsel op 37 °C.
- Pak een gloeiend rooster met een pincet en klik ze in de diepvries.
- Plaats de polystyreencontainer met vloeibaar ethaan in de dompelvriezer en doorloop het voorbereide programma: breng eerst 3,5 μL microtubuli-oplossing aan op het rooster, laat de duikvriezer het rooster deppen, breng dan onmiddellijk 3,5 μL vers verdund eiwit aan en laat ten slotte de zuiger deppen en bevries het rooster in vloeibaar ethaan.
- Breng de rasters over naar een rasteropslagdoos en sla ze op in een LN2-dewar tot beeldvorming.
Representative Results
We onderzochten de tubuline detyrosinase MATCAP gebonden aan getyrosineerde microtubuli door cryo-EM. Om dit te doen, hebben we volledig getyrosineerde microtubuli geëxtraheerd uit een genetisch gemodificeerde HCT116-cellijn zonder alle drie bekende detyrosinerende enzymen, VASH1 / 2 en MATCAP. We gebruikten 6-12 confluente 15 cm schalen om de microtubuli te extraheren uit ongeveer 0,5-4 ml celpellet (figuur 1). Na de tweede centrifugatiestap (stap 3.11) levert dit een zichtbare maar kleine en transparante pellet op (figuur 1I). De opbrengst van de microtubuli is meestal ~ 75 μg. Als de pellet niet zichtbaar is, kan dit wijzen op een probleem in een van de vorige stappen, zoals een onjuiste microtubulepolymerisatietemperatuur, problemen met de kwaliteit van de gebruikte GTP of paclitaxel, of de toevoeging van te veel lysisbuffer, resulterend in een tubulineconcentratie die te laag is voor polymerisatie. Om de kwaliteit en concentratie van de geëxtraheerde microtubuli te beoordelen, analyseerden we monsters op een Coomassie-gekleurde SDS-gel (figuur 2A). Deze analyses gaven aan dat de geëxtraheerde microtubuli relatief zuiver waren. De geïnterpoleerde microtubuliconcentratie afgeleid van BSA-kwantificering was ~ 1,4 mg / ml. Dit komt goed overeen met het aantal gemeten met een spectrofotometer (figuur 2B,C).
De vers geëxtraheerde microtubuli kunnen direct worden gebruikt om monsters voor cryo-EM te maken. De microtubuli moeten er intact en overvloedig uitzien op de microfoto's. Voor verdere cryo-EM-analyse is het belangrijk om een lage microtubulidichtheid per micrograaf te hebben om te voorkomen dat de microtubuli elkaar kruisen (figuur 3A). Gebroken microtubuli of microtubuli die niet zichtbaar zijn, kunnen erop wijzen dat de microtubuli gedepolymeriseerd zijn (bijvoorbeeld als gevolg van een lage temperatuur of GTP-hydrolyse) of dat de parameters voor blotting en plunge freezing niet correct zijn ingesteld. De achtergrond rond de microtubuli is dicht, vermoedelijk met ongepolymeriseerde tubuline.
Het molecuulgewicht van MATCAP is 53 kDa en het heeft een bolvormig katalytisch domein net onder de grootte van een tubulinemonomeer. De decoratie van MATCAP op de microtubule kon daarom visueel worden gedetecteerd. Microtubuli die MATCAP niet bindden vertoonden "gladde" randen, terwijl microtubuli die MATCAP bonden "ruwe" randen hadden, gekenmerkt door elektronendichte stippen op het microtubule-oppervlak (figuur 3B). MATCAP-gebonden en MATCAP-ongebonden microtubuli konden ook worden onderscheiden in de berekende 2D-klassen, hoewel dit vanwege vorm en grootte kan verschillen voor andere microtubuli-interagerende eiwitten (figuur 3C). Om te bevestigen dat de dichtheid inderdaad tot het eiwit van belang behoort, kan men profiteren van experimenteel bepaalde of voorspelde structuren. We raden ook aan om een controleraster te maken dat microtubuli bevat, alleen ter vergelijking. Dit geeft aan of de microtubuli intact zijn gepolymeriseerd en geëxtraheerd met een voldoende hoge concentratie en dat het vriesproces correct is uitgevoerd. We merkten dat de overvloed aan microtubuli afnam in roosters met een tweede MATCAP-toepassing.
Figuur 1: Visuele begeleiding van de experimentele stappen. (A) Celpellet vóór lysis; B) gesonificeerde cellen in een ultracentrifugebuis vóór centrifugering; C) gesonificeerde cellen in een ultracentrifugebuis na centrifugatie; D) spuit met het geklaarde supernatant; E) restpellets na verwijdering van het bovennatuurlijke middel, met inbegrip van een "witte drijvende laag"; F) P10-tip met een celrestpellet voor de SDS Coomassie-gel; g) GTP/met paclitaxel aangevuld supernatant vóór incubatie; h) GTP/paclitaxel-geïncubeerd supernatant bovenop een glycerolkussen in een ultracentrifugebuis; (I) reinig de microtubulekorrel na de tweede centrifugatiestap. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Bepaling van de zuiverheid en concentratie van microtubuli . (A) Coomassie-gekleurde SDS-paginagel met de monsters die tijdens het extractieprotocol zijn genomen en een BSA-concentratievergelijking. S1 en P1 komen overeen met respectievelijk het supernatant en de pellet na de eerste centrifugatiestap. S2 en P2 komen op dezelfde manier overeen met de tweede centrifugatiestap. (B) Een niet-lineaire regressielijn van de relatieve BSA-grootheden afgeleid van A. De interpolatie van de microtubuliband rond 50 kDa in de P2 (microtubuli) baan duidt op een uiteindelijke concentratie van 1,42 mg/ml. (C) De spectrofotometrische analyse van de geresuspendeerde microtubuli (P2), gemeten door twee personen en gecorrigeerd voor de gecombineerde extinctiecoëfficiënt van TUBA1A en TUBB3 (0,971), geeft een gemiddelde en standaardafwijkingsconcentratie aan van 1,46 mg/ml ± 0,14 mg/ml. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Voorbeeld micrografieën . (A) Voorbeeld micrografieën van microtubuli gebonden aan MATCAP. De microtubuli die met een groene doos worden aangegeven, zijn intact, versierd en kunnen worden gebruikt voor de cryo-EM-analyse. De microtubule aangegeven door de oranje doos is een intacte en versierde microtubule, maar is dicht bij de microtubuli links ervan geplaatst; daarom is het minder geschikt om op te nemen in de cryo-EM-analyse. De microtubuli in de rode doos zijn overstekend en gebroken. Deze moeten worden uitgesloten van de cryo-EM-analyse. (B) Een ingezoomde weergave van de groene omcirkelde microtubuli van het linkerpaneel. De rode pijlpunten geven de zwarte stippen aan die alleen op de microtubuli in de micrografieën verschenen en die dus waarschijnlijk overeenkomen met MATCAP gebonden aan de microtubule. (C) Voorbeeld 2D-klassen van microtubulideeltjes geplukt uit A die hoge en lage decoratie vertoonden en een 2D-klasse uit een andere dataset waarvoor we geen decoratie door MATCAP (meest rechtse paneel) hebben waargenomen. Schaalbalken = (A) 50 nm, (B) 25 nm, (C) 10 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Immunoblot analyse van microtubuli afgeleid van MATCAP-deficiënte en VASH1/2-deficiënte triple knockout (TKO) HCT116 cellen, commerciële varkenshersenen en HeLa tubuline. Afkortingen: TKO = triple knockout; mAb = monoklonaal antilichaam; pAb = polyklonaal antilichaam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Deze methode beschrijft hoe je snel endogene tubuline uit cellijnen kunt extraheren en die microtubuli vervolgens kunt versieren op cryo-EM-roosters. Microtubuli zijn temperatuurgevoelig. Ze depolymeriseren in een koude omgeving en polymeriseren in een warme omgeving31. Het is daarom van cruciaal belang om de ultrasoonapparaat- en klaringsspin (stappen 1.1-1.5) bij 4 ° C uit te voeren om de tubuline op te lossen. Als er factoren waren die de microtubuli zo goed stabiliseerden dat ze in deze stap niet zouden depolymeriseren, zouden deze microtubuli en de stabiliserende factoren na de eerste klaringsspin in de pellet worden weggegooid. Na het (her)polymeriseren van de microtubuli is het belangrijk om de oplossing met de gepolymeriseerde microtubuli te allen tijde warm te houden. We hebben de microtubuli geëxtraheerd uit HCT116-cellen, die een tekort hebben aan de VASH1-, VASH2- en MATCAP-eiwitten. Andere cellijnen, evenals weefsels, kunnen worden gebruikt om microtubuli29 te extraheren, hoewel de verontreinigingen, tubuline-isotypen en opbrengst heel anders kunnen zijn dan wat hier wordt beschreven. Overexpressie plasmiden die modificerende enzymen bevatten, kunnen ook worden gebruikt om specifieke tubulinemodificaties te introduceren.
Andere protocollen 18,27,28,29,30 gebruiken meerdere cycli van polymerisatie en depolymerisatie van de microtubuli om microtubuli te verkrijgen zonder andere interagerende eiwitten. Hier hebben we deze protocollen vereenvoudigd en de microtubuli slechts één keer gepolymeriseerd. Het is mogelijk dat vanwege deze enkele polymerisatie, deze microtubuli kunnen co-sedimenteren met andere microtubule-interagerende eiwitten. We hebben echter ontdekt dat dit protocol voldoende zuivere microtubuli geeft voor cryo-EM-doeleinden. Als een zuiverder monster nodig is voor specifieke testen, kunnen extra cycli van polymerisatie en depolymerisatie een zuiverder monster opleveren, hoewel dit ten koste kan gaan van de opbrengst van de microtubuli. In dit protocol gebruikten we paclitaxel om de microtubuli te polymeriseren. Paclitaxel kan echter het microtubulirooster in de richting van een bepaalde draaiing en stijging vertekenen, wat de microtubuli-affiniteit van het eiwit van belang zou kunnen verstoren. Andere microtubulistabiliserende reagentia kunnen worden gebruikt als paclitaxel ongeschikt is; voorbeelden van deze reagentia zijn niet-taxaanmoleculen zoals peloruside of niet-hydrolyseerbare GTP-varianten zoals GMPCPP17,32.
Om structureel eiwitten te onderzoeken die binden aan microtubuli op cryo-EM-roosters, moet men een voldoende hoeveelheid van het eiwit van belang binden aan de microtubuli. Een veel voorkomend probleem is dat eiwitcomplexen die stabiel zijn in oplossing uit elkaar vallen op het rooster. Voor het vormen van het eiwitcomplex op het rooster was het cruciaal om eerst de microtubuli te layeren en vervolgens het microtubule-bindende eiwit met een lage zoutconcentratie op het met microtubuli gecoate rooster aan te brengen, waardoor het eiwitcomplex direct op het rooster werd geassembleerd. Anderen hebben op dezelfde manier een zoutarm 33,34-protocol en een tweestapstoepassing34,35,36-protocol gemeld voor succesvolle microtubule-decoratie. Het is waarschijnlijk dat een lagere zoutconcentratie het eiwitcomplex vertekent in de richting van een stabielere interactie als gevolg van de verminderde elektrostatische ladingen. Vanwege de lage zoutconcentratie loopt het eiwit van belang echter het risico neer te slaan. Daarom wordt het ten zeerste aanbevolen om het eiwit op of rond fysiologisch relevante zoutconcentraties te houden tot kort voor het vitrificeren van de roosters. Dit tweestaps applicatieprotocol voorkomt waarschijnlijk dat het eiwitcomplex uit elkaar valt tijdens de blotting- of plunge-freezingsstappen. In dit protocol hebben we de Vitrobot gebruikt. Snellere vitrificatiemethoden (VitroJet) of het gebruik van vlekvrije roosters (Puffalot) of apparaten met beide eigenschappen (kameleon) zouden de tweestapstoepassing mogelijk kunnen overwinnen, maar deze zijn momenteel niet op grote schaal beschikbaar om te testen.
De uiteindelijke resolutie van de gereconstrueerde cryo-EM-dichtheid kan worden beïnvloed door een aantal factoren, waaronder de beweging van het microtubulibindende eiwit ten opzichte van de microtubule en het niveau van decoratie dat kan worden bereikt. Hogere microtubule-decoratie is waarschijnlijk gunstig voor de uiteindelijke resolutie die wordt verkregen in de reconstructie van de 3D-dichtheid. Dit kan worden beperkt door een paar factoren, zoals de hoogste eiwitconcentratie die wordt verkregen tijdens de zuivering van het microtubule-bindende eiwit, de laagste zoutconcentratie die het microtubule-interagerende eiwit kan weerstaan zonder te aggregeren, en de bindingsmodus van het microtubule-interagerende eiwit (het eiwit kan bijvoorbeeld meer dan één tubulinedimeer omvatten, waardoor een bindingsverhouding van 1: 1 wordt belemmerd). Hoewel de resolutie van de cryo-EM-reconstructie in gevaar kan komen door schaars versierde microtubuli, kan computationele analyse veel problemen omzeilen, zoals geïllustreerd door een onlangs gerapporteerde microtubule-eiwitcomplexstructuur die extreem schaars versierd was8.
Het protocol dat we hier beschrijven, presenteert een snelle, goedkope methode om microtubuli te verkrijgen die geschikt zijn voor cryo-EM-doeleinden. In tegenstelling tot in de handel verkrijgbare varkens hersentubuline, zijn de microtubuli afgeleid van MATCAP-deficiënte en vasohibine-deficiënte HCT116-cellen volledig getyrosineerd (figuur 4). Commercieel HeLa-tubuline, een duur reagens, is in principe relatief uniform getyrosineerd en bevat weinig andere modificaties4 zoals glutamylering, maar batches kunnen variëren en modificatie kan alleen in vitro worden bereikt. Een voordeel van het extraheren van microtubuli uit op maat gemaakte cellijnen is de flexibiliteit die men heeft om tubuline-modificerende enzymen, zoals tubuline detyrosinasen, te overexpresseren of te verwijderen om een meer homogene pool van microtubuli te creëren. Dit kan de decoratie en uniformiteit van het cryo-EM-monster ten goede komen en zal uiteindelijk het gemak en de kwaliteit van de cryo-EM-dichtheidskaarten en moleculaire structuren die van dit monster zijn afgeleid, ten goede komen.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
We bedanken alle leden van de Sixma-, Brummelkamp- en Perrakis-groepen voor hun vruchtbare wetenschappelijke discussies en voor het bieden van een aangename werkomgeving, en in het bijzonder bedanken we Jan Sakoltchik ("persoon 2") voor het helpen bepalen van de eiwitconcentratie afgebeeld in figuur 3C. Ook willen we de CRYO-EM-faciliteit van het AVL en het Nederlands Centrum voor Elektronennanoscopie (NeCEN) van de Universiteit Leiden bedanken voor hun steun. Dit werk werd ondersteund door NWO Vici-subsidie 016.Vici.170.033 toegekend aan T.R.B.. A.P. en T.R.B. zijn Oncode-onderzoekers en ontvangen financiering van NWO ENW (OCENW. M20.324). L.L. ontving financiering van het Oostenrijkse Wetenschapsfonds (FWF JB4448-B). Dit onderzoek werd ondersteund door een instellingssubsidie van KWF Kankerbestrijding en het Ministerie van Volksgezondheid, Welzijn en Sport.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Cell culture |
| 10 cm plate | Falcon | 353003 | Cell culture |
| 15 cm plate | Thermo FisherScientific | 168381 | Cell culture |
| 50 mL tubes | Sarstedt | 62.547255 | Cell culture |
| 300 mesh quantifoil holey carbon copper grid R1.2/1.3 | Quantifoil Micro Tools | N1-C14nCu30-01 | Cryo-EM grid preparation |
| Cell scrapers | Falcon | 353085 | Cell culture |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | Cell culture |
| EDTA | Merck | 108418 | Cell culture |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3899 | Microtubule extraction |
| Ethane gas | Cryo-EM grid preparation | ||
| FCS | Serana | s-FBS-EU-015 | Cell culture |
| Glycerol | VWR | 24.397.296 | Microtubule extraction |
| GTP | Fisher Scientific | G8877-1G | Microtubule extraction |
| HCT116 VASH1 VASH2 MATCAP KO cells | self made | Wild type HCT116 cells RRID: CVCL_0291 | Cell culture |
| KOH | Merck | 1.05033 | Microtubule extraction |
| MgCl2 | Merck | 105833 | Microtubule extraction |
| Microtubule binding protein | self made | Cryo-EM grid preparation | |
| Needle | BD microlance | 300600 | Microtubule extraction |
| Paclitaxel | Santa Cruz Biotechnology | sc-212517 | caution toxic, microtubule extraction |
| PBS | Fisher Scientific | BP399 | Cell culture |
| Penicillin and streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | Cell culture |
| PIPES | Merck | P8203 | Microtubule extraction |
| PMSF (in EtOH) | Roche | 16837091001 | Microtubule extraction |
| SDS sample buffer | self made | Quality assessment | |
| Syringe | BD plastipak | 309658 | Microtubule extraction |
| Ultra protease tables mini | Fisher Scientific | NC0975224 | Microtubule extraction |
| Whatman blotting paper | Whatman | 47000-100 | Cryo-EM grid preparation |
| Equipment | |||
| Flow hood | cell culture | ||
| GloQube | Quorum | Cryo-EM grid preparation | |
| Grid storage box | SWISSCI | 41018 | Cryo-EM grid storage |
| Heating block, electric or metal | to warm the buffers | ||
| Incubator, cell culture | NUAIR | cell culture | |
| LN2 dewar | Cryo-EM grid storage | ||
| Plunge-tweezers | Electron Microscopy Sciences | 0508-L5-PS | Cryo-EM grid preparation, hole drilled in top to fit the vitrobot |
| Polystyrene box | to keep the buffers warm | ||
| Sonicator | Qsonica | Q700 | Microtubule extraction |
| Standard light microscope | Olympus | CKX 41 | Quality assessment |
| TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
| TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
| Tubes for TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | 326819 | Microtubule extraction |
| Tubes for TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | 347356 | Microtubule extraction |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Microtubule extraction |
| Vitrobot | FEI, ThermoFischer Scientific | mark IV | Cryo-EM grid preparation |
| Vitrobot polystyrene container assembly with metal ethane cup | ThermoFisher Scientific | 200703 | Cryo-EM grid preparation |
| Water bath | cell culture |
References
- Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
- Peris, L., et al. Motor-dependent microtubule disassembly driven by tubulin tyrosination. Journal of Cell Biology. 185 (7), 1159-1166 (2009).
- McKenney, R. J., Huynh, W., Tanenbaum, M. E., Bhabha, G., Vale, R. D. Activation of cytoplasmic dynein motility by dynactin-cargo adapter complexes. Science. 345 (6194), 337-341 (2014).
- Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
- Sirajuddin, M., Rice, L. M., Vale, R. D. Regulation of microtubule motors by tubulin isotypes and post-translational modifications. Nature Cell Biology. 16 (4), 335-344 (2014).
- Nogales, E., Kellogg, E. H. Challenges and opportunities in the high-resolution cryo-EM visualization of microtubules and their binding partners. Current Opinion in Structural Biology. 46, 65-70 (2017).
- Manka, S. W., Moores, C. A. Microtubule structure by cryo-EM: Snapshots of dynamic instability. Essays in Biochemistry. 62 (6), 737-751 (2018).
- Chaaban, S., Carter, A. P. Structure of dynein-dynactin on microtubules shows tandem adaptor binding. Nature. 610 (7930), 212-216 (2022).
- Lacey, S. E., He, S., Scheres, S. H., Carter, A. P. Cryo-EM of dynein microtubule-binding domains shows how an axonemal dynein distorts the microtubule. eLife. 8, 47145 (2019).
- Walton, T., Wu, H., Brown, A. Structure of a microtubule-bound axonemal dynein. Nature Communications. 12, 477 (2021).
- Sindelar, C. V., Downing, K. H. An atomic-level mechanism for activation of the kinesin molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4111-4116 (2010).
- Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins. Cell. 162 (4), 849-859 (2015).
- Maurer, S. P., Fourniol, F. J., Bohner, G., Moores, C. A., Surrey, T. EBs Recognize a nucleotide-dependent structural cap at growing microtubule ends. Cell. 149 (2), 371-382 (2012).
- Benoit, M. P. M. H., Asenjo, A. B., Sosa, H. Cryo-EM reveals the structural basis of microtubule depolymerization by kinesin-13s. Nature Communications. 9, 1662 (2018).
- Kellogg, E. H., et al.
- Brotzakis, Z. F., et al. A structural ensemble of a Tau-microtubule complex reveals regulatory Tau phosphorylation and acetylation mechanisms. ACS Central Science. 7 (12), 1986-1995 (2021).
- Kellogg, E. H., et al. Insights into the distinct mechanisms of action of taxane and non-taxane microtubule stabilizers from cryo-EM structures. Journal of Molecular Biology. 429 (5), 633-646 (2017).
- Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
- Wloga, D., Joachimiak, E., Louka, P., Gaertig, J.
- Nieuwenhuis, J., Brummelkamp, T. R. The tubulin detyrosination cycle: Function and enzymes. Trends in Cell Biology. 29 (1), 80-92 (2019).
- Nieuwenhuis, J., et al.
- Aillaud, C., et al. Vasohibins/SVBP are tubulin carboxypeptidases (TCPs) that regulate neuron differentiation. Science. 358 (6369), 1448-1453 (2017).
- Landskron, L., et al. Posttranslational modification of microtubules by the MATCAP detyrosinase. Science. 376 (6595), (2022).
- Erck, C., et al. A vital role of tubulin-tyrosine-ligase for neuronal organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (22), 7853-7858 (2005).
- Pagnamenta, A. T., et al. Defective tubulin detyrosination causes structural brain abnormalities with cognitive deficiency in humans and mice. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3391-3405 (2019).
- Peris, L., et al. Tubulin tyrosination regulates synaptic function and is disrupted in Alzheimer's disease. Brain. 145 (7), 2486-2506 (2022).
- Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14 (5), 1634-1660 (2019).
- Gell, C., et al.
- Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of tubulin with controlled posttranslational modifications and isotypes from limited sources by polymerization-depolymerization cycles. Journal of Visualized Experiments. (165), e61826 (2020).
- Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
- Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
- Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue. GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
- Sindelar, C. V., Downing, K. H. The beginning of kinesin's force-generating cycle visualized at 9-Å resolution. Journal of Cell Biology. 177 (3), 377-385 (2007).
- Kellogg, E. H., et al. Near-atomic cryo-EM structure of PRC1 bound to the microtubule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9430-9439 (2016).
- Maurer, S. P., Bieling, P., Cope, J., Hoenger, A., Surrey, T. GTPγS microtubules mimic the growing microtubule end structure recognized by end-binding proteins (EBs). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (10), 3988-3993 (2011).
- Manka, S. W., Moores, C. A. Pseudo-repeats in doublecortin make distinct mechanistic contributions to microtubule regulation. EMBO Reports. 21 (12), 51534 (2020).
