Summary
تستخدم ذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر) على نطاق واسع في البحوث البيولوجية والسمية. لتوسيع فائدة الذباب ، قمنا بتطوير أداة ، مصفوفة التخدير التسلسلي ، التي تعرض في وقت واحد عينات ذباب متعددة للتخدير العام المتطاير (VGAs) ، مما يجعل من الممكن التحقيق في الآثار الجانبية (السامة والوقائية) ل VGAs.
Abstract
يستخدم التخدير العام المتطاير (VGAs) في جميع أنحاء العالم على ملايين الأشخاص من جميع الأعمار والحالات الطبية. التركيزات العالية من VGAs (مئات الميكرومولار إلى المليمولار المنخفض) ضرورية لتحقيق قمع عميق وغير فسيولوجي لوظائف المخ التي تقدم ك "تخدير" للمراقب. الطيف الكامل للآثار الجانبية الناجمة عن هذه التركيزات العالية من العوامل المحبة للدهون غير معروف ، ولكن لوحظت تفاعلات مع الجهاز المناعي للالتهابات ، على الرغم من أن أهميتها البيولوجية غير مفهومة.
للتحقيق في الآثار البيولوجية ل VGAs في الحيوانات ، قمنا بتطوير نظام يسمى مصفوفة التخدير التسلسلي (SAA) لاستغلال المزايا التجريبية التي توفرها ذبابة الفاكهة (Drosophila melanogaster). يتكون SAA من ثماني غرف مرتبة في سلسلة ومتصلة بتدفق مشترك. تتوفر بعض الأجزاء في المختبر ، ويمكن تصنيع أو شراء أجزاء أخرى بسهولة. المرذاذ ، وهو ضروري للإدارة المعايرة ل VGAs ، هو المكون الوحيد المصنع تجاريا. ولا تشكل هذه المركبات سوى نسبة مئوية صغيرة من الغلاف الجوي الذي يتدفق عبر الناقل أثناء التشغيل، حيث أن الجزء الأكبر (عادة أكثر من 95 في المائة) هو الغاز الناقل؛ الناقل الافتراضي هو الهواء. ومع ذلك ، يمكن فحص الأكسجين وأي غازات أخرى.
الميزة الرئيسية ل SAA على الأنظمة السابقة هي أنها تسمح بالتعرض المتزامن لمجموعات متعددة من الذباب لجرعات قابلة للمعايرة بالضبط من VGAs. يتم تحقيق تركيزات متطابقة من VGAs في غضون دقائق في جميع الغرف ، مما يوفر ظروفا تجريبية لا يمكن تمييزها. يمكن أن تحتوي كل غرفة من ذبابة واحدة إلى مئات الذباب. على سبيل المثال ، يمكن ل SAA فحص ثمانية أنماط وراثية مختلفة أو أربعة أنماط وراثية ذات متغيرات بيولوجية مختلفة (على سبيل المثال ، ذكر مقابل أنثى ، قديم مقابل صغير). لقد استخدمنا SAA للتحقيق في الديناميكا الدوائية ل VGAs وتفاعلاتها الدوائية الجينية في نموذجين تجريبيين للذباب مرتبطين بطفرات الالتهاب العصبي والميتوكوندريا وإصابات الدماغ الرضحية (TBI).
Introduction
إن وجود تأثيرات مخدرة جانبية (أي تأثيرات لا يمكن ملاحظتها على الفور ولكن قد يكون لها عواقب سلوكية متأخرة) مقبول بشكل عام ، لكن فهم آلياتها وعوامل الخطر يظل بدائيا 1,2. يحد تأخرها في ظهورها ودقتها من عدد المتغيرات المهمة المحتملة التي يمكن التحقيق فيها في نماذج الثدييات ضمن أطر زمنية معقولة وبتكلفة مقبولة. تقدم ذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر) مزايا فريدة في سياق المرض التنكسي العصبي3 ولفحص السموم4 التي لم يتم تطبيقها حتى الآن على دراسة التأثيرات الجانبية المخدرة.
قمنا بتطوير مصفوفة التخدير التسلسلي (SAA) لتسهيل استخدام ذباب الفاكهة في دراسة الديناميكا الدوائية المخدرة وعلم الوراثة الدوائي. الميزة الرئيسية ل SAA هي التعرض المتزامن لظروف تجريبية متطابقة لمجموعات متعددة. عند إقرانها بالمرونة التجريبية لذباب الفاكهة ، فإن الإنتاجية العالية ل SAA تسمح باستكشاف المتغيرات البيولوجية والبيئية على نطاق مستحيل في نماذج الثدييات.
من حيث المبدأ ، فإن SAA هي ببساطة سلسلة من مواقع التخدير المتصلة (غرف مصنوعة من قارورة سعة 50 مل) يقوم من خلالها الغاز الناقل بتوصيل عوامل متطايرة. تحتوي الغرفة الأولى للنظام على ماء مقطر يتم من خلاله ترطيب الغاز الناقل (الذباب حساس للجفاف) ، وينتهي بمؤشر تدفق بسيط يشير إلى تدفق الغاز عبر النظام. تفصل الشباك الدقيقة الموضوعة على فتحات أنبوب التوصيل الغرف لمنع هجرة الذباب بين الغرف. عدد المواقع "في سلسلة" محدود بمقاومة تدفق الغاز غير المضغوط (الأنابيب ، الشباك).
قمنا بتمييز حركية هذا النموذج الأولي SAA في منشور سابق5. على الرغم من أن الخصائص الدوائية الدقيقة ستختلف بين SAAs ، فإن الأساسيات ذات الصلة التي تم اختبارها تجريبيا هي كما يلي: (i) التدفق الأولي من 1.5-2 لتر / دقيقة يوازن جميع الغرف (الحجم الإجمالي ±550 مل) مع التركيز المطلوب للمخدر في غضون دقيقتين. (ii) لا يتغير تركيز بخار التخدير الذي يتم توصيله إلى الغرف بشكل ملحوظ بين الموقع الأول والأخير لأن كمية المخدر الموجودة في حجم الغاز في غرفة فردية (50 مل) تتجاوز بكثير الكمية التي يمتصها أي عدد من الذباب ؛ و (iii) بمجرد توازن الغرف ، يمكن تقليل تدفق الغاز الناقل (50-100 مل / دقيقة أو أقل) لتجنب الهدر وتلوث البيئة (التخدير المتطاير له خصائص غازات الدفيئة). يعتمد الحد الأدنى من التدفق الضروري للحفاظ على تركيز بخار الحالة المستقرة في المقام الأول على تسرب SAA ، حيث أن امتصاص البخار بواسطة الذباب لا يكاد يذكر. في ظل هذه الظروف القياسية (2٪ إيزوفلوران و 1.5 لتر / دقيقة تدفق الغاز الناقل) ، يتم تخدير الذباب (أي غير متحرك) في جميع مواضع المصفوفة في غضون 3-4 دقائق ، مع وجود اختلافات غير ملحوظة بين المواضع. يمكن إعطاء VGAs لمدة دقائق إلى ساعات ، ونماذج التعرض النموذجية لدينا في حدود 15 دقيقة إلى 2 ساعة. لشطف النظام ، يتم إيقاف تشغيل المرذاذ ، ويتم الحفاظ على التدفق لتبادل ما يقرب من 10 أضعاف أحجام الصفيف (1.5 لتر / دقيقة لمدة 5 دقائق). تختلف سرعة التخلص من التخدير باختلاف معدل التدفق المحدد.
تتفاعل عوامل التخدير المتطايرة مع العديد من الأهداف التي لا تزال مجهولة الهوية ، بما في ذلك نظام الالتهاب المناعي6. إن مساهمة الأهداف الجزيئية الفردية في النتائج الأولية مقابل النتائج الجانبية ("حالة التخدير" مقابل "الآثار الجانبية" طويلة وقصيرة الأجل) غير مفهومة بشكل جيد. لذلك ، يعد نظام الذباب الحساس عالي الإنتاجية ذا قيمة لإبلاغ التجارب في الحيوانات العليا ، على الرغم من الاختلافات الواضحة بين الذباب والثدييات7. بعض الاختلافات ، في الواقع ، يمكن أن تكون مفيدة. على سبيل المثال ، يختلف الجهاز المناعي للذبابة عن الحيوانات العليا من حيث أنه يفتقر إلى الذراع التكيفي للاستجابة8. في حين أن هذا قد يبدو وكأنه قيد لفهم المرض لدى البشر ، إلا أنه يوفر فرصة فريدة لدراسة تفاعل VGAs مع الاستجابة الالتهابية المناعية الفطرية بمعزل عن الاستجابة التكيفية9. وهذا يسمح بدراسات التأثيرات الدوائية ل VGA على الالتهاب وتعديلها من خلال الخلفيات الجينية المتنوعة الموجودة في السكان.
Protocol
ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد المستخدمة في البروتوكول.
1. بناء SAA
- اصنع الإطار عن طريق قطع الخشب وتجميع الإطار باستخدام الأبعاد الواردة في الشكل 1 أ.
- تعديل 50 مل من أغطية الأنابيب المخروطية.
- حفر فتحتين في كل غطاء مع 9/32 في مثقاب الثقاب. صنفر الثقوب لتنظيف البلاستيك الخشن. صنفر الجزء العلوي من الغطاء لتخشين السطح (وهذا يساعد في التصاق الغراء).
- قم بقص 5 مل من الماصات المصلية حسب الحجم (3 بوصات للتدفق الداخلي و 1.5 بوصة للتدفق الخارجي) عن طريق تسجيل البلاستيك ثم كسره نظيفا عند الخط المسجل. صنفر نهايات الماصات المقطوعة / المكسورة.
- شبكة الغراء على الأنابيب (السماح بوقت تجفيف مناسب للمادة اللاصقة). قطع المعاوضة إلى حجم الأنبوب بعد أن يجف اللاصق.
- أدخل الأنابيب في فتحات الأغطية المخروطية مع امتداد كلا الأنبوبين (3/4 بوصة) فوق الغطاء ؛ تأكد من أن أنبوب التدفق يمتد إلى الأنبوب لفترة أطول من التدفق الخارجي (الشكل 1 ب).
- ضع الغراء على قمم الأغطية حول الأنابيب لتثبيت الأجزاء معا (اترك وقت تجفيف مناسب للمادة اللاصقة قبل المتابعة).
- قم بتوصيل الأغطية بالإطار ، وقم بتوجيه الأنبوب (الشكل 1C).
- قم بتوصيل أربطة الكابلات اللاصقة بالإطار (3.25 في المسافة ، من المركز إلى المركز).
- تثبيت الأغطية على الإطار باستخدام الروابط المضغوطة ؛ قطع علامة ربطة عنق الرمز البريدي ينتهي قصيرة.
- قطع وتوصيل أطوال (9 بوصات) من أنابيب Tygon بأنابيب التدفق / التدفق على كل غطاء معدل (الشكل 1D). بدءا من نهاية المنبع ، قم بإرفاق التدفق أولا ، ثم قم بتوصيل الأنبوب من التدفق الخارجي بتدفق الموضع التالي.
- أضف مؤشر تدفق إلى "التدفق" الأكثر تفيا (الموضع 10 ، الشكل 1E).
- ضع أنبوبا مخروطيا سعة 50 مل في الموضع الأول ، واملأه بالماء أسفل أنبوب التدفق مباشرة (الشكل 1F).
- تحضير الواجهة للمبخر. قم بإزالة الغطاسات ، وقطع الشقوق من حقنتين سعة 10 مل (1/2 بوصة عميقة × 1/4 بوصة بعرض ، الشكل 1 ج) ، وأدخلها في تدفق المرذاذ وتدفقه مع توجيه الشقوق مباشرة نحو مقدمة المرذاذ لتتماشى مع الثقوب (الشكل 1 ح). اختياري: الصق المحاقن المعدلة في مكانها. إذا كان ذلك ميسور التكلفة ، فاستخدم مشعبا تجاريا (انظر جدول المواد للحصول على خيار واحد).
- ربط النظام بأكمله. استخدم أنابيب Tygon لربط المكونات معا بالترتيب التالي: خزان غاز ناقل مع منظم > مقياس تدفق خاص بالغاز > مبخر > SAA (الشكل 1C).
- املأ المواضع الفارغة على الصفيف بأنابيب مخروطية فارغة سعة 50 مل. قم بتشغيل خزان الغاز ، وافتح مقياس التدفق إلى ~ 2 لتر / دقيقة ، وقم بتشغيل المرذاذ إلى 0٪. تأكد من تدفق الغاز عبر النظام عن طريق فحص مقياس التدفق في أعلى المنبع للمبخر ومؤشر التدفق في اتجاه مجرى الغرفة الأخيرة من SAA للتدفق. بدلا من ذلك ، أدخل طرف الأنبوب في الماء ، وابحث عن الفقاعات.
ملاحظة: نظرا لأن النظام غير مضغوط ، فإن عمود الماء الذي يزيد ارتفاعه عن بضعة سنتيمترات سيوقف التدفق. إذا لم يكن هناك تدفق في نهاية المصب للصفيف ، فتحقق مما يلي: يجب أن يكون المرذاذ قيد التشغيل للسماح بالتدفق ؛ تأكد من أن منظم الخزان وعدادات التدفق تسمح بالتدفق ؛ تحقق من مواضع الصفيف للتأكد من ثمل الأنابيب بإحكام ؛ وتحقق من وجود تسربات حول المادة اللاصقة على الأغطية المعدلة.
الشكل 1: بناء SAA. (أ) تخطيطي ، مع قياسات ، للإطار الخشبي الذي يدعم SAA. (ب) مقطع عرضي مخطط ، مع قياسات ، لغطاء معدل مع أنابيب تدفق وتدفق مصنوعة من ماصات مصلية سعة 5 مل. (ج) SAA المجمع (مستنسخ من Olufs et al.5) (د) تفاصيل غطاء مخروطي معدل سعة 50 مل يوضح أنابيب التدفق الداخلة والخارجة. (ه) التدفق الخارجي (الموضع 10) مع مؤشر التدفق. (F) أنبوب مملوء بالماء في المنبع (الموضع 1) لترطيب الغاز الناقل. يشير السهم الأحمر إلى مستوى الماء. (ز) حقنة توزيع معدلة سعة 10 مل للمشعب المؤقت. تبرز الدائرة الحمراء الشق المقطوع الواقع بين علامات 8 مل و 10 مل (أو 1/2 بوصة × 1/4 بوصة). (H) منظر خلفي لمبخر Tec7 يوضح إدخال واتجاه المحاقن المعدلة. توجد حقنة واحدة فقط في هذا العرض لإظهار ، على اليسار ، الثقب (السهم الأحمر) الذي يجب محاذاته مع شق المحقنة المعدلة. ملاحظة: سيؤدي اختلال محاذاة هذا الشق المقطوع وفتحة التدفق الخارجي إلى تعطيل إعطاء التخدير. هذا الجزء هو نقطة ضعف محتملة في هذا النظام المخصص. إذا كانت الأموال متاحة ، يجب استخدام مشعب تجاري. اختصار: SAA = مجموعة التخدير التسلسلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. قبل التعرض للتخدير
- قبل أربع وعشرين ساعة أو أكثر من التعرض للمخدر ، قم بفرز مجموعات الذباب حسب الحاجة للتجربة باستخدام الطريقة المفضلة (على سبيل المثال ، CO2 أو الأثير).
3. تشغيل SAA
- نقل الذباب من قوارير الطعام إلى أنابيب مخروطية فارغة سعة 50 مل (بدون ثاني أكسيد الكربون2).
- عد وسجل أي ذباب ميت قبل التعرض.
- قم بفك وربط الأنابيب المخروطية سعة 50 مل مع الذباب على SAA.
- قم بتشغيل الغاز الناقل ، واضبطه على معدل التدفق المطلوب.
ملاحظة: نستخدم عادة 1-2 لتر / دقيقة. - اضبط مبخر التخدير على التركيز المطلوب.
ملاحظة: نستخدم عادة 2٪ للأيزوفلوران و 3.5٪ للسيفوفلوران ، وهي جرعات متساوية في الثدييات10. - فضح الذباب للمدة المطلوبة (دقيقة: 15 دقيقة).
ملاحظة: يوصى بوقت تعرض لا يقل عن 15 دقيقة لتجنب التباين المحتمل في التوازن عبر مواضع SAA. في هذا النظام ، يستغرق التخدير 2-3 دقائق لتحقيق التوازن في جميع المواقف. - في نهاية التعرض ، اغسل النظام بتدفق الغاز الطازج (ضبط المرذاذ على 0٪) عند 1.5 لتر / دقيقة لمدة 5 دقائق تقابل حوالي 10 أضعاف أحجام إجمالي حجم SAA.
4. قائمة مرجعية قبل بدء التجربة
- افتح منظم الضغط العالي (أعلى خزان الهواء) تماما ، ثم أغلقه نصف دورة لضمان تدفق الغاز الناقل.
- اتبع الأنبوب لكل سطر إلى i) مقاييس التدفق و ii) المرذاذ (تأكد من توصيل التدفق الداخل / الخارج بشكل صحيح) ، و iii) تحقق من مستوى التخدير في المبخرات.
- بعد تحميل الغرف بالموضوعات ، تحقق من تدفق الهواء / الغاز باستخدام اختبار الفقاعة أو مؤشر التدفق.
ملاحظة: لا تسمح بعض أجهزة التبخير بتدفق الهواء عندما يكون القرص في وضع إيقاف التشغيل. - عندما يتدفق الغاز ، تأكد من أن كلا من مقياس التدفق ومؤشر التدفق السفلي يشيران إلى التدفق.
- في نهاية التجربة ، اترك 4-5 دقائق من تدفق الهواء لغسل المخدر.
Representative Results
يتم توفير رابط فيديو SAA هنا: طرق بحث Perouansky - قسم التخدير - UW-Madison (wisc.edu) (https://anesthesia.wisc.edu/research/researchers/perouansky-laboratory/perouansky-research-methods/) استخدم مختبرنا SAA من أجل (i) دراسة تأثير النمط الجيني على الحساسية السلوكية للتخدير5 ؛ (ii) فحص طفرات الميتوكوندريا بحثا عن الآثار الجانبية للتخدير11 ؛ و (iii) التحقيق في الديناميكا الدوائية للأيزوفلوران والسيفوفلوران على النتائج في إصابات الدماغ الرضحية (TBI)12،13،14،15،16،17. تظهر النتائج المنشورة بوضوح أن الخلفية الجينية تؤثر على الديناميكا الدوائية ل VGAs المستخدمة سريريا فيما يتعلق بكل من النمط الظاهري التقليدي للتخدير والآثار الجانبية للسمية المخدرة ، وكذلك حماية الأنسجة5،11،13،14،15.
المثال التمثيلي 1 (الشكل 2): الانجراف الجيني في القدرة على الصمود أمام سمية الأيزوفلوران المكتشفة بواسطة ظروف تجريبية قابلة للتكرار بشكل موثوق
يعد اكتشاف التغير الكمي التدريجي في الوفيات الناجمة عن VGA بين ذباب ND2360114 المستزرع بشكل منفصل مثالا على فائدة المقارنات الموثوقة للديناميكا الدوائية المخدرة عبر المجموعات التجريبية باستخدام SAA. ND23 هو جين يشفر وحدة فرعية في قلب المركب الأول من mETC (مشابه ل Ndufs8 في الثدييات)18. الطفرات في هذه الوحدة الفرعية هي سبب لمتلازمة لي ، وهو مرض ميتوكوندريا مميت. لاحظنا ضعفا تدريجيا في النمط الظاهري للوفيات الناجم عن الأيزوفلوران بمرور الوقت في العديد من مخزونات ND2360114 متماثلة الزيجوت المستزرعة في وقت واحد في ظل ظروف المختبر القياسية (أي دون التعرض ل VGAs). حدث هذا التكيف التطوري مع سمية الأيزوفلوران في غياب أي تعرض ل VGAs وربما يكون تأثيرا جانبيا ل "البقاء للأصلح" داخل الأرصدة الطافرة. كان هذا التغيير التدريجي في حساسية الأيزوفلوران سيبقى غير معترف به بدون ثقتنا في أن الظروف التجريبية كانت متطابقة عبر المقايسات وبمرور الوقت. نستنتج أن الاختيار يفضل معدلات تأثيرات ND2360114 ، مع زيادة المرونة من قبيل الصدفة لسمية الأيزوفلوران. نظرا لأن الالتهاب في الجهاز العصبي المركزي يلعب دورا مهما في التسبب في متلازمة لي ، فقد يكون التطور الملحوظ للمقاومة ناتجا عن التغيرات التكيفية في الاستجابة الالتهابية المناعية الفطرية ، مع كون مقاومة سمية الأيزوفلوران منتجا ثانويا عرضيا.
الشكل 2: التباين في الوفيات الناجمة عن سمية الأيزوفلوران نتيجة للضغط التطوري في ذباب ND2360114. سبعة خطوط (A-G) معزولة من مجموعة واحدة من خلال تزاوج زوج واحد ، تم توسيعها واختبارها لمعدل الوفيات لمدة 24 ساعة (PM24) بعد التعرض لمدة ساعتين ل 2٪ إيزوفلوران (في عمر 10-13 يوما) تظهر تباينا في النمط الظاهري ناشئا عن مجموعة سكانية واحدة. تظهر البيانات كمخططات مربعة وشارب. تمثل المربعات الربعين الثاني والثالث من البيانات ، مع امتداد الشعيرات إلى الحد الأدنى والحد الأقصى لنقاط البيانات. يشار إلى المتوسط والوسيط بخطوط "+" وأفقية ، على التوالي. يتم عرض النسبة المئوية لوفيات النسخ المتماثلة الفردية (N) كدوائر. N = 3-4 قوارير من 20-50 ذباب / قارورة. قيمة P ل ANOVA عادي أحادي الاتجاه ؛ p = 0.012 يشير إلى اختلاف كبير بين الوسائل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
مثال تمثيلي 2 (الشكل 3): رسم توضيحي لتطبيق عالي الإنتاجية ل SAA للكشف عن تأثيرات الخلفية الجينية على الديناميكا الدوائية للأيزوفلوران
كمثال على الإنتاجية العالية للنظام ، يوضح الشكل 3 آثار التعرض المتطابقة للأيزوفلوران (15 دقيقة من 2٪ إيزوفلوران) قبل إصابة الدماغ الرضحية (TBI) 16 ، وهو بروتوكول يختبر التكييف المسبق للتخدير (AP) في نموذج الذبابةهذا 13،15،19. القراءة هي معدل الوفيات بعد 24 ساعة من تصحيح إصابات الدماغ الرضية للاستنزاف الطبيعي (MI24). في هذا النموذج ، استعادت جميع الذباب حركتها (أي كانت على قيد الحياة) في غضون 30 دقيقة بعد إصابات الدماغ الرضية ، وكانت الوفيات المسجلة في MI24 نتيجة لإصابة الدماغ الثانوية (sBI). في خطوط الطيران الأربعة ، خفضت AP مع isoflurane MI24 بدرجات مختلفة ، مما يشير إلى أن الاستجابة ل AP هي سمة كمية. نظرا لأن الاستجابة الالتهابية هي عامل مهم في المراضة من sBI ، فقد تتضمن AP تعديل الجهاز المناعي20.
الشكل 3: تأثير الخلفية الوراثية على قمع الوفيات (MI24) عن طريق التكييف المسبق مع الأيزوفلوران. أدى ذباب التكييف المسبق مع 15 دقيقة من 2٪ إيزوفلوران (أرجواني) إلى خفض مؤشر الوفيات عند 24 ساعة (MI24) في سلالات w 1118 و y1w1118 (p < 0.0001 و p = 0.036 ، على التوالي ). لم يكن MI 24 أقل بكثير في خطوط Oregon R (OR) و Canton S (CS) المشروطة مسبقا (p = 0.16 و p = 0.27 ، على التوالي). تظهر البيانات كمخططات مربعة وشارب. تمثل المربعات الربعين الثاني والثالث من البيانات ، مع امتداد الشعيرات إلى الحد الأدنى والحد الأقصى لنقاط البيانات. يشار إلى المتوسط والوسيط بخطوط "+" وأفقية ، على التوالي. يتم عرض قيم MI24 للتكرارات الفردية (N) كدوائر. N = 15-33 قارورة من 30-40 ذباب / قارورة للذباب المعالج بإصابات الدماغ الرضية. N = 2-15 قارورة من 30-40 ذباب / قارورة للضوابط غير المعالجة. قيم P من اختبار t للطالب غير المزاوج ثنائي الذيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
تشمل الخطوات الحاسمة في بناء SAA ضمان تركيبات محكمة لتجنب تسرب خليط الغازات المخدر. يجب وضع SAA في غطاء دخان لتجنب تلوث مساحة المختبر. يجب فحص جميع العناصر من أسطوانات الغاز الحاملة إلى مؤشر التدفق في اتجاه مجرى SAA كما هو موضح في قائمة المراجعة.
الطرق الأخرى لإدارة VGAs للذباب معقدة في التشغيل (مقياس السكر)21 ، ولها إنتاجية منخفضة22 ، ولا تسمح بالتعرض المتزامن لعدة مجموعات23 ، ولا تسمح بالتحكم الدقيق في تركيز التخدير 21 ، أو لديها قراءات يصعب ترجمتها إلى مصطلحات مقبولة سريريا 24.
يعتمد الإصدار الحالي من SAA على مبخر تجاري ، وبالتالي ، تقتصر دراسات السموم على التخدير المتطاير. إذا تم استخدامه مع مواد متطايرة أخرى ، يمكن استخدام المرذاذ "خارج التسمية" بعد معايرة المخرجات. بدلا من ذلك ، يمكن تطبيق طريقة مختلفة لتبخير المواد المتطايرة ، الأمر الذي يتطلب قياسات مخصصة لمعايرة تركيزات الدواء ، كما هو موضح سابقا25.
بصرف النظر عن مؤشرات التدفق ، لا توجد إنذارات (على سبيل المثال ، إذا كانت الخزانات فارغة ، مقاطعة التدفق عبر SAA). اعتمادا على كثافة الاستخدام ، قد يحتاج SAA إلى التنظيف والشد وربما استبدال أنبوب Tygon. لقد أجرينا "صيانة" على SAA الأصلي مرتين في 7 سنوات من الاستخدام.
تسمح هذه الطريقة لتخدير ذباب الفاكهة باستخدام صندوق الأدوات الوراثية المتاح لباحثي ذبابة الفاكهة في نظام عالي الإنتاجية. يمكن أن تتعرض مجموعات متعددة من الذباب من مجموعات مختلفة (على سبيل المثال ، النمط الوراثي والعمر والجنس) في وقت واحد لتركيزات مخدرة متطابقة والتركيبة المرغوبة من الغاز الناقل (الهواء ، O 2 ، N2 O ، الغازات النبيلة) المناسبة لسؤال البحث المطروح.
نوضح هنا أن SAA كان مفيدا للكشف عن التغييرات غير المتوقعة في المرونة لسمية الأيزوفلوران في خط الطيران ND2360114 وأن خطوط الطيران المختبرية القياسية تختلف في استجابتها ل AP. كان تحديد هذه النتائج ممكنا بسبب التحكم الصارم في الظروف التجريبية والإنتاجية العالية ل SAA.
يمكن تكييف SAA لدراسة آثار المركبات العضوية المتطايرة الأخرى (VOCs) على الحشرات (مثل نحل العسل). بالنسبة للمركبات العضوية المتطايرة ذات ضغوط البخار القريبة من تلك الموجودة في التخدير المتطاير (إيزوفلوران: 240 مم زئبق عند 20 درجة مئوية) ، يمكن استخدام المبخرات التقليدية ، ولكن يجب معايرة المخرجات. يتم تسخين المرذاذ التجاري للديسفلوران ، مما قد يوفر مرونة إضافية.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
Acknowledgments
نشكر مارك جي بيركنز ، مختبر بيرس ، قسم التخدير ، جامعة ويسكونسن ماديسون ، على بناء النموذج الأولي ل SAA. يتم دعم العمل من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS) مع R01GM134107 وصندوق البحث والتطوير التابع لقسم التخدير ، جامعة ويسكونسن ماديسون.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Serial Anesthesia Array: | |||
| 5 mL Serological Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10C | Polystyrene, 5mL serological pipette |
| 50 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 1495949A | Polypropylene, 50 mL |
| Cable Tie Mounting Pad | Grainger | 6EEE6 | 1.25 inch L x 1 inch W x 0.28 inch H |
| Dispensing Syringe | Grainger | 5FVE0 | 10 mL with Luer-Lock Connection |
| Fabric Mesh Netting | 1 mm mesh | ||
| Flow Indicator | Grainger | 8RH52 | 5/16 to 1/2 inch connection size, paddle wheel style |
| Tygon Tubing | Tygon | E-3603 | ID: 5/16, OD: 7/16, wall: 1/16 |
| Wood Frame | 10 feet of 2 inch x 3/4 inch | ||
| Zip Tie | >5inch | ||
| Vaporizer Interface (Budget Alternative to Manifold): | |||
| Dispensing Syringe | Grainger | 5FVE0 | 10 mL with Luer-Lock Connection |
| Commercial Manifold and Vaporizers: | |||
| 1/4 inch Equal Barbed Y Connector | Somni Scientific | BF-9000 | |
| 1/8 inch NPT to 1/4 inch Barbed Elbow (Plastic) | Somni Scientific | BF-9004 | |
| AIR 0-4 LPM Flowmeter w/ black knob | Somni Scientific | FP-4002 | |
| Flowmeter auxiliary mounting bracket | Somni Scientific | NonInvPart | |
| Medical Air, 1/8 inch NPT Male x DISS Male | Somni Scientific | GF-11012 | |
| TT-2 Table Top Anesthesia System, built in dual diverter valve system. Includes 6' color coded tubing X2. (Vaporizer not Included) | Somni Scientific | TT-17000 | |
| Tec 7 Isoflurane Vaporizer | GE Datex-Ohmeda | 1175-9101-000 | Agent-specific vaporizer (Isoflurane) |
| Tec 7 Sevoflurane Vaporizer | GE Datex-Ohmeda | 1175-9301-000 | Agent-specific vaporizer (Sevoflurane) |
References
- Jevtovic-Todorovic, V., et al. Early exposure to common anesthetic agents causes widespread neurodegeneration in the developing rat brain and persistent learning deficits. The Journal of Neuroscience. 23 (3), 876-882 (2003).
- Vutskits, L., Xie, Z. Lasting impact of general anaesthesia on the brain: Mechanisms and relevance. Nature Reviews Neuroscience. 17 (11), 705-717 (2016).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Rand, M. D. Drosophotoxicology: The growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32 (1), 74-83 (2010).
- Olufs, Z. P. G., Loewen, C. A., Ganetzky, B., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Genetic variability affects absolute and relative potencies and kinetics of the anesthetics isoflurane and sevoflurane in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 8, 2348 (2018).
- Stollings, L. M., et al. Immune modulation by volatile anesthetics. Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).
- Yamaguchi, M., Yoshida, H. Drosophila as a model organism. In Drosophila Models for Human Diseases., edited by. , Springer. Singapore. 1-10 (2018).
- Hoffmann, J. A.
- Buchon, N., Silverman, N., Cherry, S. Immunity in Drosophila melanogaster-From microbial recognition to whole-organism physiology. Nature Reviews Immunology. 14 (12), 796-810 (2014).
- Shaughnessy, M. R., Hofmeister, E. H. A systematic review of sevoflurane and isoflurane minimum alveolar concentration in domestic cats. Veterinary Anaesthesia and Analgesia. 41 (1), 1-13 (2014).
- Olufs, Z. P. G., Ganetzky, B., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Mitochondrial complex I mutations predispose Drosophila to isoflurane neurotoxicity. Anesthesiology. 133 (4), 839-851 (2020).
- Johnson-Schlitz, D., et al. Anesthetic preconditioning of traumatic brain injury is ineffective in a Drosophila model of obesity. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 381 (3), 229-235 (2022).
- Schiffman, H. J., Olufs, Z. P. G., Lasarev, M. R., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Ageing and genetic background influence anaesthetic effects in a D. melanogaster model of blunt trauma with brain injury. British Journal of Anaesthesia. 125 (1), 77-86 (2020).
- Scharenbrock, A. R., Schiffman, H. J., Olufs, Z. P. G., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Interactions among genetic background, anesthetic agent, and oxygen concentration shape blunt traumatic brain injury outcomes in Drosophila melanogaster. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6926 (2020).
- Fischer, J. A., Olufs, Z. P. G., Katzenberger, R. J., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Anesthetics influence mortality in a Drosophila model of blunt trauma with traumatic brain injury. Anesthesia & Analgesia. 126 (6), 1979-1986 (2018).
- Katzenberger, R. J., et al. A Drosophila model of closed head traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4152-E4159 (2013).
- Katzenberger, R. J., et al. A method to inflict closed head traumatic brain injury in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (100), e52905 (2015).
- Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-nuclear interactions affecting lifespan and neurodegeneration in a Drosophila model of Leigh syndrome. Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).
- Johnson-Schlitz, D., et al. Anesthetic preconditioning of traumatic brain injury is ineffective in a Drosophila model of obesity. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 381 (3), 229-235 (2022).
- Li, H., et al. Isoflurane postconditioning reduces ischemia-induced nuclear factor-kappaB activation and interleukin 1beta production to provide neuroprotection in rats and mice. Neurobiology of Disease. 54, 216-224 (2013).
- Leibovitch, B. A., Campbell, D. B., Krishnan, K. S., Nash, H. A. Mutations that affect ion channels change the sensitivity of Drosophila melanogaster to volatile anesthetics. Journal of Neurogenetics. 10 (1), 1-13 (1995).
- Tinklenberg, J. A., Segal, I. S., Guo, T. Z., Maze, M. Analysis of anesthetic action on the potassium channels of the Shaker mutant of Drosophila. Annals of the New York Academy of Sciences. 625, 532-539 (1991).
- Gamo, S., Ogaki, M., Nakashima-Tanaka, E. Strain differences in minimum anesthetic concentrations in Drosophila melanogaster. Anesthesiology. 54 (4), 289-293 (1981).
- Campbell, J. L., Nash, H. A. The visually-induced jump response of Drosophila melanogaster is sensitive to volatile anesthetics. Journal of Neurogenetics. 12 (4), 241-251 (1998).
- Perouansky, M., Hentschke, H., Perkins, M., Pearce, R. A. Amnesic concentrations of the nonimmobilizer 1,2-dichlorohexafluorocyclobutane (F6, 2N) and isoflurane alter hippocampal theta oscillations in vivo. Anesthesiology. 106 (6), 1168-1176 (2007).
