Summary
Hier beschrijven we een verbetering van de semi-in vitro (SIV) methode voor het observeren van pollenbuisgeleiding en -ontvangst in Arabidopsis thaliana, die de ontvankelijkheid van eitjes verhoogt. De high-throughput SIV cum septum-methode kan worden gekoppeld aan gametofytmarkerlijnen en genetisch gecodeerde biosensoren om het dynamische proces van bevruchting te volgen.
Abstract
Bij bloeiende planten zijn de groei en begeleiding van de stuifmeelbuis (mannelijke gametofyt) in de stamper en de ontvangst van de stuifmeelbuis door de vrouwelijke gametofyt essentieel voor dubbele bevruchting en daaropvolgende zaadontwikkeling. De interacties tussen mannelijke en vrouwelijke gametofyten tijdens de ontvangst van de stuifmeelbuis culmineren in stuifmeelbuisruptuur en de afgifte van twee zaadcellen om dubbele bevruchting te bewerkstelligen. Omdat stuifmeelbuisgroei en dubbele bevruchting diep verborgen zijn in de weefsels van de bloem, is dit proces moeilijk in vivo waar te nemen.
Een semi-in vitro (SIV) methode voor de live-cell imaging van bevruchting in de modelplant Arabidopsis thaliana is ontwikkeld en geïmplementeerd in verschillende onderzoeken. Deze studies hebben geholpen om de fundamentele kenmerken op te helderen van hoe het bevruchtingsproces plaatsvindt in bloeiende planten en welke cellulaire en moleculaire veranderingen optreden tijdens de interactie van de mannelijke en vrouwelijke gametofyten. Omdat deze live cell imaging-experimenten echter de excisie van individuele eicellen omvatten, zijn ze beperkt tot een laag aantal observaties per beeldvormingssessie, waardoor deze aanpak vervelend en zeer tijdrovend is. Naast andere technische problemen wordt vaak een falen van de stuifmeelbuizen om de eicellen in vitro te bevruchten gemeld, wat dergelijke analyses ernstig verstoort.
Hier wordt een gedetailleerd videoprotocol geleverd voor het in beeld brengen van de ontvangst en bevruchting van pollenbuizen op een geautomatiseerde en high-throughput manier, waardoor tot 40 observaties van pollenbuisontvangst en -breuk per beeldvormingssessie mogelijk zijn. In combinatie met het gebruik van genetisch gecodeerde biosensoren en markerlijnen maakt deze methode het genereren van grote steekproefgroottes mogelijk met een verminderde tijdsinvestering. Nuances en kritische punten van de techniek, waaronder bloemstadiëring, dissectie, mediumvoorbereiding en beeldvorming, zijn duidelijk gedetailleerd in videoformaat om toekomstig onderzoek naar de dynamiek van pollenbuisgeleiding, ontvangst en dubbele bevruchting te vergemakkelijken.
Introduction
Het genereren van genetisch unieke nakomelingen in seksueel reproducerende organismen is afhankelijk van de succesvolle fusie van mannelijke en vrouwelijke gameten. In bloeiende planten is de interactie van twee mannelijke gameten (zaadcellen) met twee vrouwelijke gameten (eicel en centrale cel) tijdens dubbele bevruchting afhankelijk van de afgifte van sperma uit de stuifmeelbuis (de mannelijke gametofyt). Dit proces, de ontvangst van stuifmeelbuizen, wordt grotendeels gecontroleerd door de synergetische cellen die zich in de embryozak (de vrouwelijke gametofyt) bevinden1,2. Omdat de ontvangst van stuifmeelbuizen diep in de bloem plaatsvindt, is eenmethode vastgesteld die live-cell imaging van het proces mogelijk maakt, genaamd semi-in vitro (SIV) pollenbuisontvangst, 3. Met deze methode worden weggesneden Arabidopsis-eitjes op semi-vloeibaar stuifmeelkiemmedium geplaatst en gericht op stuifmeelbuizen die groeien door het stigma en de stijl van een stamper die is afgesneden op de stijloverlatende tractusjunctie 3,4. Sinds de ontwikkeling van deze techniek hebben gedetailleerde waarnemingen geleid tot verschillende ontdekkingen rond pollenbuisgeleiding, ontvangst en bevruchting. Deze ontdekkingen omvatten onder andere de verwerving van stuifmeelbuisgericht competentie door groei door het stigma3, het begin van intracellulaire calciumoscillaties in de synergiden bij aankomst van de stuifmeelbuis 5,6,7,8,9, en de dynamiek van het vrijgeven en bevruchten van zaadcellen bij stuifmeelbuisuitbarsting10 . Niettemin, omdat deze techniek afhankelijk is van de excisie van eicellen, zijn de waarnemingen van bevruchting beperkt in aantal en is de ontvangst van stuifmeelbuizen vaak afwijkend, wat resulteert in het falen van stuifmeelbuisruptuur (Video 1 en Aanvullend Dossier 1). Daarom is er behoefte aan een efficiëntere aanpak die analyses met een hoge doorvoer van de ontvangst en bemesting van pollenbuizen mogelijk maakt.
Bij de ontwikkeling van dit protocol werden verschillende nieuwe benaderingen voor het analyseren van pollenbuisontvangst, variërend van de meest "in vitro" tot de meest "in vivo" -methoden, getest en werd een efficiënte techniek op basis van de excisie van het hele septum vastgesteld, die tot 40 observaties van bevruchting per dag mogelijk maakt. Hier worden de nuances en kritische punten van de techniek geschetst, waaronder bloemstadiëring, dissectie, mediumvoorbereiding en beeldvormingsinstellingen. Door dit protocol te volgen, moet onderzoek gericht op pollenbuisgeleiding, pollenbuisontvangst en dubbele bevruchting worden vergemakkelijkt. De hogere steekproefgroottes die de methode mogelijk maakt, zullen naar verwachting de wetenschappelijke deugdelijkheid van de conclusies uit live beeldvormingsexperimenten versterken. De mogelijke toepassingen van deze techniek omvatten, maar zijn niet beperkt tot, het uitvoeren van observaties van de moleculaire en fysiologische veranderingen in cytosolische calciumconcentraties ([Ca2+]cyt), pH ofH 2 O2 tijdens gametofyteninteracties door het gebruik van genetisch gecodeerde biosensoren. Bovendien kunnen cytologische veranderingen, zoals degeneratie van de receptieve synergie, spermacelmigratie of karyogamie, gemakkelijker worden waargenomen met behulp van deze verbeterde methode. Ten slotte kan de timing van de verschillende stadia van bevruchting worden gevolgd onder widefieldmicroscopie, en vervolgens kunnen meer gedetailleerde analyses met behulp van confocale laserscanmicroscopie (CLSM) of tweefoton excitatiemicroscopie (2PEM) worden uitgevoerd voor een hogere resolutie en 3D-reconstructie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Zie de Materiaaltabel voor een lijst van de materialen en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt.
1. Overwegingen voor het ontwerpen van het beeldvormingsexperiment
- Bepaal vooraf de beeldduur en bemonsteringsfrequentie die nodig zijn om het gewenste waargenomen fenomeen vast te leggen. Volgens de bemonsteringsstelling van Nyquist moet de bemonsteringsfrequentie bijvoorbeeld groter zijn dan tweemaal de hoogste frequentie van het invoermonster. Daarom, om synergetische [Ca2 +] cyt-oscillaties nauwkeurig vast te leggen, ongeveer elke 10 s beeldvorming uit te voeren, maar om de snelheid van de zaadcellen bij afvoer van de stuifmeelbuis te meten, zorgt u voor een temporele resolutie van minder dan 1 s10.
- Selecteer fluorescerende markers voor de cellen van belang die voldoende helder zijn buiten de achtergrondautofluorescentie. Selecteer voor het gebruik van biosensoren de helderste lijnen die de celfunctie niet verstoren, omdat ze over het algemeen gevoeliger zijn en minder belichtingstijd vereisen.
- Bedenk welk type fluorescentiemicroscopie en vergroting het meest geschikt zijn om het gewenste fenomeen vast te leggen. Gebruik widefieldmicroscopie en lage vergrotingsdoelstellingen om licht van een grotere scherptediepte vast te leggen en de focus in de loop van de tijd te behouden, grotere objecten zoals hele eitjes in beeld te brengen of ratiometrische sensoren te gebruiken die gevoelig zijn voor chromatische verschuivingsartefacten. Gebruik CLSM of 2PEM met hoge vergrotingsdoelstellingen voor een betere resolutie van cellulaire en subcellulaire objecten, maar let op de moeilijkheid om de focus in de loop van de tijd te behouden.
- Schat het aantal monsters dat per experiment in beeld moet worden gebracht. Gebruik bijvoorbeeld een 10x-objectief met een minimale bemonsteringstijd van ~30 s voor het in beeld brengen van drie septa en het in beeld brengen van maximaal 40 bevruchtingsgebeurtenissen per experiment vanwege de tijd die nodig is voor de autofocus- en meertrapsacquisitiefuncties.
2. Bereiding van het ontkiemingsmedium voor stuifmeel
- Bereid vloeibaar stuifmeelkiemmedium (5mM CaCl2, 1mM MgSO4, 5mM KCl, 0,01% [w/v] H 3 BO3en 10% [w/v] sucrose) met behulp van 1 M aliquote voorraden van elke micronutriënt, die worden opgeslagen bij −20 °C. Stel de pH in op 7,5 met 0,1 M KOH. Bewaar het medium bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken.
OPMERKING: De pH kan na verloop van tijd dalen. - Voeg 2,5 ml vloeibaar medium toe aan een bekerglas van 10 ml en voeg langzaam 32 mg agarose met ultralaag smeltpunt (~ 1,3%) toe met een snel roterende roerstaaf om klonteren te voorkomen.
- Smelt agarose op een kookplaat bij 65 °C en nutteer het bekerglas om eventuele condensatie van de zijkanten op te vangen.
- Pipetteer 130 μL medium in de 14 mm put van een 35 mm glazen bodemschaal en draai de schaal totdat het medium de put bedekt.
- Zuig in totaal 40 μL aan met een pipet vanuit het midden van de schaal, waardoor een totaal volume van 90 μL achterblijft.
OPMERKING: Er kan meer medium uit de put worden geaspireerd om een lager totaal volume te bereiken; Dit kan nodig zijn voor hoge vergrotingsdoelen met lage werkafstanden. Hoe dunner het agarpad is, hoe sneller het zal uitdrogen. - Koel de schotel op een aluminium blok in een vochtigheidskamer om een gelijkmatige koeling te garanderen. Bewaar de borden een nacht bij 4 °C voor gebruik de volgende ochtend.
3. Bloemenstadiëring van septumdonoren, stigmadonoren en stuifmeeldonoren
Figuur 1: Bloemenstadiëring van septumdonoren, stigmadonoren en stuifmeeldonoren. (A) Stadia van Arabidopsis-bloemen (Ler-0) binnen een bloeiwijze. Knoppen in stadium 12B, die bloemblaadjes hebben die op het punt staan te openen en gele onopvallende helmknoppen, moeten worden uitgemergeld door alle kelkbladen, bloemblaadjes en meeldraden te verwijderen. Stampers (die de vrouwelijke gametofytenmaker herbergen) zijn dan 24 uur later bruikbaar als septumdonor. (B) Stadia van Arabidopsis-bloemen (Col-0) binnen een bloeiwijze. Knoppen in stadium 12B, die gele ondehiscente helmknoppen en stigma's hebben die nauwelijks uit de bloemblaadjes komen, moeten worden uitgemergeld door alle kelkbladen, bloemblaadjes en meeldraden te verwijderen. De stampers zijn dan 24 uur later bruikbaar als stigmadonoren, wanneer ze moeten worden bestoven door bloemen (met de mannelijke gametofytmarker) die open zijn en stuifmeel afstoten. Bestoven stigma's moeten binnen 1 uur na bestuiving worden ontleed. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Kies de ochtend voor de beeldvorming Arabidopsis-planten om te worden gebruikt als septumdonoren en stigmadonoren; Zorg ervoor dat ze gezond zijn en zijn onlangs begonnen met het produceren van siliques.
OPMERKING: Landsberg erecta (L er-0) is een goede toetreding voor gebruik als septumdonor, omdat de septa stevig zijn ener kleine internodes tussen de eicellen zijn. Columbia (Col-0) is een goede aanwinst om te gebruiken als stigmadonor omdat ze bevorderlijk lijken te zijn voor de groei van stuifmeelbuizen. - Emasculeer ten minste drie fase 12B septum donorbloemen en 12 stadium 12B stigmadonorbloemen door hun meeldraden, kelkbladen en bloemblaadjes te verwijderen (figuur 1A, B). Verwijder ook oudere bloemen op dezelfde bloeiwijze, die mogelijk de uitgemergelde bloem kunnen bestuiven.
- In de ochtend, 24 uur later, bestuif de stigmadonoren met de stuifmeeldonorbloemen (bijvoorbeeld met stuifmeelbuis of spermacelmarkers) die gemakkelijk stuifmeel afstoten. De bestuiving is voltooid wanneer de stigma's bijna volledig bedekt zijn met stuifmeel (figuur 1B).
4. Septumdissectie
Figuur 2: Een korte handleiding voor septum- en stigmadissectie . (A) Stappen van septumdissectie. Speld de stamper vast op dubbelzijdige tape met een injectiespuitnaald en maak sneden op de stijl-eierstokverbinding en de ovarium-pedikelverbinding, gevolgd door een ondiepe snede langs het septum van een van beide carpels (stap 1). Pel de carpelwanden terug op de tape (stap 2). Snijd de replum onder het bovenste septum (stap 3). Knip het septum in de stijl en verwijder het met een tang aan de steel (stap 4). Plaats het septum op agarmedia en sluit het voorzichtig in met een tang. (B) Stappen van stigmadissectie. Speld de stamper (<1 uur eerder bestoven) vast op dubbelzijdige tape en snijd op de stijl-eierstokverbinding met een scheermesje (stap 6). Plaats het stigma op agarmedium met een insulinenaald naast het septum en pas de afstand aan tot ongeveer 250 μm (stappen 7-8). Zorg ervoor dat zich een semi-vloeibare pool vormt rond de micropyles en de basis van de stijlen (stap 9). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Verzamel dertig minuten na de bestuiving gezonde en volwassen septumdonorstampers bij de pedikel en plaats ze op verse dubbelzijdige plakband gemonteerd op een glazen dia, waarbij het stigma net buiten de rand van de tape plakt.
OPMERKING: Beperk de dissectietijd waarvoor de stampers op de plakband zitten om ervoor te zorgen dat deze zo kort mogelijk is. De dissectie moet worden uitgevoerd bij een hoge luchtvochtigheid, wat kan worden bereikt door een luchtbevochtiger naast de dia te plaatsen. - Speld de stamper stevig vast op de tape door zachtjes op de steel en langs de eierstok te drukken met behulp van de achterkant van een nieuwe insulinespuitnaald voordat u de kelkblad-, bloemblad- en meeldradenresten verwijdert die overblijven van de emasculatie.
- Gebruik onder een stereoscoop een injectiespuitnaald om twee sneden per carpel te maken op de stijl-eierstokovergang en de ovarium-pedikelverbinding, gevolgd door ondiepe sneden langs het septum van elke carpel (figuur 2, stap 1).
OPMERKING: Te diep snijden langs het septum zal de eicellen bij de funiculus doorsnijden. - Pel de eierstokwanden voorzichtig terug op de tape (figuur 2, stap 2) en schuif de naald voorzichtig tussen de twee septa om de replum over de gehele lengte van de stamper te snijden zonder de eitjes te verstoren (figuur 2, stap 3).
OPMERKING: Snijd de replum in de richting van de stijl naar de steel om ervoor te zorgen dat de eitjes op het bovenste septum zo min mogelijk worden verstoord. - Snijd het bovenste septum voorzichtig af op zowel de kruising met de stijl als met de steel en verwijder het septum met een tang van de pedikelzijde (figuur 2, stap 4).
OPMERKING: Houd deze snede recht en zacht, zodat het septum vlak blijft en niet kromt. - Plaats het septum zo plat mogelijk op het medium, zodat de micropyles van de eitjes naar boven en in hetzelfde brandpuntsvlak liggen. Druk het septum zachtjes in het medium totdat de eitjes net iets in het medium zijn ingebed (figuur 2, stap 5).
OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat het septum zo wordt geplaatst dat de micropyles van de eicellen toegankelijk zijn voor de stuifmeelbuizen (eventuele ontoegankelijke eitjes kunnen voorzichtig worden herschikt met een naald). Een kleine plas vloeistof moet zich na inbedding rond het septum vormen. - Herhaal stap 4.1-4.6 voor nog maximaal twee stampers en plaats de septa van begin tot eind.
5. Stigmadissectie
- Plaats de bestoven stigmadonorstampers op verse dubbelzijdige plakband die op een glazen dia is gemonteerd, zodat de overgang in eierstokstijl van de rand van de tape is (figuur 2, stap 6).
- Gebruik een vers scheermesje om de stijl recht naar beneden te snijden en weg te tillen om het stigma op het mes te houden (figuur 2, stap 6).
OPMERKING: Knip aan de rand van de tape voor de schoonste snede. - Verwijder het stigma van het mes met een injectiespuitnaald en plaats het plat op ongeveer 250-300 μm van de eicellen (figuur 2, stappen 7-8).
OPMERKING: De stijl moet horizontaal op zijn kant worden georiënteerd; Anders zullen de meeste stuifmeelbuizen onder het septum groeien. Een kleine plas vloeistof bij de ingang van de stijl moet verschijnen nadat deze 1 minuut op het medium heeft gelegen; Dit is een goed teken, omdat de stuifmeelbuizen een gladde uitgang van de stijl hebben. - Herhaal stap 5.1-5.3 voor maximaal 12 stigma's en plaats er twee aan weerszijden van elk septum. Zoek naar een kleine plas vloeistof die zich vormt rond de micropyle van de eicellen; dit helpt de toegankelijkheid en het richten van de stuifmeelbuizen naar de embryozakken (figuur 2, stap 9).
OPMERKING: Beperk de hoeveelheid tijd dat het gerecht open is om te voorkomen dat het medium en de eicellen uitdrogen.
6. Beeldvorming
Figuur 3: SIV cum septum imaging schema. (A) Volledige SIV cum septum opstelling met 12 bestoven stigma's en 3 septa, gezien door een stereoscoop. (B) Samengevoegde beelden van de volledige SIV cum septum-opstelling gezien in A 5 uur na incubatie met behulp van een 10x-objectief, met de vijf overzichtsgebieden (~ 1 mm elk) gemarkeerd voor meertrapsacquisitie. De groene dozen tonen de eitjes die stuifmeelbuizen hebben ontvangen die een explosieve uitbarsting in de synergiden ondergaan. (C) Nadere weergave van overzichtsgebied 2 op verschillende tijdstippen. Ongeveer 3 uur na het broeden in de vochtigheidskamer op de microscoop, zouden de stuifmeelbuizen in de buurt van de micropyles moeten aankomen en tegen 6 uur beeldvorming zouden de meeste eitjes pollenbuizen (groene vierkanten) goed moeten hebben ontvangen; Deze eitjes ondergaan vervolgens een explosieve stuifmeelbuisbreuk (sterretje). Schaalstaven = (A) 5 mm, (B,C) 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Zodra de dissectie is voltooid en het gerecht klaar is om te worden afgebeeld, laat u het incuberen in een vochtigheidskamer op de microscoop die op 92% relatieve vochtigheid en 21 ° C wordt gehouden.
OPMERKING: Als er geen vochtigheidskamer beschikbaar is voor de microscoop, zal het bekleden van de buitenranden van het deksel en de schaal met een klein volume water helpen om een hoge luchtvochtigheid in de schaal te handhaven. - Breng de samples scherp onder brightfield bij een lage lichtintensiteit en schakel vervolgens over op fluorescerend licht, waarbij de gebieden van het monster op het werkgebiedoverzicht worden gemarkeerd om te worden afgebeeld.
OPMERKING: Bij een vergroting van 10x kunnen ongeveer vijf gebieden worden gemarkeerd voor een totaal van drie septa (figuur 3). Beperk de hoeveelheid tijd die wordt gebruikt voor het markeren van de overzichtsgebieden om fototoxiciteit of de opwarming van het monster door het fluorescerende licht te minimaliseren. - Begin met beeldvorming met behulp van een meertraps acquisitieschema met een autofocusfunctie aan het begin van elk overzichtsgebied. Omdat stuifmeelbuizen ~ 1 uur na het incuberen van het monster uit de stijl komen, vertraagt u de verwerving met 2 uur of totdat de stuifmeelbuizen de micropyle hebben bereikt. Zorg ervoor dat de autofocus is ingesteld met een bereik van 100 μm (7 μm grote stappen en 1 μm fijne stappen) om de eitjes scherp te houden terwijl de septa in de loop van de tijd enigszins beweegt en zakt.
- Stop de beeldacquisitie ~ 9 uur na het starten van de incubatie van het monster, omdat tegen die tijd de meeste eitjes een stuifmeelbuis zouden moeten hebben aangetrokken en ontvangen.
OPMERKING: Als een laag aantal eitjes stuifmeelbuizen aantrekt, is zorgvuldige observatie van het gerecht onder een stereoscoop nuttig om te bepalen hoe de eicel- of stijloriëntatie de volgende keer kan worden verbeterd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de timing van nucleaire degeneratie in de receptieve synergie met betrekking tot stuifmeelbuisruptuur in Arabidopsis te beoordelen, en om te observeren of de linker- of rechtersynergie voorbestemd is om de receptieve synergie te worden, werd de hier beschreven SIV cum septum-methode gebruikt met behulp van een vrouwelijke gametofyt-nucleaire marker gestapeld met een synergetische cytosolische marker (pFG: roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98:roGFP2-ORP1) als septumdonor en een mannelijke gametofytenmarker (pLAT52:R-GECO) als stuifmeeldonor. De septa en bestoven stigma's werden 24 uur na emasculatie ontleed, volgens secties 4-5 van het protocol, en op glazen bodemschalen geplaatst met een medium dat de dag ervoor was bereid. Elke schotel werd in een vochtigheidskamer op de microscoop geplaatst en een meertrapsexperiment werd uitgevoerd met behulp van een 10x objectieflens (numeriek diafragma: 0,4) met vijf overzichtsgebieden (figuur 3). Van elk gebied werden elke 60 s gedurende 9 uur beelden gemaakt met vier fluorescerende kanalen: Kanaal (1) 560/640 voor R-GECO (25 ms), Kanaal (2) 488/520 voor roGFP2-ORP1 (60 ms), Kanaal (3) 387/520 voor roGFP2-ORP1 (60 ms) en Kanaal (4) 387/640 voor achtergrondaftrek (60 ms) (tabel 1). Een autofocusfunctie met een bereik van 100 μm met 7 μm grove stappen en 1 μm fijne stappen werd gebruikt voor elke minuut vóór beeldacquisitie. De vijf beeldbestanden werden geopend in FIJI, de kanalen werden gescheiden en vervolgens werden de beelden handmatig aan elkaar geplakt (Video 2 en Aanvullend Bestand 1).
In Video 2 (zie ook Aanvullend Dossier 1) zijn 41 voorbeelden te zien van explosieve stuifmeelbuisbreuk in de synergiden in de eicellen, met groene vierkanten die de interessegebieden markeren. Met behulp van de calciumbiosensorlijn pLAT52: RGECO als stuifmeeldonor, werden gevallen van explosieve stuifmeelbuisbreuk waargenomen aan de uiteinden van de stuifmeelbuizen waar ze lyseren. Met name was er een snelle toename van de helderheid van de biosensor als gevolg van de plotselinge blootstelling aan hoge niveaus van calcium. Explosieve stuifmeelbuisruptuur kan ook worden geanalyseerd met op GFP gebaseerde of RFP-gebaseerde spermacel- of cytosolische markers, die ook een snelle afgifte van het sperma of cytoplasmatische inhoud laten zien. Bij het ruptuur van de stuifmeelbuis werd waargenomen dat de kern van het receptieve synergie gelijktijdig degradeerde (binnen de 1 min-tijdresolutie in het experiment), en migratie van de eicelkern naar de micropyle werd ook waargenomen bij stuifmeelbuisruptuur als gevolg van karyogamie (Video 3 en Aanvullend Bestand 1). Zowel de linker- als de rechtersynergiden konden dienen als het receptieve synergetisch en er werden gevallen van twee stuifmeelbuisuitbarstingen waargenomen, ten eerste in het receptieve synergetische en ten tweede in het persistente synergie. Video 2 (zie ook Aanvullend Dossier 1) toont 10 voorbeelden van defecte pollenbuisontvangst, die te zien is in de eicellen, waarbij de interessegebieden worden gemarkeerd door rode vierkanten. De algehele efficiëntie van de ontvangst van de pollenbuis was dus ~ 80% met betrekking tot de eitjes die stuifmeelbuizen aantrokken. In deze onsuccesvolle gevallen stoppen de stuifmeelbuizen hun groei in de micropyle, stoppen ze hun groei na de snelle groei in de synergiden, of slagen ze er niet in om hun groei te stoppen en blijven ze groeien en oprollen in de embryozak. De eitjes zonder aangegeven interessegebieden trokken geen stuifmeelbuizen aan of bevonden zich niet in een toegankelijke oriëntatie. Uitvergrote voorbeelden van negatieve en positieve uitkomsten zijn te zien in Video 3 (zie ook Aanvullend Dossier 1), met twee gevallen van defecte pollenbuisontvangst (Video 3A,C en Aanvullend Dossier 1), en twee gevallen van succesvolle pollenbuisontvangst (Video 3B,D en Aanvullend Dossier 1).
Figuur 4: Vergelijking van de efficiëntie van de SIV-methode. Acht technische replicaties van de SIV-methode met weggesneden eicellen (71 totale eicellen) toonden slechts ~ 28% eitjes met explosieve stuifmeelbuisbreuken, wat resulteerde in een efficiëntie variërend van ~ 10% -50%. Vijf technische replicaties van de SIV cum septum-methode (8 septa en 102 eicellen) toonden ~ 79% eicellen met explosieve stuifmeelbuisbreuk, wat resulteerde in een efficiëntie variërend van ~ 70% -100%. Alleen eitjes die stuifmeelbuizen naar de micropyle trokken en eitjes die voldoende geregistreerde tijd hadden om de aangetrokken stuifmeelbuis te ontvangen, werden geteld. De "X" geeft respectievelijk het gemiddelde aan en de middellijn de mediaanwaarde (50e percentiel). De lijnen buiten het bovenste en onderste kwartiel tonen de minimale en maximale percentages van succesvolle pollenbuisontvangst. Het percentage eitjes met stuifmeelbuisbreuk was significant verschillend (p < 0,001) tussen de twee methoden op basis van een ongepaarde t-test. Afkorting: SIV = semi-in vitro. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Uitrusting/instelling | Aanvullende video 2 & 3 |
| Microscoop | Olympus IX-81F-ZDC2 omgekeerde microscoop |
| Temperatuurregeling | Life Imaging Services GmbH Kubus & Doos (22C) |
| Vochtigheidsregeling | Life Imaging Services GmbH Baksteen (92% relatieve vochtigheid) |
| Software | Olympus cellSens Dimensie 2.3 |
| Real-time controller | Olympus U-RTC |
| Laser | MT20- 150 W xenon boogbrander |
| Objectief lens | 10x luchtonderdompeling U Plan SApo objectief lens (0.4 NA), werkafstand 3.1 mm |
| Spiegel Kubus | GFP/RFP |
| Filterwiel | Olympus U-FFWO |
| Kanaal 1 (25 ms) : gereflecteerde (560/25) waarneming (624/40) | |
| Kanaal 2 (60 ms): gereflecteerde (485/20) waarneming (525/30) | |
| Kanaal 3 (60 ms): gereflecteerde (387/11) waarneming (525/30) | |
| Kanaal 4 (60 ms): gereflecteerde (387/11) waarneming (624/30) | |
| Detector | Hamamatsu ORCA-Fusion Digitale CMOS camera |
| Autofocus | 100 μm bereik, 7 μm grove stap, 1 μm fijne stap |
| Tijdsinterval | 1 min |
Tabel 1: De microscoopsystemen en -instellingen die in dit manuscript worden gebruikt.
Video 1: Timelapses van de SIV gesneden eicellen methode. Samengevoegde timelapse van acht technische replicaties van SIV met behulp van weggesneden eicellen die de groei van stuifmeelbuizen (met pLAT52: R-GECO) en pollenbuisontvangst in de eicellen laten zien. De 20 groene dozen tonen gevallen van explosieve stuifmeelbuisbreuk in de synergiden, en de 51 rode dozen tonen gevallen van mislukte stuifmeelbuisbreuk en overgroei. De timelapses liggen tussen de 260 min en 400 min en de schaalbalk is 100 μm. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: SIV cum septum timelapse. (A) Samengevoegde timelapse van alle vijf overzichtsgebieden (zie figuur 3) van de groei en ontvangst van de stuifmeelbuis in de eicellen met alleen het RFP-kanaal (kanaal 1). Het stuifmeel herbergt pLAT52:R-GECO en de eitjes pFG:roGFP2-ORP1-NLS; pMYB98:roGFP2-ORP1. De 41 groene dozen tonen gevallen van explosieve stuifmeelbuisbreuk en de 10 rode dozen tonen gevallen van mislukte stuifmeelbuisbreuk en stuifmeelbuisovergroei. (B) Hetzelfde tijdsverloop met zowel het RFP- als het GFP-kanaal (kanaal 1 en kanaal 2), dat de nucleaire dynamiek in de gameten en synergetische cellen tijdens de ontvangst van de pollenbuis weergeeft. De getallen rechtsboven geven de tijd (h:min) aan. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 3: Voorbeelden van positieve en negatieve uitkomsten van SIV cum septum. (A,C) Voorbeeld van ovules uit Video 2 met twee gevallen van mislukte bevruchting. Bij A slagen de stuifmeelbuizen er niet in om de groei te stoppen en blijven ze oprollen in de embryozak. In C wordt een tweede categorie stuifmeelbuisovergroei gezien, waarbij de eerste stuifmeelbuis een snelle groei ondergaat terwijl deze in de synergetische groeit, maar de groei stopt zonder te scheuren. (B,D) Voorbeeld van eitjes uit Video 2 met twee gevallen van succesvolle pollenbuisontvangst. De wildtype-achtige stuifmeelbuisbreuk toont de explosieve breuk van de stuifmeelbuis in de synergiden, en de migratie van de eicelkern naar de micropyle duidt op karyogamie. De getallen rechtsboven geven de tijd (h:min) aan. De pijlpunten geven de receptieve synergetische kernen (rSN) aan en de pijlen geven de migratie van de eicelkern (EN) aan na stuifmeelbuisbreuk (lysis). Schaalbalk = 30 μm. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullend bestand 1: stilstaande beelden van Video 1, Video 2 en Video 3. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript introduceert een efficiënt protocol voor de beeldvorming van pollenbuisontvangst en dubbele bevruchting in Arabidopsis. De verbeterde methode, SIV cum septum, verhoogt het percentage en het totale aantal succesvolle pollenbuisontvangstgebeurtenissen die per beeldvormingssessie waarneembaar zijn, aanzienlijk. De hier getoonde representatieve resultaten tonen een beeldvormingssessie met 41 succesvolle pollenbuisontvangstgebeurtenissen en 10 eicellen die ontvangstdefecten vertonen (~ 80% efficiëntie). Dit is meer dan het dubbele van het aantal succesvolle pollenbuisontvangstgebeurtenissen die zijn vastgelegd in een totaal van acht beeldvormingssessies met behulp van de oorspronkelijke SIV-weggesneden eicelmethode (Video 1). Met behulp van de SIV cum septum-methode in vijf technische replicaties voor een totaal van acht septa, bereikten we een gemiddelde ontvangstefficiëntie van pollenbuizen van 79% in vergelijking met een gemiddelde van 28% met behulp van de SIV-weggesneden septummethode met acht technische replicaties (figuur 4).
Hoewel de efficiëntie van de ontvangst van stuifmeelbuizen veel groter is voor de SIV cum septum-methode , komen gevallen van pollenbuisovergroei nog steeds met verschillende snelheden voor, afhankelijk van verschillende factoren. Het belangrijkste is dat de synergetische cellen in leven en ontvankelijk moeten worden gehouden voor de enkele uren waarin ze worden afgebeeld. Het handhaven van een vochtige omgeving tijdens dissectie en beeldvorming, het gebruik van vers gemaakt medium, het inbedden van de eicellen en het septum in de semi-vloeibare agar en het vermijden van warmte die wordt gegenereerd door overmatige blootstelling aan licht tijdens beeldacquisitie zijn allemaal cruciale factoren om een succesvolle ontvangst van de pollenbuis te garanderen. De toegankelijkheid en aantrekkingskracht van stuifmeelbuizen op de micropyles van de eicellen zijn ook belangrijke factoren die het aantal succesvolle pollenbuisontvangstgebeurtenissen beperken. Het minimaliseren van de verstoring van de eicellen op het septum tijdens dissectie, het richten van het septum zodanig dat de micropyles naar boven zijn gericht, en de vorming van een semi-vloeibare pool tussen de eicellen en de opening van de stijl zijn de sleutel tot het aantrekken van stuifmeelbuizen. De vorming van deze pool kan variëren tussen merken agar met een laag smeltpunt en het wordt daarom aanbevolen om de experimenten te beginnen met verschillende percentages agar van 1% tot 1,5%. Ten slotte betekent de moeilijkheid van de dissectie dat het enige oefening vereist, en het wordt aanbevolen om geduldig te blijven, te oefenen met ontspannen en diep ademhalen vóór de dissectie, en, belangrijker nog, om de technieken bij te houden die de stabiliteit en consistentie verbeteren (bijv. Handpositionering, diaoriëntatie).
Dit gedetailleerde protocol van de SIV cum septum-methode zou de efficiëntie en het monsteraantal voor experimenten gericht op de live beeldvorming van pollenbuisontvangst en dubbele bevruchting aanzienlijk moeten verbeteren. Toepassingen omvatten het gebruik van genetisch gecodeerde biosensoren, mutantenanalyse en beschrijvende observaties van cytologische gebeurtenissen voor, tijdens en net na dubbele bevruchting. We hopen dat deze methode kan worden uitgebreid en uitgebreid naar andere bloeiende plantensoorten waar het behoud van eicellen op de placenta van de eierstok van nut kan zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs melden geen belangenconflicten.
Acknowledgments
We bedanken Sara Simonini en Stefano Bencivenga voor het doneren van de pFG:roGFP2-ORP1-NLS construct en Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter en Celia Baroux voor hun advies over microscopie. We erkennen vriendelijk het advies van Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima en alle anderen op de International Conference on Sexual Plant Reproduction 2022 die interesse toonden in een protocol over SIV cum septum. Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Zürich en subsidies van de Swiss National Science Foundation aan U.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
References
- Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception. Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).
- Rotman, N., et al. Female control of male gamete delivery during fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 13 (5), 432-436 (2003).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Distinct short-range ovule signals attract or repel Arabidopsis thaliana pollen tubes in vitro. BMC Plant Biology. 6, 7 (2006).
- Susaki, D., Maruyama, D., Yelagandula, R., Berger, F., Kawashima, T. Live-cell imaging of F-actin dynamics during fertilization in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1669, 47-54 (2017).
- Iwano, M., et al. Cytoplasmic Ca2+ changes dynamically during the interaction of the pollen tube with synergid cells. Development. 139 (22), 4202-4209 (2012).
- Ngo, Q., Vogler, H., Lituiev, D., Nestorova, A., Grossniklaus, U. A calcium dialog mediated by the FERONIA signal transduction pathway controls plant sperm delivery. Developmental Cell. 29 (4), 491-500 (2014).
- Denninger, P., et al. Male-female communication triggers calcium signatures during fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4645 (2014).
- Hamamura, Y., et al. Live imaging of calcium spikes during double fertilization in Arabidopsis. Nature Communications. 5, 4722 (2014).
- Ponvert, N., Johnson, M. Synergid calcium ion oscillations define a new feature of pollen tube reception critical for blocking interspecific hybridization. bioRxiv. , (2020).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21 (6), 497-502 (2011).
